CN112941066B

CN112941066B - 一种细菌核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用

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Publication number: CN112941066B
Application number: CN202110153620.9A
Authority: CN
Inventors: 王文轩; 胖铁良; 刘莹; 李丛笑; 张志达; 陈传红; 陈江坡; 卢孟孟
Original assignee: Beijing Zhongke Medical Laboratory Co ltd; Cangzhou Nordo Zhongke Medical Laboratory Co ltd; Shijiazhuang Nodao Medical Laboratory Co ltd; Tianjin Nuodao Medical Laboratory Center Co ltd; Langfang Norway Medical Laboratory Co ltd
Current assignee: Beijing Zhongke Medical Laboratory Co ltd; Cangzhou Nordo Zhongke Medical Laboratory Co ltd; Langfang Norway Medical Laboratory Co ltd; Shijiazhuang Nodao Medical Laboratory Co ltd; Tianjin Nuodao Medical Laboratory Center Co ltd
Priority date: 2021-02-04
Filing date: 2021-02-04
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2041-02-04
Also published as: CN112941066A

Abstract

本发明涉及一种细菌核酸提取用裂解结合液，由盐酸胍，EDTA，tritonX‑100，Tris‑HCl，CTAB的水溶液组成。该裂解结合液可以将传统的磁珠法核酸提取的先裂解后节后的步骤有机的结合在一起，可以保证所提取的核酸纯度好，浓度高。应用本发明提供的裂解结合液制备的细菌核酸提取试剂盒提取核酸时，全部核酸提取过程仅需4个步骤，完成特定核酸提取时间短，克服了现有磁珠法核酸提取方法步骤繁多的缺点；裂解与结合步骤一步完成，减少了操作步骤，该方法更适用于全自动化核酸提取应用。加大样本处理量和样本处理速率，快速高通量提取出生物样品中的核酸。

Description

一种细菌核酸提取用裂解结合液及其试剂盒和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种细菌核酸提取用裂解结合液，还涉及到应用该裂解结合液制备的细菌核酸提取的试剂盒。

背景技术

随着分子生物学技术的发展，为满足高通量处理样本和获得高质量核酸的实验要求，核酸提取分离技术也更趋向于简便快捷、高质量、高纯度和高通量发展，核酸质量的好坏直接决定了后续实验的成败。

传统提取方法如酚氯仿法、离心柱提取法、玻璃粉吸附法虽然提取效率较高，但费时费力，操作步骤繁琐，增加了样本污染的概率，且提取过程中易造成DNA损失。而采用磁珠载体的核酸提取分离技术，无需离心，操作简捷，易实现自动化和高通量，具有传统提取方法无法实现的优势。

采用磁珠提取法会用到裂解液、结合液、洗涤液和洗脱液，核酸提取率和提取纯度受上述液体影响，若提取样品的量和纯度不太高，就不能完全满足后续的实验要求。在为申请号201110124322.3一种增强的磁珠法核酸提取方法中也对传统的磁珠法核酸提取进行了改进，因当前的磁珠法核酸提取方法有两方面不足：首先是RNA的提取效率较低，其次是核酸提取步骤繁多，裂解与结合分为两步，磁珠在裂解完成之后才能加入溶液中结合核酸，不利于全自动化应用。该发明将样本的核酸裂解与核酸磁珠结合一步完成，游离的RNA在裂解液中高浓度盐和异丙醇作用下吸附到磁珠表面，最后通过磁力作用使离心管内磁珠紧贴于离心管壁，吸弃离心管内溶液，从而达到裂解和结合的目的。该发明在于核酸提取仅需4个步骤，分别是裂解与结合、清洗1、清洗2、洗脱，而前3个步骤都是通过加入异丙醇增强了溶液中磁珠吸附核酸的作用，从而增强了磁珠法核酸提取的效率，其裂解结合时，生物样品、异丙醇与裂解液的体积比为1:1:2。并且在应用于RNA提取时提供了一种高效提取RNA的方法。使得裂解与结合一步完成，在应用于自动化核酸提取时每一步骤的反应试剂可以预先灌装入该步骤对应的反应舱内，使该发明更适用于全自动化应用。但是异丙醇对眼、呼吸道的黏膜有刺激作用，能损伤视网膜及视神经，挥发性吸入时给人带来恶心难受感觉。其毒性、麻醉性以及对上呼吸道黏膜的刺激都比乙醇强。接触高浓度蒸气出现头痛、倦睡以及眼、鼻、喉刺激症状。食入或吸入大量的蒸汽可引起面红、头疼、精神抑郁、恶心、昏迷等。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种简单有效的细菌核酸提取用裂解结合液，还提供包含该裂解结合液的细菌核酸提取试剂盒。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种细菌核酸提取用裂解结合液，所述裂解结合液由以下物质组成：盐酸胍，EDTA，tritonX-100，Tris-HCl，CTAB，水。

进一步，所述裂解结合液由以下物质组成：3-6M盐酸胍，5-20mM EDTA，1-10％(v/v)TritonX-100，0.1-1M Tris-HCl，0.1-5％(w/v)CTAB，余量为水。

进一步，所述裂解结合液由以下物质组成：5M盐酸胍，15mM EDTA，10％TritonX-100，0.6M Tris-HCl，0.5％CTAB，余量为水。

进一步，所述裂解结合液还包括3％-8％磁珠。

所述磁珠为超顺磁性氧化硅纳米微球，直径为100～1000nm。

进一步，所述磁珠直径为500nm。

2.以上任意项所述的细菌核酸提取用裂解结合液在制备核酸提取的试剂或试剂盒中的应用。

3.含有以上任意项所述的细菌核酸提取用裂解结合液的细菌核酸提取试剂盒，所述细菌核酸提取试剂盒包括裂解结合液、蛋白酶K溶液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液。

进一步，所述蛋白酶K溶液的浓度为10-30mg/ml。

进一步，洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液1由以下组分组成：10-100mM MOPS，0.5-2M LiCl，NaCl 0.1-1M，pH值6.5-7.5，30-60％乙醇溶液；洗涤缓冲液2为70-85％乙醇水溶液。

进一步，洗脱缓冲液由以下组分组成：EDTA 1-5mM，Tris-HCl 5-20mM,pH值7.0-10。

4.提取细菌核酸的提取方法，其具体步骤如下：

1)将生物样品用溶菌酶溶液和蛋白酶K溶液处理后，加入裂解结合液，在50-75℃裂解5-15min，生物样品释放出核酸，在裂解结合液下与磁珠结合，在外部磁场作用下，磁珠聚集，形成磁珠-核酸复合物，收集磁珠-核酸复合物；

2)向磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液，洗涤去除磁珠-核酸复合物上的杂质，在外部磁场作用下，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；

3)向洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，55℃-85℃洗脱3-8min可将结合在磁珠上的核酸洗脱下来，即得到提取的核酸。

进一步，所述蛋白酶K溶液的浓度为10-30mg/ml。

所述裂解结合液由以下物质组成：3-6M盐酸胍，5-20mM EDTA，1-10％TritonX-100，0.1-1M Tris-HCl，0.1-5％CTAB，3％-8％磁珠，余量为水，其中百分比为质量百分比浓度。

进一步，洗脱缓冲液由以下组分组成：EDTA 1-5mM，Tris-HCl 5-20mM,pH值7.0-10。所述洗脱缓冲液由以下组分组成：EDTA 1-5mM，Tris-HCl 5-20mM,pH值7.0-10。

进一步，步骤1)中裂解温度为65℃，步骤3)中洗脱温度为65℃。

进一步，所述生物样品包括细菌培养物、组织、细胞、血浆、血清、体液、拭子、粪便、痰液或尿液等。

本发明的有益效果在于：本发明提供的裂解结合液可以将传统的磁珠法核酸提取的先裂解后节后的步骤有机的结合在一起，可以保证所提取细菌的核酸纯度好，浓度高。且裂解结合液中所用组分摒弃了传统磁珠法核酸提取中所用的有机溶剂异丙醇，保障所提取的核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂，也给核酸提取用户避免吸入异丙醇机会，增加良好的实验体验感。

应用本发明提供的裂解结合液制备的细菌核酸提取试剂盒提取核酸时，全部核酸提取过程仅需4个步骤，完成特定核酸提取时间短，克服了现有磁珠法核酸提取方法步骤繁多的缺点；裂解与结合步骤一步完成，减少了操作步骤，该方法更适用于全自动化核酸提取应用；加大样本处理量和样本处理速率，快速高通量提取出生物样品中的核酸，这在临床应用时尤其能发挥技术优势和效能，减轻临床工作人员单调枯燥乏味的反复操作步骤。细菌核酸提取试剂盒成本低，核酸提取方法简单，提取的核酸完成纯度高，可以直接进行PCR等分子生物学实验研究及临床检测。本发明提供的细菌核酸提取试剂盒可适用于多种生物样本，包括但不限于细菌培养物、棉拭子、痰液、尿液等，其技术效果在实施例里均已得以体现。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为实施例1提取的核酸的荧光定量PCR结果；

图2为实施例2提取的核酸的荧光定量PCR结果。

具体实施方式

下面将结合附图及实施例对本发明的技术方案做进一步说明。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1大肠埃希菌

1)裂解结合：取新鲜培养的大肠埃希菌菌液200ul于1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃上清。取1mL生理盐水清洗，12000rpm离心1min，弃上清。加入180uL 20mg/mL溶菌酶溶液和20uL 10-30mg/mL蛋白酶K溶液，充分混匀后50℃水浴20min以上，水浴结束后瞬时离心。向离心管内加入裂解结合缓冲液400ul，65℃加热混匀5-10min，将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，吸弃上清。

其中，裂解结合缓冲液的组成为：盐酸胍5M，EDTA 15mM，tritonX-100 10％(v/v)，Tris-HCl 0.6M，CTAB 0.5％(w/v)，纳米磁珠8％(w/v)，余量为水，pH值调至6.0。其中百分比(％)对应的地方相同表示。

2)洗涤：继续向所述离心管中加入600ul的洗涤缓冲液1，混匀1分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，吸弃上清；继续向所述离心管中加入600ul的洗涤缓冲液2，混匀1分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，吸弃上清；

其中，所述洗涤缓冲液1的组成为：MOPS 50mM，LiCl 1M，0.5M NaCl，pH值7.0，50％(v/v)乙醇溶液；所述洗涤缓冲液2为70％(v/v)乙醇水溶液。

3)洗脱：最后向离心管中加入100ul的洗脱缓冲液，65℃加热混匀5分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，即可得到最终提取纯化的DNA溶液，可在-20℃温度下保存。

所述洗脱缓冲液含EDTA 1mM，Tris-HCl 10mM，pH值调至8。

对照试剂选用QIAamp DNA Mini Kit提取的样本量为200ul，洗脱体积为100ul,提取方法按照其说明书完成。

提取完成后，取上述核酸提取液2uL作为模板，反应液18uL，总反应体积20uL，利用荧光定量PCR仪进行扩增检测。荧光定量PCR，结果表1和图1所示。

表1：

如表1结果和图1所示，本发明试剂提取核酸的荧光定量PCR的Ct值要小于对照试剂的结果，更早检测到，说明本发明试剂要优于对照试剂。

实施例2金色葡萄球菌

1)裂解结合：取新鲜培养的金色葡萄球菌200ul置于1.5mL EP管中，12000rpm离心1min，弃上清。取1mL生理盐水清洗，12000rpm离心1min，弃上清。加入180uL 20mg/mL溶菌酶溶液和20uL 10-30mg/mL蛋白酶K溶液，充分混匀后50℃水浴20min以上，水浴结束后瞬时离心。向离心管内加入裂解结合缓冲液400ul，65℃加热混匀5-10min，将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，弃上清。

其中，所述裂解结合缓冲液的组成为：盐酸胍4M，EDTA 10mM，tritonX-100 2％，Tris-HCl0.5M，CTAB 0.5％，纳米磁珠8％，余量为水，裂解结合缓冲液的pH值调至6.0。

其中，所述洗涤缓冲液1的组成为：MOPS 50mM，LiCl 1M，0.5M NaCl，pH值7.0，50％乙醇溶液；所述洗涤缓冲液2为70％乙醇水溶液。

3)洗脱：最后向离心管中加入100ul的洗脱缓冲液，65℃加热混匀5分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，即可得到最终提取纯化的DNA溶液，可在-20℃温度下保存；所述洗脱缓冲液的组成为：1mM EDTA，10mMTris-HCl，pH值调至8.0。

对照试剂选用QI Aamp DNA Mini Kit提取的样本量为200ul，洗脱体积为100ul，提取方法按照其说明书完成。

提取完成后，取上述核酸提取液2uL作为模板，反应液18uL，总反应体积20uL，利用荧光定量PCR仪进行扩增检测。荧光定量PCR，结果表2和图2所示。

表2：

实施例3临床样本

1)裂解结合：从廊坊当地医院采集呼吸道感染的患者拭子(采集者自愿的原则)10例。将上述采集的棉拭子样本置于1mL的生理盐水中，充分震荡洗涤10min，待大块沉淀物沉淀后，取上清液于1.5mL EP管中7500rpm离心10min，弃上清。加入180uL 20mg/mL溶菌酶溶液和20uL 10-30mg/mL蛋白酶K溶液，充分混匀后50℃水浴20min以上，水浴结束后瞬时离心。加入400ul裂解结合缓冲液，65℃加热混匀3分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，弃上清；

3)洗脱：最后向离心管中加入100ul的洗脱缓冲液，65℃加热混匀5分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，即可得到最终提取纯化的核酸溶液，可在-20℃温度下保存。

其中，本发明实施例3中使用的所述裂解结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液与实施例1中使用的相同，即采用的试剂盒与实施例1中的试剂盒相同。

本发明也可用试剂盒配合自动化仪器，快速高通量地提取出拭子样本的核酸，使用自动核酸提取仪，程序如下表3：

表3：

对照试剂选用QIAamp DNA Mini Kit提取的样本量为200ul，洗脱体积为100ul，提取方法按照其说明书完成。

提取完成后，利用市售细菌检测试剂盒进行荧光定量PCR检测，取上述核酸DNA提取液2uL作为模板，反应液18uL，总反应体积20uL，利用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增检测，检测结果见下表4：

表4：

如表中所示，本发明试剂提取核酸后，检测临床样本的荧光定量PCR的Ct值要小于对照试剂的结果，更早检测到，说明本发明试剂要优于对照试剂。

实施例4临床样本

1)裂解结合：从廊坊当地医院采集呼吸道感染的痰液样本(采集者自愿的原则)10例。痰液处理如下：①稀痰(痰如米汤或白色泡沫样，吸痰后枪头内壁上无痰液滞留)或中度粘痰(较粘稠吸痰后有少量痰液在枪头内壁滞留但易被水冲洗干净)：取1ml痰液样本于2.0mL EP管中，向管中加入1mL PBS(或生理盐水)涡旋混匀后12000rpm离心10min，弃上清。②重度粘痰(外观明显粘稠，常呈黄色，枪头常因负压过大而塌陷，枪头内壁滞有大量痰液，且不易用水冲净)：取1ml痰液样本于2.0mL EP管中，加入1ml 1M NaOH溶液，充分混匀使痰液液化，12000rpm离心10min，弃上清；向离心管中加入1mL PBS轻微混匀后12000rpm离心10min，弃上清。加入180uL 20mg/mL溶菌酶溶液和20uL 10-30mg/mL蛋白酶K溶液，充分混匀后50℃水浴20min以上，水浴结束后瞬时离心。加入400ul裂解结合缓冲液，65℃加热混匀3分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，弃上清；

3)洗脱：最后向离心管中加入100ul的洗脱缓冲液，65℃加热混匀5分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，在-20℃温度下保存即可得到最终提取纯化的DNA溶液。

其中，本发明实施例4中使用的所述裂解结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液与实施例1中使用的相同，即采用的试剂盒与实施例1中的试剂盒相同。

本发明也可用试剂盒配合自动化仪器，快速高通量地提取出拭子样本的核酸，使用自动核酸提取仪，程序如下表5：

表5：

对照试剂选用QIAamp DNA Mini Kit提取的样本量为1ml，洗脱体积为100ul，提取方法按照其说明书完成。

提取完成后，利用市售细菌检测试剂盒进行荧光定量PCR检测，取上述核酸DNA提取液2uL作为模板，反应液18uL，总反应体积20uL，利用ABI7500荧光定量PCR仪进行扩增检测。检测结果见下表6：

如表中所示，本发明试剂提取核酸后，同样的检测临床样本的荧光定量PCR的Ct值均小于对照试剂的结果，更早检测到，说明本发明试剂要优于对照试剂。

实施例5临床样本

1)裂解结合：从廊坊当地医院收集尿液标本(采集者自愿的原则)5例。将上述采集的尿液样本1ml 7500rpm离心10min，弃上清。加入180uL溶菌酶溶液和20uL蛋白酶K溶液，充分混匀后50℃水浴20min以上，水浴结束后瞬时离心。加入400ul裂解结合缓冲液，65℃加热混匀3分钟，再将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，弃上清；

3)洗脱：最后向离心管中加入100ul的洗脱缓冲液，65℃加热混匀5分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，在-20℃温度下保存即可得到最终提取纯化的核酸溶液。

本发明实施例5中使用的所述裂解结合缓冲液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液与实施例1中使用的相同，即采用的试剂盒与实施例1中的试剂盒相同。

表6：

-表示阴性/未检出

实施例7：

1、用本发明的方法，直接裂解并结合后进行核酸的洗涤和洗脱。

1)将新鲜培养的大肠埃希菌菌液200ul置于离心管内(设置3个平行样)，12000rpm离心1min，弃上清。取1mL生理盐水清洗，12000rpm离心1min，弃上清。加入180uL20mg/mL溶菌酶溶液和20uL 10-30mg/mL蛋白酶K溶液，充分混匀后50℃水浴20min以上，水浴结束后瞬时离心。向离心管内加入裂解缓冲液400ul，65℃加热混匀5-10min，将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，弃上清。

其中，所述裂解缓冲液内加入的成分分别是：盐酸胍5M，EDTA 15mM，tritonX-10010％，Tris-HCl 0.6M，CTAB 0.5％，磁珠8％，其余成分为水，裂解缓冲液的pH值调至6.0。

继续向所述离心管中加入600ul的洗涤缓冲液1，混匀1分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，吸弃上清；继续向所述离心管中加入600ul的洗涤缓冲液2，混匀1分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，吸弃上清；其中，所述洗涤缓冲液1的组成为：MOPS50mM，LiCl 1M，0.5M NaCl，pH值7.0，50％乙醇溶液；所述洗涤缓冲液2为70％乙醇水溶液。

最后向离心管中加入100ul的洗脱缓冲液，65℃加热混匀5分钟后将离心管置于磁力架上，磁力分离20s，将上清液转移至另一洁净无酶的离心管中，在-20℃温度下保存即可得到最终提取纯化的DNA溶液。所述洗脱缓冲液含EDTA 1mM，Tris-HCl 10mM，pH8.0。

所述纳米磁珠为超顺磁性氧化硅纳米微球，直径为500nm。

2、采用传统的方法，先进行裂解，后加入200ul-500ul异丙醇作为结合液进行结合，再进行核酸的洗涤和洗脱。裂解缓冲液：碘化钠2M，盐酸胍3M，EDTA 10mM，Tween-205％，纳米磁珠5％，SDS 2％。洗涤同前本发明的方法1。

3、按照申请号为201110124322.3中增强的磁珠法核酸提取方法中提及的进行操作，5M盐酸胍、异硫氰酸胍、碘化钠、碘化钾：裂解液的其组成分包括：1～2％triton X-100，1～2％壬基酚聚氧乙烯醚(NP 40)，1～2％吐温20tween-20，10～20mM Tris—Hcl,pH7-8，1-2mM EDTA。且生物样品、异丙醇与裂解液的体积比为1:1:2。洗涤同前本发明的方法1。

提取完用紫外分光光度计检测提取纯度和浓度，结果见下表7。

表7

如表7中所示，利用本发明方法和添加结合液的结果，提取的纯度在1.7-2.1之间符合最基本要求，但提取的浓度远不如本发明的结果。

最后说明的是，以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims

1.一种细菌核酸提取试剂盒，其特征在于，所述细菌核酸提取试剂盒包括裂解结合液、蛋白酶K溶液、洗涤缓冲液和洗脱缓冲液；

所述裂解结合液由以下物质组成：5M盐酸胍，15mM EDTA，10%TritonX-100，0.6M Tris-HCl，0.5%CTAB，余量为水；

所述洗涤缓冲液包括洗涤缓冲液1和洗涤缓冲液2，洗涤缓冲液1由以下组分组成：10-100mM MOPS，0.5-2M LiCl，NaCl 0.1-1M，pH值6.5-7.5，30-60%乙醇溶液；洗涤缓冲液2为70-85%乙醇水溶液；

所述洗脱缓冲液由以下组分组成：EDTA 1-5mM，Tris-HCl 5-20mM，pH值7.0-10；

所述蛋白酶K溶液的浓度为10-30mg/ml。

2.根据权利要求1所述的细菌核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解结合液还包括3%-8%磁珠。

3.使用权利要求1或2所述的细菌核酸提取试剂盒提取细菌核酸的提取方法，其特征在于，提取方法的具体步骤如下：

1）将生物样品用溶菌酶溶液和蛋白酶K溶液处理后，加入裂解结合液，在50-75℃裂解5-15min，生物样品释放出核酸，在裂解结合液下与磁珠结合，在外部磁场作用下，磁珠聚集，形成磁珠-核酸复合物，收集磁珠-核酸复合物；

2）向磁珠-核酸复合物中加入洗涤缓冲液，洗涤去除磁珠-核酸复合物上的杂质，在外部磁场作用下，收集洗涤后的磁珠-核酸复合物；

3）向洗涤后的磁珠-核酸复合物中加入洗脱缓冲液，55℃-85℃洗脱3-8min可将结合在磁珠上的核酸洗脱下来，即得到提取的核酸。