CN112912518A - 用于测量复制缺陷型病毒载体和病毒的感染性的方法 - Google Patents
用于测量复制缺陷型病毒载体和病毒的感染性的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本文提供了用于测量复制缺陷型病毒和病毒载体的感染性的改进的方法。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒是重组AAV。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年10月15日提交的美国临时申请号62/745,859的优先权，所述临时申请整体并入本文。
背景技术
基于重组腺相关病毒(AAV)的载体目前是开发中使用最广泛的基因疗法产物。rAAV载体系统的优选使用部分是由于缺乏与野生型病毒相关联的疾病、AAV转导非分裂细胞和分裂细胞的能力以及在临床试验中观察到的所得的长期稳健的转基因表达，并且表明在基因疗法适应症中具有巨大的递送潜力。此外，不同的天然存在和重组rAAV载体血清型特异性地靶向不同的组织、器官和细胞，并帮助逃避对所述载体的任何预先存在的免疫，从而扩大基于AAV的基因疗法的治疗性应用。
在基于复制缺陷型病毒(例如AAV)的基因疗法可更广泛地用于临床后期和商业用途之前，需要开发用于大规模生产重组病毒颗粒的新方法。通过有限稀释终点分析(也称为TCID50感染滴度测定)对感染滴度进行绝对定量已成为用于体外测量重组病毒(例如AAV)制剂感染性的标准方法。虽然TCID50感染滴度测定已可用于确认AAV载体制剂具有感染性，但其较大的测定变异性(高达200％的几何变异系数)限制了其在支持产物一致性、可比性和稳定性方面的适用性。因此，需要更准确的方法来测量包含复制缺陷型病毒颗粒(例如rAAV颗粒)的组合物的感染性。
发明内容
本公开提供了用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，其中所述方法包括：在允许所述病毒颗粒对靶细胞进行接种的条件下，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物接触；去除细胞外病毒颗粒；分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在一些实施方案中，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液接触。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液小于十倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液。在一些实施方案中，所述方法还包括使用平行线模型计算所述测试样品相对于所述参考样品的感染性。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应来确定。在一些实施方案中，所述聚合酶链反应是定量聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述聚合酶链反应是数字聚合酶链反应。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV、腺病毒、牛痘或慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒，例如重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述AAV是重组AAV(rAAV)。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是Huh-7细胞。
本公开提供了分离的多核苷酸，其具有约15至约40个核苷酸，包含SEQ ID NO:1–6的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述多核苷酸被可检测地标记，其中所述可检测标记共价连接到所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述可检测标记包括FAM、JOE、TAMRA和ROX中的一种或多种。
本公开提供了产生感兴趣的多核苷酸的方法，其包括使用本文所述的一个或多个多核苷酸使来自生物样品的DNA进行聚合酶链反应。
本公开提供了用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含本文所述的一个或多个多核苷酸。
本公开提供了用于确定包含病毒颗粒的测试样品的感染性相对于包含病毒颗粒的参考样品的感染性的试剂盒，其中所述试剂盒包含以下一种或多种：(a)任选地带有探针的能够扩增病毒序列的正向引物和反向引物，(b)任选地带有探针的能够扩增靶细胞基因组序列的正向引物和反向引物，以及(c)病毒参考样品。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，任选地带有探针的能够扩增病毒序列的所述正向引物和所述反向引物包含本文公开的多核苷酸。在一些实施方案中，任选地带有探针的能够扩增靶细胞基因组序列的所述正向引物和所述反向引物包含本文公开的多核苷酸。
本公开进一步提供了用于确定在不同条件下病毒颗粒组合物的相对感染性的方法，其包括：在第一组条件和第二组条件下用包含病毒颗粒的所述组合物对靶细胞进行接种；洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；分别从在所述第一组条件和所述第二组条件下接种的靶细胞中分离出第一核酸样品和第二核酸样品；以及确定所述第一核酸样品和所述第二核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。
在一些实施方案中，本公开提供：
[1]一种用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，所述方法包括
[a]用所述测试组合物和所述参考组合物单独地对靶细胞进行接种；
[b]洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；
[c]分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及
[d]确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。
[2]一种用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，所述方法包括
[a]制备所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液；
[b]用所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液单独地对靶细胞进行接种；
[c]洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；
[d]分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及
[e]确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。
[3]如[2]所述的方法，其中所述系列稀释液小于10倍稀释液。
[4]如[2]所述的方法，其中所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。
[5]如[2]所述的方法，其中所述系列稀释液为2倍稀释液。
[6]如[2]至[5]中任一项所述的方法，其中所述系列稀释液包含至少两种稀释液、至少三种稀释液、至少五种稀释液或至少十种稀释液。
[7]如[2]至[5]中任一项所述的方法，其中所述系列稀释液包含两种稀释液至20种稀释液。
[8]如[2]至[7]中任一项所述的方法，其还包括使用平行线模型计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性。
[9]如[8]所述的方法，其中计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性包括
[a]计算测试组合物和参考组合物的每种稀释液的VGC:TCGC比率；
[b]绘制所述测试组合物和所述参考组合物的log VGC:TCGC比率对log稀释倍数；
[c]使用共同斜率将所述测试组合物和所述参考组合物的数据点拟合到测试组合物线和参考组合物线；以及
[d]计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性为
[10]如[1]至[9]中任一项所述的方法，其中所述变异系数(cv)小于约100％、小于约50％或小于约25％。
[11]如[1]至[10]中任一项所述的方法，其中所述对靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育
[a]约5分钟至约3天，
[b]约12小时至约36小时，
[c]约18小时至约30小时，
[d]约1小时、约2小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时或约36小时，
[e]约1天、或约1.5天、或约2天，或
[f]约24小时。
[12]如[1]至[11]中任一项所述的方法，其中所述核酸组合物中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应来确定。
[13]如[12]所述的方法，其中所述聚合酶链反应是定量聚合酶链反应。
[14]如[12]所述的方法，其中所述聚合酶链反应是数字聚合酶链反应。
[15]如[1]至[14]中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒。
[16]如[15]所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV、腺病毒、牛痘或慢病毒。
[17]如[15]所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是逆转录病毒。
[18]如[15]所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV。
[19]如[18]所述的方法，其中所述AAV是重组AAV(rAAV)。
[20]如[19]所述的方法，其中所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
[21]如[20]所述的方法，其中所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
[22]如[1]至[21]中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。
[23]如[22]所述的方法，其中所述靶细胞是Huh-7细胞。
[24]如[1]至[23]中任一项所述的方法，其中所述测试组合物和所述参考组合物具有相同的滴度，其中所述滴度测量为每毫升基因组拷贝(GC)。
[25]如[1]至[23]中任一项所述的方法，其中所述测试组合物和所述参考组合物具有不同的滴度，其中所述滴度测量为每毫升基因组拷贝(GC)。
[26]如[24]或[25]所述的方法，其中所述测试组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的rAAV颗粒之间。
[27]如[24]至[26]中任一项所述的方法，其中所述参考组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的rAAV颗粒之间。
[28]一种分离的多核苷酸，其具有约15至约40个核苷酸，包含以下核苷酸序列
[a]5’–GGACATCATGAAGCCCCTT–3’(SEQ ID NO:1)，
[b]5’–TCCAACACACTATTGCAATGAAAA–3’(SEQ ID NO:2)，
[c]5’–AGCATCTGACTTCTGGCTAATAAAGGAA–3’(SEQ ID NO:3)，
[d]5’–TGAAACATACGTTCCCAAAGAGTTT–3’(SEQ ID NO:4)，
[e]5’–CTCTCCTTCTCAGAAAGTGTGCATAT–3’(SEQ ID NO:5)，或
[f]5’–TGCTGAAACATTCACCTTCCATGCA–3’(SEQ ID NO:6)，
所述核苷酸序列包含0、1、2、3、4或5个取代。
[29]一种分离的多核苷酸，其具有约15至约40个核苷酸并包含SEQ ID NO:1–6的核苷酸序列。
[30]一种分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO:1–6的核苷酸序列组成。
[31]一种组合物，其包含(i)如[28]至[30]中任一项所述的多核苷酸以及(ii)可检测标记]，其中所述标记共价连接到所述多核苷酸。
[32]如[31]所述的组合物，其中所述可检测标记是荧光标记。
[33]如[32]所述的组合物，其中所述可检测标记包括FAM、JOE、TAMRA和ROX中的一种或多种。
[34]一对正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含SEQID NO:1和2的多核苷酸序列。
[35]一对正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含SEQID NO:4和5的多核苷酸序列。
[36]一种探针、正向引物和反向引物的组合，其中所述正向引物、所述反向引物和所述探针分别包含由SEQ ID NO:1、2和3的核苷酸序列组成的多核苷酸。
[37]一种探针、正向引物和反向引物的组合，其中所述正向引物、所述反向引物和所述探针分别包含由SEQ ID NO:4、5和6的核苷酸序列组成的多核苷酸。
[38]一种产生感兴趣的多核苷酸的方法，其包括使用如[34]或[35]所述的一对正向引物和反向引物使来自生物样品的DNA进行聚合酶链反应。
[39]一种产生感兴趣的多核苷酸的方法，其包括使用如[36]或[37]所述的探针、正向引物和反向引物的组合使来自生物样品的DNA进行聚合酶链反应。
[40]一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含一个或多个选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的多核苷酸。
[41]一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含如[34]所述的一对正向引物和反向引物。
[42]一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含如[36]所述的探针、正向引物和反向引物的组合。
[43]一种用于确定rAAV测试样品的感染性相对于参考样品的感染性的试剂盒，其包含如[34]所述的一对正向引物和反向引物。
[44]如[43]所述的试剂盒，其还包含如[35]所述的一对正向引物和反向引物。
[45]一种用于确定rAAV测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的试剂盒，其包含如[36]所述的探针、正向引物和反向引物的组合。
[46]如[45]所述的试剂盒，其还包含如[37]所述的探针、正向引物和反向引物的组合。
[47]如[40]至[46]中任一项所述的试剂盒，其还包含rAAV参考组合物。
[48.]一种用于确定在不同条件下病毒颗粒组合物的相对感染性的方法，其包括
[a]在第一组条件和第二组条件下用包含病毒颗粒的所述组合物对靶细胞进行接种；
[b]洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；
[c]分别从在所述第一组条件和所述第二组条件下接种的靶细胞中分离出第一核酸样品和第二核酸样品；以及
[d]确定所述第一核酸样品和所述第二核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。
[49.]如[48]所述的方法，其中所述第一组条件和所述第二组条件使用相同的靶细胞。
[50.]如[48]所述的方法，其中所述第一组条件和所述第二组条件使用不同的靶细胞。
[51.]如[50]所述的方法，其中所述不同的靶细胞包含不同的遗传修饰。
[52.]如[50]所述的方法，其中除了所述靶细胞之一中存在遗传修饰之外，所述不同的靶细胞是相同的。
[53.]如[49]至[52]中任一项所述的方法，其中所述对靶细胞进行接种包括用所述组合物的系列稀释液对靶细胞进行接种。
[54.]如[53]所述的方法，其中所述系列稀释液为2倍稀释液。
[55.]如[53]或[54]所述的方法，其中所述对靶细胞进行接种包括用所述组合物的系列稀释液对靶细胞进行接种。
[56.]如[53]至[55]中任一项所述的方法，其还包括使用平行线模型计算在所述第一组条件和所述第二组条件下所述组合物的相对感染性。
[57.]如[56]所述的方法，其中计算在所述第一组条件和所述第二组条件下所述组合物的相对感染性包括
[a]计算所述第一组条件和所述第二组条件的每种稀释液的VGC:TCGC比率；
[b]绘制所述第一组条件和所述第二组条件的log VGC:TCGC比率对log稀释倍数；
[c]使用共同斜率将所述第一条件和所述第二条件的数据点拟合到第一条件线和第二条件线；以及
[d]计算在所述第一条件下相对于所述第二条件的感染性为
[58.]如[53]至[57]中任一项所述的方法，其中所述变异系数(cv)小于约100％、小于约50％或小于约25％。
[59.]如[53]至[58]中任一项所述的方法，其中所述核酸组合物中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应来确定。
[60.]如[59]所述的方法，其中所述聚合酶链反应是定量聚合酶链反应。
[61.]如[59]所述的方法，其中所述聚合酶链反应是数字聚合酶链反应。
[62.]如[48]至[61]中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒。
[63.]如[62]所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV、腺病毒、牛痘或慢病毒。
[64.]如[62]所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是逆转录病毒。
[65.]如[62]所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV。
[66.]如[65]所述的方法，其中所述AAV是重组AAV(rAAV)。
[67.]如[66]所述的方法，其中所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
[68.]如[67]所述的方法，其中所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
[69.]如[48]至[68]中任一项所述的方法，其中在至少一组条件下的所述靶细胞包含BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。
[70.]如[22]或[69]所述的方法，其中在至少一组条件下的所述靶细胞包含Huh-7细胞。
在一些实施方案中，本文公开的方法包括确定包含分离的rAAv颗粒的组合物的感染性，其中所述组合物通过从包含杂质的进料(例如rAAV生产培养物)中分离出rAAV颗粒来产生，其中用于分离rAAV颗粒的所述方法包括一个或多个加工步骤。在一些实施方案中，所述加工是以下中的至少一种：收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、无菌过滤。在其他实施方案中，所述加工包括以下中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种：收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱和无菌过滤。在一些实施方案中，所述加工不包括离心所述收获的细胞培养物。
本公开提供了一种用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的药物组合物的方法，其包括：(a)通过离心、深度过滤、切向流过滤、超滤、亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种来从包含杂质的进料中分离出rAAV颗粒；使用本文公开的方法确定所述rAAV颗粒的感染性；以及配制所述分离的rAAV颗粒以产生药物组合物。
本公开提供了一种用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的药物单位剂量的方法，其包括：(a)通过离心、深度过滤、切向流过滤、超滤、亲和色谱、尺寸排阻色谱、离子交换色谱和疏水相互作用色谱中的一种或多种来从包含杂质的进料中分离出rAAV颗粒；使用本文公开的方法确定所述rAAV颗粒的感染性；以及配制所述分离的rAAV颗粒。
当结合附图阅读时，本文所述的组合物和方法的其他特征和优点将从以下详细描述中变得更加显而易见。
附图说明
图1.相对感染性方法的工作流程。
图2.使用平行线模型计算相对感染性。
具体实施方式
本文提供了一种用于确定包含复制缺陷型病毒(例如AAV载体)的组合物的感染性的方法。发明人已令人惊奇地发现，本文公开的方法提供了显著改善的准确性。具体地说，本文公开的方法提供了与用于测量感染性的目前标准的TCID50测定相比的显著优点。所述优点包括改善准确性、改善可重复性以及以更少的样品加工实现更快的结果。本文公开的方法的改善的准确性和速度使它们适用于开发和生产包含复制缺陷型病毒(例如AAV)的药物组合物的各种应用。例如，本文公开的方法非常适合用于制剂开发，因为它们允许快速和高度准确地比较包含不同赋形剂和/或在不同条件下储存不同时间长度的大量样品的感染性。本文公开的方法也非常适合用于确定药物剂量的生物活性，例如在批签发(lotrelease)测定中。
在一些实施方案中，本文所述的方法能够检测和定量包含复制缺陷型病毒(例如AAV载体)的组合物感染性的微小差异。在一些实施方案中，所述方法涉及用复制缺陷型病毒测试样品的稀释液系列与参考标准品的稀释液系列平行感染贴壁细胞。在一些实施方案中，所述稀释液系列是两倍、三倍或五倍稀释液系列。在感染期后，将所述细胞洗涤、收集并进行PCR，例如ddPCR，以定量存在于所述细胞中的病毒载体DNA。每次稀释时回收的病毒载体DNA的量用于计算样品相对于参考标准品的感染性。本文所述的方法可用于比较包含复制缺陷型病毒的不同批次组合物的感染性，以及用于定量由于降解引起的感染性变化。本文所述的方法还可用于比较复制缺陷型病毒载体感染不同人细胞的能力，用于评估重组工程化变体的感染性改善，用于探测病毒感染动力学，或用于评估变体(例如包含跨不同项目的不同衣壳的变体)作为平台方法支持过程和制剂开发的活性。在本文所述方法的一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒载体是AAV。技术人员理解的是，本文所述的方法还可以用于筛选和鉴定病毒组合物的改善感染性的条件，例如，用于筛选和鉴定允许复制缺陷型病毒的组合物感染的细胞。在一个实施方案中，本文所述的方法可用于确定病毒制剂对不同细胞系的相对感染性。在一个实施方案中，本文所述的方法可用于确定病毒制剂对包含遗传修饰(例如包含转基因)的细胞系变体的相对感染性。
在一些实施方案中，本文所述的方法适用于任何rAAV血清型，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16以及它们的衍生物、修饰或假型。在一些实施方案中，所述方法用于测量rAAV8颗粒的感染性。在一些实施方案中，所述方法用于测量rAAV8衍生物颗粒、rAAV8修饰颗粒或rAAV8假型颗粒的感染性。在一些实施方案中，所述方法用于测量rAAV9颗粒的感染性。在一些实施方案中，所述方法用于测量rAAV9衍生物颗粒、rAAV9修饰颗粒或rAAV9假型颗粒的感染性。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科技术语具有与本发明相关领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。为促进对本公开方法的理解，以下定义多个术语和短语。
限定例如本文提供的方法中使用的组合物中成分的量、组合物中成分的浓度、流速、rAAV颗粒产量、进料体积、盐浓度和类似的值及其范围的“约(about)”，是指例如通过用于制备浓缩物或使用溶液的典型测量和处理程序；通过这些程序中的无意错误；通过制备组合物或实施方法使用的成分的制造、来源或纯度方面的差异；和类似的考虑可出现的数值数量变化。术语“约”还涵盖由于具有特定初始浓度或混合物的组合物的老化而不同的量。术语“约”还涵盖由于混合或加工具有特定初始浓度或混合物的组合物而不同的量。无论是否被术语“约”限定，权利要求书都包括量的等效物。在一些实施方案中，术语“约”是指大于或小于所指示的数字或范围大约10％-20％的范围。在其他实施方案中，“约”是指所指示的数字或范围加或减10％。例如，“约10％”表示9％至11％的范围。
如本文所用，术语“复制缺陷型”是指不能完全有效复制的病毒载体。复制缺陷型病毒是关于病毒基因组复制或病毒颗粒合成和组装必不可少的一种或多种功能的突变型或缺陷型。复制缺陷型病毒可以在表达所缺失基因产物的互补细胞系中繁殖。然而，在正常靶细胞中，复制缺陷型病毒可表达病毒基因产物，但不会复制形成感染性子代病毒颗粒。在一些实施方案中，复制缺陷型病毒或病毒载体是关于病毒基因组复制必不可少的一种或多种功能的病毒或载体突变型或缺陷型。在一些实施方案中，复制缺陷型病毒或病毒载体是关于病毒颗粒合成和组装必不可少的一种或多种功能的病毒或载体突变型或缺陷型。在一些实施方案中，复制缺陷型病毒或病毒载体是逆转录病毒或逆转录病毒载体，例如慢病毒或慢病毒载体。在一些实施方案中，复制缺陷型病毒或病毒载体是腺病毒或腺病毒载体、HSV或HSV载体或流感病毒或病毒载体。在一些实施方案中，复制缺陷型病毒或病毒载体是AAV病毒或病毒载体。复制缺陷型病毒载体是本领域技术人员已知的，例如，如美国专利号7198784、9408905、9862931、8067156；美国专利申请公布号20150291935、20120220492、20180291351和20170175137中所公开，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
“AAV”是腺相关病毒的缩写，并且可用于指病毒本身或其修饰、衍生物或假型。除了另外要求的情况外，所述术语覆盖所有亚型以及天然存在和重组形式两者。缩写“rAAV”是指重组腺相关病毒。术语“AAV”包括AAV类型1(AAV1)、AAV类型2(AAV2)、AAV类型3(AAV3)、AAV类型4(AAV4)、AAV类型5(AAV5)、AAV类型6(AAV6)、AAV类型7(AAV7)、AAV类型8(AAV8)、AAV类型9(AAV9)、禽AAV、牛AAV、犬AAV、马AAV、灵长类动物AAV、非灵长类动物AAV和绵羊AAV以及它们的修饰、衍生物或假型。“灵长类动物AAV”是指感染灵长类动物的AAV，“非灵长类动物AAV”是指感染非灵长类哺乳动物的AAV，“牛AAV”是指感染牛哺乳动物的AAV，等。在一些实施方案中，所述AAV颗粒是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的衍生物、修饰或假型。
应用于AAV颗粒的“重组”意指AAV颗粒是产生与自然界中的AAV颗粒不同的AAV颗粒构建体的一种或多种程序的产物。
重组腺相关病毒颗粒“rAAV颗粒”是指由至少一种AAV衣壳蛋白和衣壳化的多核苷酸rAAV载体组成的病毒颗粒，所述载体包含异源多核苷酸(即除野生型AAV基因组以外的多核苷酸，诸如待递送到哺乳动物细胞的转基因)。所述rAAV颗粒可以是任何AAV血清型，包括任何修饰、衍生物或假型(例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或AAV10或它们的衍生物/修饰/假型)。此类AAV血清型和衍生物/修饰/假型，以及产生此类血清型/衍生物/修饰/假型的方法是本领域已知的(参见例如，Asokan等,Mol.Ther.20(4):699-708(2012)。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
本公开的rAAV颗粒可以是任何血清型或血清型的任何组合(例如包含两种或更多种血清型的rAAV颗粒群体，例如包含rAAV2、rAAV8和rAAV9颗粒中的两种或更多种)。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是rAAV1、rAAV2、rAAV3、rAAV4、rAAV5、rAAV6、rAAV7、rAAV8、rAAV9、rAAV10或其他rAAV颗粒或它们的两种或更多种的组合。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是rAAV8或rAAV9颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的两种或更多种血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含为选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16衣壳蛋白的两种或更多种血清型的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16或它们的衍生物、修饰或假型组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8、AAV9或它们的衍生物、修饰或假型的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
如本文所用，术语“数字PCR”或“dPCR”是指其中样品被分成大量小的子样品的任何PCR方法，所述小的子样品随后各自进行PCR扩增反应。PCR扩增后，通过检测各个子样品中靶特异性PCR终产物的存在或不存在来确定含有靶特异性PCR终产物(阳性反应)的子样品与不含靶特异性PCR终产物(阴性反应)的子样品的比率。考虑到泊松(Poisson)分布，从阳性和阴性子样品反应的比率计算起始样品中靶序列的拷贝数和浓度。与常规PCR不同，数字PCR不依赖于进行的扩增循环数来确定初始样品的靶浓度，因此消除了依赖于不确定的指数数据来定量靶核酸并提供了绝对定量。如本文所用，“数字液滴PCR”涉及数字PCR方法，其中初始样品被细分为若干个液滴。在一些实施方案中，数字PCR反应是多重PCR，其允许在单个dPCR反应中定量多个靶序列。在一些实施方案中，dPCR反应是数字液滴PCRTM或ddPCRTM反应，其中初始样品被细分为构成子样品的若干个液滴。
短语“参考标准品”、“参考标准品”或“参考组合物”是指用于产生病毒颗粒的载体的表征良好的样品，并且这些短语在全文中可互换使用。参考标准品可以代表临床材料，或者以其他方式认证，或者已被表征为以一致的方式产生病毒颗粒。例如，可以从内部或外部可靠来源中选择参考标准品。
如本文所用，术语“纯化(purifying/purification)”、“分离(separate/separating/separation)”或“分离(isolate/isolating/isolation)”是指从包含靶产物和一种或多种杂质的样品中提高rAAV颗粒的纯度。通常，通过从样品中(完全或部分地)去除至少一种杂质来提高靶产物的纯度。在一些实施方案中，通过使用本文所述的方法从样品中(完全或部分地)去除一种或多种杂质来提高样品中rAAV的纯度。
除非上下文另外明确规定，否则如本公开和权利要求书所用，单数形式“一个/一种(a/an)”和“所述(the)”包括复数形式。
应理解无论在本文中将实施方案用语言“包含”来描述的情况如何，都提供以“由……组成”和/或“基本上由……组成”的术语描述的另外相似的实施方案。还应理解无论在本文中将实施方案用语言“基本上由……组成”来描述的情况如何，都提供以“由……组成”的术语描述的另外相似的实施方案。
如本文中诸如“A和/或B”的短语中所使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；和B(单独)。同样，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一种：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。
在以马库什组(Markush group)或替代方案的其他分组来描述本公开的实施方案的情况下，所公开的方法不仅涵盖作为整体列出的整个组，而且还包括单独列出的组的每个成员和主组的所有可能的子组，并且还包括缺少一个或多个组成员的主组。所公开的方法还设想在所公开的方法中明确排除任何组成员中的一个或多个。
用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，其中所述方法包括：在允许所述病毒颗粒对靶细胞进行接种的条件下，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物接触；去除细胞外病毒颗粒；分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在不受任何理论约束的情况下，测试组合物或参考组合物中病毒颗粒对靶细胞的感染导致病毒基因组引入到靶细胞中。接种后去除细胞外病毒颗粒可去除未通过感染引入到靶细胞中的病毒基因组。在一些实施方案中，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液接触。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液小于2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液至10倍稀释液。在一些实施方案中，所述对靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约5分钟至约3天。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应，任选地通过数字聚合酶链反应来确定。在一些实施方案中，所述方法还包括使用平行线模型计算所述测试样品相对于所述参考样品的感染性。平行线方法是稳健的生物统计分析方法，用于基于相对效力将一种或多种测试物质与参考物质进行比较。Finney,D.J.,Statistical method in biological assay(Charles Griffin&Co.,Ltd.1952)；Wardlaw,A.C.,Practical Statistics for Experimental Biologists 210(Wiley 1986)(2000)。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒，例如重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.eB、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是Huh-7细胞。
在一些实施方案中，本公开提供了用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，其中所述方法包括：制备所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液；在允许所述病毒颗粒对靶细胞进行接种的条件下，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液接触；去除细胞外病毒颗粒；分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液小于2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液至10倍稀释液。在一些实施方案中，所述对靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约5分钟至约3天。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应，任选地通过数字聚合酶链反应来确定。在一些实施方案中，所述方法还包括使用平行线模型计算所述测试样品相对于所述参考样品的感染性。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒，例如重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是Huh-7细胞。
在一些实施方案中，本文公开的用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的方法包括：用所述测试组合物和所述参考组合物单独地对靶细胞进行接种；洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在一些实施方案中，使所述靶细胞与所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液接触。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液小于2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液至10倍稀释液。在一些实施方案中，所述对靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约5分钟至约3天。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应，任选地通过数字聚合酶链反应来确定。在一些实施方案中，所述方法还包括使用平行线模型计算所述测试样品相对于所述参考样品的感染性。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒，例如重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是Huh-7细胞。
在一些实施方案中，本文公开的用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的方法包括：制备所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液；用所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液对靶细胞进行接种；洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液小于2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液至10倍稀释液。在一些实施方案中，所述对靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约5分钟至约3天。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应，任选地通过数字聚合酶链反应来确定。在一些实施方案中，所述方法还包括使用平行线模型计算所述测试样品相对于所述参考样品的感染性。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒，例如重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是Huh-7细胞。
本文公开的方法可用于确定包含复制缺陷型病毒颗粒的测试样品的相对感染性。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV、腺病毒、牛痘或慢病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是逆转录病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白的rAAV颗粒。
在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物包含遗传上相同的分离病毒颗粒。应理解，遗传上相同的分离病毒颗粒包含相同或基本相同的基因组和相同或基本相同的病毒多肽。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物包含遗传上相同的病毒颗粒，所述病毒颗粒被单独分离或在分离后被单独加工。因此，技术人员理解的是，所公开的方法可用于比较以不同批次生产的遗传上相同的分离病毒颗粒的感染性。在一些实施方案中，使用相同的过程产生了不同批次的遗传上相同的分离病毒颗粒。在一些实施方案中，使用不同的上游和/或下游过程产生了不同批次的遗传上相同的分离病毒颗粒。在一些实施方案中，所述不同的上游过程使用不同的宿主细胞、不同的培养基、不同的组织培养过程和不同的收获过程中的一种或多种。在一些实施方案中，所述不同的下游过程使用不同的纯化步骤、不同的缓冲液、不同的加工温度、不同的配制缓冲液和不同的储存温度中的一种或多种。在一些实施方案中，将不同批次的遗传上相同的分离病毒颗粒储存不同的时间段。
在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物中包含的病毒颗粒不是遗传上相同的。在一些实施方案中，所述测试病毒颗粒和所述参考病毒颗粒包含不同的基因组。在一些实施方案中，所述测试病毒颗粒和所述参考病毒颗粒包含不同的病毒多肽。在一些实施方案中，所述测试病毒颗粒和所述参考病毒颗粒包含一种或多种具有不同氨基酸序列的衣壳多肽。
在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物包含遗传上相同的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物包含遗传上相同的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物包含遗传上相同的rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含AAV8或AAV9衣壳蛋白。
在本文所述方法的一些实施方案中，在使所述靶细胞与所述病毒颗粒接触前将所述测试组合物和所述参考组合物稀释。在一些实施方案中，在使所述靶细胞与所述病毒颗粒接触前将所述测试组合物和所述参考组合物进行系列稀释。在一些实施方案中，使用相同的稀释因子对所述测试组合物和所述参考组合物进行系列稀释。在一些实施方案中，将所述测试组合物和所述参考组合物用小于10的稀释因子进行系列稀释。在一些实施方案中，将所述测试组合物和所述参考组合物用稀释因子1.5、2、3、4、5、6、7、8或9进行系列稀释。在一些实施方案中，将所述测试组合物和所述参考组合物用稀释因子2进行系列稀释。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液为2倍。
在本文公开的方法的一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液包含至少两种稀释液、至少三种稀释液、至少五种稀释液或至少十种稀释液。在本文公开的方法的一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液包含两种稀释液至20种稀释液。在本文公开的方法的一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液包含两种稀释液至30种稀释液。在本文公开的方法的一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液包含3种稀释液、4种稀释液、5种稀释液、6种稀释液、7种稀释液、8种稀释液、9种稀释液、10种稀释液、15种稀释液或20种稀释液。
本领域技术人员理解的是，本文公开的方法也适用于确定除病毒组合物以外的变量如何影响感染过程的效力。因此，本文提供了用于确定在不同条件下病毒颗粒组合物的相对感染性的方法。在一个实施方案中，本文公开的方法包括：在第一组条件和第二组条件下用包含病毒颗粒的组合物对靶细胞进行接种；洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；分别从在所述第一组条件和所述第二组条件下接种的靶细胞中分离出第一核酸样品和第二核酸样品；以及确定所述第一核酸样品和所述第二核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在一些实施方案中，所述第一组条件和所述第二组条件使用不同的靶细胞。在一些实施方案中，所述第一组条件和所述第二组条件使用包含不同遗传修饰的不同的靶细胞。在一些实施方案中，所述第一组条件和所述第二组条件使用不同的靶细胞，除了所述靶细胞之一中存在遗传修饰之外，所述靶细胞是相同的。在一些实施方案中，所述遗传修饰是存在转基因。在一些实施方案中，所述第一组条件和所述第二组条件使用代表不同组织类型的靶细胞。在一些实施方案中，所述第一组条件和所述第二组条件使用为衍生自亲代细胞系的不同谱系的靶细胞。在一些实施方案中，使所述靶细胞与所述病毒组合物的系列稀释液接触。在一些实施方案中，所述病毒组合物的所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液小于2倍稀释液。在一些实施方案中，所述测试样品和所述参考样品的所述系列稀释液为2倍稀释液至10倍稀释液。在一些实施方案中，所述对靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约5分钟至约3天。在一些实施方案中，所述核酸样品中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应，任选地通过数字聚合酶链反应来确定。在一些实施方案中，所述方法还包括使用平行线模型计算所述测试样品相对于所述参考样品的感染性。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒颗粒。在一些实施方案中，所述复制缺陷型病毒颗粒是AAV颗粒，例如重组AAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述不同条件中的至少一种包括使用选自由BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6和A549细胞组成的组的靶细胞。在一些实施方案中，所述不同条件中的至少一种包括使用Huh-7细胞作为靶细胞。
本领域中已知容易受所述测试样品和所述参考样品中的病毒颗粒感染的任何细胞或细胞系都可以用作本文所述方法的靶细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是贴壁细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是悬浮细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是人细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK21、HEK293、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是Huh-7细胞。在一些实施方案中，所述靶细胞是BHK细胞、COS细胞、PerC6细胞或Vero细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用昆虫细胞，例如SF-9细胞。在一些实施方案中，本文公开的方法使用HEK293细胞。
所述靶细胞可保持在本领域技术人员已知的任何合适的培养基中。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括改良伊格尔培养基(Modified Eagle Medium，MEM)和杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco's ModifiedEagle Medium，DMEM)。在一些实施方案中，所述培养基包括来自Invitrogen/ThermoFisher的DynamisTM培养基、FreeStyleTM 293表达培养基或Expi293TM表达培养基。在一些实施方案中，所述培养基包括DynamisTM培养基。在一些实施方案中，本文公开的方法使用包含无血清培养基、无动物组分培养基或化学成分确定的培养基的细胞培养物。在一些实施方案中，所述培养基是无动物组分培养基。在一些实施方案中，所述培养基包含血清。在一些实施方案中，所述培养基包含胎牛血清。在一些实施方案中，所述培养基是无谷氨酰胺的培养基。在一些实施方案中，所述培养基包含谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述培养基补充有营养素、盐、缓冲剂和添加剂(例如消泡剂)中的一种或多种。在一些实施方案中，所述培养基补充有谷氨酰胺。在一些实施方案中，所述培养基补充有血清。在一些实施方案中，所述培养基补充有胎牛血清。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述靶细胞是血清饥饿细胞。在一些实施方案中，在与所述病毒颗粒接触前，使所述靶细胞血清饥饿24小时。
在本文所述方法的一些实施方案中，使靶细胞与多孔板(例如96孔或384孔板)中的病毒颗粒接触。在一些实施方案中，本文公开的方法在96孔板中进行。应理解，多孔板的使用允许在同一测定中一式两份、一式三份或更高倍数使用同一接种反应。
在本文所述方法的一些实施方案中，对所述靶细胞进行接种包括在适用于病毒颗粒进入靶细胞的条件下在病毒颗粒存在下孵育所述靶细胞。在一些实施方案中，对所述靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约5分钟至约3天。在一些实施方案中，对所述靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约12小时至约36小时。在一些实施方案中，对所述靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约18小时至约30小时。在一些实施方案中，对所述靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约1小时、约2小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时或约36小时。在一些实施方案中，对所述靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约1天、或约1.5天、或约2天。在一些实施方案中，对所述靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育约24小时。
在本文所述的方法的一些实施方案中，洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒包括使所述细胞与适用于去除细胞外病毒颗粒但不裂解所述接种的靶细胞的任何缓冲液接触。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水或杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水洗涤所述细胞。
本领域技术人员已知的任何方法均可用于从所述接种的细胞中分离出核酸样品。在一些实施方案中，使用适用于处理多孔板(例如96孔板)的可商购获得的系统和试剂分离所述核酸样品。合适的系统和试剂包括ExtractaTM DNA Prep提取试剂、
SV 96基因组DNA纯化系统和GenElute 96孔组织基因组DNA纯化试剂盒。
在一些实施方案中，所述核酸样品为DNA样品。在一些实施方案中，所述核酸样品为RNA样品。
本领域技术人员已知的任何方法均可用于确定所述核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。在一些实施方案中，VGC与TGCG的比率通过下一代测序、定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)来确定。在一些实施方案中，VGC与TGCG的比率通过qPCR来确定。在一些实施方案中，VGC与TGCG的比率通过dPCR、例如通过液滴数字PCR(ddPCR)来确定。在一些实施方案中，用于确定VGC与TGCG比率的PCR(例如dPCR)反应是多重PCR反应。在一些实施方案中，所述多重PCR(例如dPCR)反应包含病毒基因组特异性反应和靶细胞基因组特异性反应。
本领域技术人员应理解，任何病毒基因组特异性序列均可通过PCR进行靶向扩增，以使用qPCR或dPCR确定样品中的病毒基因组拷贝(VGC)数或浓度。类似地，任何靶细胞基因组特异性序列均可通过PCR进行靶向扩增，以使用qPCR或dPCR确定样品中的靶细胞基因组拷贝(TCGC)数或浓度。用于设计正向引物、反向引物、探针组合以确定样品中病毒基因组或靶细胞基因组特异性序列的拷贝数或浓度的软件工具是本领域技术人员众所周知的，并且可以在线，例如在Takara、New England Biolabs、Integrated DNA Technologies和BioRad的网站上获得。这些软件工具中的任何一个均可用于设计根据本文公开的方法确定样品中的病毒基因组拷贝(VGC)和靶细胞基因组拷贝数量或浓度的引物和探针。
在一些实施方案中，所述病毒基因组特异性序列靶标是兔β-珠蛋白polyA元件。在一些实施方案中，能够扩增所述兔β-珠蛋白polyA元件内的靶序列的正向引物和反向引物分别由SEQ ID NO:1和2的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，能够检测所述兔β-珠蛋白polyA元件内的靶序列的正向引物、反向引物和探针分别包含由SEQ ID NO:1、2和3的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一些实施方案中，所述探针还包含共价连接在寡核苷酸的5'端的第一荧光标记和共价连接在寡核苷酸的3'端的第二荧光标记。在一些实施方案中，所述第一荧光标记是FAM，并且所述第二荧光标记是TAMRA。
在一些实施方案中，所述靶细胞基因组特异性序列靶标是人白蛋白基因。在一些实施方案中，能够扩增所述人白蛋白基因内的靶序列的正向引物和反向引物分别由SEQ IDNO:4和5的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，能够检测所述人白蛋白基因内的靶序列的正向引物、反向引物和探针分别包含由SEQ ID NO:4、5和6的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一些实施方案中，所述探针还包含共价连接在寡核苷酸的5'端的第一荧光标记和共价连接在寡核苷酸的3'端的第二荧光标记。在一些实施方案中，所述第一荧光标记是FAM，并且所述第二荧光标记是TAMRA。
在一些实施方案中，本公开提供用于确定测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的方法，其中所述方法包括从所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中确定的病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性。在一些实施方案中，本文所述的方法包括使用平行线模型计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性。在一些实施方案中，计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性包括：计算测试组合物和参考组合物的每种稀释液的VGC:TCGC比率；绘制所述测试组合物和所述参考组合物的log VGC:TCGC比率对log稀释倍数；使用共同斜率将所述测试组合物和所述参考组合物的数据点拟合到测试组合物线和参考组合物线；以及计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性为antilog((截距(测试样品)-截距(参考样品)/共同斜率)。
在一些实施方案中，本文公开的用于确定相对感染性的方法的可重复性和准确性高于50％组织培养感染剂量(TCID50)测定的可重复性和准确性。在一些实施方案中，根据本文所述方法的相对感染性测量的变异系数(cv)小于约100％、小于约50％或小于约25％。在一些实施方案中，根据本文所述方法的相对感染性测量的变异系数(cv)小于约25％。
在一些实施方案中，本公开提供了用于确定测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的方法，其中所述测试组合物和所述参考组合物具有相同的滴度。在一些实施方案中，本公开提供了用于确定测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的方法，其中所述测试组合物和所述参考组合物具有不同的滴度。在一些实施方案中，所述滴度测量为每毫升病毒基因组拷贝(GC)。在一些实施方案中，所述测试组合物和所述参考组合物包含rAAV颗粒。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述测试组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+11GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度在约1x10e+11GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约5x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度在约1x10e+11GC/ml与约5x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9血清型。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述测试组合物的滴度为至少约5x10e+10GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度为至少约1x10e+11GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度为至少约5x10e+11GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度为至少约1x10e+12GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度为至少约5x10e+12GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度为至少约1x10e+13GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度为至少约5x10e+13GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9血清型。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述参考组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+11GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度在约1x10e+11GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约5x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度在约1x10e+11GC/ml与约5x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9血清型。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+10GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度为至少约1x10e+11GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+11GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度为至少约1x10e+12GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+12GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度为至少约1x10e+13GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+13GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9血清型。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+11GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约1x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度在约1x10e+11GC/ml与约1x10e+13GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度在约5x10e+10GC/ml与约5x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度在约1x10e+11GC/ml与约5x10e+12GC/ml的病毒颗粒之间。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9血清型。
在本文所述方法的一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+10GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度为至少约1x10e+11GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+11GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度为至少约1x10e+12GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+12GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度为至少约1x10e+13GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述测试组合物的滴度和所述参考组合物的滴度为至少约5x10e+13GC/ml病毒颗粒。在一些实施方案中，所述病毒颗粒是rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒是AAV8或AAV9血清型。
本文公开的方法可用于评估包含来自任何AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的rAAV颗粒的感染性。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含为AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV8和AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV9的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV9衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB、AAV.PHP.eB或AAV.7m8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在另外的实施方案中，所述rAAV颗粒包含镶嵌衣壳(mosaiccapsid)。在另外的实施方案中，所述rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。
rAAV颗粒
提供的方法适用于生产任何分离的重组AAV颗粒、生产包含任何分离的重组AAV颗粒的组合物或用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的方法，所述方法包括施用任何分离的重组AAV颗粒。因此，所述rAAV可以是本领域已知的任何血清型、修饰或衍生物或它们的任何组合(例如包含两种或更多种血清型的rAAV颗粒群体，例如包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或其他rAAV颗粒中的两种或更多种，或它们的两种或更多种的组合)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或它们的衍生物、修饰或假型的AAV血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与例如AAV衣壳血清型的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、rAAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16或它们的衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含与例如AAV衣壳血清型的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含Anc80或Anc80L65的衣壳，如Zinn等,2015,CellRep.12(6):1056-1068中所述，所述参考以引用的方式整体并入。在某些实施方案中，所述rAAV颗粒包含具有以下氨基酸插入中的一种的衣壳：LGETTRP或LALGETTRP，如美国专利号9,193,956；9458517；和9,587,282以及美国专利申请公布号2016/0376323中所述，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV.7m8的衣壳，如美国专利号9,193,956；9,458,517；和9,587,282以及美国专利申请公布号2016/0376323中所述，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,585,971中公开的任何AAV衣壳，诸如AAVPHP.B。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号9,840,719和WO 2015/013313中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV.Rh74和RHM4-1，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO 2014/172669中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV rh.74，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAV2/5的衣壳，如Georgiadis等,2016,Gene Therapy 23:857-862和Georgiadis等,2018,Gene Therapy 25:450中所述，所述参考各自以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含WO 2017/070491中公开的任何AAV衣壳，诸如AAV2tYF，所述专利以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含AAVLK03或AAV3B的衣壳，如Puzzo等,2017,Sci.Transl.Med.29(9):418中所述，所述参考以引用的方式整体并入。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含美国专利号8,628,966；US 8,927,514；US9,923,120和WO 2016/049230中公开的任何AAV衣壳，诸如HSC1、HSC2、HSC3、HSC4、HSC5、HSC6、HSC7、HSC8、HSC9、HSC10、HSC11、HSC12、HSC13、HSC14、HSC15或HSC16，所述专利各自以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含在以下任何专利和专利申请中公开的AAV衣壳，所述专利和专利申请各自以引用的方式整体并入本文：美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公布号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳在以下任何专利和专利申请中公开，所述专利和专利申请各自以引用的方式整体并入本文：美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US 9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公布号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；以及国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335。
在一些实施方案中，rAAV颗粒具有在国际申请公布号WO 2003/052051(参见例如SEQ ID NO:2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO:123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQ ID NO:2、81、85和97)、WO 2006/068888(参见例如SEQ ID NO:1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO:5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、WO 2010/127097(参见例如SEQ ID NO:5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ IDNO:80-294)和美国申请公布号20150023924(参见例如SEQ ID NO:1、5-10)中公开的衣壳蛋白，所述专利各自的内容以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，rAAV颗粒具有与AAV衣壳的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％得同一性的衣壳蛋白，所述AAV衣壳在国际申请公布号WO 2003/052051(参见例如SEQID NO:2)、WO 2005/033321(参见例如SEQ ID NO:123和88)、WO 03/042397(参见例如SEQID NO:2、81、85和97)、WO 2006/068888(参见例如SEQ ID NO:1和3-6)、WO 2006/110689(参见例如SEQ ID NO:5-38)、WO2009/104964(参见例如SEQ ID NO:1-5、7、9、20、22、24和31)、WO 2010/127097(参见例如SEQ ID NO:5-38)和WO 2015/191508(参见例如SEQ ID NO:80-294)和美国申请公布号20150023924(参见例如SEQ ID NO:1,5-10)。
基于AAV的病毒载体的核酸序列以及制备重组AAV和AAV衣壳的方法在例如美国专利号7,282,199；7,906,111；8,524,446；8,999,678；8,628,966；8,927,514；8,734,809；US9,284,357；9,409,953；9,169,299；9,193,956；9458517；和9,587,282；美国专利申请公布号2015/0374803；2015/0126588；2017/0067908；2013/0224836；2016/0215024；2017/0051257；国际专利申请号PCT/US2015/034799；PCT/EP2015/053335；WO 2003/052051、WO2005/033321、WO 03/042397、WO 2006/068888、WO 2006/110689、WO2009/104964、WO 2010/127097和WO 2015/191508，以及美国申请公布号20150023924中有所教导。
所提供的方法适用于产生编码转基因的重组AAV。在某些实施方案中，所述转基因来自表1A-表1C。在一些实施方案中，rAAV基因组包含含有以下组分的载体：(1)位于表达盒侧面的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码转基因的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的单克隆抗体(mAb)的其他实施方案中，rAAV基因组包含含有以下组分的载体：(1)位于表达盒侧面的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码抗体的轻链Fab和重链Fab或至少重链或轻链Fab以及任选地重链Fc区的核酸序列。在用于表达完整或基本上完整的mAb的其他实施方案中，rAAV基因组包含含有以下组分的载体：(1)位于表达盒侧面的AAV反向末端重复序列；(2)调节控制元件，诸如a)启动子/增强子，b)poly A信号，和c)任选地内含子；以及(3)编码抗VEGF(例如赛伐珠单抗(sevacizumab)、兰尼单抗(ranibizumab)、贝伐珠单抗(bevacizumab)和溴珠单抗(brolucizumab))、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗(ascrinvacumab))、抗C5(例如特斯多鲁单抗(tesidolumab)和依库丽单抗(eculizumab))、抗CD105(例如卡罗妥昔单抗(carotuximab))、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗(adalimumab)、英夫利昔单抗(infliximab)和戈利木单抗(golimumab))、抗RGMa(例如伊莱单抗(elezanumab))、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗(pamrevlumab))、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗(satralizumab)和沙利姆单抗(sarilumab))、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗(dupilumab))、抗IL17A(例如依克珠单抗(ixekizumab)和苏金单抗(secukinumab))、抗IL-5(例如美泊利单抗(mepolizumab))、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗(ustekinumab))、抗CD19(例如尼比珠单抗(inebilizumab))、抗ITGF7 mAb(例如依托珠单抗(etrolizumab))、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗(romosozumab))、抗pKal mAb(例如拉那利尤单抗(lanadelumab))、抗ITGA4(例如那他珠单抗(natalizumab))、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗(vedolizumab))、抗BLyS(例如贝利木单抗(belimumab))、抗PD-1(例如纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab))、抗RANKL(例如地诺单抗(densomab))、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗(alirocumab)和依洛尤单抗(evolocumab))、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗(evinacumab)*)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗(lampalizumab))或抗MMP9(例如安达昔单抗(andecaliximab))的重链Fab；任选地，具有与治疗性抗体的天然形式相同的同种型的Fc多肽，诸如IgG同种型氨基酸序列IgG1、IgG2或IgG4或其修饰的Fc；以及抗VEGF(例如赛伐珠单抗、兰尼单抗、贝伐珠单抗和溴珠单抗)、抗EpoR(例如LKA-651)、抗ALK1(例如阿斯万卡单抗)、抗C5(例如特斯多鲁单抗和依库丽单抗)、抗CD105(例如卡罗妥昔单抗)、抗CC1Q(例如ANX-007)、抗TNFα(例如阿达木单抗、英夫利昔单抗和戈利木单抗)、抗RGMa(例如伊莱单抗)、抗TTR(例如NI-301和PRX-004)、抗CTGF(例如帕姆雷单抗)、抗IL6R(例如沙曲利珠单抗和沙利姆单抗)、抗IL4R(例如杜匹鲁单抗)、抗IL17A(例如依克珠单抗和苏金单抗)、抗IL-5(例如美泊利单抗)、抗IL12/IL23(例如乌司奴单抗)、抗CD19(例如尼比珠单抗)、抗ITGF7mAb(例如依托珠单抗)、抗SOST mAb(例如罗莫珠单抗)、抗pKalmAb(例如拉那利尤单抗)、抗ITGA4(例如那他珠单抗)、抗ITGA4B7(例如维多珠单抗)、抗BLyS(例如贝利木单抗)、抗PD-1(例如纳武单抗和派姆单抗)、抗RANKL(例如地诺单抗)、抗PCSK9(例如阿罗洛单抗和依洛尤单抗)、抗ANGPTL3(例如依维苏单抗)、抗OxPL(例如E06)、抗fD(例如兰帕珠单抗)或抗MMP9(例如安达昔单抗)的轻链的核酸序列；其中所述重链(Fab和任选地Fc区)和所述轻链由自裂解的弗林蛋白酶(furin)(F)/F2A或柔性接头分离，确保表达等量的所述重链和所述轻链多肽。
表1A
表1B
表1C
在一些实施方案中，本文提供了编码抗VEGF Fab的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码抗VEGF Fab的基于rAAV8的病毒载体。在更具体的实施方案中，本文提供了编码兰尼单抗的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码艾杜糖苷酸酶(IDUA)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码IDUA的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码艾杜糖醛酸2-硫酸酯酶(IDS)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码IDS的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码低密度脂蛋白受体(LDLR)的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码LDLR的基于rAAV8的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码三肽基肽酶1(TPP1)蛋白的rAAV病毒载体。在具体的实施方案中，本文提供了编码TPP1的基于rAAV9的病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码VEGF受体1(sFlt-1)的非膜相关剪接变体的rAAV病毒载体。在一些实施方案中，本文提供了编码编码γ-肌聚糖、Rab护航蛋白1(REP1/CHM)、类维生素A异构水解酶(RPE65)、环状核苷酸门控通道α3(CNGA3)、环核苷酸门控通道β3(CNGB3)、芳香族L-氨基酸脱羧酶(AADC)、溶酶体相关膜蛋白2同工型B(LAMP2B)、因子VIII、因子IX、色素性视网膜炎GTPase调节剂(RPGR)、视网膜劈裂蛋白(RS1)、肌浆网钙ATPase(SERCA2a)、阿柏西普、battenin(CLN3)、跨膜ER蛋白(CLN6)、谷氨酸脱羧酶(GAD)、胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)、水通道蛋白1(AQP1)、肌微管素(MTM1)、卵泡抑素(FST)、葡萄糖6磷酸酶(G6Pase)、载脂蛋白A2(APOA2)、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1(UGT1A1)、芳基硫酸酯酶B(ARSB)、N-乙酰基-α-氨基葡萄糖苷酶(NAGLU)、α-葡萄糖苷酶(GAA)、α-半乳糖苷酶(GLA)、β-半乳糖苷酶(GLB1)、脂蛋白脂肪酶(LPL)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、磷酸二酯酶6B(PDE6B)、鸟氨酸氨甲酰基转移酶9OTC)、存活运动神经元(SMN1)、存活运动神经元(SMN2)、神经秩蛋白(NRTN)、神经营养蛋白3(NT-3/NTF3)、胆色素原脱氨酶(PBGD)、神经生长因子(NGF)、线粒体编码的NADH：泛醌氧化还原酶核心亚基4(MT-ND4)、保护性蛋白组织蛋白酶A(PPCA)、戴斯弗林蛋白、MER原癌基因、酪氨酸激酶(MERTK)、囊性纤维化跨膜传导调节物(CFTR)或肿瘤坏死因子受体(TNFR)-免疫球蛋白(IgG1)Fc融合蛋白的rAAV病毒载体。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型AAV衣壳。在一些实施方案中，所述假型AAV衣壳是rAAV2/8或rAAV2/9假型AAV衣壳。用于生产和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等,J.Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert等,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin等,Methods 28:158-167(2002)；以及Auricchio等,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在一些实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。
在某些实施方案中，可使用单链AAV(ssAAV)。在某些实施方案中，可使用自补载体，例如scAAV(参见例如Wu,2007,Human GeneTherapy,18(2):171-82,McCarty等,2001,Gene Therapy,第8卷,第16号,第1248-1254页；以及美国专利号6,596,535；7,125,717和7,456,683，所述参考各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含来自选自AAV8或AAV9的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含来自选自由AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB和AAV.7m8组成的组的AAV衣壳血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含与AAV8或AAV9具有高序列同源性的衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV1或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV4或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV5或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV8或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒具有AAV9或其衍生物、修饰或假型的AAV衣壳血清型。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含为AAV8或AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含为AAV9衣壳蛋白的衍生物、修饰或假型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与AAV9衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性的AAV8衣壳蛋白。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与AAV7、AAV8、AAV9、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.PHB、AAV.PHP.eB或AAV.7m8衣壳蛋白的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含衣壳蛋白，所述衣壳蛋白与与AAV8或AAV9具有高序列同源性的AAV衣壳蛋白，诸如AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1和AAV.hu37的VP1、VP2和/或VP3序列具有至少80％或更高的同一性，例如85％、85％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％等，即高达100％的同一性。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含镶嵌衣壳。镶嵌AAV颗粒由来自不同AAV的血清型的病毒衣壳蛋白的混合物组成。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的血清型的衣壳蛋白的镶嵌衣壳。
在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10的血清型的衣壳蛋白的镶嵌衣壳。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，所述假型rAAV颗粒包含(a)包含AAV ITR的核酸载体以及(b)由衍生自AAVx(例如AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16)的衣壳蛋白组成的衣壳。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含由选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV血清型的衣壳蛋白组成的假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含含有AAV8衣壳蛋白的假型rAAV颗粒。在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含由AAV9衣壳蛋白组成的假型rAAV颗粒。在一些实施方案中，假型rAAV8或rAAV9颗粒是rAAV2/8或rAAV2/9假型颗粒。用于生产和使用假型rAAV颗粒的方法是本领域已知的(参见例如Duan等,J.Virol.,75:7662-7671(2001)；Halbert等,J.Virol.,74:1524-1532(2000)；Zolotukhin等,Methods 28:158-167(2002)；以及Auricchio等,Hum.Molec.Genet.10:3075-3081,(2001)。
在另外的实施方案中，rAAV颗粒包含衣壳，所述衣壳含有两种或更多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白嵌合体。在其他实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、rAAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。在其他实施方案中，所述衣壳蛋白是来自选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10的AAV血清型的2种或更多种AAV衣壳蛋白的嵌合体。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8衣壳蛋白和来自AAV血清型的一种或多种AAV衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV血清型选自AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV9、AAV10、AAVrh.8和AAVrh.10。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16。
在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9衣壳蛋白和一种或多种AAV衣壳血清型的衣壳蛋白的AAV衣壳蛋白嵌合体，所述AAV衣壳血清型选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AA6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh.8和AAVrh.10。
用于分离rAAV颗粒的方法
在一些实施方案中，本公开提供了用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的药物组合物的方法，其包括：从包含杂质的进料(例如rAAV生产培养物)中分离出rAAV颗粒；确定所述分离的rAAV颗粒的基因组滴度；使用本文公开的方法确定所述分离的rAAV颗粒的感染性；以及配制所述分离的rAAV颗粒以产生药物组合物。在一些实施方案中，用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的药物组合物的方法包括：从包含杂质的进料(例如rAAV生产培养物)中分离出rAAV颗粒；以及使用本文公开的方法确定所述分离的rAAV颗粒的感染性；以及配制所述分离的rAAV颗粒以产生药物组合物。
在一些实施方案中，本公开还提供了用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的药物单位剂量的方法，其包括：从包含杂质的进料(例如rAAV生产培养物)中分离出rAAV颗粒；确定所述分离的rAAV颗粒的基因组滴度；使用本文公开的方法确定所述分离的rAAV颗粒的感染性；以及配制所述分离的rAAV颗粒。在一些实施方案中，用于生产包含分离的重组腺相关病毒(rAAV)颗粒的药物单位剂量的方法包括：从包含杂质的进料(例如rAAV生产培养物)中分离出rAAV颗粒；以及使用本文公开的方法确定所述分离的rAAV颗粒的感染性；以及配制所述分离的rAAV颗粒。
分离的rAAV颗粒可以使用本领域已知的方法进行分离。在一些实施方案中，分离rAAV颗粒的方法包括下游加工，例如像收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、无菌过滤或它们的任何组合。在一些实施方案中，下游加工包括以下中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种或至少6种：收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物或细胞培养物上清液(例如通过离心或深度过滤)、切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、羟基磷灰石色谱和无菌过滤。在一些实施方案中，下游加工包括收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，下游加工包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、无菌过滤、切向流过滤、亲和色谱和阴离子交换色谱。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，下游加工不包括离心。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
在一些实施方案中，分离rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，本文公开的分离rAAV颗粒的方法包括收获细胞培养物、澄清所述收获的细胞培养物(例如通过深度过滤)、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，本文公开的分离rAAV颗粒的方法包括澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，分离根据本文公开的方法产生的rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、第一切向流过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、第二切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，本文公开的分离rAAV颗粒的方法包括通过深度过滤来澄清收获的细胞培养物、第一无菌过滤、亲和色谱、阴离子交换色谱(例如整体式阴离子交换色谱或使用季胺配体的AEX色谱)、切向流过滤和第二无菌过滤。在一些实施方案中，所述方法不包括离心。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV8血清型的衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述rAAV颗粒包含AAV9血清型的衣壳蛋白。
用于生产rAAV颗粒的许多方法是本领域已知的，包括转染、稳定的细胞系生产以及包括腺病毒-AAV杂合体、疱疹病毒-AAV杂合体和杆状病毒-AAV杂合体的感染性杂合病毒生产系统。用于生产rAAV病毒颗粒的rAAV生产培养物都需要：(1)合适的宿主细胞，包括例如人衍生细胞系，诸如HeLa、A549或HEK293细胞以及它们的衍生物(HEK293T细胞、HEK293F细胞)；哺乳动物细胞系，诸如Vero或昆虫衍生细胞系诸如SF-9(就杆状病毒生产系统而言)；(2)合适的辅助病毒功能，由野生型或突变型腺病毒(诸如温度敏感性腺病毒)、疱疹病毒、杆状病毒或提供辅助功能的质粒构建体提供；(3)AAV rep和cap基因以及基因产物；(4)与AAV ITR序列侧接的转基因(诸如治疗性转基因)；以及(5)支撑rAAV生产的合适的培养基和培养基组分。本领域已知的合适的培养基可用于生产rAAV载体。这些培养基包括但不限于由Hyclone Laboratories和JRH生产的培养基，包括如美国专利号6,723,551中所述的改良伊格尔培养基(MEM)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)和Sf-900 II SFM培养基，所述专利以引用的方式整体并入本文。
rAAV生产培养物可常规地在适合于所利用的特定宿主细胞的各种条件下(在宽的温度范围内、变化的时间长度等)生长。如本领域中已知的，rAAV生产培养物包括可在合适的粘附依赖性容器，例如像滚瓶、中空纤维过滤器、微载体和填充床或流化床生物反应器中培养的粘附依赖性培养物。rAAV载体生产培养物还可包括悬浮适应性宿主细胞，诸如HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞，它们可以多种方式进行培养，包括例如旋转瓶、搅拌釜生物反应器和一次性系统，诸如波浪袋系统。在一些实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。在一些实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公布号20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，所述rAAV生产培养物包括高密度细胞培养物。在一些实施方案中，所述培养物的总细胞密度为约1x10E+06细胞/ml与约30x10E+06细胞/ml之间。在一些实施方案中，约50％以上的细胞是活细胞。在一些实施方案中，所述细胞是HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞或SF-9细胞。在其他实施方案中，所述细胞是HEK293细胞。在其他实施方案中，所述细胞是适于在悬浮培养物中生长的HEK293细胞。
在所提供方法的另外的实施方案中，所述rAAV生产培养物包含含有rAAV颗粒的悬浮培养物。用于生产rAAV颗粒的许多悬浮培养物是本领域已知的，包括例如在美国专利号6,995,006、9,783,826和在美国专利申请公布号20120122155中公开的培养物，所述专利各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括哺乳动物细胞或昆虫细胞的培养物。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括HeLa细胞、HEK293细胞、HEK293衍生细胞(例如HEK293T细胞、HEK293F细胞)、Vero细胞、CHO细胞、CHO-K1细胞、CHO衍生细胞、EB66细胞、BSC细胞、HepG2细胞、LLC-MK细胞、CV-1细胞、COS细胞、MDBK细胞、MDCK细胞、CRFK细胞、RAF细胞、RK细胞、TCMK-1细胞、LLCPK细胞、PK15细胞、LLC-RK细胞、MDOK细胞、BHK细胞、BHK-21细胞、NS-1细胞、MRC-5细胞、WI-38细胞、BHK细胞、3T3细胞、293细胞、RK细胞、Per.C6细胞、鸡胚细胞或SF-9细胞的培养物。在一些实施方案中，所述悬浮培养物包括HEK293细胞的培养物。
在一些实施方案中，用于生产rAAV颗粒的方法涵盖：提供包含能够产生rAAV的细胞的细胞培养物；向所述细胞培养物中加入组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂至最终浓度为约0.1mM与约20mM之间；以及将所述细胞培养物保持在允许生产所述rAAV颗粒的条件下。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括短链脂肪酸或其盐。在一些实施方案中，所述HDAC抑制剂包括丁酸盐(例如丁酸钠)、丙戊酸盐(例如丙戊酸钠)、丙酸盐(例如丙酸钠)或它们的组合。
在一些实施方案中，如在2019年8月9日提交的标题为“SCALABLE METHOD FORRECOMBINANT AAV PRODUCTION”的国际申请号PCT/US19/45926中所公开的那样生产rAAV颗粒，所述申请以引用的方式整体并入本文。
可通过收获包含宿主细胞的生产培养物或从生产培养物中收获废培养基来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒，前提是要在本领域已知的条件下培养细胞以使rAAV颗粒从完整的宿主细胞释放到培养基中。还可通过裂解生产培养物的宿主细胞来从rAAV生产培养物中收获重组AAV颗粒。裂解细胞的合适方法也是本领域已知的，并且包括例如多次冷冻/解冻循环、超声处理、微流化和使用化学物质诸如洗涤剂和/或蛋白酶处理。
在收获时，rAAV生产培养物可含有以下中的一种或多种：(1)宿主细胞蛋白；(2)宿主细胞DNA；(3)质粒DNA；(4)辅助病毒；(5)辅助病毒蛋白；(6)辅助病毒DNA；和(7)培养基组分，包括例如血清蛋白、氨基酸、转铁蛋白和其他低分子量蛋白。rAAV生产培养物还可包含产物相关的杂质，例如无活性载体形式、空的病毒衣壳、聚集的病毒颗粒或衣壳、错误折叠的病毒衣壳、降解的病毒颗粒。
在一些实施方案中，澄清rAAV生产培养物收获物以去除宿主细胞碎片。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过经由一系列深度过滤器的过滤来澄清。还可通过本领域已知的多种其他标准技术来实现澄清，诸如通过本领域已知的0.2mm或更大孔径的任何乙酸纤维素过滤器的离心或过滤。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括无菌过滤。在一些实施方案中，所述生产培养物收获物通过离心来澄清。在一些实施方案中，澄清所述生产培养物收获物不包括离心。
在一些实施方案中，使用过滤澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物包括深度过滤。在一些实施方案中，澄清所述收获的细胞培养物还包括深度过滤和无菌过滤。在一些实施方案中，使用包含一种或多种不同过滤介质的过滤器系列澄清收获的细胞培养物。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括一种或多种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括两种深度过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括无菌过滤介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括2种深度过滤介质和无菌过滤介质。在一些实施方案中，深度过滤器介质是多孔深度过滤器。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括
20MS、
C0HC和无菌级过滤器介质。在一些实施方案中，所述过滤器系列包括
20MS、
C0HC和
2XLG 0.2μm。在一些实施方案中，在使所述收获的细胞培养物与深度过滤器接触前对其进行预处理。在一些实施方案中，所述预处理包括将盐加入到所述收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，所述预处理包括将化学絮凝剂加入到所述收获的细胞培养物中。在一些实施方案中，在使所述收获的细胞培养物与深度过滤器接触前不对其进行预处理。
在一些实施方案中，在2019年4月27日提交的标题为“SCALABLE CLARIFICATIONPROCESS FOR RECOMBINANT AAV PRODUCTION”的PCT国际专利申请号PCT/US2019/029539中公开了通过过滤澄清的生产培养物收获物，所述申请以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，使用核酸酶(例如
)或核酸内切酶(例如来自粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)的核酸内切酶)处理rAAV生产培养物收获物，以消化所述生产培养物中存在的高分子量DNA。核酸酶或核酸内切酶消化可常规地在本领域已知的标准条件下进行。例如，核酸酶消化在最终浓度为1-2.5单位/ml
温度在环境温度至37℃范围内，时间段为30分钟至若干个小时下进行。
无菌过滤涵盖使用无菌级过滤器介质的过滤。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚醚砜(PES)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质包括聚偏氟乙烯(PVDF)。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有0.8μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质具有1.2μm的预过滤器和0.2μm的最终滤膜的亲水性异质双层设计。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是0.2或0.22μm的孔过滤器。在其他实施方式中，所述无菌级过滤器介质是0.2μm的孔过滤器。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是
2XLG 0.2μm、DuraporeTM PVDF膜0.45μm或
PES 1.2μm+0.2μm标称孔径组合。在一些实施方案中，所述无菌级过滤器介质是
2XLG0.2μm。
在一些实施方案中，在将澄清的进料施加到色谱介质例如亲和色谱介质之前，将其通过切向流过滤(“TFF”)进行浓缩。Paul等,HumanGene Therapy 4:609-615(1993)已描述了使用TFF超滤的大规模病毒浓缩。澄清进料的TFF浓度能够实现在技术上可控的澄清进料的体积以进行色谱，并且无需漫长的再循环时间即可使柱大小更合理。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少两倍与至少十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少十倍与至少二十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩至少二十倍与至少五十倍之间。在一些实施方案中，所述澄清进料浓缩约二十倍。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于通过渗滤从所述澄清进料中去除小分子杂质(例如包含培养基组分、血清白蛋白或其他血清蛋白的细胞培养物污染物)。在一些实施方案中，对所述澄清进料进行渗滤以去除小分子杂质。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约3倍与约10倍之间的渗滤体积的缓冲液。在一些实施方案中，所述渗滤包括使用约5倍渗滤体积的缓冲液。本领域普通技术人员还将认识到，TFF还可用于纯化过程中的任何步骤，其中期望在进行纯化过程的下一步骤之前交换缓冲液。在一些实施方案中，用于从本文公开的澄清进料中分离rAAV的方法包括使用TFF以交换缓冲液。
亲和色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从所述澄清进料中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，亲和色谱用于从已经过切向流过滤的澄清进料中分离rAAV颗粒。合适的亲和色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于AVBSepharoseTM、POROSTM CaptureSelectTM AAVX亲和树脂、POROSTM CaptureSelectTM AAV9亲和树脂和POROSTM CaptureSelectTM AAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTM CaptureSelectTM AAV9亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTM CaptureSelectTM AAV8亲和树脂。在一些实施方案中，所述亲和色谱介质是POROSTMCaptureSelectTM AAVX亲和树脂。
阴离子交换色谱可用于从组合物中分离rAAV颗粒。在一些实施方案中，在亲和色谱后使用阴离子交换色谱作为最终浓缩和抛光步骤。合适的阴离子交换色谱介质是本领域已知的，并且包括但不限于Unosphere Q(Biorad，Hercules，Calif.)和N带电荷的氨基或亚氨基树脂，例如像POROS 50PI或任何DEAE、TMAE、叔胺或季胺或本领域已知的PEI基树脂(美国专利号6,989,264；Brument等,Mol.Therapy 6(5):678-686(2002)；Gao等,Hum.GeneTherapy 11:2079-2091(2000))。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质包含季胺。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是整体式阴离子交换色谱。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质包括甲基丙烯酸缩水甘油酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯或苯乙烯-二乙烯基苯聚合物。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质选自由CIMmultusTM QA-1高级复合柱(季胺)、CIMmultusTM DEAE-1高级复合柱(二乙氨基)、
QA盘(季胺)、
DEAE和
EDA盘(乙烯二氨基)组成的组。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是CIMmultusTM QA-1高级复合柱(季胺)。在一些实施方案中，所述整体式阴离子交换色谱介质是
QA盘(季胺)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是CIM QA(BIASeparations，Slovenia)。在一些实施方案中，所述阴离子交换色谱介质是BIA
QA-80(柱体积为80mL)。本领域普通技术人员可理解的是，可确定具有合适离子强度的洗涤缓冲液，使得rAAV保持与树脂的结合，同时杂质(包括但不限于通过上游纯化步骤可能引入的杂质)被除去。
在一些实施方案中，根据在2019年6月13日提交的标题为“Anion ExchangeChromatography for Recombinant AAV production”的国际申请号PCT/US2019/037013中公开的方法进行阴离子交换色谱，所述申请以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，分离rAAV颗粒的方法包括确定包含所述分离的rAAV颗粒的组合物中的载体基因组滴度、衣壳滴度和/或完整衣壳与空衣壳的比率。在一些实施方案中，所述载体基因组滴度通过定量PCR(qPCR)或数字PCR(dPCR)或液滴数字PCR (ddPCR)来确定。在一些实施方案中，所述衣壳滴度通过血清型特异性ELISA来确定。在一些实施方案中，所述完整衣壳与空衣壳的比率通过分析型超速离心(AUC)或透射电子显微镜(TEM)来确定。
在一些实施方案中，所述载体基因组滴度、所述衣壳滴度和/或所述完整衣壳与空衣壳的比率通过分光光度法、例如通过测量所述组合物在260nm处的吸光度；以及测量所述组合物在280nm处的吸光度来确定。在一些实施方案中，在测量所述组合物的吸光度之前，所述rAAV颗粒未变性。在一些实施方案中，在测量所述组合物的吸光度之前，所述rAAV颗粒已变性。在一些实施方案中，使用分光光度计测定所述组合物在260nm和280nm处的吸光度。在一些实施方案中，使用HPLC测定所述组合物在260nm和280nm处的吸光度。在一些实施方案中，所述吸光度是峰值吸光度。用于测量组合物在260nm和280nm处的吸光度的若干种方法是本领域已知的。确定包含所述分离的重组rAAV颗粒的组合物的载体基因组滴度和衣壳滴度的方法公开在2019年4月27日提交的标题为“Systems and methods ofspectrophotometry for the determination of genome copies and full/emptyratios of adeno-associated virus particles”的国际申请号PCT/US19/29540中，所述申请以引用的方式整体并入本文。
在另外的实施方案中，本公开提供了包含根据本文公开的方法产生的分离的rAAV颗粒的组合物。在一些实施方案中，所述组合物是包含药学上可接受的载剂的药物组合物。
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指适用于一种或多种施用途径、体内递送或接触的生物学上可接受的制剂，其为气态、液态或固态或它们的混合物。“药学上可接受的”组合物是在生物学上或其他方面不是不期望的材料，例如可向受试者施用所述材料而不会引起实质的不期望的生物学效应。因此，这种药物组合物可用于例如向受试者施用根据所公开的方法分离的rAAV。此类组合物包括与药物施用或体内接触或递送相容的溶剂(水性或非水性)、溶液(水性或非水性)、乳剂(例如水包油或油包水)、悬浮液、糖浆、酏剂、分散和悬浮介质、包衣、等渗剂和吸收促进剂或延迟剂。水性和非水性溶剂、溶液和悬浮液可包括悬浮剂和增稠剂。此类药学上可接受的载剂包括片剂(包衣的或未包衣的)、胶囊(硬或软的)、微珠、粉末、颗粒和晶体。也可将补充活性化合物(例如防腐剂、抗菌剂、抗病毒剂和抗真菌剂)掺入所述组合物中。如本文所列出或本领域技术人员已知的，可将药物组合物配制为与特定的施用或递送途径相容。因此，药物组合物包括适用于通过各种途径施用的载剂、稀释剂或赋形剂。适用于本发明的rAAV颗粒以及方法和用途的药物组合物和递送系统是本领域已知的(参见例如Remington:The Science and Practice of Pharmacy(2003)第20版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.；Remington's Pharmaceutical Sciences(1990)第18版,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.；The Merck Index(1996)第12版,MerckPublishing Group,Whitehouse,N.J.；Pharmaceutical Principles of Solid DosageForms(1993),Technonic Publishing Co.,Inc.,Lancaster,Pa.；Ansel和Stoklosa,Pharmaceutical Calculations(2001)第11版,Lippincott Williams&Wilkins,Baltimore,Md.；以及Poznansky等,Drug Delivery Systems(1980),R.L.Juliano编,Oxford,N.Y.,第253-315页)。
在一些实施方案中，所述组合物是药物单位剂量。“单位剂量”是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；当以一种或多种剂量施用时，计算含有任选地与药物载剂(赋形剂、稀释剂、媒介物或填充剂)相关联的预定量的每个单位，以产生所需的作用(例如预防性或治疗性作用)。单位剂型可在例如安瓿和小瓶内，所述单位剂型可包括液体组合物或处于冷冻干燥或冻干状态的组合物；例如，可在体内施用或递送之前添加无菌液体载剂。单个单位剂型可包含在多剂量药盒或容器中。出于易于施用和剂量均一性，重组载体(例如AAV)序列、质粒、载体基因组和重组病毒颗粒以及它们的药物组合物可以单一单位剂量或多单位剂量的形式进行包装。在一些实施方案中，所述组合物包含rAAV颗粒，所述rAAV颗粒包含来自选自AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15和AAV.HSC16的AAV衣壳血清型的AAV衣壳蛋白。在一些实施方案中，所述AAV衣壳血清型是AAV8。在一些实施方案中，所述AAV衣壳血清型是AAV9。
多核苷酸
在一些实施方案中，本公开提供了分离的多核苷酸。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸可用于检测或确定包含兔β-珠蛋白polyA元件的重组病毒或病毒载体的基因组拷贝数。在一些实施方案中，本文所述的分离的多核苷酸可用于检测或确定包含人白蛋白基因的人靶细胞的基因组拷贝数。
在一些实施方案中，本文公开的分离的多核苷酸包含约15至约40个核苷酸，包含以下核苷酸序列：
5’–GGA CAT CAT GAA GCC CCT T–3’(SEQ ID NO:1)，
5’–TCC AAC ACA CTA TTG CAA TGA AAA–3’(SEQ ID NO:2)，
5’–AGC ATC TGA CTT CTG GCT AAT AAA GGA A–3’(SEQ ID NO:3)，
5’–TGA AAC ATA CGT TCC CAA AGA GTT T–3’(SEQ ID NO:4)，
5’–CTC TCC TTC TCA GAA AGT GTG CAT AT–3’(SEQ ID NO:5)，或
5’–TGC TGA AAC ATT CAC CTT CCA TGC A–3’(SEQ ID NO:6)，
所述核苷酸序列包含0、1、2、3、4或5个取代。
在一些实施方案中，本文公开的分离的多核苷酸具有约15至约40个核苷酸，并且包含SEQ ID NO:1-6的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸由SEQ ID NO:1-6的核苷酸序列组成。
在一些实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含(i)本文所述的多核苷酸和(ii)可检测的标记，其中所述标记共价连接到所述多核苷酸。在一些实施方案中，所述可检测标记是荧光标记。在一些实施方案中，所述可检测标记包括FAM、JOE、TAMRA和ROX中的一种或多种。在一些实施方案中，所述分离的多核苷酸包含SEQ IDNO:1-6的核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供一对正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含SEQ ID NO:1和2的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供一对正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含SEQ ID NO:4和5的多核苷酸序列。
在一些实施方案中，本公开提供一种探针、正向引物和反向引物的组合，其中所述正向引物、所述反向引物和所述探针分别包含由SEQ ID NO:1、2和3的核苷酸序列组成的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供一种探针、正向引物和反向引物的组合，其中所述正向引物、所述反向引物和所述探针分别包含由SEQ ID NO:4、5和6的核苷酸序列组成的多核苷酸。
在一些实施方案中，本文所述的分离的寡核苷酸是探针，其中所述多核苷酸由选自SEQ ID NO:3和6的核苷酸序列组成。
在一些实施方案中，本文所述的探针包含可检测标记。所述可检测标记可以共价连接到所述多核苷酸。所述可检测标记可以是荧光标记，例如FAM、JOE、TAMRA和ROX。在一些实施方案中，本文所述的探针包含一种或多种选自由FAM、JOE、TAMRA和ROX组成的组的共价连接的荧光标记。在一些实施方案中，本文所述的探针包含多核苷酸，所述多核苷酸包含共价连接在5'端的第一荧光标记和共价连接在3'端的第二荧光标记。在一些实施方案中，本文所述的探针是包含荧光报告分子和猝灭剂染料的双标记探针。在一些实施方案中，所述猝灭剂能够通过荧光共振能量转移(FRET)猝灭所述报告分子的荧光。在一些实施方案中，所述猝灭剂能够通过静态猝灭来猝灭所述报告分子的荧光。在一些实施方案中，所述荧光报告分子选自由FAM、JOE、T AMRA和ROX组成的组，并且所述猝灭剂是TAMRA。
本文提供了能够扩增所述兔β-珠蛋白polyA元件或所述人白蛋白基因内的靶序列的正向引物和反向引物的组合。在一些实施方案中，能够扩增所述兔β-珠蛋白polyA元件内的靶序列的正向引物和反向引物分别由SEQ ID NO:1和2的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，能够扩增所述人白蛋白基因内的靶序列的正向引物和反向引物分别由SEQ ID NO:4和5的核苷酸序列组成。
本文提供了能够通过qPCR或dPCR反应来检测所述兔β-珠蛋白polyA元件或所述人白蛋白基因内的靶序列的探针、正向引物和反向引物的组合。在一些实施方案中，能够检测所述兔β-珠蛋白polyA元件内的靶序列的正向引物、反向引物和探针分别包含由SEQ IDNO:1、2和3的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一些实施方案中，能够检测所述人白蛋白基因内的靶序列的正向引物、反向引物和探针分别包含由SEQ ID NO:4、5和6的核苷酸序列组成的多核苷酸。在一些实施方案中，所述探针还包含共价连接在寡核苷酸的5'端的第一荧光标记和共价连接在寡核苷酸的3'端的第二荧光标记。在一些实施方案中，所述第一荧光标记是FAM，并且所述第二荧光标记是TAMRA。
在一些实施方案中，本公开提供了一种产生感兴趣的多核苷酸的方法，其包括使用本文所述的一对正向引物和反向引物使来自生物样品的DNA进行聚合酶链反应。
在一些实施方案中，本公开提供了一种产生感兴趣的多核苷酸的方法，其包括使用本文所述的探针、正向引物和反向引物的组合使来自生物样品的DNA进行聚合酶链反应。
试剂盒
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含一个或多个选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含本文所述的一对正向引物和反向引物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含本文所述的探针、正向引物和反向引物的组合。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于确定rAAV测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的试剂盒，其包含本文所述的探针、正向引物和反向引物的组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含rAAV参考组合物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于确定在不同条件下病毒颗粒组合物的相对感染性的试剂盒，其包含本文所述的探针、正向引物和反向引物的组合。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含rAAV参考组合物。
实施例
实施例1.相对感染性是用于定量体外AAV载体感染性差异的可靠方法。
已经依靠测量体外感染性的方法来支持AAV基因疗法产物的产物一致性、可比性和稳定性。TCID50感染滴度测定是用于测量AAV病毒载体体外感染性的最常用方法之一，但存在很大的测定变异性。例如，使用TCID50感染滴度测定对rAAV2和rAAV9参考标准材料进行的感染性测量分别具有191％几何CV(SD＝0.46log10 IU/mL)和209％几何CV(SD＝0.49log10 IU/mL)。高测定变异性使TCID50成为了用于测量不同载体制剂的感染性差异或因降解导致的感染性变化的不可靠工具。
已开发出能够检测和定量AAV载体的体外感染性中的微小差异的相对感染性方法。所述方法的示意图在图1和图2中示出。为了提供准确的相对感染性测量，准确定量测试样品和参考标准品中的载体基因组浓度非常重要。使用具有已知生物活性或感染性的表征良好的参考标准品也很重要。
简而言之，第1天，将两个96孔Edge板以40,000-50,000个细胞/孔播种HuH-7细胞。第2天，使所述细胞血清饥饿过夜。第3天，将测试样品和参考标准品的系列稀释液一式两份制备到含有0.001％Pluronic F-68的培养基中，并将稀释的测试样品和参考标准品转移到细胞中，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。第4天，用DPBS洗涤细胞、用AccutaseTM(蛋白水解酶和胶原水解酶的细胞分离溶液)处理孔、沉淀细胞，并从细胞沉淀物中提取DNA。建立多重ddPCR反应以确定DNA样品中的病毒基因组拷贝数和靶细胞基因组拷贝数。将兔珠蛋白polyA特异性引物/探针(SEQ ID NO:1-3)用于确定病毒基因组拷贝数。将人白蛋白特异性引物/探针(SEQ ID NO:4-6)用于确定靶细胞基因组拷贝数。使用平行线模型确定相对感染性，如图2所示。
为了评估测定的线性、准确性和精确度，使用包含100％rAAV颗粒的起始组合物作为参考，测量包含200％、150％、125％、100％、75％或50％rAAV8颗粒的测试组合物的相对感染性。下文所示的结果是在9个不同的运行中收集的，N＝20。
强制降解后的相对感染性比较。测量在60℃下孵育10分钟的rAAV样品的相对感染性。还测量了未处理样品(在-80℃下储存)的相对感染性作为对照。在60℃下孵育的样品中观察到的相对感染性为375％(标准误差42％)。未处理对照的相对感染性为99％(标准误差6％)。因此，本文所述的相对感染性方法能够检测强制降解后感染性的变化。相对感染性可能因为由聚集引起的含GC颗粒的吸收增加而提高。
不同rAAV载体的相对感染性比较。测量了包含不同有效载荷的AAV9和AAV8载体的相对感染性。获得的结果如下文所示。不同的重组载体使用不同的ddPCR方法。
| 血清型 | 相对感染性 | 标准误差 | |
| 产物A | AAV9 | 124％ | 10％ |
| 产物B | AAV9 | 75％ | 6％ |
| 产物C | AAV9 | 78％ | 7％ |
| 产物D | AAV8 | 89％ | 7％ |
多个批次的相对感染性比较。测量了多个批次的相同重组AAV8载体的相对感染性。获得的结果如下文所示。
| 批次/批号 | 相对感染性 | 标准误差 | |
| 产物D | 1 | 103％ | 5％ |
| 产物D | 2 | 108％ | 5％ |
| 产物D | 3 | 81％ | 4％ |
| 产物D | 4 | 102％ | 4％ |
| 产物D | 5 | 90％ | 4％ |
本文所述的体外相对感染性方法能够检测AAV载体的感染性中的微小差异。由50-200％的相对感染性，相对感染性方法是线性的、准确的且精确的。由50-200％的相对感染性，相对感染性方法是线性的、准确的且精确的。相对感染性方法为比较不同制剂、产物和AAV衣壳血清型的感染性提供了有用的工具。
实施例2.AAV载体在体外感染不同细胞的能力比较。
本文公开的测量体外相对感染性的方法还可用于筛选和鉴定允许病毒感染的细胞，以及用于鉴定调节细胞对病毒感染的易感性的因子。在一个实施方案中，为了筛选或鉴定允许病毒感染的细胞和条件，使用本文公开的方法在不同细胞底物上平行测量了具有已知生物活性或感染性的单个AAV载体或参考标准品的体外相对感染性。
人贴壁HEK293细胞系的不同变体的比较。第1天，将96孔Edge板以30,000个细胞/孔播种人贴壁HEK293细胞系的不同变体。第2天，使所述细胞血清饥饿过夜。第3天，将单个AAV8载体参考标准品的系列稀释液一式两份制备到含有0.001％Pluronic F-68的培养基中，并将稀释的参考标准品转移到所述细胞中，并在37℃、5％CO2下孵育24小时。第4天，用DPBS洗涤细胞、用AccutaseTM(蛋白水解酶和胶原水解酶的细胞分离溶液)处理孔、沉淀细胞，并从细胞沉淀物中提取DNA。建立多重ddPCR反应以确定DNA样品中的病毒基因组拷贝数和靶细胞基因组拷贝数。将兔珠蛋白poly A特异性引物/探针(SEQ ID No:1-3)用于确定病毒基因组拷贝数。将人白蛋白特异性引物/探针(SEQ ID NO:4-6)用于确定靶细胞基因组拷贝数。使用平行线模型确定相对感染性，如图2所示。获得的结果如下文所示。
| 相对感染性 | |
| HEK293(参考) | 100％(参考) |
| 具有修饰A的HEK293 | 147％ |
| 具有修饰A和修饰B的HEK293 | 6,968％ |
结果表明，相对感染性方法为鉴定细胞修饰和调节细胞对病毒感染的易感性的因子提供了有用的工具。
尽管所公开的方法已经结合当前被认为是最实际和优选的实施方案来描述，但是应当理解，本公开所涵盖的方法不限于所公开的实施方案，而是相反，旨在覆盖包括在所附权利要求书的精神和范围内的各种修改和等效安排。
所有出版物、专利、专利申请、互联网站点和登录号/数据库序列(包括本文引用的多核苷酸和多肽序列)出于所有目的在此以引用的方式整体并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利、专利申请、互联网站点或登录号/数据库序列具体地和单独地被指示为以引用的方式并入。
Claims (70)
1.一种用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，所述方法包括
a.用所述测试组合物和所述参考组合物单独地对靶细胞进行接种；
b.洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；
c.分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及
d.确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。
2.一种用于确定包含病毒颗粒的测试组合物的感染性相对于包含病毒颗粒的参考组合物的感染性的方法，所述方法包括
a.制备所述测试组合物和所述参考组合物的系列稀释液；
b.用所述测试组合物和所述参考组合物的所述系列稀释液单独地对靶细胞进行接种；
c.洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；
d.分别从接种所述测试组合物和所述参考组合物的所述靶细胞中分离出测试核酸样品和参考核酸样品；以及
e.确定所述测试核酸样品和所述参考核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述系列稀释液小于10倍稀释液。
4.如权利要求2所述的方法，其中所述系列稀释液为1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或8倍稀释液。
5.如权利要求2所述的方法，其中所述系列稀释液为2倍稀释液。
6.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述系列稀释液包含至少两种稀释液、至少三种稀释液、至少五种稀释液或至少十种稀释液。
7.如权利要求2至5中任一项所述的方法，其中所述系列稀释液包含两种稀释液至20种稀释液。
8.如权利要求2至7中任一项所述的方法，其还包括使用平行线模型计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性包括
a.计算测试组合物和参考组合物的每种稀释液的VGC:TCGC比率；
b.绘制所述测试组合物和所述参考组合物的log VGC:TCGC比率对log稀释倍数；
c.使用共同斜率将所述测试组合物和所述参考组合物的数据点拟合到测试组合物线和参考组合物线；以及
d.计算所述测试组合物相对于所述参考组合物的感染性为
10.如权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述变异系数(cv)小于约100％、小于约50％或小于约25％。
11.如权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述对靶细胞进行接种包括在病毒颗粒存在下将所述靶细胞孵育
a.约5分钟至约3天，
b.约12小时至约36小时，
c.约18小时至约30小时，
d.约1小时、约2小时、约6小时、约12小时、约18小时、约24小时、约30小时或约36小时，
e.约1天、或约1.5天、或约2天，或
f.约24小时。
12.如权利要求1至11中任一项所述的方法，其中所述核酸组合物中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应来确定。
13.如权利要求12所述的方法，其中所述聚合酶链反应是定量聚合酶链反应。
14.如权利要求12所述的方法，其中所述聚合酶链反应是数字聚合酶链反应。
15.如权利要求1至14中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV、腺病毒、牛痘或慢病毒。
17.如权利要求15所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是逆转录病毒。
18.如权利要求15所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述AAV是重组AAV(rAAV)。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
21.如权利要求20所述的方法，其中所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
22.如权利要求1至21中任一项所述的方法，其中所述靶细胞是BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述靶细胞是Huh-7细胞。
24.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述测试组合物和所述参考组合物具有相同的滴度，其中所述滴度测量为每毫升基因组拷贝(GC)。
25.如权利要求1至23中任一项所述的方法，其中所述测试组合物和所述参考组合物具有不同的滴度，其中所述滴度测量为每毫升基因组拷贝(GC)。
26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其中所述测试组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的rAAV颗粒之间。
27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述参考组合物的滴度在约1x10e+10GC/ml与约1x10e+13GC/ml的rAAV颗粒之间。
28.一种分离的多核苷酸，其具有约15至约40个核苷酸，包含以下核苷酸序列
a.5’–GGA CAT CAT GAA GCC CCT T–3’(SEQ ID NO:1)，
b.5’–TCC AAC ACA CTA TTG CAA TGA AAA–3’(SEQ ID NO:2)，
c.5’–AGC ATC TGA CTT CTG GCT AAT AAA GGA A–3’(SEQ ID NO:3)，
d.5’–TGA AAC ATA CGT TCC CAA AGA GTT T–3’(SEQ ID NO:4)，
e.5’–CTC TCC TTC TCA GAA AGT GTG CAT AT–3’(SEQ ID NO:5)，或
f.5’–TGC TGA AAC ATT CAC CTT CCA TGC A–3’(SEQ ID NO:6)；
所述核苷酸序列包含0、1、2、3、4或5个取代。
29.一种分离的多核苷酸，其具有约15至约40个核苷酸并包含SEQ ID NO:1–6的核苷酸序列。
30.一种分离的多核苷酸，其由SEQ ID NO:1–6的核苷酸序列组成。
31.一种组合物，其包含(i)如权利要求28至30中任一项所述的多核苷酸以及(ii)可检测标记，其中所述标记共价连接到所述多核苷酸。
32.如权利要求31所述的组合物，其中所述可检测标记是荧光标记。
33.如权利要求32所述的组合物，其中所述可检测标记包括FAM、JOE、TAMRA和ROX中的一种或多种。
34.一对正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含SEQ IDNO:1和2的多核苷酸序列。
35.一对正向引物和反向引物，其中所述正向引物和所述反向引物分别包含SEQ IDNO:4和5的多核苷酸序列。
36.一种探针、正向引物和反向引物的组合，其中所述正向引物、所述反向引物和所述探针分别包含由SEQ ID NO:1、2和3的核苷酸序列组成的多核苷酸。
37.一种探针、正向引物和反向引物的组合，其中所述正向引物、所述反向引物和所述探针分别包含由SEQ ID NO:4、5和6的核苷酸序列组成的多核苷酸。
38.一种产生感兴趣的多核苷酸的方法，其包括使用如权利要求34或35所述的一对正向引物和反向引物使来自生物样品的DNA进行聚合酶链反应。
39.一种产生感兴趣的多核苷酸的方法，其包括使用如权利要求36或37所述的探针、正向引物和反向引物的组合使来自生物样品的DNA进行聚合酶链反应。
40.一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含一个或多个选自由SEQ ID NO:1-3组成的组的多核苷酸。
41.一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含如权利要求34所述的一对正向引物和反向引物。
42.一种用于检测样品中rAAV的试剂盒，其包含如权利要求36所述的探针、正向引物和反向引物的组合。
43.一种用于确定rAAV测试样品的感染性相对于参考样品的感染性的试剂盒，其包含如权利要求34所述的一对正向引物和反向引物。
44.如权利要求43所述的试剂盒，其还包含如权利要求35所述的一对正向引物和反向引物。
45.一种用于确定rAAV测试组合物的感染性相对于参考组合物的感染性的试剂盒，其包含如权利要求36所述的探针、正向引物和反向引物的组合。
46.如权利要求45所述的试剂盒，其还包含如权利要求37所述的探针、正向引物和反向引物的组合。
47.如权利要求40至46中任一项所述的试剂盒，其还包含rAAV参考组合物。
48.一种用于确定在不同条件下病毒颗粒组合物的相对感染性的方法，其包括
a.在第一组条件和第二组条件下用包含病毒颗粒的所述组合物对靶细胞进行接种；
b.洗涤所述接种的细胞以去除细胞外病毒颗粒；
c.分别从在所述第一组条件和所述第二组条件下接种的靶细胞中分离出第一核酸样品和第二核酸样品；以及
d.确定所述第一核酸样品和所述第二核酸样品中病毒基因组拷贝(VGC)与靶细胞基因组拷贝(TCGC)的比率。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述第一组条件和所述第二组条件使用相同的靶细胞。
50.如权利要求48所述的方法，其中所述第一组条件和所述第二组条件使用不同的靶细胞。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述不同的靶细胞包含不同的遗传修饰。
52.如权利要求50所述的方法，其中除了所述靶细胞之一中存在遗传修饰之外，所述不同的靶细胞是相同的。
53.如权利要求49至52中任一项所述的方法，其中所述对靶细胞进行接种包括用所述组合物的系列稀释液对靶细胞进行接种。
54.如权利要求53所述的方法，其中所述系列稀释液为2倍稀释液。
55.如权利要求53或权利要求54所述的方法，其中所述对靶细胞进行接种包括用所述组合物的系列稀释液对靶细胞进行接种。
56.如权利要求53至55中任一项所述的方法，其还包括使用平行线模型计算在所述第一组条件和所述第二组条件下所述组合物的相对感染性。
57.如权利要求56所述的方法，其中计算在所述第一组条件和所述第二组条件下所述组合物的相对感染性包括
a.计算所述第一组条件和所述第二组条件的每种稀释液的VGC:TCGC比率；
b.绘制所述第一组条件和所述第二组条件的log VGC:TCGC比率对log稀释倍数；
c.使用共同斜率将所述第一条件和所述第二条件的数据点拟合到第一条件线和第二条件线；以及
d.计算在所述第一条件下相对于所述第二条件的感染性为
58.如权利要求53至57中任一项所述的方法，其中所述变异系数(cv)小于约100％、小于约50％或小于约25％。
59.如权利要求53至58中任一项所述的方法，其中所述核酸组合物中的所述VGC和所述TCGC通过聚合酶链反应来确定。
60.如权利要求59所述的方法，其中所述聚合酶链反应是定量聚合酶链反应。
61.如权利要求59所述的方法，其中所述聚合酶链反应是数字聚合酶链反应。
62.如权利要求48至61中任一项所述的方法，其中所述病毒颗粒是复制缺陷型病毒。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV、腺病毒、牛痘或慢病毒。
64.如权利要求62所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是逆转录病毒。
65.如权利要求62所述的方法，其中所述复制缺陷型病毒是AAV。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述AAV是重组AAV(rAAV)。
67.如权利要求66所述的方法，其中所述rAAV包含AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAV13、AAV14、AAV15和AAV16、AAV.rh8、AAV.rh10、AAV.rh20、AAV.rh39、AAV.Rh74、AAV.RHM4-1、AAV.hu37、AAV.Anc80、AAV.Anc80L65、AAV.7m8、AAV.PHP.B、AAV.PHP.eB、AAV2.5、AAV2tYF、AAV3B、AAV.LK03、AAV.HSC1、AAV.HSC2、AAV.HSC3、AAV.HSC4、AAV.HSC5、AAV.HSC6、AAV.HSC7、AAV.HSC8、AAV.HSC9、AAV.HSC10、AAV.HSC11、AAV.HSC12、AAV.HSC13、AAV.HSC14、AAV.HSC15或AAV.HSC16血清型的衣壳蛋白。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述rAAV包含AAV8或AAV9血清型的衣壳蛋白。
69.如权利要求48至68中任一项所述的方法，其中在至少一组条件下的所述靶细胞包含BHK21、HEK293、BEAS-2BS、HeLaS3、Huh-7、Hepa1-6或A549细胞。
70.如权利要求22或69所述的方法，其中在至少一组条件下的所述靶细胞包含Huh-7细胞。
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