CN112868671B - 杀柑橘害螨的死亡谷芽胞杆菌悬浮剂制备方法及应用 - Google Patents
杀柑橘害螨的死亡谷芽胞杆菌悬浮剂制备方法及应用 Download PDFInfo
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本发明属于农药技术领域，具体涉及杀柑橘害螨的死亡谷芽胞杆菌悬浮剂制备方法及应用。该悬浮剂是将死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis）NBIF‑001的发酵液与木质素磺酸钠、黄原胶、山梨酸钾、乙二醇混合制得。本发明制备的悬浮剂对柑橘红蜘蛛和锈壁虱具有很好的杀螨效果，是一种高效的生物农药，具有很好的应用和推广前景。
Description
技术领域
本发明属于农药技术领域，具体涉及杀柑橘害螨的死亡谷芽胞杆菌悬浮剂制备方法及应用。
背景技术
柑橘的各类害螨属蛛形纲，主要包括叶螨，瘿螨和跗线螨三科。中国常见的叶螨有柑橘全爪螨(Panonychus citri)，柑橘始叶螨(Eotetranychus kankitus)和柑橘裂爪螨(Schizotetranychus baltazarae)等。瘿螨有柑橘锈壁虱(Eriophyes oleivorus)。跗线螨有侧多食跗线螨(Polyhagotarsonemus latus)。以上害螨均以刺吸式口器吸食。危害寄主广泛，如柑橘、枇杷、葡萄、樱桃、桃、梨、草莓等，尤其对柑橘类危害严重。叶螨主要为害寄主的叶片、嫩枝、幼果、花蕾等部位，尤以嫩叶和嫩梢受害严重。受害部位先褪绿色，后呈现灰白色斑点，叶片失去光泽，受害果实呈灰白色，严重时造成大量落叶、落花、落果，嫩稍枯死，极大地影响了柑橘产量和品质。瘿螨为害后，幼叶被害部在叶背先出现黄绿的斑块，害斑凹陷，其被害部位畸变形成毛瘿，毛瘿内的寄主组织因受刺激而产生灰白色绒毛，以后绒毛逐渐变成黄褐色、红褐色至深褐色，形似毛毡状。跗线螨主要危害柑桔的嫩芽、幼果，以幼若成螨群集于芽、叶背面和幼果表面危害，吸食汁液，破坏表皮组织，使受害嫩叶反卷，叶柄变硬变小，嫩芽失去抽梢和再发芽能力，变成秃顶和生长受阻。幼果被害后，因其表皮和油泡被破坏，使果皮失去固有光泽，形成褐斑，严重时全果被害，变成小果，失去商品价值。
柑橘螨害的防治方法主要分为农业防治、生物防治和化学防治。农业防治包括冬季清园，清理病叶并集中烧毁，降低害螨越冬数量；加强肥水管理，改善果园小气候等。生物防治包括利用天敌、生物杀螨剂等绿色安全的手段加以防控。化学防治主要采用化学杀螨剂等药剂来进行防治。近年来由于杀螨剂品种缺乏替代，造成杀螨剂的大量反复使用，加快了害螨抗性的产生，导致螨害越来越重，给种植户造成了极大的经济损失。
死亡谷芽胞杆菌(Bacillus vallismortis)是一种好氧、产胞的革兰氏阳性细菌。1996年首次由美国生物学家Michael S.Roberts从美国死亡谷国家公园的土壤中分离获得，并命名为死亡谷芽胞杆菌。该种芽胞杆菌与枯草芽胞杆菌很相似，但是其脂肪酸的组成和DNA序列均与枯草芽胞杆菌有区别。目前国际上对死亡谷芽胞杆菌研究报道的文献很少，主要集中在亲缘性分析、抑菌活性、降解活性、生物吸附活性及产酶情况等方面的研究，对环境抗逆性强，且具有优良的生物活性，可以广泛的应用到农业、医药及环境治理等领域。
死亡谷芽胞杆菌NBIF-001也为申请人公开过的具有专利权的菌株，所述的菌株可用于防治西瓜枯萎病、黄瓜灰霉病、水稻纹枯病以及抑螨；同时该菌株还可以抑制真菌，包括番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、禾谷镰刀菌、小麦赤霉病菌或水稻纹枯病菌。
本发明主要针对于NBIF-001菌株进行了不同剂型的创制与应用，一个新产品的上市，剂型的差异对于产品性能好坏具有决定性的作用。同一个菌株，不同剂型产品的杀虫效果也不同，如“灭蚊幼芽孢杆菌剂型的研究与应用”(陈国英等，2006)，实验结果显示漂浮颗粒剂Bti效价为550IU/mg，漂浮块剂Bti效价为230IU/mg，发泡剂Bti效价为513IU/mg，证明了剂型的不同对药效的影响。
剂型的具体配方对于菌株的生防效果也具有重要影响，例如不同的稳定剂、分散剂或是防冻剂，对于不同株的生防菌的生防效果是有显著影响的，也就是说，辅料的配方对主效成分会有影响。如中国发明专利“杀棉叶螨苏云金芽孢杆菌悬浮剂、制备方法及应用”及“杀蛴螬类害虫苏云金芽孢杆菌微胶囊悬浮剂及制备方法”中均涉及不同配方的微生物悬浮剂产品，对药效的影响是显著的。
同一种药剂对于不同的害螨其防效也不同，如240g/L螺螨酯乳油用药后28天对柑橘锈壁虱的防效为99.79％，而对柑橘红蜘蛛的防效为79.42％(刘少武等，2018)；15％哒螨灵乳油用药后7天柑橘红蜘蛛的死亡率为19.68％，柑橘锈壁虱的死亡率为56.79％。因此如何将一种产品做成最有效的剂型配比产品是至关重要的。
目前国际上还未见针对死亡谷芽胞杆菌开发的相关剂型产品，因此基于以上背景，有必要开发死亡谷芽胞杆菌芽胞杆菌悬浮剂，用于柑橘螨害防治领域，具有重要的生产实践意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于，提供杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂制备方法及应用，用于防治柑橘红蜘蛛和锈壁虱，以达到更加有效地防治害螨，同时对人体及环境生物更加友好的生态效益。
为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案予以实现：
杀柑橘害螨的死亡谷芽胞杆菌悬浮剂，所述悬浮剂的组分按重量份配比为：死亡谷芽胞杆菌发酵原液70～90，木质素磺酸钠5～10，黄原胶0.5～1.5，山梨酸钾2～4，乙二醇2～5；
配制完毕后，所述悬浮剂中死亡谷芽胞杆菌的有效菌浓度为80～150×108CFU/mL；
所述的死亡谷芽胞杆菌为死亡谷芽胞杆菌(Bacillus vallismortis)NBIF-001，保藏编号为CCTCC NO：M2015087。
所述的死亡谷芽孢杆菌的发酵原液按照目前的常规死亡谷芽孢杆菌进行发酵制备即可。
如上所述的杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂制备方法，将组分加入死亡谷芽胞杆菌发酵原液中，搅拌均匀即可。
如上所述的杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂用于防治柑橘害螨中的应用，特别是红蜘蛛、锈壁虱、朱砂叶螨或二斑叶螨。
本发明与现有技术相比，具有如下技术效果：
本发明的悬浮剂是死亡谷芽胞杆菌剂型上的首创，相对于常规的药剂，对靶标害螨防治效果更为彻底，且对使用者和环境生物更为安全。本发明可达到更加有效地防治害螨，同时对人体及环境生物更加友好的生态效益。田间防效试验结果表明，本发明对柑橘红蜘蛛和锈壁虱表现出优异的杀螨活性，可作为田间防治的有效药剂加以推广使用。
本发明提供了专门适配于死亡谷芽胞杆菌(Bacillus vallismortis)NBIF-001及其用于柑橘红蜘蛛和锈壁虱生防的悬浮剂配方。
附图说明
图1是柑橘锈壁虱防治效果图；
其中，A.未用药前柑橘；B.用药后7天柑橘；C.用药后14天柑橘。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如无特别说明，均为本领域的常规操作方法，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
本发明实施例所述的死亡谷芽胞杆菌为死亡谷芽胞杆菌(Bacillusvallismortis)NBIF-001，保藏编号为CCTCC NO：M2015087，已在申请号为2015104854956的专利文件中公开。
本发明所用的死亡谷芽胞杆菌发酵原液的制备方法为：
发酵培养基采用下列重量百分比的各组分配置而成，玉米淀粉2％、豆粕4％，酵母粉1.5％，鱼粉1.5％，pH7.0，其余为水。
在200L发酵罐中进行发酵，(装罐体积120L)每分钟通气量与发酵罐容积比为1.5：1，培养温度32℃，接种量3％，转速150r/min，发酵时间38h。
发酵完毕后，发酵原液中的有效菌浓度是150×108CFU/mL，用于以下实施例。
实施例1：
杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂A的制备(本发明实施例中或简称为001悬浮剂A)：
死亡谷芽胞杆菌发酵原液84g，木质素磺酸钠10g，梭甲基纤维素钠为1.5g，山梨酸钾2.5g，乙二醇为2g。
将上述各原料按照配方比例进行预混合，充分混合搅拌即可。
实施例2：
杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂B的制备：
001悬浮剂B1：
死亡谷芽胞杆菌发酵原液84g，木质素磺酸钠10g，黄原胶1.5g，山梨酸钾2.5g，乙二醇2g；
001悬浮剂B2：
死亡谷芽胞杆菌发酵原液70g，木质素磺酸钠5g，黄原胶0.5g，山梨酸钾2g，乙二醇2g；
001悬浮剂B3：死亡谷芽胞杆菌发酵原液90g，木质素磺酸钠10g，黄原胶1.5g，山梨酸钾4g，乙二醇5g；
将上述各原料按照配方比例进行预混合，充分混合搅拌即可。
实施例3：
杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂C的制备(本发明实施例中或简称为001悬浮剂C)：
死亡谷芽胞杆菌发酵原液84g，木质素磺酸钠10g，黄原胶1.5g，苯甲酸钠2.5g，乙二醇2g。
将上述各原料按照配方比例进行预混合，充分混合搅拌即可。
实施例4：
杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂对朱砂叶螨和二斑叶螨的室内活性测定：
试验药剂为3％阿维菌素乳油(河北八源生物制品有限公司)、15％哒螨灵乳油(山东恒利达生物科技有限公司)、40％炔螨特乳油(青岛翰生生物科技股份有限公司)、200g/L氯虫苯甲酰胺悬浮剂(美国富美实公司)及死亡谷芽胞杆菌可湿性粉剂A、B、C。病原为朱砂叶螨和二斑叶螨。
操作步骤：参照FAO(联合国粮农组织)推荐的测定害螨的标准方法-玻片浸渍法。将双面胶带剪成2-3cm长，贴在显微镜载玻片的一端，用镊子揭去胶带上的纸片，用零号毛笔挑选大小一致、体色鲜艳、行动活泼的雌成螨，将其背部粘在双面胶带上(注意：不要粘住螨足、螨须和口器)，每片粘4行，每行粘10头。在温度25℃，相对湿度85％左右的生化培养箱中放置4h后，用双目镜观察，剔除死亡或不活泼个体。药剂在预试的基础上用水稀释5-7个浓度，将带螨玻片的一端浸入药液中，轻轻摇动5s后取出，迅速用吸水纸吸干螨体及其周围多余的药液。置于上述生化培养箱中，24h后用双目镜检查结果。用毛笔轻触螨体，以螨足不动者为死亡。每一浓度重复3次，另以浸渍清水作为对照。
按照上述实验步骤，各药剂对朱砂叶螨的生测结果见下表1所示。LC50值的计算利用SPASS 19.0数据处理软件计算获得。
其中，表1和表2的结果为发酵原液获得后，马上配制成各药剂，进行杀螨测定的结果。表3为制备的药剂贮存6个月后的杀螨活性的变化。
表1各药剂对朱砂叶螨的杀螨活性
表2各药剂对二斑叶螨的杀螨活性
表3各药剂室温贮存6个月后对二斑叶螨的杀螨活性
实施例5：
杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂对柑橘红蜘蛛的田间活性测定：
试验于2020年6月在江西省赣州大余县柑橘园进行，该地区土壤类型属于粘土，土壤肥力中等，pH值为6.1。树龄2年，株距1.5m，行距2.5m，树高1.0～1.3m，冠径0.5～0.8m。平均气温为10～21℃，大气湿度为25％。各处理栽培期、生长期、密度一致，中耕除草、水肥等均按常规管理，试验期间不使用其他任何药剂。试验于6月23日施药，试验时田间试虫处于高龄成螨期，试验用手持放大镜调查叶片，试验区红蜘蛛发生情况基本一致。
供试药剂：20％阿维.螺螨酯悬浮剂(河北兴柏农业科技有限公司，3000倍稀释)；生物杀螨剂NBIF-001悬浮剂A、B1，其中A和B1的有效菌浓度均为100亿CFU/mL，使用时用水进行100倍稀释。
试验共4个处理，其剂量如表1所示，每个处理重复3次，随机区组排列，每小区施药3株，周围设保护行。于6月23日(晴天)傍晚喷药，用可控压手动喷雾器将树冠喷雾，叶片正反面均匀喷施，使其充分接触药液，药液不下滴为宜。在每个小区取三株柑橘树，在树的东、西、南、北、中5个方位标记侧枝，共调查25片叶正反两面的红蜘蛛数量，用手持放大镜直接观察并记录所有活螨数。于用药前调查基数，用药后1、4d共2次进行调查。
药效计算方法：依据药前红蜘蛛基数和药后各天的存活红蜘蛛数量，计算防效，计算公式如下所示。数据使用DPS软件Duncan’s新复极差进行显著性分析。
几种杀螨剂防治柑橘红蜘蛛的田间防效结果见表3。
表4几种杀螨剂防治柑橘红蜘蛛的药效结果
实施例6：
杀柑橘害螨死亡谷芽胞杆菌悬浮剂对柑橘锈壁虱的田间活性测定：
试验于2019年10月在湖北省武汉市金水区柑橘园进行，该地区土壤类型属于黄棕壤，土壤肥力中等。树龄5年，株距1.0m，行距2.0m，树高2.0～3.0m，冠径1.0～2.0m。平均气温为15～21℃，大气湿度为45％。各处理栽培期、生长期、密度一致，中耕除草、水肥等均按常规管理，试验期间不使用其他任何药剂。试验于10月10日施药，试验时田间试虫处于高龄成螨期，试验用手持放大镜调查叶片，试验区锈壁虱发生情况基本一致。
供试药剂：15％哒螨灵乳油(山东恒利达生物科技有限公司，2500倍稀释)；生物杀螨剂NBIF-001 100亿CFU/mL悬浮剂B1(使用时用水进行75倍稀释)。
试验共3个处理，每个处理重复3次，随机区组排列，每小区施药10株，周围设保护行。于10月10日(晴天)傍晚喷药，用可控压手动喷雾器将树冠喷雾，叶片正反面均匀喷施，使其充分接触药液，药液不下滴为宜。于用药前和用药后12d分别调查每棵树的健康果数和病果数。
药效计算方法：依据药前和药后的病果率进行相对防效的计算。计算公式如下所示。数据使用DPS软件Duncan’s新复极差进行显著性分析。
几种杀螨剂防治柑橘锈壁虱的田间防效结果见表4。
表4几种杀螨剂防治柑橘锈壁虱的药效结果
实施例7：
柑橘果实状态观察
对药后柑橘果实病害变化情况进行观察(图1所示)，结果显示：使用001悬浮剂后，果实变褐的速度大大减缓，数量也随之减少，且对叶片起到了一定的增绿效果。
Claims (3)
1.杀柑橘害螨的死亡谷芽胞杆菌悬浮剂，所述悬浮剂的组分按重量份配比为：死亡谷芽胞杆菌发酵原液70~90，木质素磺酸钠5~10，黄原胶0.5~1.5，山梨酸钾2~4，乙二醇2~5；
所述悬浮剂中死亡谷芽胞杆菌的有效菌浓度为80~150×108 CFU/mL；
所述的死亡谷芽胞杆菌为死亡谷芽胞杆菌（Bacillus vallismortis）NBIF-001，保藏编号为CCTCC NO：M2015087。
2.权利要求1所述的悬浮剂在制备柑橘害螨杀虫剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，所述的柑橘害螨为红蜘蛛、锈壁虱、朱砂叶螨或二斑叶螨。
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