CN112969788A - 用于清洁的核酸内切酶1核糖核酸酶 - Google Patents

Abstract

披露了核酸内切酶1核糖核酸酶多肽和含有这些多肽的清洁组合物。还披露了用于使用这些多肽和清洁组合物的方法。还披露了编码这些多肽的多核苷酸以及含有这些多核苷酸的载体和细胞。

Description

用于清洁的核酸内切酶1核糖核酸酶

序列表的引用

本申请含有处于计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。

技术领域

本申请描述了具有RNA酶活性的多肽、含有这些多肽的组合物、以及编码这些多肽的多核苷酸。还披露了编码这些多肽的核酸构建体和载体、以及表达这些构建体和载体的宿主细胞，用于生产这些多肽。披露了使用这些多肽的方法。

背景技术

含有酶的、用于清洁的组合物是本领域已知的。通常，清洁组合物中的酶可以去除污渍，改进白度并消除恶臭。这些酶可以降解或去除污垢和污渍中可能存在的分子，像蛋白质、多糖或脂肪。在某些情况下，有机污渍(如体垢、汗液、皮脂、死细胞或生物膜)中可能存在这些分子和其他分子，这些有机污渍是基质内微生物的形成物，该基质通常由在表面上形成的细胞外聚合物(EPS)构成。生物膜是某些微生物的天然生境(habitat)，并且随着微生物在生物膜中生长，它们会分泌像多糖、蛋白质、脂质、核酸(例如，DNA和RNA)等分子。

继续开发新的清洁组合物，包括含有酶的那些以及能够去除污渍、改进白度并消除恶臭的那些。

发明内容

我们已经表明，含有RNA酶(特别地核酸内切酶1核糖核酸酶)的组合物对物品(包括织物)具有清洁活性。尽管其他酶已显示可有效去除污垢和污渍，但尚未描述RNA酶的用途。

在一方面，所披露的发明涉及具有RNA酶活性的分离的多肽，这些分离的多肽通常选自含有Pfam PF04231氨基酸结构域并具有RNA酶活性的氨基酸序列。在一些实例中，这些多肽与SEQ ID NO.2和/或3、5和/或6、8和/或9、或者13和/或14中之一具有至少60％序列同一性、或至少60％序列同一性但小于100％序列同一性。一个实施例涉及具有RNA酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：

与下组的SEQ ID NO之一具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，或者

与下组的SEQ ID NO之一具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、但小于100％序列同一性的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；

(b)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6；

(c)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；以及

(d)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。

本发明的多肽不包括来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的Mg²⁺活化的核糖核酸酶，如Nakamura,A.,等人,1992.Gene cloning and characterization of a novelextracellular ribonuclease of Bacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的新型细胞外核糖核酸酶的基因克隆和表征].European Journal of Biochemistry[欧洲生物化学杂志]209,121-127中所述。

在一方面，本发明涉及上述为变体的分离的多肽。这些变体可以具有一个或多个氨基酸取代、缺失、插入、或其组合。这些变体可以是在这些多肽的N-末端、C-末端、或N-末端和C-末端两者的氨基酸的延伸。这些延伸可以是His-或HQ-标签。在一些实例中，这些变体在这些多肽的PF04231结构域之外可以具有氨基酸取代和/或缺失。一方面涉及根据本发明的分离的多肽，其中该分离的多肽是具有从该多肽的C-末端缺失的一个或多个氨基酸的变体，条件是PF04231结构域是完整的。一方面涉及上文和本文所述的分离的多肽用于清洁物品的用途。

在一方面，本发明涉及含有上文和本文所述的多肽中任一个的组合物。一方面涉及组合物，该组合物包含上文和本文所述的分离的多肽以及至少一种清洁组合物组分和/或洗涤剂辅助剂成分。除了具有RNA酶活性的多肽之外，这些组合物还可以含有其他酶，包括DNA酶、蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶、和/或甘露聚糖酶。在某些情况下，那些另外的酶中的一种或多种可以从组合物中特别排除。在一些实施例中，以上列出的酶中的一种或多种可以从本文披露的组合物中特别排除。一方面涉及洗涤剂组合物，该洗涤剂组合物包含上文和本文所述的多肽和洗涤剂辅助剂成分。

在一方面，本发明涉及使用上文和本文所述的多肽或组合物的方法。该物品可以是纺织品。这些方法通常是通过将物品暴露于多肽或组合物从而用于清洁物品的方法。

一方面涉及用于清洁物品的方法，该方法包括使该物品与上文和本文所述的组合物接触。一方面涉及用于洗涤物品的方法，该方法包括：

(a)将该物品暴露于上文和本文所述的组合物；

(b)完成至少一个洗涤周期；以及

(c)任选地，冲洗该纺织品。

一方面涉及上文和本文所述的多肽或组合物用于清洁物品的用途。

在其他方面，本发明涉及编码上文和本文所述的多肽的多核苷酸，包含这些多核苷酸的核酸构建体或表达载体，以及包含这些核酸构建体或表达载体的重组宿主细胞。

附图说明

图1示出了实例1中所述的系统发育树。

图2示出了如实例5中所述的实例实验的结果。

序列综述

SEQ ID NO:1是来自莫哈韦芽孢杆菌(Bacillus mojavensis)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:2是由SEQ ID NO:1编码的全长多肽。

SEQ ID NO:3是衍生自SEQ ID NO:2的成熟多肽。

SEQ ID NO:4是来自枯草芽孢杆菌的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:5是由SEQ ID NO:4编码的全长多肽。

SEQ ID NO:6是衍生自SEQ ID NO:5的成熟多肽。

SEQ ID NO:7是来自短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:8是由SEQ ID NO:7编码的全长多肽。

SEQ ID NO:9是衍生自SEQ ID NO:8的成熟多肽。

SEQ ID NO:10是衍生自SEQ ID.NO:7的编码全长多肽的密码子优化的DNA序列。

SEQ ID NO:11是是由SEQ ID NO:10编码的全长多肽。这与SEQ ID NO:8中所示的蛋白质相同。

SEQ ID NO:12是来自枯草芽孢杆菌斯氏亚种(Bacillus subtilissubsp.spizizenii)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:13是由SEQ ID NO:12编码的全长多肽。

SEQ ID NO:14是衍生自SEQ ID NO:13的成熟多肽。

SEQ ID NO:15是衍生自SEQ ID.NO:12的编码全长多肽的密码子优化的DNA序列。

SEQ ID NO:16是由SEQ ID NO:15编码的全长多肽。这与SEQ ID NO:13中所示的蛋白质相同。

SEQ ID NO:17是来自披发糖多孢菌(Saccharopolyspora hirsuta)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:18是由SEQ ID NO:17编码的全长多肽。

SEQ ID NO:19是衍生自SEQ ID NO:18的成熟多肽。

SEQ ID NO:20是来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:21是由SEQ ID NO:20编码的全长多肽。

SEQ ID NO:22是衍生自SEQ ID NO:21的成熟多肽。

SEQ ID NO:23是来自嗜热一氧化碳链霉菌(Streptomyces thermocarboxydus)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:24是由SEQ ID NO:23编码的全长多肽。

SEQ ID NO:25是衍生自SEQ ID NO:24的成熟多肽。

SEQ ID NO:26是来自地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:27是由SEQ ID NO:26编码的全长多肽。

SEQ ID NO:28是衍生自SEQ ID NO:27的成熟多肽。

SEQ ID NO:29是来自格氏糖多孢菌(Saccharopolyspora gregorii)的编码全长多肽的DNA序列。

SEQ ID NO:30是由SEQ ID NO:29编码的全长多肽。

SEQ ID NO:31是衍生自SEQ ID NO:30的成熟多肽。

SEQ ID NO:32是在一些核酸内切酶1核糖核酸酶多肽中发现的氨基酸基序。

SEQ ID NO:33是在一些核酸内切酶1核糖核酸酶多肽中发现的氨基酸基序。

SEQ ID NO:34是在一些核酸内切酶1核糖核酸酶多肽中发现的氨基酸基序。

SEQ ID NO:35是在一些核酸内切酶1核糖核酸酶多肽中发现的氨基酸基序。

SEQ ID NO:36是来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)的分泌信号氨基酸序列。

定义

术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异可以通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。如果在多肽编码序列内，这些基因变化可以是沉默的(所编码的多肽无变化)或可以编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。

术语“生物膜”意指由其中细胞彼此粘附在一起或粘附至表面(如纺织品、餐具、硬表面)或另一种表面的任何群组的微生物产生的膜。这些粘附细胞通常嵌入细胞外聚合物(EPS)的自生基质中。生物膜EPS是一般由细胞外大分子(例如，DNA、蛋白质和多糖)构成的聚合物团块。生物膜可以形成在活的或非活的表面上。在生物膜中生长的微生物细胞与同一生物的浮游细胞(相比之下，浮游细胞是可以在液体介质中漂浮或浮游的单个细胞)在生理上可以是不同的。生活在生物膜中的细菌可以与同一物种的浮游细菌具有不同的特性，因为膜的密集并且受保护的环境允许它们以不同方式协作和相互作用。微生物的这一环境的一个益处是增加对洗涤剂和抗生素的抗性，因为，密集的细胞外基质和细胞的外层保护群落的内部。

术语“cDNA”意指可以通过从获得自真核或原核细胞的成熟的、剪接的mRNA分子进行反转录而制备的DNA分子。cDNA缺乏可以存在于对应基因组DNA中的内含子序列。初始的初级RNA转录物是mRNA的前体，其要通过一系列的步骤(包括剪接)进行加工，然后呈现为成熟的剪接的mRNA。

术语“编码序列”意指直接指定多肽的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由可读框确定，该可读框以起始密码子(例如ATG、GTG或TTG)开始并且以终止密码子(例如TAA、TAG或TGA)结束。编码序列可为基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。

术语“控制序列”意指表达编码本发明的成熟多肽的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码该多肽的多核苷酸来说可以是原生的(即，来自相同基因)或外源的(即，来自不同基因)，或相对于彼此是原生的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、多腺苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列、以及转录终止子。最少，控制序列包括启动子、以及转录和翻译终止信号。出于引入有利于将控制序列与编码多肽的多核苷酸的编码区连接的特异性限制位点的目的，这些控制序列可以提供有多个接头。

在本上下文中，术语“深度清洁”意指破坏、减少或去除有机组分，如多糖、蛋白质、RNA、DNA、污垢或存在于有机物质(如生物膜)中的其他组分。在一些实例中，减少或去除纺织品/织物中的生物膜是深度清洁。

术语“洗涤剂辅助剂成分”是指不同于本发明的RNA酶的成分。这些另外的辅助剂组分的精确性质及其掺入水平将取决于组合物的物理形式和将在其中使用组合物的操作的性质。适合的辅助剂材料包括但不限于以下描述的组分，如表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合剂、粘土去污剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、和/或颜料。

术语“清洁组分”包括可用于衣物洗涤和餐具洗涤中的任何组分(其不是水)，该组分包括手动餐具洗涤组合物并且包括但不限于表面活性剂、助洗剂、絮凝助剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、酶、酶稳定剂、酶抑制剂、催化材料、漂白活化剂、过氧化氢、过氧化氢源、预形成的过酸、聚合剂、粘土去污剂/抗再沉积剂、增亮剂、抑泡剂、染料、香料、结构弹力剂、织物软化剂、运载体、水溶助剂、助洗剂和共助洗剂、织物调色剂、防沫剂、分散剂、加工助剂、和/或颜料。清洁组分的选择可以包括(用于纺织品护理)有待清洁的纺织品的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度的考虑。术语“洗涤剂组合物”或“清洁组合物”是指用于从有待清洁的物品(如纺织品)去除不希望的化合物的组合物。术语“洗涤剂组合物”和“清洁组合物”在本申请中可互换使用。该清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)可以用于例如清洁纺织品，用于家用清洁和工业清洁两者。这些术语涵盖选择用于希望的特定类型的清洁组合物和产品的形式(例如，液体、凝胶、粉末、颗粒、糊剂、或喷雾组合物)的任何材料/化合物，并且包括但不限于清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)，如液体和/或固体衣物洗涤剂和精细织物洗涤剂；织物清新剂；织物软化剂；以及纺织品和衣物预去污剂/预处理。除了含有本发明的酶之外，该清洁配制品(例如，洗涤剂配制品)还可以含有一种或多种另外的酶(如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶以及甘露聚糖酶、或其任何混合物)，和/或洗涤剂辅助剂成分，如表面活性剂、助洗剂、螯合剂或螯合试剂、漂白系统或漂白组分、聚合物、织物柔顺剂、增泡剂、抑泡剂、染料、香料、晦暗抑制剂、光学增亮剂、杀细菌剂、杀真菌剂、污垢悬浮剂、防蚀剂、酶抑制剂或稳定剂、酶活化剂、一种或多种转移酶、水解酶、氧化还原酶、上蓝剂和荧光染料、抗氧化剂以及增溶剂。

术语“核酸内切酶1核糖核酸酶”是指含有Pfam PF04231结构域并且具有RNA酶活性的多肽。与被称为Pfam PF04231的氨基酸结构域有关的信息可在本披露的其他地方和此处：http://pfam.xfam.org/family/PF04231找到。核酸内切酶1核糖核酸酶中还可以存在其他结构域。

术语“表达”包括涉及多肽产生的任何步骤，包括但不限于：转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰、以及分泌。

术语“表达载体”意指直链或环状DNA分子，其包含编码多肽的多核苷酸并且可操作地连接至提供用于其表达的控制序列。

“His-标签”是指典型地包含至少6个组氨酸残基的多组氨酸标签，其可以添加到N-或C-末端上。His标签在本领域已知用于例如蛋白质纯化，但也可以用于改进低pH值下的溶解度。类似地，如本领域已知的，“HQ-标签”(即组氨酸-谷氨酰胺标签)也可以用于纯化。

术语“宿主细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。

术语“未成熟多肽”意指在翻译之后未处于其最终形式的多肽。例如，未成熟多肽在被认为是成熟多肽之前可能经历翻译后修饰，如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等。在本文中，未成熟多肽可称为全长多肽。

术语“分离的”意指处于自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离的物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子的任何物质，该物质至少部分地从与其性质相关的一种或多种或所有天然存在的成分中去除；(3)相对于自然界中发现的物质通过人工修饰的任何物质；或(4)通过相对于与其天然相关的其他组分增加该物质的量而修饰的任何物质(例如，在宿主细胞中的重组生产；编码该物质的基因的多个拷贝；以及使用比与编码该物质的基因天然相关联的启动子更强的启动子)。分离的物质可以存在于发酵液样品中；例如宿主细胞可以经遗传修饰以表达本发明的多肽。来自该宿主细胞的发酵液将包含分离的多肽。

术语“衣物洗涤”涉及家用衣物洗涤和工业衣物洗涤两者并且意指用含有本发明的清洁或洗涤剂组合物的溶液处理纺织品的过程。衣物洗涤过程可以例如使用例如家用或工业洗衣机进行或可以用手(即手动)进行。

术语“待洗衣物”通常是指弄脏的(例如，具有小于最佳的白度；产生恶臭)家用(例如，衣服、毛巾、床单等)或工业织物物品。

术语“恶臭”意指在清洁物品上不希望的气味。清洁的物品应气味清新并且干净，而没有粘附在该物品上的恶臭。恶臭的一个实例是具有令人不快的气味的化合物，其可以由微生物产生并且被在生物膜内捕获或粘附到生物膜的“胶”上。令人不快的气味的其他实例是附着于已经与人或动物接触的物品的汗味或体味。恶臭的其他实例是来自香味料的气味，其粘附于物品，例如气味强烈的咖喱或其他异国香味料。

术语“成熟多肽”意指在翻译和任何翻译后修饰如N-末端加工、C-末端截短、糖基化作用、磷酸化作用等之后处于其最终形式的多肽。

在本领域中已知的是，宿主细胞可以产生由相同多核苷酸表达的两种或更多种不同的成熟多肽(即，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)的混合物。在本领域中还已知的是，不同的宿主细胞不同地加工多肽，并且因此一个表达多核苷酸的宿主细胞当与另一个表达相同多核苷酸的宿主细胞相比时可以产生不同的成熟多肽(例如，具有不同的C-末端和/或N-末端氨基酸)。

术语“成熟多肽编码序列”意指编码具有RNA酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

术语“微生物”通常意指通过显微镜可见的小的生物。微生物通常以单细胞或细胞集落的形式存在。一些微生物可能是多细胞的。微生物包括原核生物(例如，细菌和古生菌)和真核生物(例如，一些真菌、藻类、原生动物)。在本文中，病毒可以被认为是微生物。

术语“天然存在的”通常意指存在于自然界中且无人为干预的事物。更特别地，“天然存在的”涵盖根据《美国法典》第35篇第101条在美国无法申请专利的事物。在一些实例中，本文披露的多肽可以是天然存在的。在一些实例中，本文披露的多肽可以不是天然存在的。

术语“核酸构建体”意指单链或双链的核酸分子，该核酸分子是从天然存在的基因中分离的，或以原本不存在于自然界中的方式被修饰成包含核酸的区段，或者是合成的，该核酸分子包含一个或多个控制序列。

术语“可操作地连接”意指如下构型，在该构型中，控制序列被放置在相对于多核苷酸的编码序列适当的位置处，使得该控制序列指导该编码序列的表达。

两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的关联度通过参数“序列同一性”来描述。

出于本发明的目的，使用如在EMBOSS包(EMBOSS:The European MolecularBiology Open Software Suite[EMBOSS：欧洲分子生物学开放软件套件],Rice等人,2000,Trends Genet.[遗传学趋势]16:276-277)(优选5.0.0版或更新版本)的尼德尔(Needle)程序中所实施的尼德尔曼-翁施(Needleman-Wunsch)算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]48:443-453)来确定两个氨基酸序列之间的序列同一性。所使用的参数是空位开放罚分10、空位延伸罚分0.5和EBLOSUM62(EMBOSS的BLOSUM62版)取代矩阵。将标记为“最长同一性”的Needle的输出(使用非简化选项(nobrief option)获得)用作同一性百分比并且计算如下：(相同的残基x 100)/(比对长度-比对中的空位总数)。

术语“RNA酶”是术语核糖核酸酶的缩写，其意指催化RNA降解成较小的组分、具有RNA酶活性的核酸酶。核糖核酸酶可以分为内切核糖核酸酶和外切核糖核酸酶。在本发明的一些实施例中，核糖核酸酶可以具有内切核糖核酸酶活性、外切核糖核酸酶活性、或内切核糖核酸酶和外切核糖核酸酶活性。出于本发明的目的，根据实例中所描述的程序确定RNA酶活性。通常，本文披露的RNA酶是多肽并且是酶。在一方面，本发明的多肽具有SEQ ID NO:3、6、9或14中所示的成熟多肽中任一个的至少20％，例如至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或至少100％的RNA酶活性。测量RNA酶活性的测定法通常测量RNA降解成较小的组分的情况。

通常，作为本申请主题的RNA酶是核酸内切酶1核糖核酸酶。核酸内切酶1核糖核酸酶通常通过描述为Pfam PF04231的氨基酸结构域的存在来定义。另外，核酸内切酶1核糖核酸酶中可以存在其他结构域。

术语“纺织品”意指衣服或织物。

术语“变体”意指具有RNA酶活性的、在一个或多个(例如，几个)位置处包含改变(即，取代、插入和/或缺失)的多肽。取代意指用不同的氨基酸替代占据某一位置的氨基酸；缺失意指去除占据某一位置的氨基酸；而插入意指在邻接并且紧随占据某一位置的氨基酸之后添加氨基酸。

术语“白度”是指呈现白色的特性或质量。通常，纺织品的白度可与其清洁度相关。弄脏的物品的深度清洁可以增加该物品的白度。

命名法

出于本披露的目的，命名法[E/Q]或简单的[EQ]意指在该位置的氨基酸可以是谷氨酸(Glu，E)或谷氨酰胺(Gln，Q)。同样，命名法[V/G/A/I]或[VGAI]意指在此位置的氨基酸可以是缬氨酸(Val，V)、甘氨酸(Gly，G)、丙氨酸(Ala，A)或异亮氨酸(Ile，I)，对于如本文所描述的其他组合，依次类推。除非进一步另有限制，否则氨基酸X被这样定义，使得它可以是20种天然氨基酸中的任一种。

RNA酶

本文披露的RNA酶是核酸内切酶1核糖核酸酶。通常，在本披露中，核酸内切酶1核糖核酸酶含有PFAM PF04231氨基酸结构域并具有RNA酶活性。在一些实例中，该核酸内切酶1核糖核酸酶含有本文实例3中所述的氨基酸基序中的一个或多个。

PFAM蛋白质家族数据库是欧洲生物信息学研究所(European BioinformaticsInstitute)(EMBL-EBI)的资源(https://pfam.xfam.org/)。PFAM PF04231结构域是氨基酸结构域。对于包括PF04231的PFAM结构域/家族，选择了一组称为种子的蛋白质序列来定义该家族。对于PF04231，用于定义家族并创建种子比对的种子示于此处：https://pfam.xfam.org/family/PF04231/alignment/seed/html。使用HMMER3软件(http://hmmer.org/)将种子比对用于构建序型隐马尔可夫模型(HMM)(Accelerated profile HMMsearches[加速序型HMM搜索].S.R.Eddy.PLOS[公共科学图书馆]Comp.Biol.[计算生物学杂志],7:e1002195,2011)。PF04231的HMM序型在此处：https://pfam.xfam.org/family/PF04231/hmm。使用HMMER3可以打开HMM文件。该HMM序型用于搜索其他蛋白质序列，所有匹配项得分均大于或等于被认为是PF04231家族成员的策划阈值(称为聚集阈值)(http://pfam.xfam.org/family/PF04231#tabview＝tab6)。随后将这些成员与序型HMM比对，以生成完全比对。

本文披露的分子具有RNA酶活性。通常使用测量RNA降解成较小的组分的测定法来确定RNA酶活性。实例测定法是本领域已知的。本披露的实例中描述了一些实例测定法。

核酸内切酶1核糖核酸酶可来自许多不同的生物。核酸内切酶1核糖核酸酶可来自原核细胞、古生菌或真核细胞。在一些实例中，核酸内切酶1核糖核酸酶来源于微生物。在一些实例中，核酸内切酶1核糖核酸酶可来自真菌。在一些实例中，核酸内切酶1核糖核酸酶可来自细菌。含有PF04231结构域的许多已知多肽的起源可在https://pfam.xfam.org/family/PF04231#tabview＝tab7中找到。

含有PFAM PF04231结构域并且具有RNA酶活性的多肽的一个实例是来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶，该核糖核酸酶已在(Nakamura,A.,等人,1992.Gene cloningand characterization of a novel extracellular ribonuclease of Bacillussubtilis[枯草芽孢杆菌的新型细胞外核糖核酸酶的基因克隆和表征].European Journalof Biochemistry[欧洲生物化学杂志]209,121-127)中描述。

根据本发明的含有Pfam PF04231结构域的多肽的组还包含氨基酸序列NREH(SEQID NO:32)。这种保守结构域是RNA酶(例如，核酸内切酶1核糖核酸酶)的特征，并允许具有相同结构和功能特征(如洗涤性能、生物膜减少能力、深度清洁效果等)的RNA酶分组。可以将包含NREH(SEQ ID NO:32)序列的多肽进一步分成子簇。一个子簇包含氨基酸序列D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)。这些多肽在此被定义为DADP进化枝(D[AEQ]DP；SEQ ID NO:33)的成员。该进化枝涵盖存在于系统发育树的ENDO1 A和ENDO1C分支中的多肽。此类共享相同保守序列的RNA酶多肽还共享一些功能特征，并且一般而言，基序越多并且在系统发育树中的进一步分支越多，则多肽(例如，RNA酶)所共享的功能关系就越多。可以将作为DADP进化枝(D[AEQ]DP；SEQ ID NO:33)的成员的RNA酶多肽进一步分成子簇。一个子簇包含氨基酸序列TDEDP(SEQ ID NO:34)。这些多肽在此被定义为TDED进化枝(TDEDP；SEQ ID NO:34)的成员。该进化枝涵盖存在于系统发育树的ENDO1 A分支中的多肽。可以将作为TDED进化枝(TDEDP；SEQ ID NO:34)的成员的RNA酶多肽进一步分成子簇。这些RNA酶多肽中的一些含有氨基酸序列SHG。TDED进化枝(TDEDP；SEQ ID NO:34)中的一些多肽包含氨基酸序列NREHVWA(SEQID NO:35)。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含氨基酸序列NREH(SEQ ID NO:32)。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含氨基酸序列D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含氨基酸序列TDEDP(SEQ ID NO:34)。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含氨基酸序列SHG。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含氨基酸序列NREHVWA(SEQ ID NO:35)。

本发明的一个实施例涉及分离的多肽，其具有RNA酶活性并且另外包含以下氨基酸序列中的至少一种：NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ ID NO:34)、SHG、和/或NREHVWA(SEQ ID NO:35)。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含以下一种或多种氨基酸序列：NREH(SEQ ID NO:32)和/或氨基酸序列D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含以下一种或多种氨基酸序列：NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)和/或氨基酸序列TDEDP(SEQ ID NO:34)。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含以下一种或多种氨基酸序列：NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ ID NO:34)和/或氨基酸序列SHG。

本发明的一个实施例涉及RNA酶，优选地核酸内切酶1核糖核酸酶，其包含以下一种或多种氨基酸序列：NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ ID NO:34)、SHG和/或氨基酸序列NREHVWA(SEQ ID NO:35)。

在一方面，本文披露的多肽是未成熟的核酸内切酶1核糖核酸酶。特别地，本文披露了：

SEQ ID NO:2是来自莫哈韦芽孢杆菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:2的近似氨基酸47-255。SEQ ID NO:3是SEQ ID NO:2的氨基酸1-262。

SEQ ID NO:5是来自枯草芽孢杆菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:5的近似氨基酸44-253。SEQ ID NO:6是SEQ ID NO:5的氨基酸1-260。

SEQ ID NO:8是来自短小芽孢杆菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:8的近似氨基酸47-255。SEQ ID NO:9是SEQ ID NO:8的氨基酸1-262。

SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:8相同。

SEQ ID NO:13是来自枯草芽孢杆菌斯氏亚种的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:13的近似氨基酸46-255。SEQ ID NO:14是SEQ ID NO:13的氨基酸1-262。

SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:13相同。

SEQ ID NO:18是来自披发糖多孢菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:18的近似氨基酸14-224。SEQ ID NO:19是SEQ ID NO:18的氨基酸1-230。

SEQ ID NO:21是来自地衣芽孢杆菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:21的近似氨基酸27-236。SEQ ID NO:22是SEQ ID NO:21的氨基酸1-248。

SEQ ID NO:24是来自嗜热一氧化碳链霉菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:24的近似氨基酸23-232。SEQ ID NO:25是SEQ ID NO:24的氨基酸1-238。

SEQ ID NO:27是来自地衣芽孢杆菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:27的近似氨基酸27-236。SEQ ID NO:28是SEQ ID NO:27的氨基酸1-248。

SEQ ID NO:30是来自格氏糖多孢菌的全长核酸内切酶1核糖核酸酶。此多肽的含有将该多肽识别为核酸内切酶1核糖核酸酶的结构域的区域包括SEQ ID NO:30的近似氨基酸26-235。SEQ ID NO:31是SEQ ID NO:30的氨基酸1-242。

在一方面，本文披露的多肽是成熟的核酸内切酶1核糖核酸酶多肽。特别地，本文披露了：

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至262。SEQ ID NO:2的氨基酸-26至-1是信号肽。在SEQ ID NO:3中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至260。SEQ ID NO:5的氨基酸-28至-1是信号肽。在SEQ ID NO:6中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸1至262。SEQ ID NO:8的氨基酸-26至-1是信号肽。在SEQ ID NO:9中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸1至262。SEQ ID NO:13的氨基酸-26至-1是信号肽。在SEQ ID NO:14中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:19的氨基酸1至230。SEQ ID NO:18的氨基酸-27至-1是信号肽。在SEQ ID NO:19中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:22的氨基酸1至248。SEQ ID NO:21的氨基酸-25至-1是信号肽。在SEQ ID NO:22中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:25的氨基酸1至238。SEQ ID NO:24的氨基酸-35至-1是信号肽。在SEQ ID NO:25中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:28的氨基酸1至248。SEQ ID NO:27的氨基酸-25至-1是信号肽。在SEQ ID NO:28中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:31的氨基酸1至242。SEQ ID NO:30的氨基酸-27至-1是信号肽。在SEQ ID NO:31中也示出了该成熟多肽。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:3的氨基酸1至262。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:6的氨基酸1至260。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:9的氨基酸1至262。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:14的氨基酸1至262。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:19的氨基酸1至230。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:22的氨基酸1至248。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:25的氨基酸1至238。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:28的氨基酸1至248。

在一方面，该成熟多肽是SEQ ID NO:31的氨基酸1至242。

在一些实施例中，本发明可以是包含氨基酸序列或由其组成的肽，该氨基酸序列与上述成熟多肽中的任一个具有至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。

在一些实施例中，本发明可以是包含氨基酸序列或由其组成的多肽，该氨基酸序列与上述成熟多肽中的任一个具有小于100％的同一性，但至少与如上述情况之一所示的序列具有一样多的同一性(即，60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％)。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:3具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:6具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:9具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:14具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:19具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:22具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:25具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:28具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。

在一些实施例中，本发明涉及包含氨基酸序列的多肽，该氨基酸序列与SEQ IDNO:31具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性。在一些实施例中，本发明可以是包含上述成熟氨基酸序列中任一个的等位基因变体或由其组成的多肽，或者是其具有RNA酶活性的片段。

在一些实施例中，该多肽可以包含上述成熟氨基酸序列中的任一个或由其组成；包含那些氨基酸序列以及N-末端和/或C-末端His-标签和/或HQ-标签中之一或由其组成；包含那些氨基酸序列以及1与10个氨基酸之间的N-末端和/或C-末端延伸中之一或由其组成；或者是其片段，该片段具有RNA酶活性并且具有那些氨基酸序列之一的长度的至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。

在一些实施例中，本发明可以涉及上述成熟多肽中任一个的变体，这些变体在一个或多个(例如，几个)位置处包含取代、缺失和/或插入。在一些实施例中，氨基酸取代、缺失和/或插入的数目多达10个，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个。

与作为本专利申请一部分的序列表中所示的氨基酸序列相比，本发明的核酸内切酶1核糖核酸酶的氨基酸序列的一些变化(例如，当本发明的多肽与序列表中所示的氨基酸序列之一不具有100％同一性时)可如下所述进行描述。

氨基酸改变可以具有微小性质，如不会显著地影响蛋白质的折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；典型地为1-30个氨基酸的小缺失；小的氨基末端或羧基末端延伸，如氨基末端的甲硫氨酸残基；多达20-25个残基的小接头肽；或小的延伸，其通过改变净电荷或另一功能(例如聚组氨酸段、抗原表位或结合结构域)来促进纯化。

保守取代的实例是在下组之内：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸及组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸及缬氨酸)、芳族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸)及小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸及甲硫氨酸)。

多肽中的必需氨基酸可以定义为在不损失RNA酶活性的情况下不能被取代或缺失的氨基酸。可以根据本领域中已知的程序，如定点诱变或丙氨酸扫描诱变来鉴定这些氨基酸。在后一项技术中，在该分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变，并且测试所得分子的RNA酶活性以鉴别对于该分子的活性关键的氨基酸残基。通常，可以通过取代或缺失这些氨基酸，然后测试取代/缺失的分子的RNA酶活性来鉴定这些氨基酸。这些方法是本领域熟知的。当缺失或取代时，导致一些但不是全部RNA酶活性损失的氨基酸可存在于多肽中。

酶或其他生物学相互作用的活性部位可通过对结构的物理分析来确定，如由下述技术确定：核磁共振、晶体学(crystallography)、电子衍射、或光亲和标记，连同对推定的接触位点(contact site)氨基酸进行突变。还可以从与相关多肽的比对来推断必需氨基酸的身份。

可以做出单个或多个氨基酸取代、缺失和/或插入并且使用诱变、重组和/或改组的已知方法进行测试，随后进行相关筛选程序。可以使用的其他方法包括易错PCR、噬菌体展示和区域定向的诱变。

诱变/改组方法可以与高通量、自动化的筛选方法组合以检测由宿主细胞表达的克隆的、诱变的多肽的活性。可从宿主细胞回收编码活性多肽的诱变的DNA分子，并使用本领域的标准方法快速测序。这些方法允许快速确定多肽中各个氨基酸残基的重要性。

多肽可以是杂合多肽，其中一种多肽的一个区域在另一种多肽的一个区域的N-末端或C-末端处融合。

该多肽可以是融合多肽或可切割的融合多肽，其中另一种多肽在本发明多肽的N-末端或C-末端处融合。通过将编码另一种多肽的多核苷酸融合于本发明的多核苷酸来产生融合多肽。用于产生融合多肽的技术是本领域已知的，且包括连接编码多肽的编码序列使得它们符合读框，而且融合多肽的表达处于一个或多个相同的启动子和终止子的控制之下。融合多肽还可以使用内含肽技术来构建，其中融合多肽在翻译后产生。

融合多肽可进一步包含两个多肽之间的切割位点。在融合蛋白分泌之时，位点被切割，从而释放出这两种多肽。

具有RNA酶活性的多肽的来源

具有核酸内切酶1核糖核酸酶活性的多肽可获得自任何生物。在一些实例中，该核酸内切酶1核糖核酸酶获得自微生物。这些微生物可以来自任何属。在一些实例中，该核酸内切酶1核糖核酸酶可获得自真菌或细菌。在本文中，所披露的编码核酸内切酶1核糖核酸酶多肽的多核苷酸获得自以下所述的微生物。换言之，这些微生物可以被认为是RNA酶的天然宿主。然而，RNA酶可获得自其他微生物。在一些实例中，核酸内切酶1核糖核酸酶可获自其中已插入编码RNA酶的多核苷酸的生物(例如，重组生物)。其他生物可以是核酸内切酶1核糖核酸酶的来源。

在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自任何活的生物。在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自真核细胞。在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自古生菌。在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自原核细胞。在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自革兰氏阳性细菌。在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自革兰氏阴性细菌。

在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自芽孢杆菌属(Bacillus)、糖多孢菌属(Saccharopolyspora)或链霉菌属(Streptomyces)的生物。在一方面，本文披露的多核苷酸和/或多肽可获得自莫哈韦芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌斯氏亚种、披发糖多孢菌、地衣芽孢杆菌、嗜热一氧化碳链霉菌、或格氏糖多孢菌。

应理解的是，对于前述物种，本发明涵盖完全和不完全阶段(perfect andimperfect states)，和其他分类学等同物(equivalent)，例如无性型，而与它们已知的种名无关。本领域的技术人员会容易地识别适当等同物的身份。

这些物种的菌株可容易地在许多培养物保藏中心为公众所获得，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)、德国微生物和细胞培养物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，DSMZ)、荷兰菌种保藏中心(Centraalbureau Voor Schimmelcultures，CBS)以及美国农业研究服务专利培养物保藏中心北方地区研究中心(Agricultural Research Service Patent CultureCollection,Northern Regional Research Center，NRRL)。

可以使用以上提到的探针从其他来源，包括从自然界(例如，土壤、堆肥、水等)分离的微生物或直接从天然材料(例如，土壤、堆肥、水等)获得的DNA样品鉴定和获得该多肽。用于从天然生境中直接分离微生物和DNA的技术是本领域熟知的。然后可以通过类似地筛选另一微生物的基因组DNA或cDNA文库或混合的DNA样品来获得编码该多肽的多核苷酸。一旦已经用一个或多个探针检测到编码多肽的多核苷酸，则可以通过利用对本领域的普通技术人员来说已知的多种技术来分离或克隆该多核苷酸。

含有RNA酶的组合物

本发明涉及组合物，优选地清洁组合物，这些组合物包含与一种或多种另外的组分组合的本发明的核酸内切酶1核糖核酸酶。

用于清洁的组合物

通常，本文披露的含有核酸内切酶1RNA酶的组合物以及使用这些组合物的方法可用于清洁。在某些情况下，这些组合物可用于含有有机污渍如体垢(例如，皮脂、汗液、死细胞、细胞碎片)和/或生物膜的物品的深度清洁。在某些情况下，这些组合物可用于污渍/污垢去除，改进白度，防止/减少/去除恶臭，和/或防止或减少污垢再沉积。现有技术中没有描述RNA酶针对此类污渍具有清洁活性。然而：

WO 2004/041988(US 2005/0079594)披露了使用含有酶(其中一种可以是RNA酶)的组合的溶液用于去除生物膜的方法；

WO 2006/031554披露了使用α-淀粉酶(其可以与其他酶(包括RNA酶)组合)用于防止、去除、减少或破坏生物膜的方法；

WO 2008/153805披露了可含有酶的洗涤剂。在许多酶中，披露了RNA酶。

在所有上述披露中，RNA酶被披露为可能包括在组合物中的酶的一大张清单的一部分。没有描述使用RNA酶的效果或结果。在那些披露中没有披露用于在其中披露的方法或组合物中使用的特异性RNA酶。

本发明的一个实施例涉及组合物，优选地清洁组合物(如洗衣组合物)，该组合物包含核酸内切酶1核糖核酸酶和至少一种清洁组分。该清洁组分优选地选自由以下组成的组：表面活性剂、助洗剂、漂白组分和聚合物。本发明的一个实施例涉及组合物，优选地清洁组合物(如洗衣组合物)，该组合物包含RNA酶(优选地核酸内切酶1核糖核酸酶)和至少一种清洁组分，其中该RNA酶包含一个、两个、三个、四个或全部五个氨基酸序列NREH(SEQ IDNO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ ID NO:34)、SHG、和/或NREHVWA(SEQ ID NO:35)。该清洁组分优选地选自由以下组成的组：表面活性剂、助洗剂、漂白组分和聚合物。

本发明的一个实施例涉及组合物，该组合物包含：

a)至少0.001ppm(如至少0.01ppm或至少0.1ppm)的至少一种具有RNA酶(优选地核酸内切酶1核糖核酸酶)活性的多肽，该RNA酶选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:28和SEQ ID NO:31，以及与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽；以及

b)至少一种洗涤剂辅助剂成分。

本发明的一个优选的实施例涉及组合物，该组合物包含：

至少0.001ppm(如至少0.01ppm或至少0.1ppm)的至少一种具有RNA酶活性的多肽，其中该RNA酶选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14，以及与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽；以及

b)至少一种洗涤剂辅助剂成分。

本发明的一个优选的实施例涉及清洁组合物，优选地洗衣组合物，该清洁组合物包含：

a)至少0.001ppm(如至少0.01ppm或至少0.1ppm)的至少一种多肽，该多肽包含RNA酶(优选地核酸内切酶1核糖核酸酶)，其中该RNA酶包含一个、两个、三个、四个或全部五个氨基酸序列NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ ID NO:34)、SHG、和/或NREHVWA(SEQ ID NO:35)；以及

b)至少一种清洁组分，该清洁组分优选地选自由以下组成的组：表面活性剂、助洗剂、漂白组分、聚合物、分散剂和另外的酶。

本发明的一个实施例涉及清洁组合物，该清洁组合物包含：

a)至少0.001ppm(包括至少0.01ppm或至少0.1ppm)的至少一种具有RNA酶(优选地核酸内切酶1)活性的多肽，该RNA酶选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQID NO:9、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28和SEQID NO:31，以及与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽；

b)至少一种清洁组合物组分，该清洁组合物组分优选地选自由以下组成的组：表面活性剂、助洗剂、漂白组分、聚合物、分散剂和另外的酶。本发明的一个实施例涉及清洁组合物，该清洁组合物包含：

a)至少0.001ppm(包括至少0.01ppm或至少0.1ppm)的至少一种具有RNA酶(优选地核酸内切酶1)活性的多肽，其中该RNA酶选自由以下组成的组：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:14，以及与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽；

b)至少一种清洁组合物组分，该清洁组合物组分优选地选自由以下组成的组：表面活性剂、助洗剂、漂白组分、聚合物、分散剂和另外的酶。

清洁组分的选择可以包括(用于纺织品护理)有待清洁的纺织品的类型、污垢的类型和/或程度、进行清洁时的温度以及洗涤剂产品的配制的考虑。尽管根据特定的功能性对以下提及的组分由通用标题进行分类，但是这并不被解释为限制，因为如将被普通技术人员所理解，组分可以包含另外的功能性。

在一些实施例中，除了RNA酶之外，本发明的组合物还可含有洗涤剂/清洁组合物组分和或洗涤剂辅助剂成分。下文描述了这些中的一些的实例。另外的组分(例如，清洁组分)的选择处于技术人员的能力范围内并且包括常规的成分，包括下文所述的示例性非限制性组分。

表面活性剂

该清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)可以包含一种或多种表面活性剂，它们可以是阴离子型和/或阳离子型和/或非离子型和/或半极性型和/或兼性离子型、或其混合物。在特定的实施例中，洗涤剂组合物包括一种或多种非离子表面活性剂和一种或多种阴离子表面活性剂的混合物。该一种或多种表面活性剂典型地以按重量计从约0.1％至60％(如约1％至约40％、或约3％至约20％、或约3％至约10％)的水平存在。基于所希望的清洁应用来选择该一种或多种表面活性剂，并且该一种或多种表面活性剂可以包括本领域中已知的任何一种或多种常规表面活性剂。

当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的阴离子表面活性剂，如从约5％至约30％，包括从约5％至约15％，或从约15％至约20％，或从约20％至约25％的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂的非限制性实例包括硫酸盐和磺酸盐，特别是直链烷基苯磺酸盐(LAS)、LAS的异构体、支链烷基苯磺酸盐(BABS)、苯基链烷磺酸盐、α-烯烃磺酸盐(AOS)、烯烃磺酸盐、链烯烃磺酸盐、链烷-2,3-二基双(硫酸盐)、羟基链烷磺酸盐以及二磺酸盐、烷基硫酸盐(AS)(如十二烷基硫酸钠(SDS))、脂肪醇硫酸盐(FAS)、伯醇硫酸盐(PAS)、醇醚硫酸盐(AES或AEOS或FES，也被称为醇乙氧基硫酸盐或脂肪醇醚硫酸盐)、仲链烷磺酸盐(SAS)、石蜡磺酸盐(PS)、酯磺酸盐、磺化的脂肪酸甘油酯、α-磺基脂肪酸甲酯(α-SFMe或SES)(包括甲酯磺酸盐(MES))、烷基琥珀酸或烯基琥珀酸、十二烯基/十四烯基琥珀酸(DTSA)、氨基酸的脂肪酸衍生物、磺基琥珀酸的二酯和单酯或脂肪酸盐(皂)、及其组合。

当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约1％至约40％的阳离子表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。阳离子表面活性剂的非限制性实例包括烷基二甲基乙醇季胺(ADMEAQ)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、二甲基二硬脂酰氯化铵(DSDMAC)、以及烷基苄基二甲基铵、烷基季铵化合物、烷氧基化季铵(AQA)化合物、酯季铵及其组合。

当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0.2％至约40％的非离子表面活性剂，例如从约0.5％至约30％，特别是从约1％至约20％、从约3％至约10％，如从约3％至约5％、从约8％至约12％或从约10％至约12％。非离子表面活性剂的非限制性实例包括醇乙氧基化物(AE或AEO)、醇丙氧基化物、丙氧基化的脂肪醇(PFA)、烷氧基化的脂肪酸烷基酯(如乙氧基化的和/或丙氧基化的脂肪酸烷基酯)、烷基酚乙氧基化物(APE)、壬基酚乙氧基化物(NPE)、烷基多糖苷(APG)、烷氧基化胺、脂肪酸单乙醇酰胺(FAM)、脂肪酸二乙醇酰胺(FADA)、乙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(EFAM)、丙氧基化的脂肪酸单乙醇酰胺(PFAM)、多羟基烷基脂肪酸酰胺、或葡萄糖胺的N-酰基N-烷基衍生物(葡糖酰胺(GA)、或脂肪酸葡糖酰胺(FAGA))、以及以

和

商品名可获得的产品、及其组合。

当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0.1％至约10％的半极性表面活性剂。半极性表面活性剂的非限制性实例包括氧化胺(AO)，如烷基二甲胺氧化物、N-(椰油基烷基)-N,N-二甲胺氧化物和N-(牛油-烷基)-N,N-双(2-羟乙基)胺氧化物、及其组合。

当被包括在其中时，该洗涤剂将通常含有按重量计从约0.1％至约10％的兼性离子表面活性剂。兼性离子表面活性剂的非限制性实例包括甜菜碱，如烷基二甲基甜菜碱、磺基甜菜碱、及其组合。

在一些实施例中，上述表面活性剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

助洗剂和共助洗剂

该清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)可以含有按重量计约0-65％，如约5％至约50％的洗涤剂助洗剂或共助洗剂、或其混合物。在餐具洗涤洗涤剂中，助洗剂的水平典型地是40％-65％，特别是50％-65％。助洗剂和/或共助洗剂可以特别是与Ca和Mg形成水溶性络合物的螯合试剂。可以利用本领域已知的用于在清洁洗涤剂中使用的任何助洗剂和/或共助洗剂。助洗剂的非限制性实例包括沸石、二磷酸盐(焦磷酸盐)、三磷酸盐如三磷酸钠(STP或STPP)、碳酸盐如碳酸钠、可溶性硅酸盐如偏硅酸钠、层状硅酸盐(例如来自赫斯特公司(Hoechst)的SKS-6)、乙醇胺如2-氨基乙-1-醇(MEA)、二乙醇胺(DEA，也称为2,2’-亚氨基二乙-1-醇)、三乙醇胺(TEA，也称为2,2’,2”-次氮基三乙-1-醇)以及(羧甲基)菊粉(CMI)、及其组合。

洗涤剂组合物还可以含有按重量计0-50％，如约5％至约30％的洗涤剂共助洗剂。洗涤剂组合物可以包括单独的共助洗剂，或与助洗剂(例如沸石助洗剂)组合。共助洗剂的非限制性实例包括聚丙烯酸酯的均聚物或其共聚物，如聚(丙烯酸)(PAA)或共聚(丙烯酸/马来酸)(PAA/PMA)。另外的非限制性实例包括柠檬酸盐、螯合剂(如氨基羧酸盐、氨基多羧酸盐和膦酸盐)、以及烷基琥珀酸或烯基琥珀酸。另外的具体实例包括2,2’,2”-次氨基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、亚氨基二琥珀酸(IDS)、乙二胺-N,N’-二丁二酸(EDDS)、甲基甘氨酸二乙酸(MGDA)、谷氨酸-N,N-二乙酸(GLDA)、1-羟基乙烷-1,1-二膦酸(HEDP)、乙二胺四(亚甲基膦酸)(EDTMPA)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTMPA或DTPMPA)、N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸(EDG)、天冬氨酸-N-单乙酸(ASMA)、天冬氨酸-N,N-二乙酸(ASDA)、天冬氨酸-N-单丙酸(ASMP)、亚氨基二琥珀酸(IDA)、N-(2-磺甲基)-天冬氨酸(SMAS)、N-(2-磺乙基)-天冬氨酸(SEAS)、N-(2-磺甲基)-谷氨酸(SMGL)、N-(2-磺乙基)-谷氨酸(SEGL)、N-甲基亚氨基二乙酸(MIDA)、α-丙氨酸-N,N-二乙酸(α-ALDA)、丝氨酸-N,N-二乙酸(SEDA)、异丝氨酸-N,N-二乙酸(ISDA)、苯丙氨酸-N,N-二乙酸(PHDA)、邻氨基苯甲酸-N,N-二乙酸(ANDA)、磺胺酸-N,N-二乙酸(SLDA)、牛磺酸-N,N-二乙酸(TUDA)以及磺甲基-N,N-二乙酸(SMDA)、N-(2-羟乙基)-亚乙基二胺-N,N’,N”-三乙酸盐(HEDTA)、二乙醇甘氨酸(DEG)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)(DTPMP)、氨基三(亚甲基膦酸)(ATMP)、及其组合和盐。

在一些实施例中，上述助洗剂和/或共助洗剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

漂白系统

该清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)可以含有按重量计0-30％，如约1％至约20％的漂白系统。可以利用包含本领域已知的用于在清洁洗涤剂中使用的组分的任何漂白系统。合适的漂白系统组分包括过氧化氢源；过酸源；和漂白催化剂或增效剂。

过氧化氢源：

合适的过氧化氢源是无机过酸盐，包括碱金属盐(如过碳酸钠和过硼酸钠(通常是一水合物或四水合物))，以及过氧化氢―尿素(1/1)。

过酸源：

过酸可以是(a)直接作为预形成过酸掺入，或(b)从过氧化氢和漂白活化剂(过水解)在洗涤液中原位形成，或(c)从过氧化氢和过水解酶和后者合适的底物(例如酯)在洗涤液中原位形成。

a)合适的预形成过酸包括但不限于过氧羧酸(如过氧苯甲酸)及其环取代的衍生物、过氧-α-萘甲酸、过氧邻苯二甲酸、过氧月桂酸、过氧硬脂酸、ε-邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸[邻苯二甲酰亚氨基过氧己酸(PAP)]、和邻-羧基苯甲酰氨基过氧己酸；脂族和芳族二过氧二羧酸，如二过氧十二烷二酸、二过氧壬二酸、二过氧癸二酸、二过氧巴西基酸、2-癸基二过氧丁二酸、以及二过氧邻苯二甲酸、-间苯二甲酸和-对苯二甲酸；过亚氨酸；过氧单硫酸；过氧二硫酸；过氧磷酸；过氧硅酸；以及所述化合物的混合物。应理解的是，在一些情况下，所提到的过酸可能最好是作为合适的盐添加，如碱金属盐(例如

)或碱土金属盐。

b)合适的漂白活化剂包括属于酯、酰胺、酰亚胺、腈类或酸酐类别的那些，以及适用时，其盐。合适的实例是四乙酰基乙二胺(TAED)、4-[(3,5,5-三甲基己酰基)氧基]苯-1-磺酸钠(ISONOBS)、4-(十二酰基氧基)苯-1-磺酸钠(LOBS)、4-(癸酰基氧基)苯-1-磺酸钠、4-(癸酰基氧基)苯甲酸(DOBA)、4-(壬酰基氧基)苯-1-磺酸钠(NOBS)和/或披露于WO 98/17767中的那些。目的漂白活化剂的特定家族披露于EP 624154中并且在该家族中特别优选的是乙酰柠檬酸三乙酯(ATC)。ATC或短链甘油三酸酯(像三醋精)具有它们是环境友好的优点。此外，乙酰柠檬酸三乙酯和三醋精在储存时在产品中具有良好的水解稳定性，并且是有效的漂白活化剂。最后，ATC是多功能的，因为在过水解反应中释放的柠檬酸盐可以作为助洗剂起作用。

在一些实施例中，上述组分中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

漂白催化剂和增效剂

该漂白系统还可以包括漂白催化剂或增效剂。

可以用于本发明组合物中的漂白催化剂的一些非限制性实例包括草酸锰、乙酸锰、锰胶原、钴-胺催化剂和锰三氮杂环壬烷(MnTACN)催化剂；特别优选的是锰与1,4,7-三甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me3-TACN)或1,2,4,7-四甲基-1,4,7-三氮杂环壬烷(Me4-TACN)的络合物，特别是Me3-TACN，如双核锰络合物[(Me3-TACN)Mn(O)3Mn(Me3-TACN)](PF6)2、和[2,2',2”-次氮基三(乙烷-1,2-二基氮烷基亚基-κN-甲基亚基)三酚并-κ3O]锰(III)。这些漂白催化剂还可以是其他金属化合物，如铁或钴络合物。

在其中过酸源包括在内的一些实施例中，可以使用具有下式之一的有机漂白催化剂或漂白增效剂：

或(iii)及其混合物；其中每个R1独立地是含有从9至24个碳的支链烷基基团或含有从11至24个碳的直链烷基基团，优选地每个R1独立地是含有从9至18个碳的支链烷基基团或含有从11至18个碳的直链烷基基团，更优选地每个R1独立地选自由以下组成的组：2-丙基庚基、2-丁基辛基、2-戊基壬基、2-己基癸基、十二烷基、十四烷基、十六烷基、十八烷基、异壬基、异癸基、异十三烷基以及异十五烷基。

本领域中描述了其他示例性漂白系统。合适的光漂白剂可以例如是磺化的酞菁锌或酞菁铝。

在一些实施例中，上述漂白催化剂和/或增效剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

金属护理剂

金属护理剂可以防止或减少金属的锈蚀、腐蚀或氧化，这些金属包括铝、不锈钢和非铁金属，如银和铜。合适的实例包括以下的一个或多个：

(a)苯并三唑类，包括苯并三唑或双-苯并三唑及其取代的衍生物。苯并三唑衍生物是其中芳环上可获得的取代位点被部分或完全取代的那些化合物。合适的取代基包括直链或支链Ci-C20-烷基基团(例如C1-C20-烷基基团)和羟基、硫代、苯基或卤素(例如氟、氯、溴和碘)。

(b)选自下组的金属盐和络合物，该组由以下组成：锌、锰、钛、锆、铪、钒、钴，镓和铯盐和/或络合物，这些金属处于氧化态II、III、IV、V或VI之一。在一方面，合适的金属盐和/或金属络合物可以选自下组，该组由以下组成：Mn(II)硫酸盐、Mn(II)柠檬酸盐、Mn(II)硬脂酸盐、Mn(II)乙酰丙酮酸盐、K^TiF6(例如，K2TiF6)、K^ZrF6(例如，K2ZrF6)、CoSO4、Co(NOs)2和Ce(NOs)3、锌盐，例如，硫酸锌、水锌矿、或乙酸锌；

(c)硅酸盐，包括硅酸钠或硅酸钾、二硅酸钠、偏硅酸钠、结晶页硅酸盐及其混合物。

本领域中披露了用作银/铜腐蚀抑制剂的另外合适的有机和无机氧化还原活性物质。优选地，本发明的组合物包含按重量计从0.1％至5％的金属护理剂的组合物，优选地该金属护理剂是锌盐。

在一些实施例中，上述金属护理剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

水溶助剂

该清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)可以含有按重量计0-10％，例如按重量计0-5％，如约0.5％至约5％、或约3％至约5％的水溶助剂。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何水溶助剂。水溶助剂的非限制性实例包括苯磺酸钠、对甲苯磺酸钠(STS)、二甲苯磺酸钠(SXS)、枯烯磺酸钠(SCS)、伞花烃磺酸钠、氧化胺、醇和聚乙二醇醚、羟基萘甲酸钠、羟基萘磺酸钠、乙基己基磺酸钠、及其组合。

在一些实施例中，上述水溶助剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

聚合物

该清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)可以含有按重量计0-10％，如0.5％-5％、2％-5％、0.5％-2％或0.2％-1％的聚合物。可以利用本领域中已知的用于在洗涤剂中使用的任何聚合物。该聚合物可以作为如上文提到的共助洗剂起作用，或可以提供抗再沉积、纤维保护、污垢释放、染料转移抑制、油脂清洁和/或防沫特性。一些聚合物可以具有多于一种的上文提到的特性和/或多于一种的下文提到的基序。示例性聚合物包括(羧甲基)纤维素(CMC)、聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙烯吡咯烷酮)(PVP)、聚(乙二醇)或聚(环氧乙烷)(PEG)、乙氧基化的聚(亚乙基亚胺)、羧甲基菊粉(CMI)、和聚羧化物，如PAA、PAA/PMA、聚-天冬氨酸、和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物、疏水修饰的CMC(HM-CMC)和硅酮、对苯二甲酸和低聚乙二醇的共聚物、聚(对苯二甲酸乙二酯)和聚(氧乙烯对苯二甲酸乙二酯)的共聚物(PET-POET)、PVP、聚(乙烯基咪唑)(PVI)、聚(乙烯吡啶-N-氧化物)(PVPO或PVPNO)以及聚乙烯吡咯烷酮-乙烯基咪唑(PVPVI)。合适的实例包括PVP-K15、PVP-K30、来自Ashl和Aqualon的ChromaBond S-400、ChromaBond S-403E和Chromabond S-100，以及来自BASF的

HP 165、

HP 50(分散剂)、

HP 53(分散剂)、

HP 59(分散剂)、

HP 56(染料转移抑制剂)、

HP 66K(染料转移抑制剂)。另外的示例性聚合物包括磺化的聚羧酸酯、聚环氧乙烷和聚环氧丙烷(PEO-PPO)以及乙氧基硫酸二季铵盐。其他示例性聚合物披露于例如WO2006/130575中。还考虑了以上提到的聚合物的盐。特别优选的聚合物是来自BASF的乙氧基化的均聚物

HP 20，其有助于防止洗涤液中的污垢再沉积。

在一些实施例中，上述聚合物中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

织物调色剂

本发明的清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)还可以包括织物调色剂，如染料或颜料，当配制在洗涤剂组合物中时，当所述织物与洗涤液接触时织物调色剂可以沉积在织物上，该洗涤液包含所述洗涤剂组合物，并且因此通过可见光的吸收/反射改变所述织物的色彩。荧光增白剂发射至少一些可见光。相比之下，当织物调色剂吸收至少部分可见光谱时，它们改变表面的色彩。合适的织物调色剂包括染料和染料-粘土轭合物，并且还可以包括颜料。合适的染料包括小分子染料和聚合物染料。合适的小分子染料包括选自下组的小分子染料，该组由落入颜色索引(Colour Index)(C.I.)分类的以下染料组成：直接蓝、直接红、直接紫、酸性蓝、酸性红、酸性紫、碱性蓝、碱性紫和碱性红、或其混合物。洗涤剂组合物优选地包含从约0.00003wt％至约0.2wt％、从约0.00008wt％至约0.05wt％、或甚至从约0.0001wt％至约0.04wt％的织物调色剂。该组合物可以包含从0.0001wt％至0.2wt％的织物调色剂，当该组合物处于单位剂量袋的形式时，这可以是尤其优选的。本领域中描述了其他合适的调色剂。

在一些实施例中，上述织物调色剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

酶

洗涤剂添加剂连同清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)可以包括一种或多种另外的酶，如至少一种脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶，例如漆酶、和/或过氧化物酶。

一般而言，所选的一种或多种酶的特性应与所选的洗涤剂相容(即，最适pH、与其他酶和非酶成分的相容性等)，并且该一种或多种酶应以有效量存在。在一些实施例中，以上列出的酶中的一种或多种可以从本文披露的组合物中特别排除。

下文描述了另外的酶的实例。

纤维素酶

合适的纤维素酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。合适的纤维素酶包括来自芽孢杆菌属、假单胞菌属(Pseudomonas)、腐质霉属(Humicola)、镰孢属(Fusarium)、梭孢壳属(Thielavia)、枝顶孢霉属(Acremonium)的纤维素酶，例如由特异腐质霉(Humicola insolens)、嗜热毁丝霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)产生的真菌纤维素酶。

尤其合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的碱性或中性纤维素酶。

其他纤维素酶是具有以下序列的内切-β-1,4-葡聚糖酶，该序列与WO 2002/099091的SEQ ID NO:2的位置1至位置773的氨基酸序列具有至少97％同一性，或具有以下序列的家族44木葡聚糖酶，该序列与WO 2001/062903的SEQ ID NO:2的位置40-559具有至少60％同一性。

可商购的纤维素酶包括Celluzyme^TM和Carezyme^TM(诺维信公司(Novozymes A/S))、Carezyme Premium^TM(诺维信公司)、Celluclean^TM(诺维信公司)、CellucleanClassic^TM(诺维信公司)、Cellusoft^TM(诺维信公司)、Whitezyme^TM(诺维信公司)、Clazinase^TM、Puradax HA^TM(杰能科国际有限公司(Genencor International Inc.))、以及KAC-500(B)^TM(花王株式会社(Kao Corporation))。

在一些实施例中，一种或多种纤维素酶可以从本文披露的组合物中排除。

甘露聚糖酶

合适的甘露聚糖酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学或遗传修饰的突变体。甘露聚糖酶可以是家族5或26的碱性甘露聚糖酶。它可以是来自芽孢杆菌属或腐质霉属的野生型，特别是粘琼脂芽孢杆菌(B.agaradhaerens)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或特异腐质霉(H.insolens)。可商购的甘露聚糖酶是Mannaway(诺维信公司)。

在一些实施例中，一种或多种甘露聚糖酶可以从本文披露的组合物中排除。

过氧化物酶/氧化酶

合适的过氧化物酶包括包含由国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会(Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry andMolecular Biology)陈述的酶分类EC 1.11.1.7，或源自其中的展示出过氧化物酶活性的任何片段的过氧化物酶。

合适的过氧化物酶/氧化酶包括植物、细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。有用的过氧化物酶的实例包括来自鬼伞属(Coprinus)(例如，来自灰盖鬼伞(C.cinereus))的过氧化物酶及其变体。可商购的过氧化物酶包括Guardzyme^TM(诺维信公司)。

合适的过氧化物酶包括卤代过氧化物酶，如氯过氧化物酶、溴过氧化物酶以及表现出氯过氧化物酶或溴过氧化物酶活性的化合物。根据其对卤素离子的特异性将卤代过氧化物酶进行分类。氯过氧化物酶(E.C.1.11.1.10)催化从氯离子形成次氯酸盐。优选地，该卤代过氧化物酶是钒卤代过氧化物酶，即含钒酸盐的卤代过氧化物酶。已从许多不同真菌，特别是从暗色丝孢菌(dematiaceous hyphomycete)真菌组中分离出了卤代过氧化物酶，如卡尔黑霉属(Caldariomyces)(例如，煤卡尔黑霉(C.fumago))、链格孢属(Alternaria)、弯孢属(Curvularia)(例如，疣枝弯孢(C.verruculosa)和不等弯孢(C.inaequalis))、内脐蠕孢属(Drechslera)、细基格孢属(Ulocladium)以及葡萄孢属(Botrytis)。

还已从细菌，如假单胞菌属(例如吡咯假单胞菌(P.pyrrocinia))和链霉菌属(例如，金色链霉菌(S.aureofaciens))中分离出了卤代过氧化物酶。

合适的氧化酶特别地包括由酶分类EC 1.10.3.2所包含的任何漆酶或源自其的展现出漆酶活性的任何片段、或展现出类似活性的化合物，如儿茶酚氧化酶(EC 1.10.3.1)、邻氨基苯酚氧化酶(EC 1.10.3.4)或胆红素氧化酶(EC 1.3.3.5)。优选的漆酶是微生物来源的酶。这些酶可以来源于植物、细菌或真菌(包括丝状真菌和酵母)。来自真菌的合适的实例包括来源于以下的菌株的漆酶：曲霉属(Aspergillus)、链孢菌属(Neurospora)(例如，粗糙链孢菌(N.crassa))、柄孢壳菌属(Podospora)、葡萄孢属、金钱菌属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)，香菇属(Lentinus)，侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)(例如，长绒毛栓菌(T.villosa)和变色栓菌(T.versicolor))、丝核菌属(Rhizoctonia)(例如，立枯丝核菌(R.solani))，拟鬼伞属(Coprinopsis)(例如，灰盖拟鬼伞(C.cinerea)、毛头拟鬼伞(C.comatus)、弗瑞氏拟鬼伞(C.friesii)及弗瑞氏拟鬼伞(C.plicatilis))、小脆柄菇属(Psathyrella)(例如，白黄小脆柄菇(P.condelleana))、斑褶菇属(Panaeolus)(例如，蝶形斑褶菇(P.papilionaceus))，毁丝霉属(Myceliophthora)(例如，嗜热毁丝霉)，柱顶孢属(Schytalidium)(例如，嗜热柱顶孢(S.thermophilum))、多孔菌属(Polyporus)(例如，匹斯特斯多孔菌(P.pinsitus))、射脉菌属(Phlebia)(例如，射脉侧菌(P.radiata))、或革盖菌属(Coriolus)(例如，毛革盖菌(C.hirsutus))。来自细菌的合适的实例包括可来源于芽孢杆菌属的菌株的漆酶。优选的是来源于拟鬼伞属或毁丝霉属的漆酶；特别是来源于灰盖拟鬼伞(Coprinopsis cinerea)或来源于嗜热毁丝霉的漆酶。

在一些实施例中，一种或多种过氧化物酶和/或氧化酶可以从本文披露的组合物中排除。

脂肪酶和角质酶

合适的脂肪酶和角质酶包括细菌或真菌来源的那些。包括化学修饰的突变体酶或蛋白质工程化的突变体酶。实例包括来自嗜热丝孢菌属(Thermomyces)(例如来自疏绵状嗜热丝孢菌(T.lanuginosus)(以前命名为柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa))的脂肪酶、来自腐质霉属(例如特异腐质霉)的角质酶、来自假单胞菌属(这些中的一些现在重命名为伯克霍尔德菌属(Burkholderia))的菌株的脂肪酶(例如，产碱假单胞菌(P.alcaligenes)或类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligene))、洋葱假单胞菌(P.cepacia)、假单胞菌属菌株SD705、威斯康星假单胞菌(P.wisconsinensis)、GDSL型链霉菌属脂肪酶、来自稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)的角质酶、来自门多萨假多胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶、来自嗜热裂孢菌(Thermobifida fusca)的脂肪酶、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)脂肪酶、来自枯草芽孢杆菌的脂肪酶、以及来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)和始旋链霉菌(S.pristinaespiralis)的脂肪酶。

其他实例是本领域中描述的脂肪酶变体。

优选的商业化脂肪酶产品包括Lipolase^TM、Lipex^TM；Lipolex^TM和Lipoclean^TM(诺维信公司)，Lumafast(来自杰能科公司(Genencor))以及Lipomax(来自吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-Brocades))。

再其他实例是有时称为酰基转移酶或过水解酶的脂肪酶，例如与南极假丝酵母(Candida antarctica)脂肪酶A具有同源性的酰基转移酶、来自耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的酰基转移酶、来自CE 7家族的过水解酶以及耻垢分枝杆菌过水解酶的变体(特别是来自亨斯迈纺织品染化有限公司(Huntsman Textile EffectsPte Ltd)的商业产品Gentle Power Bleach中所用的S54V变体)。

在一些实施例中，一种或多种脂肪酶和/或角质酶可以从本文披露的组合物中排除。

淀粉酶

合适的淀粉酶包括α-淀粉酶和/或葡糖淀粉酶并且可以是细菌或真菌来源的。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。淀粉酶包括例如从芽孢杆菌属、例如地衣芽孢杆菌的特定菌株(更详细地描述于GB 1,296,839中)获得的α-淀粉酶。

合适的淀粉酶包括具有WO 1995/010603中的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQ IDNO:3具有90％序列同一性的变体。优选的变体描述于WO 1994/002597、WO 1994/018314、WO1997/043424中以及WO 1999/019467的SEQ ID NO:4中，例如在以下位置的一个或多个中具有取代的变体：15、23、105、106、124、128、133、154、156、178、179、181、188、190、197、201、202、207、208、209、211、243、264、304、305、391、408和444。

不同的合适的淀粉酶包括具有WO 2002/010355中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在位置181和182中具有缺失并且在位置193中具有取代的那些。

其他合适的淀粉酶是包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)的α-淀粉酶的残基1-33和示于WO 2006/066594的SEQ IDNO:4中的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的残基36-483的杂合α-淀粉酶或其具有90％序列同一性的变体。此杂合α-淀粉酶的优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：G48、T49、G107、H156、A181、N190、M197、I201、A209和Q264。包含示于WO 2006/066594的SEQ ID NO:6中的来源于解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶的残基1-33和SEQ ID NO:4的残基36-483的杂合α-淀粉酶的最优选的变体是具有以下取代的那些：

M197T；

H156Y+A181T+N190F+A209V+Q264S；或者

G48A+T49I+G107A+H156Y+A181T+N190F+I201F+A209V+Q264S。

另外的合适的淀粉酶是具有WO 1999/019467中的SEQ ID NO:6的淀粉酶或其与SEQ ID NO:6具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:6的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R181、G182、H183、G184、N195、I206、E212、E216和K269。特别优选的淀粉酶是在位置R181和G182、或位置H183和G184中具有缺失的那些。

可以使用的另外的淀粉酶是具有WO 1996/023873的SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的那些或其与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQID NO:7具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:7的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：140、181、182、183、184、195、206、212、243、260、269、304和476，使用WO 96/023873的SEQ ID 2进行编号。更优选的变体是在选自181、182、183和184的两个位置(例如181和182、182和183、或位置183和184)中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:7的最优选的淀粉酶变体是在位置183和184中具有缺失并且在位置140、195、206、243、260、304和476中的一个或多个中具有取代的那些。

可以使用的其他淀粉酶是具有WO 2008/153815的SEQ ID NO:2、WO 2001/066712中的SEQ ID NO:10的淀粉酶或其与WO 2008/153815的SEQ ID NO:2具有90％序列同一性或与WO 2001/066712中的SEQ ID NO:10具有90％序列同一性的变体。WO 2001/066712中的SEQ ID NO:10的优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：176、177、178、179、190、201、207、211和264。

另外的合适的淀粉酶是具有WO 2009/061380的SEQ ID NO:2的淀粉酶或其与SEQID NO:2具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:2的优选的变体是在以下位置中的一个或多个中具有C-末端截短和/或取代、缺失或插入的那些：Q87、Q98、S125、N128、T131、T165、K178、R180、S181、T182、G183、M201、F202、N225、S243、N272、N282、Y305、R309、D319、Q320、Q359、K444和G475。SEQ ID NO:2的更优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：Q87E,R、Q98R、S125A、N128C、T131I、T165I、K178L、T182G、M201L、F202Y、N225E,R、N272E,R、S243Q,A,E,D、Y305R、R309A、Q320R、Q359E、K444E以及G475K，和/或在位置R180和/或S181或T182和/或G183处具有缺失的那些。SEQ ID NO:2的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；

N128C+K178L+T182G+F202Y+Y305R+D319T+G475K；

S125A+N128C+K178L+T182G+Y305R+G475K；或者

S125A+N128C+T131I+T165I+K178L+T182G+Y305R+G475K，其中这些变体是C-末端截短的，并且任选地进一步包含在位置243处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。

另外的合适的淀粉酶是具有WO 2013/184577的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：K176、R178、G179、T180、G181、E187、N192、M199、I203、S241、R458、T459、D460、G476和G477。SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：K176L、E187P、N192FYH、M199L、I203YF、S241QADN、R458N、T459S、D460T、G476K、以及G477K，和/或在位置R178和/或S179或T180和/或G181中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

E187P+I203Y+G476K

E187P+I203Y+R458N+T459S+D460T+G476K

其中变体任选地进一步包含在位置241处的取代和/或在位置178和/或位置179处的缺失。

另外的合适的淀粉酶是具有WO 2010/104675的SEQ ID NO:1的淀粉酶或其与SEQID NO:1具有90％序列同一性的变体。SEQ ID NO:1的优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：N21、D97、V128、K177、R179、S180、I181、G182、M200、L204、E242、G477和G478。SEQ ID NO:1的更优选的变体是在以下位置的一个或多个中具有取代的那些：N21D、D97N、V128I、K177L、M200L、L204YF、E242QA、G477K、以及G478K，和/或在位置R179和/或S180或I181和/或G182中具有缺失的那些。SEQ ID NO:1的最优选的淀粉酶变体是具有以下取代的那些：

N21D+D97N+V128I

其中变体任选地进一步包含在位置200处的取代和/或在位置180和/或位置181处的缺失。

其他合适的淀粉酶是具有WO 2001/066712中的SEQ ID NO:12的α-淀粉酶或与SEQID NO:12具有至少90％序列同一性的变体。优选的淀粉酶变体是在WO 2001/066712中的SEQ ID NO:12的以下位置的一个或多个中具有取代、缺失或插入的那些：R28、R118、N174；R181、G182、D183、G184、G186、W189、N195、M202、Y298、N299、K302、S303、N306、R310、N314；R320、H324、E345、Y396、R400、W439、R444、N445、K446、Q449、R458、N471、N484。特别优选的淀粉酶包括具有D183和G184的缺失并且具有取代R118K、N195F、R320K和R458K的变体，以及另外在一个或多个选自下组的位置中具有取代的变体：M9、G149、G182、G186、M202、T257、Y295、N299、M323、E345和A339，最优选的是另外在所有这些位置中具有取代的变体。

其他实例是例如描述于WO 2011/098531、WO 2013/001078及WO 2013/001087中的那些淀粉酶变体。

可商购淀粉酶是Duramyl^TM、Termamyl^TM、Fungamyl^TM、Stainzyme^TM、StainzymePlus^TM、Natalase^TM、Liquozyme X和BANTM(来自诺维信公司)，以及Rapidase^TM、Purastar^TM/Effectenz^TM、Powerase、Preferenz S1000、Preferenz S100和Preferenz S110(来自杰能科国际有限公司/杜邦公司(DuPont))。

在一些实施例中，一种或多种淀粉酶可以从本文披露的组合物中排除。

蛋白酶

合适的蛋白酶包括细菌、真菌、植物、病毒或动物来源的那些，例如植物或微生物来源。优选微生物来源。包括化学修饰的突变体或蛋白质工程化的突变体。它可以是碱性蛋白酶，如丝氨酸蛋白酶或金属蛋白酶。丝氨酸蛋白酶可以例如是S1家族(如胰蛋白酶)或S8家族(如枯草杆菌蛋白酶)。金属蛋白酶蛋白酶可以例如是来自例如M4家族的嗜热菌蛋白酶或其他金属蛋白酶，如来自M5、M7或M8家族的那些。

术语“枯草杆菌酶”是指根据Siezen等人,Protein Engng.[蛋白质工程]4(1991)719-737和Siezen等人,Protein Science[蛋白质科学]6(1997)501-523的丝氨酸蛋白酶亚组。丝氨酸蛋白酶是特征为在活性位点具有与底物形成共价加合物的丝氨酸的蛋白酶的亚组。枯草杆菌酶可以被划分为6个亚类，即，枯草杆菌蛋白酶家族、嗜热蛋白酶家族、蛋白酶K家族、羊毛硫氨酸抗生素肽酶家族、Kexin家族和Pyrolysin家族。

枯草杆菌酶的实例是来源于芽孢杆菌属的那些，例如迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和吉氏芽孢杆菌(Bacillus gibsonii)；以及迟缓枯草杆菌蛋白酶(subtilisin lentus)、枯草杆菌蛋白酶Novo、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、地衣芽孢杆菌、枯草杆菌蛋白酶BPN’、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和枯草杆菌蛋白酶168以及描述于(WO 1993/018140)中的蛋白酶PD138。其他有用的蛋白酶可以是描述于WO 1992/175177、WO 2001/016285、WO 2002/026024以及WO 2002/016547中的那些。胰蛋白酶样蛋白酶的实例是胰蛋白酶(例如猪或牛来源的)和镰孢属蛋白酶，以及来源于纤维单胞菌(Cellumonas)的胰凝乳蛋白酶。

另一个优选的蛋白酶是来自迟缓芽孢杆菌DSM 5483的碱性蛋白酶及其变体。

金属蛋白酶的实例是中性金属蛋白酶，如来源于解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)的那些。

有用的蛋白酶的实例是描述于以下中的变体：WO 1992/019729、WO 1996/034946、WO 98/20115、WO 98/20116、WO 99/011768、WO 01/44452、WO 03/006602、WO 04/03186、WO04/041979、WO 07/006305、WO 11/036263、WO 11/036264，尤其是在以下一个或多个位置中具有取代的变体：3、4、9、15、24、27、42、55、59、60、66、74、85、96、97、98、99、100、101、102、104、116、118、121、126、127、128、154、156、157、158、161、164、176、179、182、185、188、189、193、198、199、200、203、206、211、212、216、218、226、229、230、239、246、255、256、268和269，其中这些位置对应于WO 2016/001449的SEQ ID NO 1中示出的迟缓芽孢杆菌蛋白酶的位置。更优选的枯草杆菌酶变体可以包括以下突变中的一个或多个：S3T、V4I、S9R、S9E、A15T、S24G、S24R、K27R、N42R、S55P、G59E、G59D、N60D、N60E、V66A、N74D、N85S、N85R、、G96S、G96A、S97G、S97D、S97A、S97SD、S99E、S99D、S99G、S99M、S99N、S99R、S99H、S101A、V102I、V102Y、V102N、S104A、G116V、G116R、H118D、H118N、N120S、S126L、P127Q、S128A、S154D、A156E、G157D、G157P、S158E、Y161A、R164S、Q176E、N179E、S182E、Q185N、A188P、G189E、V193M、N198D、V199I、Y203W、S206G、L211Q、L211D、N212D、N212S、M216S、A226V、K229L、Q230H、Q239R、N246K、N255W、N255D、N255E、L256E、L256D、T268A、R269H。这些蛋白酶变体优选地是在WO 2016/001449的SEQ ID NO 1中示出的迟缓芽孢杆菌蛋白酶

的变体、在WO 2016/001449的SEQ ID NO 2中示出的解淀粉芽孢杆菌蛋白酶(BPN’)的变体。这些蛋白酶变体与WO 2016/001449的SEQ ID NO 1或SEQ ID NO 2优选地具有至少80％序列同一性。

在以下一个或多个位置(对应于WO 2004/067737的SEQ ID NO:1的位置171、173、175、179或180)处包含取代的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶变体与WO 2004/067737的SEQID NO:1具有至少75％但小于100％的序列同一性。

合适的可商购蛋白酶包括以下列商品名出售的那些：

Duralase^TM、Durazym^TM、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

Ultra、

Blaze

100T、Blaze

125T、Blaze

150T、

和

(诺维信公司)，以下列商品名出售的那些：

Purafect

Purafect

ExcellenzP1000TM、Excellenz P1250TM、

Preferenz P100TM、Purafect

Preferenz P110TM、Effectenz P1000TM、

TM、Effectenz P1050TM、Purafect

TM、Effectenz P2000TM、

和

(丹斯尼克公司(Danisco)/杜邦公司)、AxapemTM(吉斯特布罗卡德斯公司(Gist-BrocasesN.V.))、BLAP(在US5352604的图29中所示的序列)及其变体(汉高股份(Henkel AG))、以及来自花王株式会社(Kao)的KAP(嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)枯草杆菌蛋白酶)。

在一些实施例中，一种或多种蛋白酶可以从本文披露的组合物中排除。

分散剂

本发明的洗涤剂组合物还可以包含分散剂。特别地，粉末洗涤剂可以包含分散剂。合适的水溶性有机材料包括均聚合或共聚合的酸或其盐，其中聚羧酸包含被不多于两个碳原子彼此分开的至少两个羧基。适合的分散剂例如描述于Powdered Detergents[粉末洗涤剂],Surfactant science series[表面活性剂科学系列],第71卷,Marcel Dekker[马塞尔德克尔公司]中。

在一些实施例中，上述分散剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

染料转移抑制剂

本发明的清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)还可以包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的聚合物染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、多胺N-氧化物聚合物、N-乙烯吡咯烷酮与N-乙烯基咪唑的共聚物、聚乙烯噁唑烷酮以及聚乙烯咪唑或其混合物。当在主题组合物中存在时，染料转移抑制剂可以按该组合物的重量计以从约0.0001％至约10％、从约0.01％至约5％或甚至从约0.1％至约3％的水平存在。

在一些实施例中，上述染料转移抑制剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

荧光增白剂

本发明的清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)还将优选地包含另外的组分，这些组分可以给正在清洁的物品着色，例如荧光增白剂或光学增亮剂。当存在时，该增亮剂优选地以约0.01％至约0.5％的水平存在。在本发明的组合物中可以使用合适用于在衣物洗涤剂组合物中使用的任何荧光增白剂。最常用的荧光增白剂是属于以下类别的那些：二氨基芪-磺酸衍生物、二芳基吡唑啉衍生物和二苯基-联苯乙烯基衍生物。荧光增白剂的二氨基芪-磺酸衍生物型的实例包括以下的钠盐：4,4'-双-(2-二乙醇氨基-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2,4-二苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2.2'-二磺酸盐、4,4'-双-(2-苯胺基-4-(N-甲基-N-2-羟基-乙基氨基)-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐、4,4'-双-(4-苯基-1,2,3-三唑-2-基)芪-2,2'-二磺酸盐以及5-(2H-萘并[1,2-d][1,2,3]三唑-2-基)-2-[(E)-2-苯基乙烯基]苯磺酸钠。优选的荧光增白剂是可从汽巴–嘉基股份有限公司(Ciba-Geigy AG)(巴塞尔，瑞士)获得的天来宝(Tinopal)DMS和天来宝CBS。天来宝DMS是4,4'-双-(2-吗啉代-4-苯胺基-s-三嗪-6-基氨基)芪-2,2'-二磺酸盐的二钠盐。天来宝CBS是2,2'-双-(苯基-苯乙烯基)-二磺酸盐的二钠盐。还优选的是荧光增白剂是可商购的Parawhite KX，由印度孟买的派拉蒙矿物与化学品公司(Paramount Minerals andChemicals)供应。合适用于本发明中使用的其他荧光剂包括1-3-二芳基吡唑啉和7-氨烷基香豆素。合适的荧光增亮剂水平包括从约0.01wt％、从0.05wt％、从约0.1wt％或甚至从约0.2wt％的较低水平至0.5wt％或甚至0.75wt％的较高水平。

在一些实施例中，上述荧光增白剂或光学增亮剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

污垢释放聚合物

本发明的清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)还可以包括一种或多种污垢释放聚合物，这些聚合物帮助从织物(如棉和基于聚酯的织物)去除污垢，特别是从基于聚酯的织物去除疏水性污垢。污垢释放聚合物可以例如是，非离子或阴离子对苯二甲酸基聚合物、聚乙烯基己内酰胺和相关共聚物、乙烯基接枝共聚物、或聚酯聚酰胺。另一种类型的污垢释放聚合物是包含核心结构和附接至该核心结构的多个烷氧基化基团的两亲性烷氧基化油污清洁聚合物。核心结构可以包含聚烷基亚胺结构或聚烷醇胺结构。此外，随机接枝共聚物是合适的污垢释放聚合物。现有技术中更详细地描述了合适的接枝共聚物。合适的聚乙二醇聚合物包括包含以下的随机接枝共聚物：(i)含有聚乙二醇的亲水性主链；以及(ii)选自下组的一条或多条侧链，该组由以下组成：C4-C25烷基基团、聚丙烯、聚丁烯、饱和C1-C6单羧酸的乙烯基酯、丙烯酸或甲基丙烯酸的Cl-C6烷基酯及其混合物。合适的聚乙二醇聚合物具有聚乙二醇主链(具有随机接枝的聚乙酸乙烯酯侧链)。聚乙二醇主链的平均分子量范围可以为从2,000Da至20,000Da、或从4,000Da至8,000Da。聚乙二醇主链与聚乙酸乙烯酯侧链的分子量比率可以在从1:1至1:5、或从1:1.2至1:2的范围内。每个环氧乙烷单元的接枝位点的平均数量可以小于1、或小于0.8，每个环氧乙烷单元的接枝位点的平均数量可在0.5至0.9的范围内，或每个环氧乙烷单元的接枝位点的平均数量可以在0.1至0.5、或0.2至0.4的范围内。合适的聚乙二醇聚合物是

HP22。其他污垢释放聚合物是取代的多糖结构，尤其是取代的纤维素结构，如修饰的纤维素衍生物。合适的纤维素聚合物包括纤维素、纤维素醚、纤维素酯、纤维素酰胺及其混合物。合适的纤维素聚合物包括阴离子修饰的纤维素、非离子修饰的纤维素、阳离子修饰的纤维素、兼性离子修饰的纤维素及其混合物。合适的纤维素聚合物包括甲基纤维素、羧甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、酯羧甲基纤维素及其混合物。

在一些实施例中，上述污垢释放聚合物中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

抗再沉积剂

本发明的清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)还可以包括一种或多种抗再沉积剂，如羧甲基纤维素(CMC)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚氧乙烯和/或聚乙二醇(PEG)、丙烯酸的均聚物、丙烯酸和马来酸的共聚物、和乙氧基化的聚乙亚胺。以上在污垢释放聚合物下所描述的基于纤维素的聚合物还可以作为抗再沉积剂起作用。

在一些实施例中，上述抗再沉积剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

流变改性剂

本发明的清洁组合物(例如，洗涤剂组合物)还可以包括一种或多种流变改性剂、结构剂或增稠剂，不同于降粘剂。流变改性剂选自下组，该组由以下组成：非聚合物结晶、羟基功能材料、聚合物流变改性剂，它们为液体洗涤剂组合物的水性液相基质赋予剪切稀化特征。可以通过本领域已知的方法修饰和调整洗涤剂的流变学和粘度。

在一些实施例中，上述流变改性剂中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

其他组分

其他合适的清洁组合物组分包括但不限于防缩剂、抗皱剂、杀细菌剂、粘合剂、运载体、染料、酶稳定剂、织物软化剂、填料、泡沫调节剂、水溶助剂、香料、颜料、抑泡剂、溶剂以及用于液体洗涤剂的结构剂和/或结构弹性剂。在一些实施例中，上述组分中的任一种可以从本文披露的组合物中排除。

包含RNA酶的方法和用途

可以将本发明的RNA酶(例如，核酸内切酶1核糖核酸酶)配制成清洁组合物和洗涤剂组合物，该清洁组合物和洗涤剂组合物可应用于衣物洗涤和餐具洗涤过程中。本发明的RNA酶有效地减少了污渍，如皮脂、汗液、死细胞材料、生物膜EPS和包含RNA的其他有机材料。特别地，作为生物膜的物质粘附到例如纺织品的表面，并充当附着在表面的污垢和其他物质的“胶”。这可能导致恶臭产生和/或增加的再沉积效果，其中在例如洗涤中释放的污垢以及由此而存在于洗涤液中的污垢再沉积回例如纺织品中。

因此，本发明的一个实施例涉及根据本发明的清洁组合物的用途，该用途用于如下：

i.防止、减少或去除该物品的粘性；

ii.防止、减少或去除来自该物品的生物膜或生物膜组分；

iii.减少或去除包含来自该物品的菌膜的污渍；

iv.在该物品的清洁期间防止、减少或去除污垢的再沉积；

v.防止、减少或去除污垢在该物品上的附着；

vi.维持或改进该物品的白度；或者

vii.防止、减少或去除来自该物品的恶臭，

其中该物品是纺织品、硬表面或餐具。

本发明的一个实施例涉及包含一个、两个、三个、四个或全部五个氨基酸序列NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ ID NO:34)、SHG、和/或NREHVWA(SEQ ID NO:35)的RNA酶或包含该RNA酶和至少一种清洁组分的清洁组合物的用途，该用途用于如下：

i.防止、减少或去除该物品的粘性；

ii.防止、减少或去除来自该物品的生物膜或生物膜组分；

iii.减少或去除包含来自该物品的菌膜的污渍；

iv.在该物品的清洁期间防止、减少或去除污垢的再沉积；

v.防止、减少或去除污垢在该物品上的附着；

vi.维持或改进该物品的白度；或者

vii.防止、减少或去除来自该物品的恶臭，

其中该物品是纺织品、硬表面或餐具。

本发明的一个实施例涉及具有RNA酶活性的多肽的用途，该多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31，以及与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽，或包含该RNA酶和至少一种清洁组分的清洁组合物的用途，该用途用于如下：

i.防止、减少或去除该物品的粘性；

ii.防止、减少或去除来自该物品的生物膜或生物膜组分；

iii.减少或去除包含来自该物品的菌膜的污渍；

iv.在该物品的清洁期间防止、减少或去除污垢的再沉积；

v.防止、减少或去除污垢在该物品上的附着；

vi.维持或改进该物品的白度；或者

vii.防止、减少或去除来自该物品的恶臭，

其中该物品是纺织品、硬表面或餐具。

本发明还涉及例如包含RNA酶(例如，核酸内切酶1核糖核酸酶)的洗衣组合物的方法。此类方法包括衣物洗涤和餐具洗涤方法，还包括工业清洁和医疗清洁方法。

本发明的一个实施例涉及用于洗涤物品的方法，该方法包括：

(a)将该物品暴露于根据本发明的包含RNA酶的组合物；

(b)完成至少一个洗涤周期；以及

(c)任选地，冲洗该纺织品。

本发明的一个实施例涉及用于洗涤物品的方法，该方法包括：

(a)将该物品暴露于包含RNA酶的组合物，该RNA酶包含一个、两个、三个、四个或全部五个氨基酸序列NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ ID NO:34)、SHG、和/或NREHVWA(SEQ ID NO:35)；

(b)完成至少一个洗涤周期；以及

(c)任选地，冲洗该纺织品。

本发明的一个实施例涉及用于洗涤物品的方法，该方法包括：

(a)将该物品暴露于包含具有RNA酶活性的多肽的组合物，该多肽包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:28和SEQ ID NO:31，以及与其具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的多肽；

(b)完成至少一个洗涤周期；以及

(c)任选地，冲洗该纺织品。

多核苷酸

本发明还涉及编码本发明的多肽的多核苷酸，如本文中所述。在一个实施例中，编码本发明的多肽的多核苷酸已经被分离。

在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:1、4、7、10、12或15的成熟多肽编码序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，该多核苷酸与上述列出的SEQ ID NO中的任一个具有至少上述数值中任一个的序列同一性但小于100％同一性。

在一个实施例中，本发明涉及编码具有RNA酶活性的多肽的多核苷酸，其中该多核苷酸与SEQ ID NO:17、20、23、26或29的成熟多肽编码序列具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、94％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。在一些实施例中，该多核苷酸与上述列出的SEQ ID NO中的任一个具有至少上述数值中任一个的序列同一性但小于100％同一性。

这些多核苷酸编码具有RNA酶活性的多肽。该多核苷酸可能已经被分离。

用于分离或克隆多核苷酸的技术是本领域已知的且包括从基因组DNA或cDNA或其组合进行分离。来自基因组DNA的多核苷酸的克隆可以例如通过使用众所周知的聚合酶链式反应(PCR)或用以对具有共有的结构特征的克隆的DNA片段进行检测的表达库抗体筛选来实现。可以使用其他核酸扩增程序例如连接酶链式反应(LCR)、连接激活转录(LAT)和基于多核苷酸的扩增(NASBA)。

编码本发明的多肽的多核苷酸的修饰对于合成基本上类似于该多肽的多肽可以是必需的。术语“基本上类似”于该多肽是指多肽的非天然存在的形式。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:1的核苷酸79-864，并且SEQ ID NO:1的核苷酸1至78编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:4的核苷酸85-864，并且SEQ ID NO:4的核苷酸1至84编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:7的核苷酸79-864，并且SEQ ID NO:7的核苷酸1至78编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:10的核苷酸79-864，并且SEQ IDNO:10的核苷酸1至78编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:12的核苷酸79-864，并且SEQ IDNO:12的核苷酸1至78编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:15的核苷酸79-864，并且SEQ IDNO:15的核苷酸1至78编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:17的核苷酸82-771，并且SEQ IDNO:17的核苷酸1至81编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:20的核苷酸76-819，并且SEQ IDNO:20的核苷酸1至75编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:23的核苷酸106-819，并且SEQ IDNO:23的核苷酸1至105编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:26的核苷酸76-819，并且SEQ IDNO:26的核苷酸1至75编码信号肽。

在一方面，该成熟多肽编码序列是SEQ ID NO:29的核苷酸82-807，并且SEQ IDNO:29的核苷酸1至81编码信号肽。

核酸构建体

本发明还涉及核酸构建体，这些核酸构建体包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，在与控制序列相容的条件下，该一个或多个控制序列指导该编码序列在合适的宿主细胞中的表达。

可用许多方式操作该多核苷酸以提供多肽的表达。取决于表达载体，在多核苷酸插入载体之前对其进行操作可以是理想的或必需的。用于利用重组DNA方法修饰多核苷酸的技术是本领域熟知的。

控制序列可为启动子，即，被宿主细胞识别用于表达编码本发明的多肽的多核苷酸的多核苷酸。该启动子包含介导多肽的表达的转录控制序列。该启动子可以是在宿主细胞中显示出转录活性的任何多核苷酸，包括变体、截短型及杂合型启动子，并且可以从编码与该宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。

指导本发明的核酸构建体在细菌宿主细胞中转录的合适的启动子的实例是获得自以下的启动子：解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cryIIIA基因、大肠杆菌(E.coli)lac操纵子、大肠杆菌trc启动子、天蓝链霉菌(Streptomyces coelicolor)琼脂糖酶基因(dagA)和原核β-内酰胺酶基因，连同tac启动子。

用于在丝状真菌宿主细胞中指导本发明核酸构建体的转录的适合启动子的实例是从以下基因中获得的启动子：构巢曲霉(Aspergillus nidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(Aspergillus niger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸稳定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(Aspergillus awamori)葡糖淀粉酶(glaA)、米曲霉TAKA淀粉酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶、镶片镰孢(Fusarium venenatum)淀粉葡糖苷酶、镶片镰孢Daria、镶片镰孢Quinn、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶，和里氏木霉翻译延伸因子，以及NA2-tpi启动子(来自曲霉属中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自曲霉属丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列；非限制性实例包括来自黑曲霉中性α-淀粉酶基因的经修饰的启动子，其中已经用来自构巢曲霉或米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的未翻译的前导序列替代未翻译的前导序列)；及其变体、截短型、以及杂合型启动子。

在酵母宿主中，有用的启动子从以下的基因获得：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母半乳糖激酶(GAL1)、酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH1、ADH2/GAP)、酿酒酵母丙糖磷酸异构酶(TPI)、酿酒酵母金属硫蛋白(CUP1)、以及酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶。

控制序列也可为由宿主细胞识别以终止转录的转录终止子。该终止子可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的3'-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明中。

细菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(amyL)、和大肠杆菌核糖体RNA(rrnB)。

用于丝状真菌宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：构巢曲霉乙酰胺酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶、尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶、里氏木霉β-葡糖苷酶、里氏木霉纤维二糖水解酶I、里氏木霉纤维二糖水解酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶I、里氏木霉内切葡聚糖酶II、里氏木霉内切葡聚糖酶III、里氏木霉内切葡聚糖酶V、里氏木霉木聚糖酶I、里氏木霉木聚糖酶II、里氏木霉木聚糖酶III、里氏木霉β-木糖苷酶以及里氏木霉翻译延伸因子。

酵母宿主细胞的优选终止子从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)以及酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶。

控制序列还可以是启动子下游和基因的编码序列上游的mRNA稳定子区域，其增加该基因的表达。

合适的mRNA稳定子区域的实例获得自苏云金芽孢杆菌cryIIIA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因。

控制序列也可以是前导序列，即对宿主细胞翻译很重要的mRNA的非翻译区域。该前导序列可操作地连接至编码该多肽的多核苷酸的5'-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选前导序列从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得。

酵母宿主细胞的适合的前导序列从以下的基因获得：酿酒酵母烯醇酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)。

控制序列还可以是多腺苷酸化序列，一种可操作地连接至该多核苷酸的3’-末端并且当转录时由宿主细胞识别为将多腺苷酸残基添加至所转录的mRNA的信号的序列。可以使用在宿主细胞中有功能的任何多腺苷酸化序列。

用于丝状真菌宿主细胞的优选多腺苷酸化序列从以下的基因获得：构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶以及尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的多腺苷酸化序列是本领域已知的。

控制序列还可以是编码与多肽的N-末端连接的信号肽并指导多肽进入细胞的分泌途径的信号肽编码区。多核苷酸的编码序列的5’端本身可以含有在翻译阅读框中天然与编码多肽的编码序列区段相连接的信号肽编码序列。可替代地，编码序列的5'-末端可以包含对编码序列是外源的信号肽编码序列。在编码序列天然地不含有信号肽编码序列的情况下，可能需要外源信号肽编码序列。可替代地，外源信号肽编码序列可以单纯地替代天然信号肽编码序列以便增强多肽的分泌。然而，可以使用指导已表达多肽进入宿主细胞的分泌途径的任何信号肽编码序列。

用于细菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从芽孢杆菌NCIB 11837产麦芽糖淀粉酶、地衣芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌β-内酰胺酶、嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶、嗜热脂肪芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT、nprS、nprM)和枯草芽孢杆菌prsA的基因获得的信号肽编码序列。

用于丝状真菌宿主细胞的有效的信号肽编码序列是从以下酶的基因获得的信号肽编码序列：黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉脂肪酶和米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶。

用于酵母宿主细胞的有用的信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。

控制序列还可以是编码位于多肽的N-末端的前肽的前肽编码序列。所得的多肽被称为前体酶(proenzyme)或多肽原(或在一些情况下被称为酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的并且可通过催化切割或自身催化切割来自多肽原的前肽而转化为活性多肽。前肽编码序列可以从以下的基因获得：枯草芽孢杆菌碱性蛋白酶(aprE)、枯草芽孢杆菌中性蛋白酶(nprT)、嗜热毁丝霉漆酶、米黑根毛霉天冬氨酸蛋白酶和酿酒酵母α-因子。

在信号肽序列和前肽序列二者都存在的情况下，该前肽序列位于紧邻多肽的N-末端且该信号肽序列位于紧邻前肽序列的N-末端。

还可希望的是添加调节序列，这些调节序列调节宿主细胞生长相关的多肽的表达。调节序列的实例是引起基因表达以响应于化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些。原核系统中的调节序列包括lac、tac、和trp操纵子系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKAα-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子、里氏木霉纤维二糖水解酶I启动子以及里氏木霉纤维二糖水解酶II启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些序列。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况中，编码多肽的多核苷酸会与调节序列可操作地连接。

表达载体

本发明还涉及包含本发明的多核苷酸、启动子、以及转录和翻译终止信号的重组表达载体。多个核苷酸和控制序列可连接在一起以产生重组表达载体，该重组表达载体可包括一个或多个便利的限制位点以允许编码该多肽的多核苷酸在此类位点处的插入或取代。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。

重组表达载体可以是可以方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。

载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。

载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。

细菌选择性标记的实例是地衣芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌dal基因、或赋予抗生素抗性(如氨苄青霉素、氯霉素、卡那霉素、新霉素、大观霉素、或四环素抗性)的标记。酵母宿主细胞的适合的标记包括但不限于：ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于在丝状真菌宿主细胞中使用的选择性标记包括但不限于adeA(磷酸核糖酰氨基咪唑-琥珀羧胺合酶)、adeB(磷酸核糖酰-氨基咪唑合酶)、amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(草丁膦乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5'-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷基转移酶)以及trpC(邻氨基苯甲酸合酶)连同其等同物。优选的用于曲霉细胞中的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。优选的用于木霉属(Trichoderma)细胞的是adeA、adeB、amdS、hph以及pyrG基因。

选择性标记可以是双选择性标记系统。在一方面，双选择性标记是hph-tk双选择性标记系统。

载体优选地含有允许载体整合至宿主细胞基因组中或载体在细胞中独立于基因组而自主复制的一种或多种元件。

对于整合到宿主细胞基因组中，载体可以依靠编码该多肽的多核苷酸序列或用于通过同源或非同源重组整合到该基因组中的该载体的任何其他元件。可替代地，载体可以含有用于指导通过同源重组而整合入宿主细胞基因组中的染色体中的精确位置处的另外的多核苷酸。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对和800至10,000个碱基对，这些核酸与相应的靶序列具有高度序列同一性以增强同源重组的概率。整合元件可以是与宿主细胞基因组内的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码的多核苷酸。另一方面，载体可以通过非同源重组整合入宿主细胞的基因组中。

为了自主复制，载体可以进一步包含复制起点，该复制起点使得载体在讨论中的宿主细胞中自主复制成为可能。复制起点可以是在细胞中发挥作用的介导自主复制的任何质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”意指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。

细菌复制起点的实例是允许在大肠杆菌中复制的质粒pBR322、pUC19、pACYC177、和pACYC184的复制起点，以及允许在芽孢杆菌属中复制的质粒pUB110、pE194、pTA1060、和pAMβ1的复制起点。

用于酵母宿主细胞中的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1与CEN3的组合、及ARS4与CEN6的组合。

可用于丝状真菌细胞中的复制起点的实例是AMA1和ANS1。可以根据本领域已知的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。

可将本发明多核苷酸的多于一个拷贝插入宿主细胞以增加多肽的产生。通过将序列的至少一个另外的拷贝整合到宿主细胞基因组中或者通过包括与该多核苷酸一起的可扩增的选择性标记基因可以获得多核苷酸的增加的拷贝数目，其中通过在适当的选择性试剂的存在下培养细胞可以选择包含选择性标记基因的经扩增的拷贝以及由此该多核苷酸的另外的拷贝的细胞。

用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员熟知的。

宿主细胞

本发明还涉及重组宿主细胞，这些宿主细胞包含可操作地连接至一个或多个控制序列的本发明的多核苷酸，该一个或多个控制序列指导本发明的多肽的产生。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持，如较早前所述。术语“宿主细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。宿主细胞的选择将在很大程度上取决于编码该多肽的基因及其来源。

该宿主细胞可以是在本发明多肽的重组产生中有用的任何细胞，例如原核细胞或真核细胞。

原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、大洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、以及脲原体属(Ureaplasma)。

细菌宿主细胞可以是任何芽孢杆菌属细胞，包括但不限于：嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)、解淀粉芽孢杆菌、植物解淀粉芽孢杆菌亚种(B.amyloliquefaciens subsp.plantarum)、短芽孢杆菌(Bacillusbrevis)、环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)、克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌(Bacilluscoagulans)、坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)、短小芽孢杆菌、沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)、嗜热脂肪芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、以及苏云金芽孢杆菌细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链球菌属细胞，包括但不限于类马链球菌(Streptococcus equisimilis)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、乳房链球菌(Streptococcus uberis)以及马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi subsp.Zooepidemicus)细胞。细菌宿主细胞还可以是任何链霉菌属细胞，包括但不限于：不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝链霉菌、灰色链霉菌以及浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)细胞。

可通过以下方法实现将DNA引入到芽孢杆菌属细胞：原生质体转化、感受态细胞转化、或接合。可通过以下方法实现将DNA引入到大肠杆菌细胞：原生质体转化或电穿孔。可通过以下方法实现将DNA引入到链霉菌属细胞：原生质体转化、电穿孔、接合、或转导。可通过以下方法实现将DNA引入到假单胞菌属细胞：电穿孔或接合。可通过以下方法实现将DNA引入到链球菌属细胞：天然感受态(natural competence)、原生质体转化、电穿孔或接合。然而，可以使用本领域已知的将DNA引入宿主细胞中的任何方法。

宿主细胞还可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用的“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)、和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有有丝分裂孢子真菌。真菌宿主细胞可以为酵母细胞。如本文所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知菌类(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。

酵母宿主细胞可以是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁弗酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)细胞，如乳酸克鲁弗酵母(Kluyveromyces lactis)、卡尔酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)、卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。

真菌宿主细胞可为丝状真菌细胞。“丝状真菌”包括真菌门(Eumycota)和卵菌门的亚门的所有丝状形式。丝状真菌通常的特征在于由几丁质、纤维素、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其他复杂多糖构成的菌丝体壁。营养生长是通过菌丝延伸来进行的，而碳分解代谢是专性需氧的。相反，酵母(如酿酒酵母)的营养生长是通过单细胞菌体的出芽(budding)来进行的，而碳分解代谢可以是发酵性的。

丝状真菌宿主细胞可以是枝顶孢霉属、曲霉属、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管霉属(Bjerkandera)、拟腊菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属、革盖菌属、隐球菌属(Cryptococcus)、线黑粉菌科(Filibasidium)、镰孢属、腐质霉属、梨孢菌属(Magnaporthe)、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属、新美鞭菌属(Neocallimastix)、链孢菌属、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属、平革菌属(Phanerochaete)、射脉菌属、瘤胃壶菌属(Piromyces)、侧耳属、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓菌属或木霉属细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、黑刺烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡孔菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、女王杜香金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium crookwellense)、禾谷镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusariumheterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、腐皮镰孢(Fusarium solani)、拟分枝孢镰孢(Fusariumsporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusarium trichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、柔毛腐质霉、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)、黄孢平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、射脉菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳霉(Thielaviaterrestris)、长域毛栓菌(Trametes villosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉、或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。

可以将真菌细胞通过涉及原生质体形成、原生质体转化、和细胞壁重建的方法以本身已知的方式转化。用于转化曲霉属和木霉属宿主细胞的合适的程序是本领域已知的。用于转化镰孢属物种的合适的方法是本领域已知的。也可以使用本领域已知的程序转化酵母。

配制品

本发明的组合物可以处于任何常规形式，例如条，均匀的片剂，具有两层或更多层的片剂，具有一个或多个室的袋，规则的或压缩的粉末，颗粒，糊剂，凝胶，或规则的、压缩的或浓缩的液体。

袋可以被配置为单一室或多室。它可以具有适合用于容持该组合物的任何形式、形状和材料，例如在与水接触之前，不允许该组合物从袋中释放出来。袋由水溶性膜制成，它包含了一个内部体积。可以将所述内部体积分成袋的室。优选的膜是聚合物材料，优选地形成膜或薄片的聚合物。优选的聚合物、共聚物或其衍生物选自聚丙烯酸酯、和水溶性丙烯酸酯共聚物、甲基纤维素、羧甲基纤维素、糊精钠、乙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、麦芽糊精、聚甲基丙烯酸酯，最优选地是聚乙烯醇共聚物以及羟丙基甲基纤维素(HPMC)。优选地，聚合物在膜例如PVA中的水平是至少约60％。优选的平均分子量将典型地是约20,000至约150,000。膜还可以是共混组合物，这些共混组合物包含可水解降解并且可水溶的聚合物共混物，如聚乳酸和聚乙烯醇(已知在贸易参考号M8630下，如由美国印第安纳州的MonoSol有限责任公司(MonoSol LLC)销售)加增塑剂，像甘油、乙二醇、丙二醇、山梨醇及其混合物。袋可以包含固体洗衣清洁组合物或部分组分和/或液体清洁组合物或由水溶性膜分开的部分组分。用于液体组分的室在构成上可以与包含固体的室不同。

可以由水溶性袋中的或片剂的不同层中的室来将洗涤剂成分彼此物理分开。因此，可以避免组分间的不良的储存相互作用。在洗涤溶液中，每个室的不同溶解曲线还可以引起选择的组分的延迟溶解。

非单位剂量的液体或凝胶洗涤剂可以是水性的，典型地含有按重量计至少20％并且最高达95％的水，例如高达约70％的水、高达约65％的水、高达约55％的水、高达约45％的水、高达约35％的水。包括但不限于链烷醇、胺、二醇、醚以及多元醇的其他类型的液体可以被包括在水性液体或凝胶中。水性液体或凝胶洗涤剂可以含有从0-30％的有机溶剂。液体或凝胶洗涤剂可以是非水性的。

液体配制品可以含有RNA酶，并且可以含有来自生产过程(例如，表达该RNA酶的微生物的发酵)的其他小分子材料，例如像盐、肽、代谢物等。

任选地，配制品中可以含有稳定剂(例如，多元醇、盐等)和其他成分(例如，抑制剂、抗氧化剂、抗还原剂、防腐剂、醇、pH控制剂、粘度控制剂等)。液体配制品可以是透明的、模糊的或可含有沉淀。

液体配制品中含有的多元醇(polyol或polyhydric alcohol)通常是具有两个或更多个羟基基团的醇。这些多元醇典型地具有少于10个碳，例如9、8、7、6、5、4或3个碳。分子量典型地小于500g/mol，例如400g/mol或300g/mol。合适的多元醇的实例包括但不限于甘油、丙二醇、乙二醇、山梨醇、甘露糖醇、赤藓糖醇、半乳糖醇、肌醇、木糖醇、核糖醇等。在一些实施例中，液体酶配制品中的一种或多种多元醇的量小于约50％(w/w)、40％(w/w)、30％(w/w)、20％(w/w)、或10％(w/w)。在一些实施例中，该液体酶配制品不包含多元醇。抑制剂包括所讨论的酶或打算用于相同应用的其他酶的添加的可逆抑制剂，或者是产品或应用中不需要的副活性的抑制剂。

在一些实例中，盐(尤其是用作稳定剂的那些)可用于降低水活性的目的。盐可以是有机盐或无机盐，并且通常溶解于液体配制品中。盐中阳离子的实例可以包括Na+、Ca++、K+、Mg++等。盐中阴离子的实例可以包括氯、甲酸根、乙酸根、硫酸根等。配制品也可以不添加盐。

抗氧化剂或抗还原剂可以包括例如，甲硫氨酸、牺牲剂、亚硫酸盐等。防腐剂可以包括任何食品级或工业级防腐剂。实例包括山梨酸盐、苯甲酸盐、异噻唑啉酮、BAC、苯氧乙醇等。

颗粒洗涤剂配制品

可以将含有RNA酶的组合物配制成颗粒。该颗粒通常由核心以及任选地包围该核心的一种或多种包衣(外层)构成。

颗粒的核心可以包括另外的材料如填料、纤维材料(纤维素或合成纤维)、稳定剂、增溶剂、悬浮剂、粘度调节剂、轻球体、增塑剂、盐、润滑剂和芳香剂。该核心可以包括粘合剂，如合成聚合物、蜡、脂肪、或碳水化合物。该核心典型地作为均匀的共混物可以包含多价阳离子的盐、还原剂、抗氧化剂、过氧化物分解催化剂和/或酸性缓冲液组分。该核心可以由惰性粒子组成，其中酶被吸附到该惰性粒子之内，或者被施用(例如通过流化床包衣)到该惰性粒子的表面上。该核心的直径可以是20-2000μm，特别是50-1500μm、100-1500μm或250-1200μm。

该核心可以通过粒化成分的共混物来制备，例如通过包括造粒技术的方法，例如结晶、沉淀、锅包衣(pan-coating)、流化床包衣、流化床凝集、旋转雾化、挤出、颗粒化(prilling)、滚圆(spheronization)、粒度减小法、转鼓造粒(drum granulation)和/或高剪切造粒。

a)喷雾干燥产品，其中在喷雾干燥塔中雾化液体含酶溶液以形成小液滴，在它们在沿干燥塔下降的过程中干燥形成含酶的微粒状材料；可以用这种方法产生非常小的粒子；

b)层状产品，其中酶在预形成的惰性核心粒子周围包衣成层，其中含酶溶液通常在流化床装置中被雾化，在该流化床装置中预形成的核心粒子被流体化并且含酶溶液附着到核心粒子上并干燥，直到使得干的酶层留在核心粒子的表面上。如果可以发现具有期望尺寸的有用核心粒子，则通过这种方式能够获得具有期望尺寸的粒子；

c)吸收的核心粒子，其中不是将该酶在核心周围包衣成层，而是在核心的表面上和/或表面中吸收该酶；

d)挤出或丸粒化的产品，其中将含酶糊剂压成丸粒或在压力下通过小的开口挤出并切割为粒子，随后干燥这些粒子。此类粒子通常具有相当大的尺寸，因为开有挤出开口的材料(通常是具有钻孔的平板)限制了通过挤出开口可允许的压力降。此外，当使用小开口时，非常高的挤出压力增加了酶糊剂中的热发生，这对酶是有害的；

e)颗粒化的产品，其中含酶粉末悬浮于熔化的蜡中并且例如通过转盘喷雾器将悬浮液喷洒到冷却室中，在此液滴快速地固化。所获得产物是酶均匀分布遍及整个惰性材料而不是集中在其表面上的产物；

f)混合造粒产品，其中将液体添加至例如常用造粒组分的干燥粉末组合物中，经由液体或粉末或二者引入该酶。将液体和粉末混合，并且因为液体的水分为干燥粉末所吸收，干燥粉末的组分开始附着并凝集，并且粒子将累积，形成包含酶的颗粒。在其中可以用各种高剪切混合器作为造粒机的此方法的特定产品中，将由作为酶的酶、填料和粘合剂等组成的颗粒与纤维素纤维混合以强化粒子，而得到所谓的T-颗粒(T-granulate)。经强化的粒子更加坚固，酶粉尘释放更少；

g)粒度减小，其中通过碾磨或压碎含酶的较大的粒子、丸粒、平片体、坯块(briquette)等产生核心。通过将碾磨或压碎的产物过筛获得所需要的核心粒子级分。可以回收尺寸过大和尺寸过小的粒子；

h)流化床造粒涉及将微粒悬浮于空气流中并经喷嘴喷射液体到流态化粒子上。被喷洒的液滴击中的粒子湿润并发粘。发粘的粒子与其他粒子碰撞并附着于其上并形成颗粒；或者

i)这些核心可经受干燥，例如在流化床干燥器中。本领域技术人员可以使用其他已知的在饲料或洗涤剂工业中用于干燥颗粒的方法。干燥优选在从25℃至90℃的产物温度下进行。对于一些酶来说，重要的是包含酶的核心在包衣之前含有少量的水。如果在过量水除去之前水敏性酶被包衣，则水分会截留在核心中并可能消极地影响酶的活性。干燥之后，这些核心可以含有0.1％-10％w/w的水。

该酶颗粒/粒子的核心可以被至少一个包衣包围，例如，以改进储存稳定性、以减少在处理过程中的粉尘形成或用于着色该颗粒。该一个或多个任选的包衣可以包括盐包衣、或其他适合的包衣材料，如聚乙二醇(PEG)、甲基羟基-丙基纤维素(MHPC)以及聚乙烯醇(PVA)。

可以将该包衣按核心的重量计以至少0.1％(例如，至少0.5％、1％或5％)的量施加。该量至多可以是100％、70％、50％、40％或30％。该包衣优选是至少0.1μm厚，特别是至少0.5μm、至少1μm或至少5μm厚。在特定的实施例中，包衣的厚度是低于100μm。在更特定的实施例中，包衣的厚度是低于60μm。在甚至更特定的实施例中，包衣的总厚度是低于40μm。该包衣可以通过形成基本上连续的层来密封该核心单元。基本上连续的层应当理解为具有极少或没有孔洞的包衣，使得密封/封闭的核心单元具有极少或没有未包衣的区域。该层或包衣在厚度上应是均匀的。该包衣可以进一步含有其他本领域已知的材料，例如填料、防粘剂、颜料、染料、增塑剂和/或粘合剂，例如二氧化钛、高岭土、碳酸钙或滑石。

盐包衣可以包含按重量w/w计至少60％的盐，例如，按重量w/w计，至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％。该盐可以从盐溶液(其中该盐是完全溶解的)中添加，或者从盐悬浮液(其中该细粒子是小于50μm，如小于10μm或小于5μm)中添加。该盐包衣可以包含单一盐或者两种或更多种盐的混合物。该盐可以是水溶性的，特别地具有在20℃下在100g水中至少0.1克的溶解度，优选地至少0.5g/100g水，例如，至少1g/100g水，例如，至少5g/100g水。该盐可以是无机盐，例如硫酸盐、亚硫酸盐、磷酸盐、膦酸盐、硝酸盐、氯盐或碳酸盐或者简单有机酸(少于10个碳原子，例如6个或更少的碳原子)的盐例如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。在这些盐中的阳离子的实例是碱或碱土金属离子、铵离子或第一过渡系的金属离子，例如钠、钾、镁、钙、锌或铝。阴离子的实例包括氯、溴、碘、硫酸根、亚硫酸根、亚硫酸氢根、硫代硫酸根、磷酸根、磷酸二氢根、二碱式磷酸根、次磷酸根、焦磷酸二氢根、四硼酸根、硼酸根、碳酸根、碳酸氢根、硅酸根、柠檬酸根、苹果酸根、马来酸根、丙二酸根、琥珀酸根、乳酸根、甲酸根、乙酸根、丁酸根、丙酸根、苯甲酸根、酒石酸根、抗坏血酸根或葡萄糖酸根。特别地，可以使用硫酸根、亚硫酸根、磷酸根、膦酸根、硝酸根、氯或碳酸根的碱或碱土金属盐或者简单有机酸的盐如柠檬酸盐、丙二酸盐或乙酸盐。

在包衣中的盐可以在20℃下具有超过60％的恒定湿度，特别是超过70％、超过80％或超过85％，或者它可以是此盐的另一种水合物形式(例如，无水物)。合适的盐的具体实例是NaCl(CH20℃＝76％)、Na₂CO₃(CH20℃＝92％)、NaNO₃(CH20℃＝73％)、Na₂HPO₄(CH20℃＝95％)、Na₃PO₄(CH25℃＝92％)、NH₄Cl(CH20℃＝79.5％)、(NH₄)₂HPO₄(CH20℃＝93.0％)、NH₄H₂PO₄(CH20℃＝93.1％)、(NH₄)₂SO₄(CH20℃＝81.1％)、KCl(CH20℃＝85％)、K₂HPO₄(CH20℃＝92％)、KH₂PO₄(CH20℃＝96.5％)、KNO₃(CH20℃＝93.5％)、Na₂SO₄(CH20℃＝93％)、K₂SO₄(CH20℃＝98％)、KHSO₄(CH20℃＝86％)、MgSO₄(CH20℃＝90％)、ZnSO₄(CH20℃＝90％)和柠檬酸钠(CH25℃＝86％)。其他实例包括NaH₂PO₄、(NH₄)H₂PO₄、CuSO₄、Mg(NO₃)₂以及乙酸镁。

该盐可以处于无水形式，或者它可以是水合盐，即具有结晶化的一个或多个结合水的结晶盐水合物。特定实例包括无水硫酸钠(Na₂SO₄)、无水硫酸镁(MgSO₄)、七水硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)、七水硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)、七水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·7H₂O)、六水硝酸镁(Mg(NO₃)₂(6H₂O))、二水柠檬酸钠以及四水乙酸镁。优选地，作为盐溶液施加该盐，例如使用流化床。

无尘颗粒可以产生并且可以通过本领域已知的方法进行包衣。蜡状包衣材料的实例是平均分子量为1000至20000的聚(环氧乙烷)产品(聚乙二醇，PEG)；具有16至50个环氧乙烷单元的乙氧基化壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中所述醇含有12至20个碳原子，并且其中存在15至80个环氧乙烷单元；脂肪醇；脂肪酸；以及脂肪酸的甘油单酯、和甘油二酯、和甘油三酯。适合用于通过流化床技术应用的成膜包衣材料的实例在GB 1483591中给出。液体酶制剂可以例如通常在形成颗粒之前，通过根据已确立的方法添加多元醇(如丙二醇)、糖或糖醇、乳酸或硼酸而稳定化。可以制备受保护的酶。

因此，在另一个方面，本发明提供了颗粒，其包含：

(a)含有根据本发明的核酸内切酶1RNA酶的核心，以及

(b)任选地由包围该核心的一个或多个层组成的包衣。

还可以将含有RNA酶的组合物配制成结合一种或多种酶的共颗粒。然后，每种酶将存在于多种颗粒中，这些颗粒确保酶在洗涤剂中的分布更均匀。这还减少了由于不同的粒度，不同酶的物理隔离。用于生产针对洗涤剂工业的多酶共颗粒的方法是本领域已知的。

使用共颗粒的酶的配制品的另一个实例是已知的，其涉及包含以下的洗涤剂组合物：(a)多酶共颗粒；(b)少于10％w/w沸石(无水的基础上)；和

(c)少于10％w/w磷酸盐(无水的基础上)，其中所述酶共颗粒包含从10至98％w/w的水分汇组分(sink component)，并且该组合物另外还包含从20至80％w/w的洗涤剂水分汇组分。

多酶共颗粒可以包含本发明的RNA酶和(a)一种或多种选自以下的酶：脂肪酶、半纤维素酶、蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、纤维二糖脱氢酶、木聚糖酶、磷脂酶、酯酶、角质酶、果胶酶、甘露聚糖酶、果胶裂解酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质酶、普鲁兰酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、地衣聚糖酶、葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、淀粉酶、及其混合物。

发酵液或细胞组合物

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下温育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一些实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下温育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

使用RNA酶和组合物的方法

本发明还涉及包含本发明的多肽的发酵液配制品或细胞组合物。该发酵液产物进一步包含在发酵过程中使用的另外的成分，例如像细胞(包括含有编码本发明的多肽的基因的宿主细胞，这些宿主细胞用于产生目的多肽)、细胞碎片、生物质、发酵培养基和/或发酵产物。在一些实施例中，组合物是含有一种或多种有机酸、杀灭的细胞和/或细胞碎片以及培养基的细胞杀灭的全培养液。

如本文使用的术语“发酵液”是指由细胞发酵产生的、不经历或经历最少的回收和/或纯化的制剂。例如，当微生物培养物在允许蛋白质合成(例如，由宿主细胞表达酶)并且将蛋白质分泌到细胞培养基中的碳限制条件下温育生长到饱和时，产生发酵液。该发酵液可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的或分级的内容物。典型地，该发酵液是未分级的并且包含用过的培养基以及例如通过离心去除微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，发酵液含有用过的细胞培养基、胞外酶以及有活力的和/或无活力的微生物细胞。

在一些实施例中，发酵液配制品和细胞组合物包含第一有机酸组分(包含至少一种1-5个碳的有机酸和/或其盐)和第二有机酸组分(包含至少一种6个或更多个碳的有机酸和/或其盐)。在特定实施例中，第一有机酸组分是乙酸、甲酸、丙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物；并且该第二有机酸组分是苯甲酸、环己烷羧酸、4-甲基戊酸、苯乙酸、其盐或前述两种或更多种的混合物。

在一方面，组合物含有一种或多种有机酸，并且任选地进一步含有杀灭的细胞和/或细胞碎片。在一个实施例中，从细胞杀灭的全培养液中去除这些杀灭的细胞和/或细胞碎片，以提供不含这些组分的组合物。

这些发酵液配制品或细胞组合物可以进一步包含防腐剂和/或抗微生物(例如，抑菌)剂，包括但不限于山梨醇、氯化钠、山梨酸钾、以及本领域已知的其他试剂。

该细胞杀灭的全培养液或组合物可以含有在发酵结束时得到的发酵材料的未分级的内容物。典型地，该细胞杀灭的全培养液或组合物包含用过的培养基以及在微生物细胞(例如，丝状真菌细胞)生长至饱和、在碳限制条件下温育以允许蛋白合成之后存在的细胞碎片。在一些实施例中，细胞杀灭的全培养液或组合物含有用过的细胞培养基、胞外酶和杀灭的丝状真菌细胞。在一些实施例中，可以使用本领域已知的方法来使细胞杀灭的全培养液或组合物中存在的微生物细胞透性化和/或裂解。

如本文所述的全培养液或细胞组合物典型地是液体，但是可以含有不溶性组分，例如杀灭的细胞、细胞碎片、培养基组分和/或一种或多种不溶性酶。在一些实施例中，可以去除不溶性组分以提供澄清的液体组合物。

实例

实例1.编码核酸内切酶1核糖核酸酶的基因的鉴定

使用公共和内部序列数据库，鉴定了含有Pfam PF04231(核酸内切酶1)氨基酸序列结构域的多肽(Finn,R.D.,等人,2016.The Pfam protein families database:towardsa more sustainable future.[Pfam蛋白质家族数据库：迈向更可持续的未来]NucleicAcids Res[核酸研究]44,D279-D285)。使用含有至少一个核酸内切酶1结构域的成熟多肽序列的多重比对，将这些多肽用于生成系统发育树(图1)。使用MUSCLE算法版本3.8.31(Edgar,R.C.,2004.MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy andhigh throughput.[MUSCLE：具有高精确度和高通量的多重序列比对]Nucleic Acids Res[核酸研究]32,1792-1797)对序列进行比对。使用FastTree版本2.1.8(Price,M.N.,等人,2010.FastTree 2-Approximately Maximum-Likelihood Trees for Large Alignments.[FastTree 2-用于大型比对的近似最大似然树]PLOS ONE[公共科学图书馆·综合]5,e9490)构建系统发育树，并且使用iTOL(Letunic,I.,Bork,P.,2007.Interactive Tree OfLife(iTOL):an online tool for phylogenetic tree display and annotation.[交互式生命树(iTOL)：用于系统发育树显示和注释的在线工具]Bioinformatics[生物信息学]23,127-128)对这些系统发育树进行可视化。

获得自这项工作的系统发育树示于图1中。将含有Pfam PF04231的多肽分成5个不同的簇：ENDO1 A、ENDO1 B、ENDO1 C、ENDO1 D和ENDO1E。ENDO1 A分支含有来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶(Nakamura,A.,等人,1992.Gene cloning andcharacterization of a novel extracellular ribonuclease of Bacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的新型细胞外核糖核酸酶的基因克隆和表征].European Journal ofBiochemistry[欧洲生物化学杂志]209,121-127)。在系统发育树的该分支中，从我们的菌株数据库中的许多细菌菌株中鉴定出多肽(表1)。下表1所示的细菌菌株通常是从污垢样品中分离的。将染色体DNA从菌株中分离，并且使用Illumina技术进行全基因组测序。为了从这些菌株中克隆含有Pfam PF04231氨基酸结构域的基因，设计了编码含有Pfam PF04231结构域的基因的PCR引物(侧翼于这些基因)，并使用染色体DNA作为模板将这些PCR引物用于扩增这些基因。对扩增区域进行克隆并测序。在本披露的标题为“序列综述”的部分中示出了所确认/确定的序列的鉴定。作为本申请一部分的序列表中示出了实际序列。

实例2.克隆的核酸内切酶1核糖核酸酶多肽之间的序列同一性

确定了在本披露中鉴定的成熟多肽之间的序列同一性。该分析中使用的成熟多肽的身份示于表1中。使用这些成熟多肽的氨基酸序列并使用来自EMBOSS序列包(www.emboss.org)的Needle实用工具，计算BLOSUM62序列同一性矩阵。基于一个序列对另一个序列的“全部对全部(all against all)”比对来计算该矩阵。下表2中的数字(即序列同一性)被计算为：两个序列之间的精确匹配的数字除以比对的总长度，减去比对中空位的总长度。比对使用的空位开放罚分为10以及空位延伸罚分为0.50。同一性矩阵示于下表2中。数字3、6、9、14、19、22、25、28和31标识了本披露的SEQ ID NO。其他数字(即值大于60的数字)表示两个SEQ ID NO之间的序列同一性。

该分析的数据表明，SEQ ID NO:22和28的氨基酸序列彼此具有大于98％的序列同一性。来自SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:28的多肽均来自地衣芽孢杆菌的菌株。

该分析的数据还表明，SEQ ID NO:3、6和14的氨基酸序列彼此具有大于90％的序列同一性。所有这些序列均来自芽孢杆菌属。SEQ ID NO:3来自莫哈韦芽孢杆菌。SEQ IDNO:6来自枯草芽孢杆菌。SEQ ID NO:14来自枯草芽孢杆菌斯氏亚种。

还确定了SEQ ID NO:3和6与来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶(Nakamura,A.,等人,1992.Gene cloning and characterization of a novelextracellular ribonuclease of Bacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的新型细胞外核糖核酸酶的基因克隆和表征].European Journal of Biochemistry[欧洲生物化学杂志]209,121-127)的序列同一性。SEQ ID NO:3与来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶具有98.6％同一性。SEQ ID NO:6与来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶具有90.3％同一性。

SEQ ID NO:22和28组中的任何序列与SEQ ID NO:3、6和14组中的任何序列之间的最高序列同一性为75.0％(SEQ ID NO:14和22之间；以及SEQ ID NO:14和28之间)。

该分析的数据还表明，SEQ ID NO:6和9的氨基酸序列彼此具有大于80％的序列同一性。

实例3.核酸内切酶1进化枝的定义

对用于构建系统发育树(如实例1中所述)的序列进行分析，以确定可用于鉴定含有Pfam PF04231结构域的多肽的进化枝或子簇的特定氨基酸序列。此分析的目的是试图鉴定可用于鉴定多肽的基序，这些多肽被分组到系统发育树的分支中，该系统发育树含有来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶(Nakamura,A.,等人,1992.Gene cloning andcharacterization of a novel extracellular ribonuclease of Bacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的新型细胞外核糖核酸酶的基因克隆和表征].European Journal ofBiochemistry[欧洲生物化学杂志]209,121-127)以及本文表1中的多肽。

从该分析中，发明人鉴定出一组含有Pfam PF04231结构域的多肽含有氨基酸序列NREH(SEQ ID NO:32)。这些多肽是NREH进化枝(NREH；SEQ ID NO:32)的成员。该进化枝涵盖存在于该树的ENDO1 A、ENDO1 C和ENDO1 D分支中的多肽。

可以将含有NREH(SEQ ID NO:32)序列的多肽进一步分成子簇。一个子簇含有氨基酸序列D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)。据说这些多肽是DADP进化枝(D[AEQ]DP；SEQ ID NO:33)的成员。该进化枝涵盖存在于系统发育树的ENDO1 A和ENDO1 C分支中的多肽。DADP进化枝(D[AEQ]DP；SEQ ID NO:33)含有来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶(Nakamura,A.,等人,1992.Gene cloning and characterization of a novel extracellularribonuclease of Bacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的新型细胞外核糖核酸酶的基因克隆和表征].European Journal of Biochemistry[欧洲生物化学杂志]209,121-127)。该子簇还含有大多数多肽，这些多肽含有来自芽孢杆菌属物种的Pfam PF04231结构域。

可以将作为DADP进化枝(D[AEQ]DP；SEQ ID NO:33)的成员的多肽进一步分成子簇。一个子簇含有氨基酸序列TDEDP(SEQ ID NO:34)。据说这些多肽是TDED进化枝(TDEDP；SEQ ID NO:34)的成员。该进化枝涵盖存在于系统发育树的ENDO1 A分支中的多肽。

可以将作为TDED进化枝(TDEDP；SEQ ID NO:34)的成员的多肽进一步分成子簇。这些多肽中的一些含有氨基酸序列SHG。TDED进化枝(TDEDP；SEQ ID NO:34)中的一些多肽含有氨基酸序列NREHVWA(SEQ ID NO:35)。

来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶(Nakamura,A.,等人,1992.Genecloning and characterization of a novel extracellular ribonuclease ofBacillus subtilis[枯草芽孢杆菌的新型细胞外核糖核酸酶的基因克隆和表征].European Journal of Biochemistry[欧洲生物化学杂志]209,121-127)以及本文表1中含有的多肽属于TDED进化枝(TDEDP；SEQ ID NO:34)，并且含有氨基酸序列TDEDP(SEQ IDNO:34)、NREHVWA(SEQ ID NO:35)、以及SHG。

实例4.编码核酸内切酶1核糖核酸酶的基因的表达

表达实例1中鉴定的基因以获得蛋白质。表达了表1中所示的成熟多肽。除了表1中的序列之外，还合成了来自短小芽孢杆菌的基因的密码子优化的序列。密码子优化的基因如SEQ ID NO:10所示。由SEQ ID NO:10编码的全长多肽示于SEQ ID NO:11中。SEQ ID NO:11与SEQ ID NO:8相同。基于获得自枯草芽孢杆菌斯氏亚种的序列还合成了密码子优化的基因。该基因如SEQ ID NO:15所示，并且编码如SEQ ID NO:16所示的全长多肽。SEQ ID NO:16与SEQ ID NO:13相同。

通常如WO/2022/025577中所述，构建含有多肽编码序列的表达载体并用于表达蛋白质。表达质粒编码克劳氏芽孢杆菌分泌信号、MKKPLGKIVASTALLISVAFSSSIASA(SEQ IDNO:36)、His标签和核酸内切酶1核糖核酸酶序列。如WO 1999/043835中所述，将克隆的基因的表达设计成由多重启动子系统控制。表达构建体还含有编码氯霉素乙酰转移酶的基因(Diderichsen,B.,等人,1993.A useful cloning vector for Bacillus subtilis.[枯草芽孢杆菌的有用的克隆载体]Plasmid[质粒]30,312-315)。

将表达质粒转化到枯草芽孢杆菌表达宿主中，并通过在培养基中加入氯霉素来选择含有已经同源整合到细菌染色体中的序列的转化体。选择一个已转化的克隆，使其在液体培养基中生长并收获细胞。使用标准方法使用His-标签纯化重组蛋白。

实例5.多肽的RNA酶活性

在第一组实验中，将RNA底物与酶一起孵育，并且在凝胶电泳后将反应混合物可视化，以确定RNA是否已被酶消化。100μl的反应体积含有在0.1M Hepes(pH 8)中的6g/l圆酵母RNA(西格玛公司(Sigma))和0.1ppm酶(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、或对照酶)。将反应在37℃下孵育2小时，然后将每种反应混合物的一部分与凝胶上样缓冲液混合，并如制造商所建议的，使用FlashGel^TM RNA盒(龙沙公司(Lonza))通过凝胶电泳进行分析。对照酶包括来自寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)的T1 RNA酶(阳性对照)、来自枝顶孢霉属的脒基特异性核糖核酸酶F(阳性对照)、和磷酸二酯酶(PDE；阴性对照)。还使用了不含酶的阴性对照。

该实验的数据示于图2中。图中凝胶的泳道A为无酶对照。泳道B是PDE阴性对照。泳道C是SEQ ID NO:6。泳道D是SEQ ID NO:3。泳道E是T1 RNA酶阳性对照。泳道F是脒基特异性核糖核酸酶F阳性对照。泳道G是DNA分子量标记(FlashGel^TM；龙沙公司)。

这些数据表明，在测定中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6具有RNA酶活性。

在第二组实验中，检查克隆的和表达的多肽在缓冲液(100mM Hepes，pH 8)和标准洗涤剂(标准B洗涤剂，如下所述)中的RNA酶活性。在这些实验中，使用荧光淬灭的寡核苷酸探针通过荧光确定RNA酶活性(相对荧光单位，RFU)。该探针在核酸酶降解后发出信号(RNaseAlert^TM试剂盒，整合DNA技术有限公司(Integrated DNA Technologies,Inc.)，科拉尔维尔，爱荷华州，美国)。简言之，将RNA酶在0.1M Hepes(pH 8)中稀释以获得0.1ppm的浓度，或者在水中的标准洗涤剂B洗涤液(EU，3.3g/L)(如下所述)中稀释以获得1ppm的浓度。向95μl的RNA酶样品中添加5μl的RNaseAlert^TM底物。

通过将3.33g/l的标准洗涤剂B溶解在水中来制备标准洗涤剂B洗涤液(100％)。标准洗涤剂B含有7.2％LAS、6.6％AEO Biosoft N25-7(Nl)、4.2％AEOS(SLES)、6％MPG(单丙二醇)、3％乙醇、3％TEA(三乙醇胺)、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、1.2％氢氧化钠、2％柠檬酸钠、1％甲酸钠、0.2％DTMPA和0.2％PCA(丙烯酸)。所有百分比均为w/w(重量/重量)。

在22℃使用

微板读数器(分子仪器公司(Molecular Devices))(在490nm处激发，在520nm处发射)测量动力学曲线10min。在含有不含酶的RNaseAlert^TM荧光淬灭的寡核苷酸底物的对照中未检测到活性。下表中的数据通常报告为“初始RFU”。在其他研究中，数据可以是在整个10min测量中报告为总RFU的数据。本文单个表中的报告方法是一致的。

下表3显示了在缓冲液或标准洗涤剂B中测量的RNA酶活性。相同多肽的不同行代表单独的实验样品。

这些数据表明，在该测定中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6在缓冲液和标准洗涤剂B两者中均具有RNA酶活性。数据表明，标准洗涤剂B中的RNA酶活性高于缓冲液中的RNA酶活性。

实例6.使用RNA酶通过洗涤从纺织品中去除RNA

在一组测定中，测试了核酸内切酶1核糖核酸酶多肽从弄脏的待洗衣物中去除RNA的能力。分别使用弄脏的袜子和弄脏的枕套。

对于袜子，使用了来自十二对不同袜子的十二只袜子(每对一只袜子)(沃里克伊奎斯特公司(Warwick Equest))。从每只袜子切下四个1cm直径的小块布样-两个小块布样来自该袜子的脚底，两个小块布样来自该袜子的脚后跟。将每个脚底小块布样与来自同一只袜子的脚后跟小块布样配对，并将配对的小块布样一起添加到24深孔板的孔中(总共24个孔，每个孔包含来自同一只袜子的脚底和脚后跟小块布样)。用含有SEQ ID NO:3的多肽的洗涤剂组合物洗涤六个孔。用含有SEQ ID NO:6的多肽的洗涤剂组合物洗涤六个孔。用不含多肽(阴性对照)的洗涤剂组合物洗涤六个孔。针对枕套使用类似的程序。

如下进行洗涤。向每个孔中添加2mL的标准洗涤剂B洗涤液(EU，3.3g/L)。对于每个实验孔，RNA酶多肽也以1ppm存在。对于每个对照孔，不存在RNA酶多肽。因此，使用EU条件：3.3g/L洗涤剂和硬度为15°dH的水(Ca:Mg:NaHCO₃ 4:1:1.5)。然后将该24深孔板在30℃伴随振荡(800rpm)孵育1小时。随后，将小块布样在水(硬度15°dH)中冲洗，并且干燥。

为了从小块布样中提取剩余的RNA以确定RNA的量，向每个孔中添加0.8mL的无RNA酶缓冲液(0.1％v/v DEPC，10mM EDTA，0.9％NaCl，pH 4.5)，并且将深孔板在室温伴随振荡(800rpm)孵育1小时。随后，按供应商协议的建议，将来自每个孔的100μl添加到100μl的Quant-IT^TM

(赛默飞世尔公司(Thermofisher))试剂中。在室温孵育3min后，在

微板读数器(分子仪器公司)中使用在500nm处的激发和在525nm处的发射在22℃测量终点荧光。从对照样品(无RNA酶)的荧光中减去实验样品(加RNA酶)的荧光，以确定与对照品相比实验样品中相对荧光单位的减少百分比(％RFU减少)。数据示于下表4中。

结果表明，当用作洗涤剂组合物的一部分时，具有RNA酶活性的多肽可减少弄脏的纺织品上的RNA的量。

实例7.洗涤剂中的生物膜洗涤

在该组测定中，测试了核酸内切酶1核糖核酸酶多肽从生物膜中去除RNA的能力。为了制作表面有生物膜的小块布样，将织物小块布样添加到12孔聚苯乙烯平底微板的每个孔中。然后向每个孔中添加细菌生长培养基。分别地，使克氏库克菌(Kocuria kristinae)细菌的菌株在液体培养基中生长，将其洗涤并重悬于无菌缓冲液中。将等体积的重悬细菌添加到每个微板孔中。然后将这些微板在37℃孵育72小时。通过温和的洗涤/冲洗小块布样以除去非粘附细胞。

然后将具有克氏库克菌生物膜的五块冲洗过的小块布样添加到50ml试管中，并添加10mL的洗涤剂洗涤溶液，该洗涤剂洗涤溶液包含提及的浓度的以下洗涤剂组合物：将标准洗涤剂A(EU，3.3g/L，水硬度15°dH)与0.7g/L污垢(Pigmentschmutz，09V，wfk，克雷费尔德(Krefeld)，德国)和RNA酶SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:6(2ppm)一起添加。在实例3所述的合成寡核苷酸底物测定中RNA酶具有活性。

通过将含有12％LAS、1.1％AEO Biosoft N25-7(Nl)、7％AEOS(SLES)、6％MPG、3％乙醇、3％TEA(三乙醇胺)、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、2％氢氧化钠、2％柠檬酸钠、1％甲酸钠、0.2％DTMPA和0.2％PCA(所有的百分数都是w/w(重量体积))的3.33g/l标准洗涤剂A溶解在具有硬度15dH的水中制备标准洗涤剂A洗涤液(100％)。

在30℃，将试管放入斯图尔特(Stuart)旋转器(迷你LOM)中，持续1小时。将小块布样用自来水冲洗两次并且在滤纸上干燥过夜。作为对照，平行进行用提及的洗涤剂且不添加RNA酶的洗涤。使用Color Eye(Macbeth Color Eye 7000反射分光光度计)测量460nm处的缓解(REM)值。在入射光中没有UV的情况下进行测量。更高的值表示更多的生物膜去除。

结果表明，当用作洗涤剂组合物的一部分时，具有RNA酶活性的多肽可减少弄脏的纺织品上的生物膜的量。

实例8.另外的多肽的RNA酶活性

测试了另外的成熟多肽的RNA酶活性。这些测定类似于实例5中所述的那些，即使用了荧光淬灭的寡核苷酸探针(RNaseAlert^TM试剂盒)。如下所示，实验测试了RNA酶活性：

i)在水中(硬度15°dH)使用浓度为0.1ppm的多肽；

ii)在100mM Hepes缓冲液(pH 8)中使用浓度为0.1ppm的多肽；

iii)在100mM 3-(环己基氨基)-1-丙磺酸(CAPS缓冲液)中使用浓度为1.0ppm的多肽；

iv)在标准B洗涤剂(如实例5中所述)中使用浓度为0.1ppm的多肽；

v)在标准A洗涤剂(如下以及实例5中所述)中使用浓度为0.1ppm的多肽；以及

vi)在标准X洗涤剂(如下以及实例5中所述)中使用浓度为1.0ppm的多肽。

通过将含有12％LAS、1.1％AEO、7％AEOS(SLES)、6％MPG、3％乙醇、3％TEA(三乙醇胺)、2.75％可可皂、2.75％大豆皂、2％甘油、2％氢氧化钠、2％柠檬酸钠、1％甲酸钠、0.2％DTMPA和0.2％PCA(所有的百分数都是w/w(重量体积))的3.33g/l标准洗涤剂A溶解在具有硬度15dH的水中制备标准洗涤剂A洗涤液(100％)。

通过将含有17％LAS、2.2％AEO、20％苏打灰、12.3％含水硅酸钠、16％沸石+PCA和31％硫酸钠(所有的百分数都是w/w(重量体积))的1.75g/l标准洗涤剂X溶解在具有硬度15dH的水中制备标准洗涤剂X洗涤液(100％)。

这些实验的结果示于下表6中。

这些数据表明，在这些测定中SEQ ID NO:3、6、9和14具有RNA酶活性。

序列表

<110> 诺维信公司（Novozymes A/S）

<120> 用于清洁的核酸内切酶1 核糖核酸酶

<130> 14864-WO-PCT

<160> 36

<170> PatentIn 3.5版

<210> 1

<211> 867

<212> DNA

<213> 莫哈韦芽孢杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(864)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(78)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (79)..(864)

<400> 1

atg aca aca aaa gca agg ttt ctg ccg ctc gtc tgt gta tta ctg att 48

Met Thr Thr Lys Ala Arg Phe Leu Pro Leu Val Cys Val Leu Leu Ile

-25 -20 -15

tcc gga tgg ttt gcg ccc tct gct tca gca agc gcg caa acc gga ttg 96

Ser Gly Trp Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ser Ala Gln Thr Gly Leu

-10 -5 -1 1 5

aac ctg aat gac cgt gca gct att tct ccc gca gcc tcc gga ggc att 144

Asn Leu Asn Asp Arg Ala Ala Ile Ser Pro Ala Ala Ser Gly Gly Ile

10 15 20

ctc tca ttg gtc tct ccc gct gca cca tac acc gac aca gac acc tat 192

Leu Ser Leu Val Ser Pro Ala Ala Pro Tyr Thr Asp Thr Asp Thr Tyr

25 30 35

tat gaa ggt gct gaa gga aaa agc gga gag gcg tta aaa agc gcg ctg 240

Tyr Glu Gly Ala Glu Gly Lys Ser Gly Glu Ala Leu Lys Ser Ala Leu

40 45 50

cac cgc atc atc agc gga cat acg atg ctg tct tac agc gag gta tgg 288

His Arg Ile Ile Ser Gly His Thr Met Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp

55 60 65 70

aac gcg ctg aaa gaa acg gat gca gat ccg gca aat ccg aat aac gtc 336

Asn Ala Leu Lys Glu Thr Asp Ala Asp Pro Ala Asn Pro Asn Asn Val

75 80 85

atc ctg ctc tat acg aat gaa tcg cgt tcg aaa aac cta aac ggc ggc 384

Ile Leu Leu Tyr Thr Asn Glu Ser Arg Ser Lys Asn Leu Asn Gly Gly

90 95 100

aat gtc ggg gac tgg aac cgg gag cat gtc tgg gcg aaa tcc cat ggc 432

Asn Val Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly

105 110 115

gat ttt ggt aca agc aaa ggg ccc ggc act gac att cat cac ttg cgt 480

Asp Phe Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Ile His His Leu Arg

120 125 130

cca gca gac gtc caa gta aac agc gcc aga ggc aac ttg gac ttt gac 528

Pro Ala Asp Val Gln Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Leu Asp Phe Asp

135 140 145 150

aac ggc ggc aac gag tat gcg aaa gcg cct gga aat tac tat gat gga 576

Asn Gly Gly Asn Glu Tyr Ala Lys Ala Pro Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly

155 160 165

gat tca tgg gag ccc cgc gat gat gtg aaa ggc gat gtc gcc cgc atg 624

Asp Ser Trp Glu Pro Arg Asp Asp Val Lys Gly Asp Val Ala Arg Met

170 175 180

ctg ttt tac atg gct gtc cgt tat gaa gga gat gac ggc tac cct gac 672

Leu Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Tyr Pro Asp

185 190 195

ctt gag ctc aat gat aaa aca gga aac ggc tct gct cct tat cac gga 720

Leu Glu Leu Asn Asp Lys Thr Gly Asn Gly Ser Ala Pro Tyr His Gly

200 205 210

aaa caa tcc gcc ttg ctt gaa tgg aat agg cag gac cct gtt gat gcc 768

Lys Gln Ser Ala Leu Leu Glu Trp Asn Arg Gln Asp Pro Val Asp Ala

215 220 225 230

cgc gaa aga aaa aga aat gaa atc att tat gaa aaa tat cag cac aac 816

Arg Glu Arg Lys Arg Asn Glu Ile Ile Tyr Glu Lys Tyr Gln His Asn

235 240 245

cga aat cca ttt atc gat cac cct gaa tgg gca gac gac att tgg ccg 864

Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Asp Asp Ile Trp Pro

250 255 260

taa 867

<210> 2

<211> 288

<212> PRT

<213> 莫哈韦芽孢杆菌

<400> 2

Met Thr Thr Lys Ala Arg Phe Leu Pro Leu Val Cys Val Leu Leu Ile

-25 -20 -15

Ser Gly Trp Phe Ala Pro Ser Ala Ser Ala Ser Ala Gln Thr Gly Leu

-10 -5 -1 1 5

Asn Leu Asn Asp Arg Ala Ala Ile Ser Pro Ala Ala Ser Gly Gly Ile

10 15 20

Leu Ser Leu Val Ser Pro Ala Ala Pro Tyr Thr Asp Thr Asp Thr Tyr

25 30 35

Tyr Glu Gly Ala Glu Gly Lys Ser Gly Glu Ala Leu Lys Ser Ala Leu

40 45 50

His Arg Ile Ile Ser Gly His Thr Met Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp

55 60 65 70

Asn Ala Leu Lys Glu Thr Asp Ala Asp Pro Ala Asn Pro Asn Asn Val

75 80 85

Ile Leu Leu Tyr Thr Asn Glu Ser Arg Ser Lys Asn Leu Asn Gly Gly

90 95 100

Asn Val Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly

105 110 115

Asp Phe Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Ile His His Leu Arg

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<223> 合成构建体

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10 15 20

ctt tca tta gcc gcc ccc gct gca ccc tac act gac aca gat acc tat 192

Leu Ser Leu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Tyr Thr Asp Thr Asp Thr Tyr

25 30 35

tat gaa ggg act gaa gga aaa aca gga gaa tcg cta aaa aac gcc ttg 240

Tyr Glu Gly Thr Glu Gly Lys Thr Gly Glu Ser Leu Lys Asn Ala Leu

40 45 50

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His Arg Ile Ile Ser Gly His Thr Met Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp

55 60 65 70

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Asn Ala Leu Lys Glu Thr Asp Glu Asp Pro Arg Asn Pro Asn Asn Val

75 80 85

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90 95 100

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105 110 115

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120 125 130

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Pro Ala Asp Val Gln Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Met Asp Phe Asp

135 140 145 150

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155 160 165

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Asp Ser Trp Glu Pro Arg Asp Asp Val Lys Gly Asp Val Ala Arg Met

170 175 180

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185 190 195

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200 205 210

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215 220 225 230

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235 240 245

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250 255 260

taa 867

<210> 13

<211> 288

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 13

Met Thr Lys Lys Ala Trp Phe Leu Pro Leu Val Cys Val Leu Leu Ile

-25 -20 -15

Ser Gly Trp Phe Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ser Pro Gln Thr Ala Leu

-10 -5 -1 1 5

Ser Leu Asn Asp Arg Phe Ala Ser Ser Pro Ser Gly Thr Gly Gly Leu

10 15 20

Leu Ser Leu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Tyr Thr Asp Thr Asp Thr Tyr

25 30 35

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40 45 50

His Arg Ile Ile Ser Gly His Thr Met Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp

55 60 65 70

Asn Ala Leu Lys Glu Thr Asp Glu Asp Pro Arg Asn Pro Asn Asn Val

75 80 85

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90 95 100

Asn Val Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly

105 110 115

Asp Phe Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Ile His His Leu Arg

120 125 130

Pro Ala Asp Val Gln Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Met Asp Phe Asp

135 140 145 150

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155 160 165

Asp Ser Trp Glu Pro Arg Asp Asp Val Lys Gly Asp Val Ala Arg Met

170 175 180

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185 190 195

Leu Glu Leu Asn Asp Lys Thr Gly Asn Gly Ser Ala Pro Tyr His Gly

200 205 210

Lys Gln Ser Val Leu Leu Glu Trp Asn Lys Gln Asp Pro Val Asp Asp

215 220 225 230

Arg Glu Arg Lys Arg Asn Glu Ile Ile Tyr Glu Lys Tyr Gln His Asn

235 240 245

Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Asp Glu Ile Trp Pro

250 255 260

<210> 14

<211> 262

<212> PRT

<213> 枯草芽孢杆菌

<400> 14

Ser Pro Gln Thr Ala Leu Ser Leu Asn Asp Arg Phe Ala Ser Ser Pro

1 5 10 15

Ser Gly Thr Gly Gly Leu Leu Ser Leu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Tyr

20 25 30

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50 55 60

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180 185 190

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195 200 205

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260

<210> 15

<211> 867

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 密码子优化的合成序列

<220>

<221> CDS

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<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(78)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (79)..(864)

<400> 15

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-25 -20 -15

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-10 -5 -1 1 5

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Ser Leu Asn Asp Arg Phe Ala Ser Ser Pro Ser Gly Thr Gly Gly Leu

10 15 20

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Leu Ser Leu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Tyr Thr Asp Thr Asp Thr Tyr

25 30 35

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40 45 50

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His Arg Ile Ile Ser Gly His Thr Met Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp

55 60 65 70

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Asn Ala Leu Lys Glu Thr Asp Glu Asp Pro Arg Asn Pro Asn Asn Val

75 80 85

atc ctt ctt tac act aac gaa tct cgt agc aaa aac tta aac ggt gga 384

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90 95 100

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Asn Val Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly

105 110 115

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120 125 130

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Pro Ala Asp Val Gln Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Met Asp Phe Asp

135 140 145 150

aac ggt ggt aca gaa cat gca aaa gct cct gga aac tac tat gat gga 576

Asn Gly Gly Thr Glu His Ala Lys Ala Pro Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly

155 160 165

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170 175 180

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Leu Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Tyr Pro Asp

185 190 195

ttg gaa ttg aac gac aaa act gga aat ggc tct gca ccg tac cat ggt 720

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200 205 210

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215 220 225 230

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235 240 245

cgc aat ccg ttt atc gac cac ccg gag tgg gca gat gaa atc tgg cca 864

Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Asp Glu Ile Trp Pro

250 255 260

taa 867

<210> 16

<211> 288

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成构建体

<400> 16

Met Thr Lys Lys Ala Trp Phe Leu Pro Leu Val Cys Val Leu Leu Ile

-25 -20 -15

Ser Gly Trp Phe Ala Pro Ala Ala Ser Ala Ser Pro Gln Thr Ala Leu

-10 -5 -1 1 5

Ser Leu Asn Asp Arg Phe Ala Ser Ser Pro Ser Gly Thr Gly Gly Leu

10 15 20

Leu Ser Leu Ala Ala Pro Ala Ala Pro Tyr Thr Asp Thr Asp Thr Tyr

25 30 35

Tyr Glu Gly Thr Glu Gly Lys Thr Gly Glu Ser Leu Lys Asn Ala Leu

40 45 50

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55 60 65 70

Asn Ala Leu Lys Glu Thr Asp Glu Asp Pro Arg Asn Pro Asn Asn Val

75 80 85

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90 95 100

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105 110 115

Asp Phe Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Ile His His Leu Arg

120 125 130

Pro Ala Asp Val Gln Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Met Asp Phe Asp

135 140 145 150

Asn Gly Gly Thr Glu His Ala Lys Ala Pro Gly Asn Tyr Tyr Asp Gly

155 160 165

Asp Ser Trp Glu Pro Arg Asp Asp Val Lys Gly Asp Val Ala Arg Met

170 175 180

Leu Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Tyr Pro Asp

185 190 195

Leu Glu Leu Asn Asp Lys Thr Gly Asn Gly Ser Ala Pro Tyr His Gly

200 205 210

Lys Gln Ser Val Leu Leu Glu Trp Asn Lys Gln Asp Pro Val Asp Asp

215 220 225 230

Arg Glu Arg Lys Arg Asn Glu Ile Ile Tyr Glu Lys Tyr Gln His Asn

235 240 245

Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Asp Glu Ile Trp Pro

250 255 260

<210> 17

<211> 774

<212> DNA

<213> 披发糖多孢菌

<220>

<221> CDS

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<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(81)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (82)..(771)

<400> 17

atg aag acc acc cga ttg aag tcg tta tcc ctg tta ctc ggc atc gcc 48

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-25 -20 -15

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Leu Val Ala Ile Pro Val Pro Ser Ala Ala Ala Ser Thr Ala Asp Asp

-10 -5 -1 1 5

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Tyr Tyr Gln Asp Ala Ile Gly Lys Thr Gly Pro Glu Leu Glu Ala Ala

10 15 20

ctg cac cag atc atc agc agc ggc acc acc acg ttg agc tac gac gag 192

Leu His Gln Ile Ile Ser Ser Gly Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Glu

25 30 35

gtg tgg gac gcg ctc aag gtc acc gac gag gac ccg aac aac acc aac 240

Val Trp Asp Ala Leu Lys Val Thr Asp Glu Asp Pro Asn Asn Thr Asn

40 45 50

aac gtg gtc ctg ctc tac acc ggc cgg tcg cag agc aag gac tcc aac 288

Asn Val Val Leu Leu Tyr Thr Gly Arg Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asn

55 60 65

ggc ggc gac gcc gac gac tgg aac cgc gag cac gtc tgg gcc aag tcg 336

Gly Gly Asp Ala Asp Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser

70 75 80 85

cac ggc gac ttc ggc acc gcg ccc ggt ccc ggc acc gac gtc cac cac 384

His Gly Asp Phe Gly Thr Ala Pro Gly Pro Gly Thr Asp Val His His

90 95 100

ctg cgc ccg acc gac gtc tcg gtc aac tcc gag cgc ggc agc aag gac 432

Leu Arg Pro Thr Asp Val Ser Val Asn Ser Glu Arg Gly Ser Lys Asp

105 110 115

ttc gac atg ggc ggc gac gag gtc gcc gag gcg ccc ggc aac ttc acc 480

Phe Asp Met Gly Gly Asp Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Asn Phe Thr

120 125 130

gac ggc gac tcg tgg gag ccg cgc gac gag gtc aag ggc gac gtc gcc 528

Asp Gly Asp Ser Trp Glu Pro Arg Asp Glu Val Lys Gly Asp Val Ala

135 140 145

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150 155 160 165

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170 175 180

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185 190 195

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200 205 210

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His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Val Ala Glu Ile

215 220 225

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Trp

230

<210> 18

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<212> PRT

<213> 披发糖多孢菌

<400> 18

Met Lys Thr Thr Arg Leu Lys Ser Leu Ser Leu Leu Leu Gly Ile Ala

-25 -20 -15

Leu Val Ala Ile Pro Val Pro Ser Ala Ala Ala Ser Thr Ala Asp Asp

-10 -5 -1 1 5

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10 15 20

Leu His Gln Ile Ile Ser Ser Gly Thr Thr Thr Leu Ser Tyr Asp Glu

25 30 35

Val Trp Asp Ala Leu Lys Val Thr Asp Glu Asp Pro Asn Asn Thr Asn

40 45 50

Asn Val Val Leu Leu Tyr Thr Gly Arg Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asn

55 60 65

Gly Gly Asp Ala Asp Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser

70 75 80 85

His Gly Asp Phe Gly Thr Ala Pro Gly Pro Gly Thr Asp Val His His

90 95 100

Leu Arg Pro Thr Asp Val Ser Val Asn Ser Glu Arg Gly Ser Lys Asp

105 110 115

Phe Asp Met Gly Gly Asp Glu Val Ala Glu Ala Pro Gly Asn Phe Thr

120 125 130

Asp Gly Asp Ser Trp Glu Pro Arg Asp Glu Val Lys Gly Asp Val Ala

135 140 145

Arg Met Ile Phe Tyr Met Ser Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Phe

150 155 160 165

Ala Asp Leu Glu Val Asn Asp Glu Val Gly Asn Gly Ser Ala Pro His

170 175 180

Ile Gly Arg Val Ser Val Leu Lys Gln Trp His Glu Gln Asp Pro Pro

185 190 195

Asp Ala Ala Glu Gln Arg Arg Asn Gln Val Ile Phe Asp Gln Phe Gln

200 205 210

His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Val Ala Glu Ile

215 220 225

Trp

230

<210> 19

<211> 230

<212> PRT

<213> 披发糖多孢菌

<400> 19

Ser Thr Ala Asp Asp Tyr Tyr Gln Asp Ala Ile Gly Lys Thr Gly Pro

1 5 10 15

Glu Leu Glu Ala Ala Leu His Gln Ile Ile Ser Ser Gly Thr Thr Thr

20 25 30

Leu Ser Tyr Asp Glu Val Trp Asp Ala Leu Lys Val Thr Asp Glu Asp

35 40 45

Pro Asn Asn Thr Asn Asn Val Val Leu Leu Tyr Thr Gly Arg Ser Gln

50 55 60

Ser Lys Asp Ser Asn Gly Gly Asp Ala Asp Asp Trp Asn Arg Glu His

65 70 75 80

Val Trp Ala Lys Ser His Gly Asp Phe Gly Thr Ala Pro Gly Pro Gly

85 90 95

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100 105 110

Arg Gly Ser Lys Asp Phe Asp Met Gly Gly Asp Glu Val Ala Glu Ala

115 120 125

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130 135 140

Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile Phe Tyr Met Ser Val Arg Tyr Glu

145 150 155 160

Gly Asp Asp Gly Phe Ala Asp Leu Glu Val Asn Asp Glu Val Gly Asn

165 170 175

Gly Ser Ala Pro His Ile Gly Arg Val Ser Val Leu Lys Gln Trp His

180 185 190

Glu Gln Asp Pro Pro Asp Ala Ala Glu Gln Arg Arg Asn Gln Val Ile

195 200 205

Phe Asp Gln Phe Gln His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu

210 215 220

Trp Val Ala Glu Ile Trp

225 230

<210> 20

<211> 822

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(819)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(75)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (76)..(819)

<400> 20

atg aac cga aag tgt ctc ata ccg ttt att ttg atg ctg tca gcg atg 48

Met Asn Arg Lys Cys Leu Ile Pro Phe Ile Leu Met Leu Ser Ala Met

-25 -20 -15 -10

tgc gcg ccc acc caa aac gca gaa gcc ttc cag ttg ttt tcc tta cac 96

Cys Ala Pro Thr Gln Asn Ala Glu Ala Phe Gln Leu Phe Ser Leu His

-5 -1 1 5

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Val Gln Pro His Gln Ser Ser Ala Pro Ala Asp Tyr Tyr Glu Gln Ala

10 15 20

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Gln Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys Gln Ala Leu His Asp Thr Ile

25 30 35

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Asp Asp His Arg Glu Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp Glu Ala Leu Lys

40 45 50 55

gca acg gac gaa gat ccg gcc aat cga aat aac gtg att ctc ata tat 288

Ala Thr Asp Glu Asp Pro Ala Asn Arg Asn Asn Val Ile Leu Ile Tyr

60 65 70

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Ser Arg Glu Ser Arg Ser Lys Gln Ala Asn Gly Gly Gln Thr Gly Asp

75 80 85

tgg aac cgc gag cac gta tgg gca aaa tcg cac ggt gat ttc gga aca 384

Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly Asp Phe Gly Thr

90 95 100

agc aaa gga ccc gga aca gat ttg cat cat ctc agg ccc agc gat gtg 432

Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Leu His His Leu Arg Pro Ser Asp Val

105 110 115

caa gta aac gcc gcc cgc gga aac ctt gat ttc gac gaa ggc ggc agc 480

Gln Val Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Asp Phe Asp Glu Gly Gly Ser

120 125 130 135

ccc tat ccc ggt tct ccc gga aac cgc tat gac ggc gat tcc tgg gaa 528

Pro Tyr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Arg Tyr Asp Gly Asp Ser Trp Glu

140 145 150

cct gac aaa agc att aaa ggc gat gtc gcc aga atg att ttc tat atg 576

Pro Asp Lys Ser Ile Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile Phe Tyr Met

155 160 165

gcg gtc cgc tat gaa ggg gac gac ggc cag ccg gat ctt gaa atg aac 624

Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Gln Pro Asp Leu Glu Met Asn

170 175 180

gac aca acg aac aac gga tct aaa ccg tac cac gga aaa atg tcg gtt 672

Asp Thr Thr Asn Asn Gly Ser Lys Pro Tyr His Gly Lys Met Ser Val

185 190 195

tta ttg aaa tgg cac cat gaa gat cct gtc gat gcc ctt gaa aga aag 720

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200 205 210 215

cgg aac gac atc atc tat cag caa tac cag cat aac cgc aat cca ttc 768

Arg Asn Asp Ile Ile Tyr Gln Gln Tyr Gln His Asn Arg Asn Pro Phe

220 225 230

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Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Glu Asp Ile Trp Gly Ser Gly Val Leu

235 240 245

aat tga 822

Asn

<210> 21

<211> 273

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 21

Met Asn Arg Lys Cys Leu Ile Pro Phe Ile Leu Met Leu Ser Ala Met

-25 -20 -15 -10

Cys Ala Pro Thr Gln Asn Ala Glu Ala Phe Gln Leu Phe Ser Leu His

-5 -1 1 5

Val Gln Pro His Gln Ser Ser Ala Pro Ala Asp Tyr Tyr Glu Gln Ala

10 15 20

Gln Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys Gln Ala Leu His Asp Thr Ile

25 30 35

Asp Asp His Arg Glu Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp Glu Ala Leu Lys

40 45 50 55

Ala Thr Asp Glu Asp Pro Ala Asn Arg Asn Asn Val Ile Leu Ile Tyr

60 65 70

Ser Arg Glu Ser Arg Ser Lys Gln Ala Asn Gly Gly Gln Thr Gly Asp

75 80 85

Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly Asp Phe Gly Thr

90 95 100

Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Leu His His Leu Arg Pro Ser Asp Val

105 110 115

Gln Val Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Asp Phe Asp Glu Gly Gly Ser

120 125 130 135

Pro Tyr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Arg Tyr Asp Gly Asp Ser Trp Glu

140 145 150

Pro Asp Lys Ser Ile Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile Phe Tyr Met

155 160 165

Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Gln Pro Asp Leu Glu Met Asn

170 175 180

Asp Thr Thr Asn Asn Gly Ser Lys Pro Tyr His Gly Lys Met Ser Val

185 190 195

Leu Leu Lys Trp His His Glu Asp Pro Val Asp Ala Leu Glu Arg Lys

200 205 210 215

Arg Asn Asp Ile Ile Tyr Gln Gln Tyr Gln His Asn Arg Asn Pro Phe

220 225 230

Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Glu Asp Ile Trp Gly Ser Gly Val Leu

235 240 245

Asn

<210> 22

<211> 248

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 22

Phe Gln Leu Phe Ser Leu His Val Gln Pro His Gln Ser Ser Ala Pro

1 5 10 15

Ala Asp Tyr Tyr Glu Gln Ala Gln Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys

20 25 30

Gln Ala Leu His Asp Thr Ile Asp Asp His Arg Glu Leu Ser Tyr Ser

35 40 45

Glu Val Trp Glu Ala Leu Lys Ala Thr Asp Glu Asp Pro Ala Asn Arg

50 55 60

Asn Asn Val Ile Leu Ile Tyr Ser Arg Glu Ser Arg Ser Lys Gln Ala

65 70 75 80

Asn Gly Gly Gln Thr Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys

85 90 95

Ser His Gly Asp Phe Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Leu His

100 105 110

His Leu Arg Pro Ser Asp Val Gln Val Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu

115 120 125

Asp Phe Asp Glu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Arg

130 135 140

Tyr Asp Gly Asp Ser Trp Glu Pro Asp Lys Ser Ile Lys Gly Asp Val

145 150 155 160

Ala Arg Met Ile Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly

165 170 175

Gln Pro Asp Leu Glu Met Asn Asp Thr Thr Asn Asn Gly Ser Lys Pro

180 185 190

Tyr His Gly Lys Met Ser Val Leu Leu Lys Trp His His Glu Asp Pro

195 200 205

Val Asp Ala Leu Glu Arg Lys Arg Asn Asp Ile Ile Tyr Gln Gln Tyr

210 215 220

Gln His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Glu Asp

225 230 235 240

Ile Trp Gly Ser Gly Val Leu Asn

245

<210> 23

<211> 822

<212> DNA

<213> 嗜热一氧化碳链霉菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(819)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(105)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (106)..(819)

<400> 23

atg cct gtt gtg cgc ata cgc cgc cgg aag gcg gtg gcg ctg gcg agc 48

Met Pro Val Val Arg Ile Arg Arg Arg Lys Ala Val Ala Leu Ala Ser

-35 -30 -25 -20

gcc gcc gtc ctc gcc gga ctc gcc gtc ccc gcc ctc acc ccc gcc acg 96

Ala Ala Val Leu Ala Gly Leu Ala Val Pro Ala Leu Thr Pro Ala Thr

-15 -10 -5

gcc ggc gcc tcg gcg ccc gcc ccc gag acc cgg gcc gcc gcg gtg gcc 144

Ala Gly Ala Ser Ala Pro Ala Pro Glu Thr Arg Ala Ala Ala Val Ala

-1 1 5 10

gac tac tac gag ggc gcc gag ggc aag acc ggc gag gcc ctc aag tcc 192

Asp Tyr Tyr Glu Gly Ala Glu Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys Ser

15 20 25

gcc ctc aac tcg atc atc agc gac cag acg aag ctg tcg tac tcg gcc 240

Ala Leu Asn Ser Ile Ile Ser Asp Gln Thr Lys Leu Ser Tyr Ser Ala

30 35 40 45

gtc tgg gac gcc ctc aag gag acc gac gag gac ccg tcg aac agc ggc 288

Val Trp Asp Ala Leu Lys Glu Thr Asp Glu Asp Pro Ser Asn Ser Gly

50 55 60

aac gtg atc ctg ctg tac tcc ggc gtc tcc cgc agc aag tcg ctc aac 336

Asn Val Ile Leu Leu Tyr Ser Gly Val Ser Arg Ser Lys Ser Leu Asn

65 70 75

ggc ggt gac gtg ggc gac tgg aac cgc gag cac gtc tgg gcc aag tcc 384

Gly Gly Asp Val Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser

80 85 90

cac ggc gac ttc ggc acc tcc acc ggc ccc ggc acc gac atc cac cac 432

His Gly Asp Phe Gly Thr Ser Thr Gly Pro Gly Thr Asp Ile His His

95 100 105

ctg cgt ccg tcg gac gtc cag gtc aac agc gtc cgc ggc aac aag gac 480

Leu Arg Pro Ser Asp Val Gln Val Asn Ser Val Arg Gly Asn Lys Asp

110 115 120 125

ttc gac aac ggc ggc agc gcc gtc gcg aac ggc ggg ggc agc ctc acc 528

Phe Asp Asn Gly Gly Ser Ala Val Ala Asn Gly Gly Gly Ser Leu Thr

130 135 140

gac tcc gac tcc ttc gag ccg cgc gac gcg gtc aag ggc gac gtg gcc 576

Asp Ser Asp Ser Phe Glu Pro Arg Asp Ala Val Lys Gly Asp Val Ala

145 150 155

cgc atg atc ttc tac atg gcg gtc cgc tac gag ggc acc gac ggc tgg 624

Arg Met Ile Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Thr Asp Gly Trp

160 165 170

ccc gac ctg gag ccg aac aac agc gtg agc aac ggc tcc gcg ccg tac 672

Pro Asp Leu Glu Pro Asn Asn Ser Val Ser Asn Gly Ser Ala Pro Tyr

175 180 185

atc ggc aag ctc tcg gta ctc aag gag tgg aac gaa cag gac ccg ccg 720

Ile Gly Lys Leu Ser Val Leu Lys Glu Trp Asn Glu Gln Asp Pro Pro

190 195 200 205

gac gcc ttc gag cag cac cgc aac gac gtg atc tac gag tcg tac cag 768

Asp Ala Phe Glu Gln His Arg Asn Asp Val Ile Tyr Glu Ser Tyr Gln

210 215 220

cac aac cgg aac ccg ttc atc gac cac ccg gag tgg gtc gag tcg atc 816

His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Val Glu Ser Ile

225 230 235

tgg tag 822

Trp

<210> 24

<211> 273

<212> PRT

<213> 嗜热一氧化碳链霉菌

<400> 24

Met Pro Val Val Arg Ile Arg Arg Arg Lys Ala Val Ala Leu Ala Ser

-35 -30 -25 -20

Ala Ala Val Leu Ala Gly Leu Ala Val Pro Ala Leu Thr Pro Ala Thr

-15 -10 -5

Ala Gly Ala Ser Ala Pro Ala Pro Glu Thr Arg Ala Ala Ala Val Ala

-1 1 5 10

Asp Tyr Tyr Glu Gly Ala Glu Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys Ser

15 20 25

Ala Leu Asn Ser Ile Ile Ser Asp Gln Thr Lys Leu Ser Tyr Ser Ala

30 35 40 45

Val Trp Asp Ala Leu Lys Glu Thr Asp Glu Asp Pro Ser Asn Ser Gly

50 55 60

Asn Val Ile Leu Leu Tyr Ser Gly Val Ser Arg Ser Lys Ser Leu Asn

65 70 75

Gly Gly Asp Val Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser

80 85 90

His Gly Asp Phe Gly Thr Ser Thr Gly Pro Gly Thr Asp Ile His His

95 100 105

Leu Arg Pro Ser Asp Val Gln Val Asn Ser Val Arg Gly Asn Lys Asp

110 115 120 125

Phe Asp Asn Gly Gly Ser Ala Val Ala Asn Gly Gly Gly Ser Leu Thr

130 135 140

Asp Ser Asp Ser Phe Glu Pro Arg Asp Ala Val Lys Gly Asp Val Ala

145 150 155

Arg Met Ile Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Thr Asp Gly Trp

160 165 170

Pro Asp Leu Glu Pro Asn Asn Ser Val Ser Asn Gly Ser Ala Pro Tyr

175 180 185

Ile Gly Lys Leu Ser Val Leu Lys Glu Trp Asn Glu Gln Asp Pro Pro

190 195 200 205

Asp Ala Phe Glu Gln His Arg Asn Asp Val Ile Tyr Glu Ser Tyr Gln

210 215 220

His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Val Glu Ser Ile

225 230 235

Trp

<210> 25

<211> 238

<212> PRT

<213> 嗜热一氧化碳链霉菌

<400> 25

Ser Ala Pro Ala Pro Glu Thr Arg Ala Ala Ala Val Ala Asp Tyr Tyr

1 5 10 15

Glu Gly Ala Glu Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys Ser Ala Leu Asn

20 25 30

Ser Ile Ile Ser Asp Gln Thr Lys Leu Ser Tyr Ser Ala Val Trp Asp

35 40 45

Ala Leu Lys Glu Thr Asp Glu Asp Pro Ser Asn Ser Gly Asn Val Ile

50 55 60

Leu Leu Tyr Ser Gly Val Ser Arg Ser Lys Ser Leu Asn Gly Gly Asp

65 70 75 80

Val Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly Asp

85 90 95

Phe Gly Thr Ser Thr Gly Pro Gly Thr Asp Ile His His Leu Arg Pro

100 105 110

Ser Asp Val Gln Val Asn Ser Val Arg Gly Asn Lys Asp Phe Asp Asn

115 120 125

Gly Gly Ser Ala Val Ala Asn Gly Gly Gly Ser Leu Thr Asp Ser Asp

130 135 140

Ser Phe Glu Pro Arg Asp Ala Val Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile

145 150 155 160

Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Thr Asp Gly Trp Pro Asp Leu

165 170 175

Glu Pro Asn Asn Ser Val Ser Asn Gly Ser Ala Pro Tyr Ile Gly Lys

180 185 190

Leu Ser Val Leu Lys Glu Trp Asn Glu Gln Asp Pro Pro Asp Ala Phe

195 200 205

Glu Gln His Arg Asn Asp Val Ile Tyr Glu Ser Tyr Gln His Asn Arg

210 215 220

Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Val Glu Ser Ile Trp

225 230 235

<210> 26

<211> 822

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(819)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(75)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (76)..(819)

<400> 26

atg aat cga aaa tgt ctc ata ccg ttt att ttg atg ttg tcg gcg atg 48

Met Asn Arg Lys Cys Leu Ile Pro Phe Ile Leu Met Leu Ser Ala Met

-25 -20 -15 -10

tgc gcg ccc acc caa aac gca gaa gcc ttc cag ttg ttt tcc tta cac 96

Cys Ala Pro Thr Gln Asn Ala Glu Ala Phe Gln Leu Phe Ser Leu His

-5 -1 1 5

gtc cag ccc cat cag tcc tcg gct ccg gcg gat tac tac gaa cag gca 144

Val Gln Pro His Gln Ser Ser Ala Pro Ala Asp Tyr Tyr Glu Gln Ala

10 15 20

caa ggc aaa aca ggc gaa gct tta aaa caa gcg ctt cac gac aca atc 192

Gln Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys Gln Ala Leu His Asp Thr Ile

25 30 35

gac gat cat aga gag ctt tct tac agt gag gta tgg gaa gcg ctg aaa 240

Asp Asp His Arg Glu Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp Glu Ala Leu Lys

40 45 50 55

gca acg gac gaa gat ccg gcc aat cga aat cac gtg att ctc tta tat 288

Ala Thr Asp Glu Asp Pro Ala Asn Arg Asn His Val Ile Leu Leu Tyr

60 65 70

tcc agg gag tcg cgc tct aaa cag gcg aac ggg ggg caa acc ggc gat 336

Ser Arg Glu Ser Arg Ser Lys Gln Ala Asn Gly Gly Gln Thr Gly Asp

75 80 85

tgg aac cgc gag cac gta tgg gca aaa tcg cac ggc gat ttc gga aca 384

Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly Asp Phe Gly Thr

90 95 100

agc aaa ggg ccc gga aca gat ttg cat cat ctc agg ccc agc gat gta 432

Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Leu His His Leu Arg Pro Ser Asp Val

105 110 115

caa gta aac gcc gcc cgc gga aac ctt gat ttc gac gaa ggc ggc agc 480

Gln Val Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Asp Phe Asp Glu Gly Gly Ser

120 125 130 135

ccc tat ccc ggt tcc ccc gga aac cgc tat gac ggc gat tcc tgg gaa 528

Pro Tyr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Arg Tyr Asp Gly Asp Ser Trp Glu

140 145 150

cct gac aaa agc att aaa ggc gat gtc gcc aga atg att ttc tat atg 576

Pro Asp Lys Ser Ile Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile Phe Tyr Met

155 160 165

gcg gtc cgc tat gaa gga gat gac ggt cat ccg gat ctt gaa atg aac 624

Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly His Pro Asp Leu Glu Met Asn

170 175 180

gac aca acg aac aac gga tct aaa cca tac cac gga aaa atg tcg gtt 672

Asp Thr Thr Asn Asn Gly Ser Lys Pro Tyr His Gly Lys Met Ser Val

185 190 195

tta ttg aaa tgg cac cat gaa gac cct gtc gat gcc ctc gaa aga aag 720

Leu Leu Lys Trp His His Glu Asp Pro Val Asp Ala Leu Glu Arg Lys

200 205 210 215

cgg aac gac atc atc tat cag caa tac cag cat aac cgc aat cca ttc 768

Arg Asn Asp Ile Ile Tyr Gln Gln Tyr Gln His Asn Arg Asn Pro Phe

220 225 230

att gat cac cct gaa tgg gcg gag gat att tgg gga tca gac gtt ttg 816

Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Glu Asp Ile Trp Gly Ser Asp Val Leu

235 240 245

aat tga 822

Asn

<210> 27

<211> 273

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 27

Met Asn Arg Lys Cys Leu Ile Pro Phe Ile Leu Met Leu Ser Ala Met

-25 -20 -15 -10

Cys Ala Pro Thr Gln Asn Ala Glu Ala Phe Gln Leu Phe Ser Leu His

-5 -1 1 5

Val Gln Pro His Gln Ser Ser Ala Pro Ala Asp Tyr Tyr Glu Gln Ala

10 15 20

Gln Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys Gln Ala Leu His Asp Thr Ile

25 30 35

Asp Asp His Arg Glu Leu Ser Tyr Ser Glu Val Trp Glu Ala Leu Lys

40 45 50 55

Ala Thr Asp Glu Asp Pro Ala Asn Arg Asn His Val Ile Leu Leu Tyr

60 65 70

Ser Arg Glu Ser Arg Ser Lys Gln Ala Asn Gly Gly Gln Thr Gly Asp

75 80 85

Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys Ser His Gly Asp Phe Gly Thr

90 95 100

Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Leu His His Leu Arg Pro Ser Asp Val

105 110 115

Gln Val Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu Asp Phe Asp Glu Gly Gly Ser

120 125 130 135

Pro Tyr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Arg Tyr Asp Gly Asp Ser Trp Glu

140 145 150

Pro Asp Lys Ser Ile Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile Phe Tyr Met

155 160 165

Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly His Pro Asp Leu Glu Met Asn

170 175 180

Asp Thr Thr Asn Asn Gly Ser Lys Pro Tyr His Gly Lys Met Ser Val

185 190 195

Leu Leu Lys Trp His His Glu Asp Pro Val Asp Ala Leu Glu Arg Lys

200 205 210 215

Arg Asn Asp Ile Ile Tyr Gln Gln Tyr Gln His Asn Arg Asn Pro Phe

220 225 230

Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Glu Asp Ile Trp Gly Ser Asp Val Leu

235 240 245

Asn

<210> 28

<211> 248

<212> PRT

<213> 地衣芽孢杆菌

<400> 28

Phe Gln Leu Phe Ser Leu His Val Gln Pro His Gln Ser Ser Ala Pro

1 5 10 15

Ala Asp Tyr Tyr Glu Gln Ala Gln Gly Lys Thr Gly Glu Ala Leu Lys

20 25 30

Gln Ala Leu His Asp Thr Ile Asp Asp His Arg Glu Leu Ser Tyr Ser

35 40 45

Glu Val Trp Glu Ala Leu Lys Ala Thr Asp Glu Asp Pro Ala Asn Arg

50 55 60

Asn His Val Ile Leu Leu Tyr Ser Arg Glu Ser Arg Ser Lys Gln Ala

65 70 75 80

Asn Gly Gly Gln Thr Gly Asp Trp Asn Arg Glu His Val Trp Ala Lys

85 90 95

Ser His Gly Asp Phe Gly Thr Ser Lys Gly Pro Gly Thr Asp Leu His

100 105 110

His Leu Arg Pro Ser Asp Val Gln Val Asn Ala Ala Arg Gly Asn Leu

115 120 125

Asp Phe Asp Glu Gly Gly Ser Pro Tyr Pro Gly Ser Pro Gly Asn Arg

130 135 140

Tyr Asp Gly Asp Ser Trp Glu Pro Asp Lys Ser Ile Lys Gly Asp Val

145 150 155 160

Ala Arg Met Ile Phe Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly

165 170 175

His Pro Asp Leu Glu Met Asn Asp Thr Thr Asn Asn Gly Ser Lys Pro

180 185 190

Tyr His Gly Lys Met Ser Val Leu Leu Lys Trp His His Glu Asp Pro

195 200 205

Val Asp Ala Leu Glu Arg Lys Arg Asn Asp Ile Ile Tyr Gln Gln Tyr

210 215 220

Gln His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Glu Asp

225 230 235 240

Ile Trp Gly Ser Asp Val Leu Asn

245

<210> 29

<211> 810

<212> DNA

<213> 格氏糖多孢菌

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(807)

<220>

<221> 信号肽

<222> (1)..(81)

<220>

<221> 成熟肽

<222> (82)..(807)

<400> 29

atg ctg aag acc cgc tgg aca cgc ttc gcg ctg gca ggt gtg ctg ccg 48

Met Leu Lys Thr Arg Trp Thr Arg Phe Ala Leu Ala Gly Val Leu Pro

-25 -20 -15

ctg gcc gtg gcg ctg ccg ctg ccc gct tcc gcc gcg ccc gcc gac ctg 96

Leu Ala Val Ala Leu Pro Leu Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Asp Leu

-10 -5 -1 1 5

ggc ggc acc gac cgc ccg gtg gcg gcg gac gac tcc tac tac gaa ccg 144

Gly Gly Thr Asp Arg Pro Val Ala Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Glu Pro

10 15 20

gcg ctg ggc aag acc ggc ccg gag ctg aag gcc gcc ctc aac gac atc 192

Ala Leu Gly Lys Thr Gly Pro Glu Leu Lys Ala Ala Leu Asn Asp Ile

25 30 35

atc agc agc gcc gac cag ctc acc tac gac gag gtg tgg gac gcg ctg 240

Ile Ser Ser Ala Asp Gln Leu Thr Tyr Asp Glu Val Trp Asp Ala Leu

40 45 50

aag gtc acc gac cag gac ccg gcg aac ccg gac aac gtg atc ctg ctg 288

Lys Val Thr Asp Gln Asp Pro Ala Asn Pro Asp Asn Val Ile Leu Leu

55 60 65

tac tcg ggc cgc tcg cag ggc aag gac acc aac ggc ggc ggc gcc gac 336

Tyr Ser Gly Arg Ser Gln Gly Lys Asp Thr Asn Gly Gly Gly Ala Asp

70 75 80 85

cag tgg aac cgg gag cac acc tgg gcg aag tcg cac ggc gac ttc ggc 384

Gln Trp Asn Arg Glu His Thr Trp Ala Lys Ser His Gly Asp Phe Gly

90 95 100

acc tcg ccc ggg ccg ggc acc gac gtg cac cac ctg cgc ccg acc gac 432

Thr Ser Pro Gly Pro Gly Thr Asp Val His His Leu Arg Pro Thr Asp

105 110 115

gtc tcg gtc aac tcg gcg cgc ggc aac aag gac ttc gac atg ggc ggc 480

Val Ser Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Lys Asp Phe Asp Met Gly Gly

120 125 130

agc ccg gtc gac gag gcc gag ggc aac ttc acc gac gac gac tcc ttc 528

Ser Pro Val Asp Glu Ala Glu Gly Asn Phe Thr Asp Asp Asp Ser Phe

135 140 145

gag ccc cgc gac gag gtc aag ggc gac gtc gcc cgc atg atc atg tac 576

Glu Pro Arg Asp Glu Val Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile Met Tyr

150 155 160 165

atg gcg gtg cgc tac gaa ggc gac gac ggc gcc ccc gac ctg gag ctc 624

Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Ala Pro Asp Leu Glu Leu

170 175 180

aac gac cag gtg gac aac ggc agc gcg ccc gcg atg ggc cgc cag tcg 672

Asn Asp Gln Val Asp Asn Gly Ser Ala Pro Ala Met Gly Arg Gln Ser

185 190 195

gtg ctg ctg gag tgg aac gcc cag gac ccg ccg gac gac ttc gag aag 720

Val Leu Leu Glu Trp Asn Ala Gln Asp Pro Pro Asp Asp Phe Glu Lys

200 205 210

aac cgc aac cag gtc atc ttc gac cag ttc cag cac aac cgg aac ccg 768

Asn Arg Asn Gln Val Ile Phe Asp Gln Phe Gln His Asn Arg Asn Pro

215 220 225

ttc atc gac cac ccg gag tgg gcg gcc gac atc tgg ggc tga 810

Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Ala Asp Ile Trp Gly

230 235 240

<210> 30

<211> 269

<212> PRT

<213> 格氏糖多孢菌

<400> 30

Met Leu Lys Thr Arg Trp Thr Arg Phe Ala Leu Ala Gly Val Leu Pro

-25 -20 -15

Leu Ala Val Ala Leu Pro Leu Pro Ala Ser Ala Ala Pro Ala Asp Leu

-10 -5 -1 1 5

Gly Gly Thr Asp Arg Pro Val Ala Ala Asp Asp Ser Tyr Tyr Glu Pro

10 15 20

Ala Leu Gly Lys Thr Gly Pro Glu Leu Lys Ala Ala Leu Asn Asp Ile

25 30 35

Ile Ser Ser Ala Asp Gln Leu Thr Tyr Asp Glu Val Trp Asp Ala Leu

40 45 50

Lys Val Thr Asp Gln Asp Pro Ala Asn Pro Asp Asn Val Ile Leu Leu

55 60 65

Tyr Ser Gly Arg Ser Gln Gly Lys Asp Thr Asn Gly Gly Gly Ala Asp

70 75 80 85

Gln Trp Asn Arg Glu His Thr Trp Ala Lys Ser His Gly Asp Phe Gly

90 95 100

Thr Ser Pro Gly Pro Gly Thr Asp Val His His Leu Arg Pro Thr Asp

105 110 115

Val Ser Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Lys Asp Phe Asp Met Gly Gly

120 125 130

Ser Pro Val Asp Glu Ala Glu Gly Asn Phe Thr Asp Asp Asp Ser Phe

135 140 145

Glu Pro Arg Asp Glu Val Lys Gly Asp Val Ala Arg Met Ile Met Tyr

150 155 160 165

Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Ala Pro Asp Leu Glu Leu

170 175 180

Asn Asp Gln Val Asp Asn Gly Ser Ala Pro Ala Met Gly Arg Gln Ser

185 190 195

Val Leu Leu Glu Trp Asn Ala Gln Asp Pro Pro Asp Asp Phe Glu Lys

200 205 210

Asn Arg Asn Gln Val Ile Phe Asp Gln Phe Gln His Asn Arg Asn Pro

215 220 225

Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Ala Asp Ile Trp Gly

230 235 240

<210> 31

<211> 242

<212> PRT

<213> 格氏糖多孢菌

<400> 31

Ala Pro Ala Asp Leu Gly Gly Thr Asp Arg Pro Val Ala Ala Asp Asp

1 5 10 15

Ser Tyr Tyr Glu Pro Ala Leu Gly Lys Thr Gly Pro Glu Leu Lys Ala

20 25 30

Ala Leu Asn Asp Ile Ile Ser Ser Ala Asp Gln Leu Thr Tyr Asp Glu

35 40 45

Val Trp Asp Ala Leu Lys Val Thr Asp Gln Asp Pro Ala Asn Pro Asp

50 55 60

Asn Val Ile Leu Leu Tyr Ser Gly Arg Ser Gln Gly Lys Asp Thr Asn

65 70 75 80

Gly Gly Gly Ala Asp Gln Trp Asn Arg Glu His Thr Trp Ala Lys Ser

85 90 95

His Gly Asp Phe Gly Thr Ser Pro Gly Pro Gly Thr Asp Val His His

100 105 110

Leu Arg Pro Thr Asp Val Ser Val Asn Ser Ala Arg Gly Asn Lys Asp

115 120 125

Phe Asp Met Gly Gly Ser Pro Val Asp Glu Ala Glu Gly Asn Phe Thr

130 135 140

Asp Asp Asp Ser Phe Glu Pro Arg Asp Glu Val Lys Gly Asp Val Ala

145 150 155 160

Arg Met Ile Met Tyr Met Ala Val Arg Tyr Glu Gly Asp Asp Gly Ala

165 170 175

Pro Asp Leu Glu Leu Asn Asp Gln Val Asp Asn Gly Ser Ala Pro Ala

180 185 190

Met Gly Arg Gln Ser Val Leu Leu Glu Trp Asn Ala Gln Asp Pro Pro

195 200 205

Asp Asp Phe Glu Lys Asn Arg Asn Gln Val Ile Phe Asp Gln Phe Gln

210 215 220

His Asn Arg Asn Pro Phe Ile Asp His Pro Glu Trp Ala Ala Asp Ile

225 230 235 240

Trp Gly

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌核酸内切酶1 核糖核酸酶基序 #1

<400> 32

Asn Arg Glu His

1

<210> 33

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌核酸内切酶1 核糖核酸酶基序 #2

<220>

<221> 尚未归类的特征

<222> (2)..(2)

<223> Xaa = A(Ala) 或 E(Glu) 或 Q(Gln)

<400> 33

Asp Xaa Asp Pro

1

<210> 34

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌核酸内切酶1 核糖核酸酶基序 #3

<400> 34

Thr Asp Glu Asp Pro

1 5

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌核酸内切酶1 核糖核酸酶基序 #4

<400> 35

Asn Arg Glu His Val Trp Ala

1 5

<210> 36

<211> 27

<212> PRT

<213> 克劳氏芽孢杆菌

<400> 36

Met Lys Lys Pro Leu Gly Lys Ile Val Ala Ser Thr Ala Leu Leu Ile

1 5 10 15

Ser Val Ala Phe Ser Ser Ser Ile Ala Ser Ala

20 25

Claims (17)

1.一种具有RNA酶活性的分离的多肽，该分离的多肽选自由以下组成的组：

与下组的SEQ ID NO之一具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列，或者

与下组的SEQ ID NO之一具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、但小于100％序列同一性的氨基酸序列：

(a)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；

(b)SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6；

(c)SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9；以及

(d)SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14。

2.根据权利要求1所述的分离的多肽，其中该多肽选自SEQ ID NO的组，这些组由以下组成：

(a)SEQ ID NO:3；

(b)SEQ ID NO:6；

(c)SEQ ID NO:9；以及

(d)SEQ ID NO:14。

3.根据权利要求1或2所述的分离的多肽，其中该分离的多肽获得自微生物，优选地获得自细菌。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的分离的多肽，其中该分离的多肽另外包含以下氨基酸序列中的至少一种：NREH(SEQ ID NO:32)、D[AEQ]DP(SEQ ID NO:33)、TDEDP(SEQ IDNO:34)、SHG、和/或NREHVWA(SEQ ID NO:35)。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的分离的多肽，其中该分离的多肽是变体，该变体在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、或20位置中具有一个或多个氨基酸取代、或者一个或多个氨基酸缺失、或者一个或多个氨基酸插入、或者其任何组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的分离的多肽，其中该分离的多肽具有N-末端、C-末端、或1与10个氨基酸之间的N-末端和C-末端氨基酸延伸。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的分离的多肽，其中该分离的多肽是变体，该变体在该多肽的某一区域内具有一个或多个氨基酸取代、一个或多个氨基酸缺失、一个或多个氨基酸插入、或其任何组合，该区域不在该多肽的PF04231结构域内。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的分离的多肽，其中来自枯草芽孢杆菌的Mg²⁺活化的核糖核酸酶不包含在这些权利要求的范围内。

9.一种组合物，优选地清洁组合物，该组合物包含根据权利要求1-8中任一项所述的分离的多肽以及至少一种清洁组合物组分和/或洗涤剂辅助剂成分。

10.根据权利要求9所述的组合物，该组合物另外包含选自由以下组成的组的酶：蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、角质酶、纤维素酶、内切葡聚糖酶、木葡聚糖酶、果胶酶、果胶裂解酶、黄原胶酶、过氧化物酶、卤代过氧合酶、过氧化氢酶、和甘露聚糖酶。

11.一种用于清洁物品的方法，该方法包括使该物品与根据权利要求9或10所述的组合物或者根据权利要求1-8中任一项所述的分离的多肽接触，优选地，其中该物品是纺织品。

12.一种用于洗涤物品的方法，该方法包括：

(a)将该物品暴露于根据权利要求9或10所述的组合物；

(b)完成至少一个洗涤周期；以及

(c)任选地，冲洗该纺织品。

13.根据权利要求1-8中任一项所述的分离的多肽或者根据权利要求9或10所述的组合物用于清洁物品的用途，优选地，其中该物品是纺织品。

14.一种多核苷酸，其编码根据权利要求1-8中任一项所述的分离的多肽中的一种，优选地其中该多核苷酸的核苷酸序列不是天然存在的序列。

15.一种分离的多核苷酸，其编码具有RNA酶活性的多肽，其中该多核苷酸的序列与SEQID NO:1、4、7、10、12或15中之一具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性，或者一种分离的多核苷酸，其编码具有RNA酶活性的多肽，其中该多核苷酸的序列与SEQ ID NO:1、4、7、10、12或15中之一具有至少60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、但小于100％同一性。

16.一种核酸构建体或表达载体，该核酸构建体或表达载体包含根据权利要求14或15中任一项所述的分离的多核苷酸。

17.一种重组宿主细胞，其包含根据权利要求16所述的核酸构建体或表达载体。

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