CN112843338A - 一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，步骤如下：首先制备高浓度的胶原蛋白溶液并稀释获得溶液1；其次制备含有高浓度的间充质干细胞的溶液2并将其离心移除离心液；接着将溶液1和干细胞培养基溶液分别加入间充质干细胞中重悬获得细胞悬浮液；之后转移其至无菌培养瓶中滚动培养获得混合有胶原蛋白和间充质干细胞的溶液3，再接着将溶液3转移出并离心移除其中的悬浮液，然后再对其进行细胞重悬，再次离心移除悬浮液，重复多次；最后往其中注入溶液1进行细胞重悬形成注射剂。该发明能够快速制作含有高浓度胶原的间充质干细胞注射剂，操作简单，无需超净台，减少人为污染，能够临床应用于组织修复与再生。

Description

一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法

技术领域

本发明涉及干细胞治疗技术领域，尤其是一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法。

背景技术

胶原蛋白是一种天然高分子生物材料，因具有高生物相容性、低致敏性、可以生物降解等特性而被广泛应用于组织工程、药物释放、伤口敷料等领域。现有的胶原产品一般用于美容产品、化妆品、保健品以及食品添加等低技术含量领域，少量用于医学领域，如添加入药膏等，鲜有用于高端植入医用。这主要是在于难以稳定的批量化生产出微观结构完整、高浓度、高纯度、具有良好生物活性、低免疫原性的胶原，远达不到医用植入的标准。

组织工程中种子细胞(如干细胞)、可降解支架材料和细胞生长调节因子并称为组织工程三大基本要素，其中支架材料在组织工程研究中起中心作用，它不仅为特定的细胞提供结构支撑作用，而且还起到模板作用，引导组织再生和控制组织结构。通常，间充质干细胞在体外扩增后会被冻存，并在临床操作的当天进行复苏及配制成注射液，利用冻存复苏的方法取得的间充质干细胞须严格把控细胞的复苏效率，以便降低死细胞可能引起的炎症，并且在复苏后需要再次检测细胞活性。

现有的医用植入胶原产品也是多以固态和半固态存在，如胶原基质、胶原膜、胶原植入物等，其重要问题在于临床使用需配合开放手术，尚未有能够用于组织修复再生的注射类植入胶原产品。

发明内容

针对现有的不足，本发明提供一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，步骤如下：

S1，制备高浓度的胶原蛋白溶液并利用无菌注射用水对其稀释获得溶液1；

S2，制备含有高浓度的间充质干细胞的溶液2；

S3，将溶液2离心并移除离心液获得高浓度的间充质干细胞；

S4，将溶液1和干细胞培养基溶液分别加入S3中获得的间充质干细胞中进行重悬混合均匀获得细胞悬浮液；

S5，转移细胞悬浮液至无菌培养瓶中并进行滚动培养，获得混合有胶原蛋白和间充质干细胞的溶液3，所述无菌培养瓶包括圆桶状的透明的瓶体、密封盖设在瓶体瓶口上的瓶盖，所述瓶体的内壁上涂覆有降低细胞黏着力的涂层，所述瓶盖的顶部相间隔设置有第一通孔和第二通孔，所述瓶盖内设置有抵接在第一通孔和第二通孔底端的能允许气体通过的无菌过滤片，所述无菌过滤片在对应于第二通孔的位置处设有第三通孔；一橡胶塞依次插入第二通孔和第三通孔与瓶盖和无菌过滤片密封连接；

S6，从无菌培养瓶中转移出溶液3并将转移出的溶液3进行离心，离心后移除其中的悬浮液，然后再往移除悬浮液后的溶液3中加入无菌生理盐水进行细胞重悬，再次离心，再次移除悬浮液，重复该步骤多次；

S7，往经过多次离心并移除悬浮液的溶液3中注入溶液1进行细胞重悬形成可以用于直接注射的注射剂。

作为优选，所述溶液1的制备步骤如下：S1a，粉碎切割取自于动物源的胶原蛋白材料；S1b，将粉碎后的胶原蛋白材料通过酸法和酶法相结合的方式来提取胶原蛋白并进行浓缩提纯获得高浓度高纯度的胶原蛋白溶液；S1c，通过无菌注射水对胶原蛋白溶液进行稀释获得溶液1。

作为优选，所述高浓度的胶原蛋白溶液：其重量浓度6％±10％、pH值7.0±1，炽灼残渣重量1.0％以内，重金属含量不大于10μg/g，内毒素低于0.5EU/mL；所述溶液1的浓度1-10mg/ml，所述溶液1和干细胞培养基溶液以体积比为1:3的比例分别加入S3中获得的间充质干细胞中进行重悬获得细胞悬浮液。

作为优选，所述溶液2利用中空纤维生物反应器并使用活血界定培养基或无血清培养基进行培养扩增而获得，所述溶液2中的间充质干细胞表面标记CD44表达不低于98％，且无CD34表达或CD34表达不高于0.5％。

作为优选，所述离心是将装有对应溶液的容器倒置放入离心机中离心的倒置离心，所述离心液通过倒置容器并利用注射器来吸取移除，所述容器和注射器之间依次设置有无菌过滤器和三通阀。

作为优选，所述步骤S3的离心条件是30℃、300-400g条件下离心5-10分钟。

作为优选，所述无菌培养瓶中的培养是在温度37℃、含5％二氧化碳的培养箱内滚动培养2到3个小时。

作为优选，所述第二通孔设置在瓶盖的中心，所述第一通孔设置有两个并以第二通孔为中心对称设置，所述瓶盖内还设置有抵压在无菌过滤片底部的支撑架，所述支撑架对应于第一通孔的部位镂空，所述橡胶塞的厚度小于瓶盖顶部到无菌过滤片底部的距离。

作为优选，所述溶液3通过注射器来从无菌培养瓶中转移出，所述注射器上安装有穿刺橡胶塞的针头，所述针头的尺寸在16-22ga。

作为优选，所述无菌过滤器的孔隙直径为10-20微米。

本发明的有益效果在于：该发明为即时进行间充质干细胞注射液的制备，避免了细胞冻存复苏的处理步骤，该方法制备的间充质干细胞注射液中，胶原蛋白作为一个生物支架，提高了细胞的作用效率，且其中获取、离心、清洁及重悬的操作简单，在收获间充质干细胞的同时直接进行转移，通过无菌培养瓶进行滚动培养，省去了收获细胞后对超净台的需求，减少了人为污染，能够快速制作含有高浓度胶原的间充质干细胞注射剂，能够临床应用于组织修复与再生，尤其适用于软骨修复再生、肌腱修复、韧带重建等。所使用的无菌培养瓶在瓶体内壁上的涂层降低了瓶体内壁的附着性，能够有效的降低细胞的附着，更有利于悬浮型细胞的培养，减少了细胞的贴壁问题，同时瓶盖密封连接在瓶体上，瓶盖上的橡胶塞能使得针头进行多次的穿刺以进行溶液的移取，仍能保持培养瓶的密封状态，不会造成污染，而无菌过滤片能有效的过滤细菌，保持培养瓶内外的空气流通，促进细胞的培养，更有利于快速有效的培养制备注射用的干细胞溶液。

附图说明

图1是本发明的流程示意图；

图2是本发明实施例无菌培养瓶的结构示意图；

图3是本发明实施例瓶盖的结构示意图；

图4是本发明实施例瓶盖剖面结构示意图；

图中零部件名称及序号：1-注射器一，2-注射器二,3-注射器三,4-注射器四,5-注射器五，50-瓶体，51-瓶盖，510-第一通孔，511-第二通孔，52-涂层，53-无菌过滤片，530-第三通孔，531-支撑架，54-橡胶塞，6-注射器六,7-注射器七,8-注射器八,9-注射器九。

具体实施方式

为了更清楚地说明本发明实施例的目的、技术方案和优点，下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的部分实施例，而不是全部实施例。基于本发明的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明的保护范围。此外，本发明中所提到的方向用语，例如，“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“内”、“外”等，仅是参考附加图示的方向，使用的方向用语是为了更好、更清楚地说明及理解本发明，而不是指示或暗指本发明必须具有的方位，因此不能理解为对本发明的限制。

本发明实施例如图1至图4中所示，一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，步骤如下：

S1，制备高浓度的胶原蛋白溶液并利用无菌注射用水对其稀释获得溶液1；将取自动物源的胶原蛋白材料经粉碎切割，通过酸法和酶法相结合的方式提取，然后将其进行浓缩提纯，获得能够促进组织修复与再生的高浓度高纯度胶原溶液，此时胶原的重量浓度为达6％±10％(60mg/mL±10％)，pH值7.0±1，炽灼残渣重量1.0％以内，重金属含量不大于10μg/g，内毒素低于0.5EU/mL；之后取少量该高浓度胶原溶液，加入无菌注射用水进行稀释获得溶液1，其浓度为1-10mg/mL；

S2，制备含有高浓度的间充质干细胞的溶液2；将间充质干细胞通过中空纤维生物反应器进行培养，使用化学界定培养基或无血清培养基进行培养扩增至需要的浓度(10³到10⁵/mL)后，使用注射器提取间充质干细胞，化学界定或无血清培养基可预防动物源污染，注射器的规格为50mL，一次性使用无菌注射器一1取出在中空纤维生物反应器中扩增的间充质干细胞，确认该注射器一1中无空气后用密封帽封口，此步在超净台操作，间充质干细胞提取量在35-40mL之间,浓度在10³–10⁵/mL范围内，其含有的间充质干细胞表面标记CD44表达不低于98％，且无CD34表达或CD34表达不高于0.5％；

S3，将溶液2离心并移除离心液以获得高浓度的间充质干细胞；将注射器一1放置于可固定50mL注射器的离心机中进行倒置离心，根据不同情况可折断注射器一1的推杆并剪去尾部凸缘再进行离心，此时的离心条件是30℃、300-400g条件下离心5-10分钟，这样的离心条件能够在确保细胞沉淀的前提下保证细胞的活性，离心完成后小心取出注射器一1，保持倒置，取下密封帽，用70％酒精清洁后对接安装上孔隙直径为10-20微米的一次性注射器用的无菌过滤器，无菌过滤器的作用在于防止细胞通过，在无菌过滤器的另一端对接一次性的三通阀并连结空的一次性使用无菌注射器二2，将90％左右的离心液缓慢抽吸至注射器二2中，然后取下注射器二2并将其丢弃；

S4，将溶液1和干细胞培养基溶液分别加入S3中获得的间充质干细胞中进行重悬混合均匀获得细胞悬浮液；另取一支空的一次性使用无菌注射器三3抽取10mL上述配备好的胶原蛋白稀释液，即溶液1，取一支空的一次性使用无菌注射器四4抽取30mL干细胞培养基溶液，将这两个注射器分别连接到三通阀上，此时所述溶液1和干细胞培养基溶液以体积比为1:3的比例；然后依次缓慢的将溶液1以及干细胞培养基溶液通过注射器推送至前一步骤中获得的含有间充质干细胞的注射器一1中，在此推送过程中细胞就会重新悬浮形成细胞悬浮液，轻弹注射器一1外壁使溶液混合均匀，然后取下注射器三3、注射器四4、三通阀以及过滤器并丢弃；

S5，转移细胞悬浮液至无菌培养瓶中并进行滚动培养，获得混合有胶原蛋白和间充质干细胞的溶液3，在前一步骤中形成的细胞悬浮液处于注射器一1中，此时往注射器一1上安装无菌针头，将细胞悬浮液转移至无菌培养瓶中，将无菌培养瓶放置于37℃、含5％二氧化碳的培养箱内滚动培养2到3个小时，即可完成含胶原蛋白的间充质干细胞混合液的制备，得到的间充质干细胞的I型胶原蛋白覆盖率在70-90％之间。对于无菌培养瓶来说，所述无菌培养瓶包括圆桶状的透明的瓶体50、密封盖设在瓶体50瓶口上的瓶盖51，瓶体50成圆桶状，方便滚动培养细胞，更利于细胞均匀快速的培养生长，瓶盖51是密封盖设在瓶体50瓶口上的，意即瓶盖51和瓶体50之间的连接是密封的，可采用常规的方式来连接密封，所述瓶体50的内壁上涂覆有降低细胞黏着力的涂层52，瓶体50内壁上的涂层52降低了瓶体50内壁的附着性，能够有效的降低细胞的附着，更有利于悬浮型细胞的培养，减少了细胞的贴壁问题，该涂层52为低吸附性材料制成，比如硅胶脂涂层，所述瓶盖51的顶部相间隔设置有第一通孔510和第二通孔511，相间隔设置意味着两个通孔之间是有用于间隔的侧壁的，此侧壁也就形成保持瓶盖51强度的加强臂，避免设置通孔后对瓶盖51强度的减弱，同时也能避免往通孔中安装部件时损坏瓶盖51，所述瓶盖51内设置有抵接在第一通孔510和第二通孔511底端的能允许气体通过的无菌过滤片53，无菌过滤片53也就是无菌过滤滤膜，将无菌过滤片53设置在瓶盖51内，在瓶盖51盖设在瓶体50上后，无菌过滤片53就处在瓶体50瓶口和瓶盖51之间，将第一通孔510和第二通孔511与瓶体50内部间隔开，就能过滤掉微生物，而允许空气通过，就使得瓶体50内部和外部的空气能够进行交换，保证了培养瓶内细胞培养的环境，所述无菌过滤片53在对应于第二通孔510的位置处设有第三通孔530，第三通孔530就与第二通孔511相导通，方便了橡胶塞54的设置；一橡胶塞54依次插入第二通孔511和第三通孔530与瓶盖51和无菌过滤片53密封连接，橡胶塞54是能被针头进行多次穿刺的，穿刺后以及拔出针头后仍能保持密封状态的，在橡胶塞54插入第二通孔511和第三通孔530后，橡胶塞54和瓶盖51之间，橡胶塞54和无菌过滤片53之间都是密封的，就阻止了微生物进入瓶体50内部，就将瓶体50内部与外接隔绝开来，此时瓶盖51又是密封连接在瓶体50上的，瓶盖51上的橡胶塞54就能通过针头多次的穿刺来进行溶液的移取，从始至终都能保持培养瓶的密封状态，不会造成污染，而无菌过滤片53就能有效的过滤掉细菌，保持培养瓶内外的空气流通，促进细胞的培养，就更有利于快速有效的培养制备需要注射用的干细胞溶液，此时第一通孔510就用来进行瓶体50内外的空气交换，其形状就可以依据不同需求来设置，比如扇形；所述第二通孔511设置在瓶盖51的中心，所述第一通孔510设置有两个并以第二通孔511为中心对称设置，也就意味着橡胶塞54也是设置在瓶盖52的中心，也就有利于对瓶体50内溶液的移取，设置的两个第一通孔510就确保瓶体50内部与外界气体能进行充分有效的交换，对称的设置就使得瓶体50内的气体交换更均匀，促进细胞的快速培养，为了使得无菌过滤片53在瓶盖52内设置的稳固，所述瓶盖52内还设置有抵压在无菌过滤片53底部的支撑架531，所述支撑架531对应于第一通孔510的部位镂空，为了方便针头的穿刺，就使所述橡胶塞54的厚度小于瓶盖52顶部到无菌过滤片53底部的距离，橡胶塞54相对于瓶盖52顶部来说是处于下凹的状态，减小了针头穿刺的厚度，方便枕头的穿刺。

S6，从无菌培养瓶中转移出溶液3并将转移出的溶液3进行离心，从无菌培养瓶中转移溶液3至一次性使用无菌注射器五5中，通过注射器五5从无菌培养瓶中抽取来转移，注射器五5上安装有穿刺橡胶塞54的针头，所述针头的尺寸在16-22ga，抽取完毕后移除针头用密封帽将注射器五54封口，进行倒置离心，离心后注射器五5还是处于倒置状态，连接新的一次性使用无菌过滤器以及及鲁尔接头，将注射器五5中的悬浮液缓慢抽吸至空的一次性使用无菌注射器六6中并丢弃，之后再连接装有无菌生理盐水的一次性使用无菌注射器七7，将无菌生理盐水推送至注射器五5中，进行细胞重悬，离心后移除其中的悬浮液，然后再往移除注射器五5中加入无菌生理盐水进行细胞重悬，再次离心，再次移除悬浮液，重复该步骤多次，一般离心三次即可；

S7，往经过多次离心并移除悬浮液的溶液3中注入溶液1进行细胞重悬形成可以用于直接注射的注射剂，在第三次离心后，再连接新的一次性使用无菌过滤器，鲁尔接头以及空的一次性使用无菌注射器八8，抽吸注射器五5内90％的上层离心液至注射器八8中，取下含离心液的注射器八8、过滤器及鲁尔接头，丢弃，另取空的一次性使用无菌注射器九9抽取15mL制备的胶原蛋白稀释液即溶液1，使用可连接双向注射器的一次性鲁尔接头将注射器九9与注射器五5连结，推送15ml溶液1至注射器五5内以重悬细胞，此时注射器五5内获得的胶原蛋白溶液浓度在1％到3％之间,pH约为7.4，之后将含胶原的重悬的间充质干细胞溶液抽吸回注射器九9中，确定无空气后盖上无菌密封帽，就可直接用于临床的注射，最终注射液中间充质干细胞含量处于10³–10⁵/mL的有效范围内，胶原蛋白的浓度大于等于1％(10mg/mL),杂蛋白含量低于总蛋白含量1％，降解周期最长5个月，高浓度的胶原蛋白可延长细胞附着于创口的时间。

本方法直接使用从中空纤维反应器中收获的浓度在10³到10⁵/mL之间的间充质干细胞来进行制备，从细胞量考虑，可满足干细胞治疗所需的有效浓度。从细胞活性的角度考虑，本方法的优势在于，对比使用冻存后复苏的间充质干细胞制备注射液，避免了对细胞活性的二次检测评估步骤，并且含有相对更高比例的活细胞，从而保证了间充质干细胞注射液的品质。

从注射液制剂的角度，本方法中使用的无菌培养瓶可以加强间充质干细胞与胶原蛋白的结合，胶原蛋白是一种生物相容性非常高的生物材料，能够作为生物支架材料，与干细胞结合，提供一个适宜的环境，促进细胞分化和组织修复再生。以修复软骨损伤为例，溶于胶原蛋白溶液的间充质干细胞在注射至关节腔后可以更好的聚集于软骨损伤处，这是因为胶原蛋白溶液将在关节腔内形成一个生物支架，使得胶原溶液里的间充质干细胞能够依附于此以更好地增殖、分化，生成相应的软骨，从而提高治疗缺损的效率。

从实用性角度考虑，本方法中步骤使用的组件简单且操作方便，通过一次性三通阀及鲁尔接头保证了密闭性，对比需要超净台来进行的制备操作，降低了操作人员带来的交叉污染风险，利用该方法就能即时进行间充质干细胞注射液的制备，能够快速制作含有高浓度胶原的间充质干细胞注射剂，操作简单，无需超净台，减少人为污染，能够临床应用于组织修复与再生。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.一种制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于：步骤如下：

S1，制备高浓度的胶原蛋白溶液并利用无菌注射用水对其稀释获得溶液1；

S2，制备含有高浓度的间充质干细胞的溶液2；

S3，将溶液2离心并移除离心液获得高浓度的间充质干细胞；

S4，将溶液1和干细胞培养基溶液分别加入S3中获得的间充质干细胞中进行重悬混合均匀获得细胞悬浮液；

S5，转移细胞悬浮液至无菌培养瓶中并进行滚动培养，获得混合有胶原蛋白和间充质干细胞的溶液3，所述无菌培养瓶包括圆桶状的透明的瓶体、密封盖设在瓶体瓶口上的瓶盖，所述瓶体的内壁上涂覆有降低细胞黏着力的涂层，所述瓶盖的顶部相间隔设置有第一通孔和第二通孔，所述瓶盖内设置有抵接在第一通孔和第二通孔底端的能允许气体通过的无菌过滤片，所述无菌过滤片在对应于第二通孔的位置处设有第三通孔；一橡胶塞依次插入第二通孔和第三通孔与瓶盖和无菌过滤片密封连接；

S6，从无菌培养瓶中转移出溶液3并将转移出的溶液3进行离心，离心后移除其中的悬浮液，然后再往移除悬浮液后的溶液3中加入无菌生理盐水进行细胞重悬，再次离心，再次移除悬浮液，重复该步骤多次；

S7，往经过多次离心并移除悬浮液的溶液3中注入溶液1进行细胞重悬形成可以用于直接注射的注射剂。

2.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述溶液1的制备步骤如下：S1a，粉碎切割取自于动物源的胶原蛋白材料；S1b，将粉碎后的胶原蛋白材料通过酸法和酶法相结合的方式来提取胶原蛋白并进行浓缩提纯获得高浓度高纯度的胶原蛋白溶液；S1c，通过无菌注射水对胶原蛋白溶液进行稀释获得溶液1。

3.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述高浓度的胶原蛋白溶液：其重量浓度6％±10％、pH值7.0±1，炽灼残渣重量1.0％以内，重金属含量不大于10μg/g，内毒素低于0.5EU/mL；所述溶液1的浓度1-10mg/mL，所述溶液1和干细胞培养基溶液以体积比为1:3的比例分别加入S3中获得的间充质干细胞中进行重悬获得细胞悬浮液。

4.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述溶液2利用中空纤维生物反应器并使用活血界定培养基或无血清培养基进行培养扩增而获得，所述溶液2中的间充质干细胞表面标记CD44表达不低于98％，且无CD34表达或CD34表达不高于0.5％。

5.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述离心是将装有对应溶液的容器倒置放入离心机中离心的倒置离心，所述离心液通过倒置容器并利用注射器来吸取移除，所述容器和注射器之间依次设置有无菌过滤器和三通阀。

6.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述步骤S3的离心条件是30℃、300-400g条件下离心5-10分钟。

7.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述无菌培养瓶中的培养是在温度37℃、含5％二氧化碳的培养箱内滚动培养2到3个小时。

8.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述第二通孔设置在瓶盖的中心，所述第一通孔设置有两个并以第二通孔为中心对称设置，所述瓶盖内还设置有抵压在无菌过滤片底部的支撑架，所述支撑架对应于第一通孔的部位镂空，所述橡胶塞的厚度小于瓶盖顶部到无菌过滤片底部的距离。

9.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述溶液3通过注射器来从无菌培养瓶中转移出，所述注射器上安装有穿刺橡胶塞的针头，所述针头的尺寸在16-22ga。

10.根据权利要求1所述制备含胶原蛋白的间充质干细胞注射剂的方法，其特征在于:所述无菌过滤器的孔隙直径为10-20微米。

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