CN112839961B

CN112839961B - 一种cd40抗体药物组合物及其用途

Info

Publication number: CN112839961B
Application number: CN201980067049.XA
Authority: CN
Inventors: 杨健健; 李皓; 刘洵; 蒋家骅
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2018-11-30
Filing date: 2019-11-29
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2039-11-29
Also published as: CA3121291A1; MX2021006360A; TW202021620A; AU2019388931A1; EP3939998A1; KR20210097750A; JP2022513671A; CN112839961A; WO2020108621A1; US20240254248A1; EP3939998A4; BR112021010414A2

Abstract

本发明提供了一种包含CD40抗体或其抗原结合片段以及醋酸‑醋酸钠缓冲液的药物组合物及其用途。所述药物组合物还可含有糖、非离子型表面活性剂和其他辅料。本发明的药物组合物展现了良好的抗体稳定性。

Description

一种CD40抗体药物组合物及其用途

本申请要求申请日为2018/11/30的中国专利申请201811448238.5的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。

技术领域

本公开属于药物制剂领域，具体涉及一种包含CD40抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为药物的用途。

背景技术

CD40是细胞表面表达的糖蛋白之一，为分子量48kDa的I型膜内在糖蛋白，属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族，并在免疫系统中起重要作用。其表达在多种免疫细胞中，如B细胞、树突细胞、单核细胞和巨噬细胞等。当通过CD40发生信号传导时，专门的抗原呈递细胞会被激活。CD40的天然配体被命名为CD154或CD40L，已知主要表达在成熟T淋巴细胞中。CD40L介导信号的传导会触发一些细胞生物事件，包括免疫细胞激活、增殖，以及细胞因子和趋化因子的产生。CD40信号传导对于T细胞依赖性免疫应答是非常重要的，尤其在肿瘤环境背景中，CD40刺激的树突细胞能够激活肿瘤特异性效应T细胞，该类T细胞具有根除肿瘤细胞的潜力。

CD40表达发生在包括B淋巴细胞在内的许多正常细胞和肿瘤细胞中。例如黑色素瘤即属于具有CD40表达的肿瘤，而30％至70％的实体肿瘤也具有CD40表达。目前已知CD40的激活可有效触发抗肿瘤反应(Tong等人，Cancer Gene Therapy，2003，10：1-13)，包括肿瘤特异性T细胞反应的免疫激活、对CD40阳性肿瘤直接的细胞凋亡作用，以及剌激导致ADCC的体液反应，且观察到的肿瘤根除与肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞的出现强烈相关。同时也不应被忽视的是，全身施用CD40抗体与副作用相关，如休克综合征和细胞因子释放综合征(van Mierlo等人，Proc.Nat1.Acad.Sci.USA，2002，99：5561-5566)。

目前有多家国际制药公司在研发如上述针对CD40的单克隆抗体，它通过特异性刺激免疫激活，最大限度提高患者自身对肿瘤的免疫系统反应，从而达到对肿瘤细胞进行杀伤的目的。相关专利如CN1198647、CN1369015、CN1582165、CN100430419、CN101014386、CN101237882、CN101289510、CN101490086、CN103842382、CN104918957、WO2002028904、WO2011123489、WO2012149356、WO2013034904、WO2015091853、WO2016196314、WO2017040932、WO2017004006等。迄今为止，辉瑞(相关产品已许可给罗氏)、Alligator等公司的抗CD40抗体均在临床前动物模型中观测到了良好的肿瘤杀伤效果。

WO2018219327(PCT/CN2018/089252)提供有着高亲和力，高选择性，高生物活性的抗CD40抗体，用于通过刺激CD40抗体。

但是，抗体药物其分子量大，结构复杂，容易降解、聚合或发生不希望发生的化学修饰等而变得不稳定。为了使抗体适合于给药，并且在储存及随后使用过程中能保持稳定性，发挥更好的效果，抗体药物的稳定制剂研究显得尤为重要。CD40抗体制剂相关专利如WO2005063289。对于新的CD40抗体，仍需要研制更适于给药的包含CD40的药物组合物(制剂)。

发明内容

本公开提供一种药物组合物，其包含CD40抗体或其抗原结合片段，以及缓冲液。在一些实施方案中，所述缓冲液选自醋酸盐缓冲液或组氨酸缓冲液或磷酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液，优选醋酸盐缓冲液，更优选醋酸-醋酸钠缓冲液。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述CD40抗体或抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：14和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

名称	序列	编号
			HCDR1	GYILTTYWIT	SEQID NO：3
HCDR2	DIHPGSGSTKYNEKFKS	SEQID NO：4
			HCDR3	RDY	SEQID NO：5
LCDR1	RSSQNIVNSQGNTYLE	SEQID NO：6
			LCDR2	KVTNRFS	SEQID NO：7
LCDR3	FQASLVPWT	SEQID NO：8

在可选的实施方案中，药物组合物中所述CD40抗体或其抗原结合片段浓度为约1mg/ml至120mg/ml，可以约为1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、12mg/ml、14mg/ml、16mg/ml、18mg/ml、20mg/ml、22mg/ml、24mg/ml、26mg/ml、28mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、55mg/ml、60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml、95mg/ml、100mg/ml、105mg/ml、110mg/ml、115mg/ml、120mg/ml或任意两数值间任意值，优选10mg/ml至40mg/ml，最优选约为25mg/ml。

在可选的实施方案中，缓冲液的浓度约为5mM至30mM，优选约为10mM至20mM，非限制性实施例包括10mM、12mM、14mM、16mM、18mM、20mM或任意两数值间任意值，最优选约为10mM。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述缓冲液的pH值约为4.5至6.5，优选约为5.0至6.0，在非限制性实施例中还可选约为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0或任意两数值间任意值，最优选约为5.0或者5.5。

在可选的实施方案中，药物组合物还包含糖。本公开的“糖”包含常规组合物(CH₂O)_n及其衍生物，包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原性糖、非还原性糖等。可选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、sylitol、山梨糖醇、甘露醇、密里二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异-麦芽酮糖等。优选的糖为非还原性二糖，更优选海藻糖或蔗糖。

在可选的实施方案中，药物组合物中糖的浓度约为40mg/ml至95mg/ml(例如55mg/ml)，优选约为60mg/ml至90mg/ml，非限制性实施例包括60mg/ml、65mg/ml、70mg/ml、75mg/ml、80mg/ml、85mg/ml、90mg/ml或任意两数值间任意值，更优选约为80mg/ml。

在可选的实施方案中，药物组合物还包含表面活性剂。可选自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、聚羟亚烃、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-、肉豆蔻基-、亚油基-、硬脂基-肌氨酸、亚油基-、肉豆蔻基-、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-、柯卡酰胺基丙基-、亚油酰胺基丙基-、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-、棕榈酰胺基丙基-、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等等。优选的表面活性剂为聚山梨醇酯，如聚山梨醇酯80或聚山梨醇酯20，更优选聚山梨醇酯80。

在可选的实施方案中，药物组合物中表面活性剂的浓度约为0.02mg/ml至0.8mg/ml(例如0.1mg/ml)，优选约为0.3mg/ml至0.6mg/ml，非限制性实施例包括0.3mg/ml、0.35mg/ml、0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml、0.6mg/ml或任意两数值间任意值，更优选约为0.4mg/ml。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)1至120mg/ml的CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(b)5至30mM的醋酸盐缓冲液。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(b)5至30mM的醋酸盐缓冲液，(c)40至90mg/ml的蔗糖，

(d)0.02至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，优选所述药物组合物的pH为4.5至6.5，更优选5.0至6.0，进一步优选5.5。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(b)5至30mM的醋酸盐缓冲液，

(c)40至95mg/ml的海藻糖，

(d)0.02至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，优选所述药物组合物的pH约为4.5至6.5，更优选约为5.0至6.0，进一步优选5.5。

一种药物组合物，其包含

(a)1至120mg/ml的CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

(b)10至20mM的醋酸盐缓冲液，且所述药物组合物的pH为5.0至5.5。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)10mg/ml至40mg/ml的CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(b)10至20mM的醋酸盐缓冲液，

(c)60至90mg/ml的蔗糖，

(d)0.3至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80，优选所述药物组合物的pH为5.0至6.0。

在可选的实施方案中，所述药物组合物包含：

(a)25mg/ml的CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(b)10至20mM的醋酸-醋酸钠缓冲液，

(c)60至90mg/ml的蔗糖，

在具体实施方案中，所述的药物组合物包含：

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，pH5.5；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，pH5.8；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，pH6.0；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，pH5.6；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，pH5.8；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液，pH6.0；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-醋酸缓冲液，pH5.0；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-醋酸缓冲液，pH5.5；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-醋酸缓冲液，pH6.0；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-醋酸缓冲液，pH5.0；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-醋酸缓冲液，pH5.5；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM组氨酸-醋酸缓冲液，pH5.8；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液，pH6.0；

25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.4mg/ml聚山梨酯80和10mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH5.5；

或者，25mg/ml CD40抗体、80mg/ml蔗糖、0.6mg/ml聚山梨酯80和10mM醋酸-醋酸钠缓冲液，pH5.5；

上述具体实施方案中所述CD40抗体具有分别如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQID NO：8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

在一些实施方案中，本公开所述CD40抗体或其抗原结合片段具有如SEQ ID NO：1所示的重链可变区，和如SEQ ID NO：2所示的轻链可变区。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述抗体或抗原结合片段可选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

在可选实施方案中，药物组合物中所述的人源化CD40抗体轻链和重链可变区上的轻链和重链FR区序列分别来源于人种系轻链和重链或其突变序列。

进一步地，所述人源化CD40抗体重链序列为如SEQ ID NO：17所示的序列或其变体，所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为氨基酸位点在6和8的突变，突变后的氨基酸优选为I、A或L；所述人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO：18所示的序列或其变体，所述的变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为氨基酸位点在2和3的突变，突变后的氨基酸优选为I、V或L。

在可选实施方案中，所述人源化CD40抗体重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链FR区，更优选包含人源IgG1或IgG2重链FR区。

在可选的实施方案中，药物组合物中所述CD40抗体的轻链与hu9E5抗体轻链氨基酸序列具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性，所述CD40抗体的重链氨基酸序列与hu9E5抗体重链具有至少85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同一性，所述hu9E5抗体轻链序列如SEQ ID NO：18所示，hu9E5抗体重链序列如SEQ ID NO：17所示。

本公开所述药物组合物已具有足够成药稳定性，可以长期稳定放置。另一方面，为便于药品运输的方便，本公开药物组合物可以进一步的做成冻干制剂。

本公开还提供一种制备含CD40抗体的冻干制剂的方法，其中包括将前述药物组合物经冷冻干燥的步骤。

在可选的实施方案中，制备含CD40抗体的冻干制剂的方法中所述冷冻干燥依次包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。

本公开还提供一种经前述制备含CD40抗体的冻干制剂的方法制备所得含CD40抗体的冻干制剂。

在一些实施方案中，该冻干制剂于2-8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。

在一些实施方案中，该冻干制剂于25℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。

在一些实施方案中，该冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。

本公开还提供制备含有CD40抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法，其中包括将前述冻干制剂经复溶的步骤，其复溶所用溶液选自但不限于注射用水、生理盐水或葡萄糖溶液。

本公开还提供一种经前述含有CD40抗体的冻干制剂的复溶溶液的方法制备所得含有CD40抗体的冻干制剂的复溶溶液。

本公开进一步提供一种制品或试剂盒，其包含装有本文所述任何稳定的药物组合物的容器。在一些实施方案中，该玻璃瓶为中性硼硅玻璃管制注射剂瓶。

本公开还提供前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液在制备用于治疗治疗CD40相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症优选癌症，所述的癌症选自淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、食管癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、白血病、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。

本公开还提供一种治疗和预防CD40相关的疾病或病症的方法，包括给予所需患者治疗有效量的前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液，其中所述的疾病或病症优选为癌症，所述的癌症最优选为淋巴癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、胃癌、结肠直肠癌、膀胱癌、横纹肌肉瘤、食管癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、白血病、胆囊癌、胶质母细胞瘤和黑色素瘤。

本公开还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有前述的药物组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液。

要理解，可以组合本文所述各个实施方案的一项、一些或所有特性以形成本公开的其它实施方案。本公开的这些和其它方面对于本领域技术人员是显而易见的。本公开的这些和其它实施方案通过下面的详述进一步描述。

具体实施方式

一、术语

为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

“缓冲液”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲液。将pH控制在适当范围中的缓冲液的例子包括醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰甘氨酸和其它有机酸缓冲液。

“组氨酸缓冲液”是包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲液，优选组氨酸-盐酸盐缓冲液。组氨酸-盐酸盐缓冲液是组氨酸与盐酸或组氨酸与组氨酸盐酸盐配制而成。

“柠檬酸盐缓冲液”是包括柠檬酸根离子的缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的实例包括柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-柠檬酸钾、柠檬酸-柠檬酸钙、柠檬酸-柠檬酸镁等。优选的柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。

“琥珀酸盐缓冲液”是包括琥珀酸离子的缓冲液。琥珀酸盐缓冲液的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。优选的琥珀酸盐缓冲液为琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液。

“磷酸盐缓冲液”是包括磷酸离子的缓冲液。磷酸盐缓冲液的实例包括磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钾等。优选的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠酸-磷酸二氢钠缓冲液。

“醋酸盐缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的实例包括醋酸-醋酸钠、醋酸-组氨酸盐、醋酸-醋酸钾、醋酸-醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本文中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。

本公开中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。

“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或溶液制剂经过真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。

本文所用术语“约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多20％的范围。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。

本公开所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。

稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地最多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃保存包括1个月、3个月、6个月或在40℃保存1个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的抗体单体发生降解。通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的截短，通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。

如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。

如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。

如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。

术语“CD40”是指为TNF受体超家族成员的细胞表面受体，又称为TNFRSF5。CD40普遍表达于树突细胞、B细胞和巨噬细胞表面，是产生和维持T细胞免疫所需的分子。术语“CD40”包括由细胞天然表达的CD40的任何变体或同种型。本发明的抗体可与得自非人物种的CD40交叉反应。作为另一种选择，该抗体也可以是人CD40特异性的，可不表现出与其他物种的交叉反应性。CD40或其任何变体或同种型可从天然表达它们的细胞或组织中分离而得，或使用本领域通用以及本文所述的那些技术通过重组技术产生。优选地，抗CD40抗体靶向具有正常糖基化模式的人源CD40。

本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。

在本公开中，本公开所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本公开中，本公开所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。

本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人CD40的单克隆抗体。制备时用CD40抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入人载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个优选的实施方案中，所述的CD40嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的CD40嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。

本公开中术语“与CD40结合”，指能与人CD40相互作用。

术语“特异性结合”指如通过本领域可用的技术，例如竞争ELISA、

测定或

测定所测定的。该术语还适用于当例如本公开抗体的抗原结合结构域对许多抗原携带的特定表位特异的情况，在该情况下携带抗原结合结构域的抗体能够特异性结合携带该表位的多种抗原。

本公开中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人CD40结合的scFv片段及其他利用了能与人CD40结合的抗体的VH和VL区形成的可结合人CD40的片段；其包含本公开所述抗体的选自SEQ ID NO：7、13、9、10、11和12中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。

术语“表位”指在一个或更多个抗体的抗原结合区中能够被抗体识别并结合的分子部分。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

氨基酸序列“同一性”或“同源性”是指两个蛋白或多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同氨基酸残基占据时，例如如果两个多肽的一个位置都被同一个氨基酸残基占据时，那么所述分子在该位置是一致的。适于确定序列同一性百分比和序列相似性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST2.0算法，它们分别描述于Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic Acids Res.25：3389-3402。用于执行BLAST分析的软件可在美国国家生物技术信息中心公开获取(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人CD40特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Studentt检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“Tm值”是指蛋白质热变性温度，即一半蛋白去折叠时的温度，此时蛋白的空间结构被破坏，所以Tm值越高，蛋白热稳定性越高。

二、实施例与测试例

通过以下实施例进一步详细说明本公开。这些实施例仅用于说明性目的，而并不用于限制本公开的范围。

本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

本申请中CD40抗原及抗体的制备、纯化方法已在申请号为WO2018219327专利文件中记载，前述申请文件的全部内容均可引入本公开。

实施例1.免疫抗原、筛选抗原的序列及制备

带his标签的人CD40(h-CD40-his)重组蛋白、带Fc标签的人CD40(h-CD40-Fc)重组蛋白、带his标签的小鼠CD40(m-CD40-his)重组蛋白和带his标签的恒河猴CD40(rhesus-CD40-his)重组蛋白(#CD0-C52H7)均为购买自Acrobiosystems公司的纯化商业蛋白实际，其各自的序列来源见表1。蛋白可用于下述各实施例实验中。

表1.重组蛋白氨基酸序列来源

名称	氨基酸序列起止	Genbank登录号
			h-CD40-his	Glu21-Arg193	AAH12419.1
h-CD40-Fc	Glu21-Arg193	NP_001241.1
			m-CD40-his	Val24-Arg193	P27512
rhesus-CD40-his	Glu21-Arg193	NP_001252791.1

实施例2.抗体杂交瘤的制备

抗人CD40单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用C57BL/6小鼠，雌性，6～8周龄[昭衍(苏州)新药研究中心有限公司，动物生产许可证号：201503259]。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠分成2笼，每笼5只。

免疫抗原为带Fc标签的人修饰过的CD40重组蛋白(h-CD40-Fc，用磷酸盐缓冲液配制成1μg/μl)。用弗氏佐剂(Sigma，LotNo.：F5881/F5506)乳化：首次用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用核酸类佐剂(CpG，Sangon Biotech)和注射用铝(Imject Alum，Thermo，LotNo.：PH203866)。免疫注射时间为第0、14、28、42、56、70天。于第21，35，49，63，77天采血进行血检，用ELISA方法检测小鼠血清，确定小鼠血清中的抗体滴度。

在第4次免疫以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射10μg/只的磷酸盐缓冲液配制的抗原溶液。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(

CRL-8287^TM)进行融合得到杂交瘤细胞，选出体外活性好的单克隆杂交瘤细胞株。

实施例3.抗CD40抗体的克隆与定序

取以上筛选鉴定出的抗体的杂交瘤亚克隆，收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，15596-018)提取RNA(按照试剂盒说明书步骤)，反转录(PrimeScript^TMReverse Transcriptase，Takara，cat#2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-PrimerSet(Novagen，TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。最终得到鼠源抗体的序列。

9E5的重链和轻链可变区序列如下：

其含有下表2中的CDR序列：

表2

将获得的可变区序列分别接上人的抗体IgG1恒定区序列，得到人-鼠嵌合的抗体序列，利用分子克隆技术，把嵌合抗体的序列插入到pCP表达载体中(购自迈博斯生物公司)中，经过PCR后测序鉴定(该部分的分子克隆等分子生物学操作方法按常规操作条件进行，具体可以参照《分子克隆：实验室手册》)，利用HEK293细胞表达系统，即可获得人-鼠嵌合抗体9E5-C。对经过MabSelect SuRe(GE Lifesciences)亲和力层析纯化后的嵌合抗体进行各项体外活性检测，数据见表3。

表3嵌合抗体的体外活性

实施例4.小鼠抗体人源化实验

在所获得的鼠源抗体9E5的VH/VLCDR典型结构的基础上，将重、轻链可变区序列与抗体Germline数据库比较，获得同源性高的人种系模板。其中人类种系轻链框架区来自人κ轻链基因，本发明抗体优选人种系轻链模版Vk2-28/JK4(9E5)。人类种系重链框架区来自人重链，本发明抗体优选人种系重链模版VH1-2/JH6(9E5)，如下所示：

9E5优选人种系重链模版IGHV1-2(SEQ ID NO：9)：

9E5优选人种系轻链模板IGkV2-28(SEQ ID NO：10)：

将鼠源抗体的CDR区移植到选择的人源化模板上，替换人源化可变区，再与相应的人源IgG恒定区(优选重链为IgG1，轻链为κ)重组。然后以鼠源抗体的三维结构为基础，对包埋残基、与CDR区有直接相互作用的残基，以及对VL和VH的构象有重要影响的残基进行回复突变，并对CDR区化学不稳定氨基酸残基优化，得到最终的人源化分子。

hu9E5-H1a(SEQ ID NO：11)：

hu9E5-H1b(SEQ ID NO：12)：

hu9E5-H1c(SEQ ID NO：13)：

hu9E5-L1a(SEQ ID NO：14)：

hu9E5-L1b(SEQ ID NO：15)：

hu9E5-L1c(SEQ ID NO：16)：

经由以上轻重链组合的表达测试和回复突变数量对比，选择出最终的人源化hu9E5抗体分子(使用H1c重链和L1a轻链)，其各自的完整轻重链序列如SEQ ID NO：17-18所示。

实施例5.人源化抗体测试数据

本发明人源化抗体hu9E5与人，恒河猴CD40的结合活性、阻断活性等，见表4。

表4人源化hu2H6和hu9E5抗体的体外活性

实施例6.抗CD40抗体对小鼠肿瘤生长的抑制

取正常人外周血，用密度梯度离心法分离健康人PBMC。用CD14⁺microbeads试剂盒分选单核细胞，按照试剂盒所提供的protocol进行CD14+单核细胞的分离，即每10⁷个细胞加入20μl Anti-CD14 microbeads，4℃孵育15分钟。然后，将细胞加入磁柱中，洗三次后，收集磁柱中的细胞，即CD14⁺单核细胞。CD14⁺单核细胞中加入含10ng/ml IL4和100ng/ml GM-CSF的RPMI 1640培养液培养6天(培养方法为本领域常规方法)，进行MoDC细胞的诱导培养，剩余的细胞加入含IL-2的RPMI 1640，培养后收集悬浮的细胞(培养方法以及收集细胞的方法均为本领域的常规方法)，使用CD3⁺microbeads试剂盒分选T细胞。六天后收集并分取MoDC细胞和CD3⁺T细胞，将他们与Raji细胞(上海生科院细胞库，培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养液中)按1∶5∶20的比例混合，接种于每只NOG小鼠(南京银河生物，适应性饲养5天)皮下。实验动物均饲养于恒温恒湿的独立通风盒内，饲养室温度18.0-26.0℃，湿度40-70％，10-20次/小时换气，昼夜明暗交替时间12h/12h。

实验分为人IgG1抗体对照组，hu9E5和参照抗体G12，给药剂量均为3mg/kg。每组5只小鼠，每周一次，六周注射给药，连续给药3次。整个实验过程中，用游标卡尺每周测量2次肿瘤长径和宽径，肿瘤体积(mm³)＝0.5×(肿瘤长径×肿瘤短径²)计算。相对肿瘤抑制率TGI(％)：TGI％＝(1-T/C)×100％。T/C％为相对肿瘤增殖率，即在某一时间点，治疗组和对照组相对肿瘤体积或瘤重的百分比值。T和C分别为治疗组和IgG1对照组在某一特定时间点的肿瘤体积(TV)或瘤重(TW)。

结果显示，人源化的抗CD40抗体hu9E5相对IgG1对照均有非常显著的抑瘤作用，给药21天后肿瘤接近完全消除。

示例性抗体药物组合物(制剂)制备工艺

第一步：CD40抗体(如hu9E5)与稳定制剂配制成含CD40抗体的制剂原液，

经过滤后中控取样检测无菌。将原液过0.22μm PVDF滤芯，收集滤液。

第二步：调节装量至1.1ml，将滤液灌装于2ml西林瓶中，加塞，分别于灌装开始、灌装中间、灌装结束时取样中控检测装量差异。

第三步：开启轧盖机，加铝盖，进行轧盖。

第四步：目检，确认产品无装量不准等缺陷。打印、粘贴西林瓶标签；打印纸盒标签，折叠纸盒，装盒，贴纸盒标签。

实施例7.抗CD40抗体制剂缓冲体系pH值的筛选

配制下列缓冲液，制备抗CD40抗体浓度为50mg/ml的抗体制剂，取样品进行高温(40℃)稳定性研究。

1)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.0

2)10mM醋酸-醋酸钠，pH5.5

3)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.0

4)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH5.5

5)10mM琥珀酸-琥珀酸钠，pH6.0

6)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH5.5

7)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.0

8)10mM组氨酸-盐酸组氨酸，pH6.5

表5.抗CD40抗体pH值筛选结果

注：M表示月

结果表明：抗CD40抗体较适pH范围为5.0～6.0，在此pH范围3个缓冲体系SEC和CE的差别不大，ICE的变化在14.0％～24.1％区间内，相对pH6.5的缓冲体系(buffer)稳定。

实施例8.抗CD40抗体制剂中表面活性剂种类的筛选

选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5和10mM醋酸-醋酸钠pH5.5的缓冲体系，制备含50mg/ml蛋白，75mg/ml蔗糖，不同表面活性剂种类的抗CD40抗体制剂，考察25℃的外观稳定性：

1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.4mg/ml聚山梨酯80；

2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，0.4mg/ml聚山梨酯20；

3)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，0.4mg/ml聚山梨酯80；

4)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，0.4mg/ml聚山梨酯20；

表6.抗CD40抗体表面活性剂种类筛选25℃稳定性结果

结果表明：表面活性剂种类优选聚山梨酯80。

实施例9.抗CD40抗体制剂中表面活性剂浓度的筛选

选择10mM醋酸-醋酸钠pH5.5的缓冲体系，制备含50mg/ml蛋白，75mg/ml蔗糖，不同聚山梨酯80浓度的抗CD40抗体制剂：

1)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，0.1mg/ml聚山梨酯80；

2)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，0.2mg/ml聚山梨酯80；

3)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，0.4mg/ml聚山梨酯80；

4)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，0.6mg/ml聚山梨酯80；

5)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，0.8mg/ml聚山梨酯80；

取样品用0.9％氯化钠注射液分别稀释到0.5mg/ml的蛋白浓度，不溶性微粒结果表明(见表3)，当聚山梨酯80浓度在0.1mg/ml～0.8mg/ml时，抗CD40抗体蛋白与氯化钠均有较好的相容性，说明上述聚山梨酯80浓度的稳定作用均较好；再将上述样品置于振荡培养箱(25℃，300rpm)振摇5天，根据外观结果，将聚山梨酯80的浓度选定为0.4～0.8mg/ml，优选为0.4mg/ml。

表7抗CD40抗体聚山梨酯80浓度筛选结果

实施例10.抗CD40抗体制剂中糖浓度的筛选

选择10mM醋酸-醋酸钠pH5.5的缓冲体系，制备含50mg/ml蛋白，0.4mg/ml聚山梨酯80，不同蔗糖浓度的抗CD40抗体制剂：

1)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，55mg/ml蔗糖；

2)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，65mg/ml蔗糖；

3)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，70mg/ml蔗糖；

4)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，75mg/ml蔗糖；

5)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5，80mg/ml蔗糖；

各样品渗透压结果表明(见表8)，蔗糖浓度为80mg/ml时制剂等渗。

表8抗CD40抗体不同蔗糖浓度渗透压结果

序号	蔗糖浓度	渗透压值(mOsm)
			1	55mg/ml	208
2	65mg/ml	250
			3	70mg/ml	269
4	75mg/ml	283
			5	80mg/ml	294

实施例11.抗CD40抗体不同缓冲体系稳定性

用下列缓冲体系，制备含50mg/ml蛋白，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80的抗CD40制剂，并考察25℃及2～8℃稳定性。

1)10mM醋酸-醋酸钠pH5.5

2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5

3)10mM组氨酸-醋酸pH5.5

表9不同缓冲体系25℃稳定性结果

表10不同缓冲体系2～8℃稳定性结果

结果表明：25℃6个月后，10mM醋酸-醋酸钠的缓冲体系稍显出优势，10mM组氨酸-盐酸组氨酸和10mM组氨酸-醋酸缓冲体系差异不明显；2～8℃6个月后，三个体系的质量无明显差异。

实施例12.制剂蛋白浓度对稳定性影响

选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5的缓冲体系，制备含80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，蛋白浓度分别为50mg/ml、25mg/ml、1mg/ml的抗CD40抗体制剂，考察40℃高温稳定性。

1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，蛋白浓度50mg/ml

2)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，蛋白浓度25mg/ml

3)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5，蛋白浓度1mg/ml

表11不同蛋白浓度样品40℃高温稳定性实验结果

结果表明：制剂的蛋白浓度会对纯度值产生影响，50mg/ml与25mg/ml的蛋白浓度对纯度值影响不大，而1mg/ml蛋白浓度的制剂稳定性明显较差。

实施例13.制剂成分的综合筛选

为了进一步对蛋白浓度、聚山梨酯80浓度、pH进行优化，运用JMP软件进行DOE设计，应用RSM模型得到一系列处方(如下)。由于缓冲体系组氨酸-盐酸组氨酸(His-HCl)和组氨酸-醋酸(His-AA)的稳定性数据没有特别明显的差别，而His-HCl的pH缓冲范围是在5.5以上，故选择His-AA为缓冲液做DOE筛选实验。在10mM组氨酸-醋酸(His-AA)的缓冲体系中，制备不同蛋白浓度，不同聚山梨酯80浓度，含80mg/ml蔗糖的抗CD40抗体制剂，将样品保存于40℃条件下进行稳定性分析：

(1)0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，40mg/ml CD40

(2)0.2mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，10mg/ml CD40

(3)0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，25mg/ml CD40

(4)0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，25mg/ml CD40

(5)0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，10mg/ml CD40

(6)0.6mg/ml聚山梨酯80，pH6.0，40mg/ml CD40

(7)0.2mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，25mg/ml CD40

(8)0.2mg/ml聚山梨酯80，pH6.0，40mg/ml CD40

(9)0.6mg/ml聚山梨酯80，pH5.0，25mg/ml CD40

(10)0.4mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，40mg/ml CD40

(11)0.6mg/ml聚山梨酯80，pH5.5，10mg/ml CD40

(12)0.4mg/ml聚山梨酯80，pH6.0，10mg/ml CD40

表12DOE筛选40℃M1实验结果

结果表明：pH值(5.0～6.0)，聚山梨酯80(0.2～0.6mg/ml)和蛋白浓度(10～40mg/ml)对于稳定性数据的影响不是很大，所以处方的pH范围为5.0～6.0，取中值5.5作为最终pH值，聚山梨酯80的浓度结合之前的筛选结果将0.4mg/ml作为最终浓度值，蛋白浓度定为25mg/ml。

实施例14.抗CD40抗体不同缓冲体系冻干稳定性

由于醋酸(钠)缓冲体系在冻干时可能由于挥发会导致复溶后pH值偏移，不宜作为冻干制剂的缓冲体系。选择10mM组氨酸-盐酸组氨酸(His-HCl)pH5.5和10mM组氨酸-醋酸(His-AA)pH5.5两种buffer，制备含50mg/ml蛋白，80mg/ml蔗糖和0.4mg/ml聚山梨酯80的抗CD40抗体制剂，灌装量为1.2ml/瓶，冻干工艺如下表13：

1)10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5

2)10mM组氨酸-醋酸pH5.5

表13冻干工艺

冻干制品饼状良好，复溶后外观澄清，pH和纯度项也无明显变化，说明该冻干工艺良好。并放置25℃及2～8℃稳定性，结果表明：10mM组氨酸-盐酸组氨酸pH5.5和10mM组氨酸-醋酸pH5.5均适合作为抗CD40抗体制剂的缓冲体系。

表14冻干前后对比

表15冻干样品25℃稳定性结果

表16冻干样品2～8℃稳定性结果

实施例15.其它可选择制剂配方

此外，本发明还提供其它制剂配方的抗CD40抗体药物制剂，包含但不限于：

(1)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.5；

(2)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.8；

(3)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH6.0；

(4)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.6；

(5)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH5.8；

(6)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-盐酸组氨酸缓冲液pH6.0；

(7)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.0；

(8)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.5；

(9)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH6.0；

(10)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.0；

(11)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.5；

(12)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH5.8；

(13)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM组氨酸-醋酸缓冲液pH6.0；

(14)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.4mg/ml聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸钠缓冲液pH5.5；

(15)25mg/ml CD40抗体，80mg/ml蔗糖，0.6mg/ml聚山梨酯80，和10mM醋酸-醋酸钠缓冲液pH5.5；

实验结果表明，上述制剂配方的CD40抗体制剂均具有良好的稳定性，可应用于CD40抗体药物的配制。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司；上海恒瑞医药有限公司

<120> 一种CD40抗体药物组合物及其用途

<130> P19404528C

<150> CN201811448238.5

<151> 2018-11-30

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Arg Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 2

<211> 112

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 2

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Glu Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 3

<211> 10

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 3

Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 4

Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 5

<211> 3

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 5

Arg Asp Tyr

1

<210> 6

<211> 16

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 6

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 7

<211> 7

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 7

Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> PRT

<213> 小鼠(Mus musculus)

<400> 8

Phe Gln Ala Ser Leu Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 9

<211> 98

<212> PRT

<213> 人种系(Artificial Sequence)

<400> 9

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 10

<211> 100

<212> PRT

<213> 人种系(Artificial Sequence)

<400> 10

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro

100

<210> 11

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 12

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 442

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

180 185 190

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

340 345 350

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 18

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

Claims

1.一种药物组合物，其包含CD40抗体或其抗原结合片段，以及缓冲液，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，所述缓冲液选自醋酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液或琥珀酸盐缓冲液。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自醋酸盐缓冲液。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自醋酸-醋酸钠缓冲液。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段浓度为1mg/ml至120mg/ml。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段浓度为10mg/ml至40mg/ml。

6.如权利要求1或4所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为4.5至6.5。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为5.0至6.0。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为5mM至30mM。

9.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液浓度为10mM至20mM。

10.如权利要求1所述的药物组合物，其中还包括二糖，所述二糖选自海藻糖或蔗糖。

11.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述糖浓度为40mg/ml至95mg/ml。

12.如权利要求10所述的药物组合物，其中所述糖浓度为60mg/ml至90mg/ml。

13.如权利要求1所述的药物组合物，其中还包括表面活性剂，所述表面活性剂为聚山梨醇酯。

14.如权利要求13所述的药物组合物，其中所述表面活性剂为聚山梨醇酯80。

15.如权利要求13所述的药物组合物，其中表面活性剂的浓度为0.02mg/ml至0.8mg/ml。

16.如权利要求13所述的药物组合物，其中表面活性剂的浓度为0.3mg/ml至0.8mg/ml。

17.一种药物组合物，其包含：

(a)1至120mg/ml的CD40抗体或其抗原结合片段，所述CD40抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，

(b)5至30mM的醋酸盐缓冲液，

(c)40至90mg/ml的蔗糖，

(d)0.02至0.8mg/ml的聚山梨醇酯80。

18.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为4.5至6.5。

19.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为5.0至6.0。

20.如权利要求17所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为5.5。

21.一种药物组合物，其包含

(a)1至120mg/ml的CD40抗体或其抗原结合片段，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段具有分别如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和分别如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ IDNO:5所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和

22.如权利要求1、17或21所述的药物组合物，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段的重链可变区如SEQ ID NO:1所示，和轻链可变区如SEQ ID NO:2所示。

23.如权利要求22所述的药物组合物，其中所述CD40抗体或其抗原结合片段为人源化抗体。

24.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述的人源化抗体轻链和重链可变区上的轻链和重链FR区序列分别来源于人种系轻链和重链或其突变序列。

25.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述人源化抗体重链序列为如SEQ ID NO:17所示的序列；所述人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:18所示的序列。

26.如权利要求23所述的药物组合物，其中所述人源化抗体重链可变区进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其变体的重链FR区。

27.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述人源化抗体重链可变区包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链FR区。

28.如权利要求26所述的药物组合物，其中所述人源化抗体重链可变区包含人源IgG1或IgG2重链FR区。

29.制备含CD40抗体的冻干制剂的方法，其中包括将权利要求1至28任一项所述的药物组合物经冷冻干燥的步骤。

30.一种由权利要求29所述的方法制备所得含CD40抗体的冻干制剂。

31.权利要求1至28任一项所述的药物组合物或权利要求30所述的冻干制剂在制备用于治疗CD40相关的疾病或病症的药物中的用途，其中所述的疾病或病症为癌症，所述的癌症选自淋巴癌。

32.一种制品，其包括容器，该容器中装有权利要求1至28任一项所述的药物组合物或权利要求30所述的冻干制剂。