CN112899274B - miR1432在调控水稻白叶枯病抗性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR1432在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。本发明提供了一种RNA，即水稻miR1432‑5p，如序列表的序列1所示。本发明还提供了一种RNA(水稻miR1432)，即水稻miR1432‑5p的前体RNA，如序列表的序列2所示。本发明还保护水稻miR1432‑5p或水稻miR1432的应用：培育抗白叶枯病植物；调控植物白叶枯病抗病性。本发明的发明人发现，在水稻中过量表达miR1432能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性，而下调表达miR1432减弱了水稻对白叶枯病的抗性。本发明可用于水稻种质资源的改良及遗传育种领域，还可用于培育抗白叶枯病的水稻品种，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，涉及miR1432在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。
背景技术
水稻(Oryzae sativa)是世界最重要的粮食作物之一，水稻安全生产关系到人类的生存大计。水稻白叶枯病是由革兰氏阴性黄单胞杆菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)侵染所引起的世界上分布最广、破环性最严重的细菌性病害，可使水稻减产20-30％，严重时可达50％甚至绝收，并且会影响稻米品质和食用性。同时，水稻与Xoo的互作体系也是植物-微生物互作研究的重要模式系统。利用水稻自身抗源进行生物防治被认为是最为经济、安全和有效的防治手段。经典的水稻抗白叶枯病育种主要是利用亲本的主效抗病基因，简单地利用单一抗源培育抗病品种容易导致抗性丧失，抗谱较窄。抗病基因聚合则需较长的时间，也受到可利用基因数目的限制。因此，发掘新的水稻白叶枯病抗性相关基因或者利用新的功能性分子，对于水稻抗病育种具有重要的应用价值。
miRNA是一类进化上保守的、长度介于21-24nt的非编码单链小分子RNA，在植物中的生物学功能主要是在转录后水平负调控靶基因的表达，可参与植物整个生命进程。
发明内容
本发明的目的是提供miR1432在调控水稻白叶枯病抗性中的应用。
本发明提供了一种RNA，即水稻miR1432-5p，如序列表的序列1所示。
本发明还提供了一种RNA(水稻miR1432)，即水稻miR1432-5p的前体RNA，如序列表的序列2所示。
本发明还提供了一种DNA分子，如序列表的序列3所示。
本发明还提供了一种RNA(MiM1432)，如序列表的序列4所示。
本发明还提供了一种DNA分子，如序列表的序列5所示。
本发明还保护水稻miR1432-5p或水稻miR1432的应用，为如下(a)或(b)：
(a)培育抗白叶枯病植物；
(b)调控植物白叶枯病抗病性。
所述调控为正调控。所述正调控的含义为：RNA水平增高，白叶枯病抗病性提高。
所述植物为禾本科植物。所述植物为稻属植物。所述植物为水稻。所述植物为粳稻，例如水稻台北309。
本发明还保护序列表的序列3所示DNA分子在培育抗白叶枯病植物中的应用。所述植物为禾本科植物。所述植物为稻属植物。所述植物为水稻。所述植物为粳稻，例如水稻台北309。
本发明还保护一种制备转基因植物的方法，包括如下步骤：在植物中过表达水稻miR1432-5p或水稻miR1432，得到白叶枯病抗性增强的转基因植物。所述植物为禾本科植物。所述植物为稻属植物。所述植物为水稻。所述植物为粳稻，例如水稻台北309。
本发明还保护一种培育抗白叶枯病植物的方法，包括如下步骤：在受体植物中导入序列表的序列3所示DNA分子，得到白叶枯病抗性增强的转基因植物。所述DNA分子可通过植物表达载体导入受体植物并表达。所述植物表达载体可为载体pCAMBIA1300-Ubi。具体来说，在受体植物中导入DNA分子是通过在受体植物中导入重组质粒实现的。所述重组质粒可为：在载体pCAMBIA1300-Ubi的多克隆位点(例如HindIII和Kpn I酶切位点之间)插入序列表的序列3所示的DNA分子得到的重组质粒。所述受体植物为禾本科植物。所述受体植物为稻属植物。所述受体植物为水稻。所述受体植物为粳稻，例如水稻台北309。
本发明还保护MiM1432或序列表的序列5所示DNA分子或含有序列表的序列5所示DNA分子的重组表达载体在培育感白叶枯病植物中的应用。含有序列表的序列5所示DNA分子的重组表达载体可为在植物表达载体的多克隆位点插入序列表的序列5所示DNA分子得到的重组质粒。所述植物表达载体可为载体pCAMBIA1300-Ubi。含有序列表的序列5所示DNA分子的重组表达载体可为：在载体pCAMBIA1300-Ubi的多克隆位点(例如SpeI和Kpn I酶切位点之间)插入序列表的序列5所示的DNA分子得到的重组质粒。所述植物为禾本科植物。所述植物为稻属植物。所述植物为水稻。所述植物为粳稻，例如水稻台北309。
以上任一所述水稻白叶枯病具体可为黄单胞杆菌引起的。
以上任一所述水稻白叶枯病具体可为黄单胞杆菌水稻致病变种引起的。
以上任一所述水稻白叶枯病具体可为菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86引起的。
本发明的发明人发现，在水稻中过量表达miR1432能够显著提高水稻对白叶枯病的抗性，而下调表达miR1432减弱了水稻对白叶枯病的抗性。本发明提供的与水稻白叶枯病抗性相关的miR1432可用于水稻种质资源的改良及遗传育种领域，还可用于培育抗白叶枯病的水稻品种，具有良好的市场应用前景。miRNA的发现补充了研究人员对水稻基因调控机制的理解，展现了细胞内基因表达多层次、多方位的调控系统。深入了解miRNA对水稻白叶枯病的调控作用，为提高水稻产量和培育新的种质资源提供线索和思路。
附图说明
图1为重组质粒构建示意图。
图2为miR1432基因的相对表达水平结果。
图3为表型鉴定的结果；比例尺，1.5cm；**表示与WT表达量相比t检验差异显著水平P值达0.01。
图4为水稻白叶枯病菌数量统计的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
水稻台北309(用TP309或WT表示)，又称Taipei 309或野生型水稻，属于粳稻。记载于如下文献：Song WY,Wang GL,Chen LL,Kim HS,Pi LY,Holsten T,Gardner J,Wang B,Zhai WX,Zhu LH,Fauquet C,Ronald P.(1995).A receptor kinase-like proteinencoded by the rice disease resistance gene,Xa21.Science270,1804-1806.。
载体pCAMBIA1300-Ubi，在文献中的记载为“pCAMBIA1300 driven by maizeubiquitin promoter”。记载于如下文献：Chen SH,Zhou LJ,Xu P,Xue HW.SPOC domain-containing protein Leaf inclination3 interacts with LIP1 to regulate riceleaf inclination through auxin signaling.PLoS Genet.2018,14(11):e1007829.doi:10.1371/journal.pgen.。
实施例中所用的水稻白叶枯病菌为菲律宾白叶枯病菌生理小种PXO86。
实施例中的反转录均采用OMEGA公司货号为R6842-01的反转录试剂盒。
水稻miR1432-5p如序列表的序列1所示。水稻miR1432-5p的前体RNA(miR1432)如序列表的序列2所示。
实施例、转基因水稻的获得和鉴定
一、重组质粒的构建
重组质粒构建示意图见图1。
1、过表达载体的构建
(1)以水稻TP309的基因组DNA为模板，采用miR1432-FP和miR1432-RP组成的引物对进行PCR扩增，回收扩增产物。
miR1432-FP：5'-CGAAGCTTGTGGTTGACTCCGCAACCTA-3'；
miR1432-RP：5'-CCGGTACCGAGATGAGGGAGGATGTGCG-3'。
(2)取步骤(1)得到的扩增产物，用限制性内切酶HindIII和Kpn I进行双酶切，回收酶切产物。
(3)取载体pCAMBIA1300-Ubi，用限制性内切酶HindIII和Kpn I进行双酶切，回收10kb左右的载体骨架。
(4)将步骤(2)得到的酶切产物和步骤(3)得到的载体骨架连接，得到重组质粒pUbi::miR1432。根据测序结果，对重组质粒pUbi::miR1432进行结构描述如下：在载体pCAMBIA1300-Ubi的HindIII和Kpn I酶切位点之前插入了序列表的序列3所示的DNA分子。
2、下调表达载体的构建
MiM1432如序列表的序列4所示，与miR1432-5p存在三个3个不配对核苷酸，能够特异性结合miR1432-5p从而实现miR1432-5p低表达，并抑制miR1432-5p对靶基因的降解作用。
将序列表的序列5所示的DNA分子插入载体pCAMBIA1300-Ubi的SpeI和Kpn I酶切位点之间，得到重组质粒pUbi::MIM1432。重组质粒pUbi::MIM1432已进行测序验证。
二、转基因植物的获得
1、miR1432过表达植株的获得
(1)将重组质粒pUbi::miR1432导入到根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。
(2)用步骤(1)得到的重组农杆菌制备侵染液，然后用侵染液浸泡水稻台北309的胚性愈伤组织，然后依次进行共培养、筛选培养(进行两次筛选，第一次筛选采用50mg/L潮霉素B和50mg/L羧苄青霉素，第二次筛选采用400mg/L潮霉素B和400mg/L羧苄青霉素)、分化培养和生根培养，得到T0代再生植株。
(3)取T0代再生植株的叶片，提取基因组DNA，采用hpt-F和hpt-R组成的引物对进行PCR鉴定，获得约845bp扩增产物的植株为阳性植株，阳性植株即转基因植株。
hpt-F：5'-TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'；
hpt-R：5'-TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'。
(4)将T0代转基因植株自交，收获种子并培育为植株，即为T1代植株。将T1代植株自交，收获种子，即为T2代种子，T2代种子长成的植株即为T2代植株。将T1代植株进行PCR鉴定，方法同步骤(3)。对于某一T0代植株，如果其自交得到的T1代植株均PCR鉴定为阳性，该T0代植株的自交后代，为一个纯合的转基因株系。得到两个纯合的转基因株系，miR1432OE-2株系和miR1432 OE-8株系。
2、miR1432抑制表达植株的获得
用重组质粒pUbi::MIM1432代替重组质粒pUbi::miR1432，其他同步骤1。
得到两个转基因株系，MIM1432-5株系和MIM1432-9株系。
3、miR1432表达水平的鉴定
供试植株分别为：水稻台北309植株、miR1432 OE-2株系的T2代植株、miR1432OE-8株系的T2代植株、MIM1432-5株系的T2代植株、MIM1432-9株系的T2代植株。
取供试植株的叶片，提取总miRNA。将总miRNA进行反转录，得到cDNA。以cDNA为模板，通过stem-loop real-time qPCR检测miR1432基因的相对表达水平(U6基因作为内参基因)。
用于鉴定U6基因的引物对如下：
U6-qRT-F：5'-GGGGACATCCGATAAAATTGG-3'；
U6-qRT-R：5'-ACCATTTCTCGATTTGTGCGT-3'。
用于鉴定miR1432基因的引物对如下：
miR1432-qRT-F：5'-TCGCTATCAGGAGAGATGAC-3'；
miR1432-qRT-R：5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。
miR1432基因的相对表达水平结果见图2。与野生型水稻相比，miR1432 OE-2株系和miR1432 OE-8株系中miR1432基因的表达水平显著升高，MIM1432-5株系和MIM1432-9株系中miR1432基因的表达水平显著降低。
三、转基因植株的表型鉴定。
供试种子分别为：水稻台北309植株、miR1432 OE-2株系的T2代种子、miR1432OE-8株系的T2代种子、MIM1432-5株系的T2代种子、MIM1432-9株系的T2代种子。
供试种子种植于大田，正常栽培管理至分蘖期，然后采用人工剪叶法接种水稻白叶枯病菌。
接种14天后测量接菌叶片的病斑长度并记录表型。叶片照片见图3A。病斑长度结果见图3B(每个株系统计15株植株)。与野生型水稻相比，在miR1432过表达的转基因水稻中，病斑明显缩短。与野生型水稻相比，在miR1432抑制表达的转基因水稻中，病斑明显增长。
分别于接种第0天、第4天、第8天、第12天和第16天，对野生型水稻植株、MIM1432-5株系植株和MIM1432-9株系植株的接菌叶片进行水稻白叶枯病菌数量统计(每个株系统计15株植株)。结果见图4。接种8天以后，miR1432抑制表达的转基因水稻中的水稻白叶枯病菌数量显著高于野生型水稻。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所
<120> miR1432在调控水稻白叶枯病抗性中的应用
<130> GNCYX192478
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> Oryzae sativa
<400> 1
aucaggagag augacaccga c 21
<210> 2
<211> 109
<212> RNA
<213> Oryzae sativa
<400> 2
ccugugauca ggagagauga caccgacauc gccggaauuc guucuugguc uugugccaug 60
augaauugau gguccguuug augcaggugu caucuccccu gaacauagg 109
<210> 3
<211> 375
<212> DNA
<213> Oryzae sativa
<400> 3
gtggttgact ccgcaaccta tgtccttctc acacgtctat gtcagagctt ggataatcaa 60
ctcttatcac ctgcagataa tcatggaaag agaaaccaat cgaggagaca agctgacatt 120
tgcatactag catcaggcat taccttgtaa aagcaaatca agaacagaac agaacagaag 180
aaaccgaaga atcatcgagg tacacatcca ttcagggtca gtcagtccta tgttcagggg 240
agatgacacc tgcatcaaac ggaccatcaa ttcatcatgg cacaagacca agaacgaatt 300
ccggcgatgt cggtgtcatc tctcctgatc acagggccca aaccccccac aagaacgcac 360
atcctccctc atctc 375
<210> 4
<211> 24
<212> RNA
<213> Oryzae sativa
<400> 4
gucgguguca ucuacucucc ugau 24
<210> 5
<211> 557
<212> DNA
<213> Oryzae sativa
<400> 5
accctctctt aacttggcaa acaccacaaa aacaaaagaa aaatggccat cccctagcta 60
ggtgaagaag aatgaaaacc tctaatttat ctagaggtta ttcatctttt aggggatggc 120
ctaaatacaa aatgaaaact ctctagttaa gtggttttgt gttcatgtaa ggaaagcgtt 180
ttaagatatg gagcaatgaa gactgcagaa ggctgattca gactgcgagt tttgtttatc 240
tccctctaga aagtcggtgt catctactct cctgatagct tcggttcccc tcggaatcag 300
cagattatgt atctttaatt ttgtaatact ctctctcttc tctatgcttt gtttttcttc 360
attatgtttg ggttgtaccc actcccgcgc gttgtgtgtt ctttgtgtga ggaataaaaa 420
aatattcgga tttgagaact aaaactagag tagttttatt gatattcttg tttttcattt 480
agtatctaat aagtttggag aatagtcaga ccagtgcatg taaatttgct tccgattctc 540
tttatagtga attcctc 557
Claims (5)
1.序列表的序列1所示RNA分子或序列表的序列2所示RNA分子的应用，为如下（a）或（b）：
（a）培育抗白叶枯病水稻；
（b）调控水稻白叶枯病抗病性。
2.序列表的序列3所示DNA分子在培育抗白叶枯病水稻中的应用。
3.一种制备转基因水稻的方法，包括如下步骤：在水稻中过表达序列表的序列1所示RNA分子或序列表的序列2所示RNA分子，得到白叶枯病抗性增强的转基因水稻。
4.一种培育抗白叶枯病水稻的方法，包括如下步骤：在受体水稻中导入序列表的序列3所示DNA分子，得到白叶枯病抗性增强的转基因水稻。
5.序列表的序列4所示RNA分子或序列表的序列5所示DNA分子或含有序列表的序列5所示DNA分子的重组表达载体在培育感白叶枯病水稻中的应用。
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