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CN112771166A - 表达car的t细胞和car表达载体 - Google Patents

表达car的t细胞和car表达载体 Download PDF

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CN112771166A
CN112771166A CN201980056592.XA CN201980056592A CN112771166A CN 112771166 A CN112771166 A CN 112771166A CN 201980056592 A CN201980056592 A CN 201980056592A CN 112771166 A CN112771166 A CN 112771166A
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cells
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car
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武千央
叠家贵之
山口晶子
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Neuer Immune Biotechnology Co ltd
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Neuer Immune Biotechnology Co ltd
Takeda Pharmaceutical Co Ltd
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Abstract

本发明提供与单独表达CAR的(不表达细胞因子和/或趋化因子的)免疫细胞(CAR‑T细胞等)相比抗肿瘤活性更高的免疫细胞(CAR‑T细胞等)。本发明的一个方面所提供的T细胞表达(1)嵌合抗原受体(CAR)、(2)选自由白细胞介素‑15(IL‑15)、白细胞介素‑18(IL‑18)、白细胞介素‑21(IL‑21)和白细胞介素‑27(IL‑27)组成的组中的至少一种、以及(3)CC趋化因子配体19(CCL19)。

Description

表达CAR的T细胞和CAR表达载体
技术领域
本发明涉及能够用于癌症免疫治疗的、表达嵌合抗原受体(本说明书中记作“CAR”。)的免疫细胞(本说明书中记作“CAR表达免疫细胞”。)、代表性地为表达CAR的T细胞(本说明书中记作“CAR-T细胞”。)和用于制作CAR表达免疫细胞(CAR-T细胞等)的表达载体。更详细而言，本发明涉及表达指定的细胞因子和趋化因子的CAR表达免疫细胞(CAR-T细胞等)和用于制作该CAR表达免疫细胞的表达载体。
背景技术
通过给药CAR-T细胞进行的癌症免疫疗法虽然在白血病、淋巴瘤等造血系统恶性肿瘤中显示出有效性，但是，尤其是在实体瘤中，由于CAR-T细胞在生物体内的存活效率低、由癌细胞所具有的肿瘤免疫逃逸机制引起的肿瘤微环境中的CAR-T细胞的活性抑制等课题而存在看不到治疗效果的癌症类型、病例。因此，尤其需要在实体瘤中显示治疗效果的、抗肿瘤活性更高的CAR-T细胞。
专利文献1和非专利文献1记载了抗肿瘤活性优于以往的CAR-T细胞的、表达IL-7和CCL19的CAR-T细胞。但是，专利文献1和非专利文献1中，没有包含关于除此以外的细胞因子与趋化因子的组合的具体记载。
非专利文献2记载了独立于CAR的信号传送且持续性得到提高的、表达膜结合型嵌合IL-15(mbIL-15)的CAR-T细胞。但是，非专利文献2中，没有包含关于mbIL-15与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
非专利文献3中记载了：通过使用IL-15与IL-15Rαsushi结构域经由柔性接头连接而成的融合蛋白，与以往的组合使用IL-15与IL-15Rαsushi结构域的情况相比，能够增强淋巴细胞(NK细胞、NK-T细胞、记忆CD8阳性细胞)的增殖、树突细胞的活化等中的活性。但是，非专利文献3中，没有包含关于IL-15和IL-15Rαsushi结构域与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
非专利文献4中记载了：通过转染小鼠的IL-15和IL-15Rα的分泌型融合蛋白，CD8阳性T细胞的存活能力和增殖能力得到提高。但是，非专利文献4中，没有包含关于IL-15与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
非专利文献5中记载了单链IL-27(用柔性接头连接p28和EBI3而成)和其对炎症性肠病(IBD)的治疗的效果。但是，非专利文献5中，没有包含关于CAR-T细胞、以及关于单链IL-27与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
专利文献2中公开了表达重组IL-7、重组IL-15或这些的组合的的T细胞，记载了这样的细胞因子的表达使T细胞的存活提高。但是，专利文献2中，没有包含关于CAR-T细胞、以及关于上述特定的细胞因子与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
专利文献3中记载了含有编码IL-2、IL-4、IL-7、IL-15或这些的组合的表达构建体和CAR构建体的经改造的自然杀伤T细胞。但是，专利文献3中，没有包含关于上述特定的细胞因子与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
专利文献4中记载了表达IL-7、IL-15(IL-15/IL-15Rα融合蛋白)、IL-21之类的膜结合型细胞因子的CAR-T细胞。但是，专利文献4中，没有包含关于上述特定的细胞因子与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
专利文献5中记载了表达IL-15的、靶向CD19的CAR-T细胞。但是，专利文献5中，没有包含关于IL-15与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
非专利文献6中记载了表达IL-15和/或IL-21的、靶向GPC3的CAR-T细胞。但是，专利文献6中，没有包含关于上述特定的细胞因子与CCL19等趋化因子的组合的具体记载。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2016/056228
专利文献2：WO2007/037780
专利文献3：WO2013/040371
专利文献4：WO2014/186469
专利文献5：US2013/0071414
非专利文献
非专利文献1：Adachi et al.,Nature Biotechnology,VOL 36,No 4,346-353
非专利文献2：Hurton et al.,Proc Natl Acad Sci.,113(48),E7788-97,2016
非专利文献3：Mortier et al.,J Biol Chem.281(3),1612-9,2006
非专利文献4：Rowley et al.,Eur J Immunol.39(2),491-506,2009
非专利文献5：Sasaoka et al.,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol300:G568-576
非专利文献6：Barta et al.,Armored Glypican-3-Specific CAR T cells forthe Immunotherapy of Hepatocellular Carcinoma,ASGCT 2018,May 2018,abstract
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的课题在于，提供与单独表达CAR的(不表达细胞因子和/或趋化因子的)免疫细胞(CAR-T细胞等)相比抗肿瘤活性更高的免疫细胞(CAR-T细胞等)。
用于解决问题的方法
在生物体内存在至少数百种能够控制T细胞等免疫细胞的功能的分子。本发明的发明人发现，通过在CAR-T细胞中使作为细胞因子的选自由白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)和白细胞介素-27(IL-27)组成的组中的至少一种与作为趋化因子的CC趋化因子配体19(CCL19)组合且与CAR一起表达，从而与单独表达CAR时相比抗肿瘤活性得到增强、尤其是CAR-T细胞的持续性和增殖性得到提高，从而完成了本发明。
需要说明的是，IL-15、IL-18、IL-27和CCL19是在存在于生物体内的天然的(未导入外源性基因的)T细胞中不表达的细胞因子和趋化因子。IL-21是在存在于生物体内的天然的T细胞(例如NKT细胞、CD4阳性T细胞)中表达的细胞因子。本发明中，表达上述指定的细胞因子和趋化因子是指：通过向T细胞中导入外源性的用于表达上述指定的细胞因子和趋化因子的基因，从而以高于存在于生物体内的天然的T细胞的水平表达上述指定的细胞因子和趋化因子。
另外，将上述指定的白细胞介素和趋化因子与CAR一起基因导入到T细胞中并表达的实施方式能够扩展为将它们基因导入到T细胞以外的免疫细胞、例如NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等中并表达的实施方式。
本发明至少包含下述发明。
[1]
一种T细胞，其表达：
(1)嵌合抗原受体(CAR)；
(2)选自由白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)和白细胞介素-27(IL-27)组成的组中的至少一种；以及
(3)CC趋化因子配体19(CCL19)。
[2]
根据项1所述的T细胞，其中，上述(2)为IL-15。
[3]
根据项2所述的T细胞，其中，上述IL-15为处于与IL-15Rα连接而形成了融合蛋白的状态的IL-15。
[4]
根据项3所述的T细胞，其中，上述融合蛋白为IL-15LSP与IL-15连接而成的融合蛋白(IL15LSP)、IL-15Rα胞外结构域与IL-15连接而成的融合蛋白(sIL15RA)、IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
[5]
根据项3所述的T细胞，其中，上述融合蛋白为IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
[6]
一种药物，其含有项1所述的T细胞。
[7]
根据项6所述的药物，其为癌症的治疗剂。
[8]
根据项7所述的药物，其中，上述癌症为黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
[9]
一种表达载体，其包含：
(1)编码CAR的核酸；
(2)编码选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种的核酸；以及
(3)编码CCL19的核酸。
[10]
根据项9所述的表达载体，其中，上述(2)为IL-15。
[11]
根据项10所述的表达载体，其中，上述IL-15为处于与IL-15Rα连接而形成了融合蛋白的状态的IL-15。
[12]
根据项11所述的表达载体，其中，上述融合蛋白为IL-15LSP与IL-15连接而成的融合蛋白(IL15LSP)、IL-15Rα胞外结构域与IL-15连接而成的融合蛋白(sIL15RA)、IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
[13]
根据项11所述的表达载体，其中，上述融合蛋白为IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
[14]
一种CAR-T细胞的制造方法，其包括将项9所述的表达载体导入到T细胞中的步骤。
[15]
一种癌症的治疗方法，其包括将项1所述的T细胞给药于需要进行癌症的治疗的对象的步骤。
[16]
根据项15所述的治疗方法，其中，上述癌症为黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
[17]
根据项1所述的T细胞，其作为癌症的治疗的有效成分使用。
[18]
根据项17所述的T细胞，其中，上述癌症为黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
本说明书中，有时将上述[1]的T细胞称为“本发明的T细胞”、将上述[6]的药物称为“本发明的药物”、将上述[9]的表达载体称为“本发明的表达载体”、将上述[14]的CAR-T细胞的制造方法称为“本发明的制造方法”。
若为本领域技术人员，则能够整体参考本说明书所公开的内容而对上述的发明方式(范畴)进行适当变换。上述[6]的本发明的药物例如能够变换为“一种癌症的治疗方法，其包括将表达(1)CAR、(2)选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种以及(3)CCL19的T细胞给药于需要进行癌症的治疗的对象的步骤”、“一种表达(1)CAR、(2)选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种以及(3)CCL19的T细胞，其作为癌症的治疗的有效成分使用”、“表达(1)CAR、(2)选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种以及(3)CCL19的T细胞在制造用于治疗癌症的药物中的应用”等。
若为本领域技术人员，则能够整体参考本说明书所公开的内容，将通过使指定的细胞因子和趋化因子与CAR一起在T细胞中表达而得到的本发明的T细胞、以及作为其关联实施方式的本发明的药物、本发明的表达载体、本发明的制造方法等各发明适当变换为使指定的细胞因子和趋化因子与CAR一起在T细胞以外的免疫细胞(NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等)中表达而得到的T细胞以外的免疫细胞、以及作为其关联实施方式的药物、表达载体、制造方法等各发明。
发明效果
本发明的T细胞通过表达指定的细胞因子(IL-15等)和趋化因子(CCL19)而提高了T细胞的持续性和增殖性，因此能够增强CAR所带来的抗肿瘤活性(减少残存肿瘤细胞数、提高IFNγ的产生量、提高宿主免疫细胞(T细胞、树突细胞、NK细胞等)向肿瘤局部的迁移和蓄积)。另外，通过含有这样的本发明的T细胞的药物，能够提高癌症的治疗效果。尤其是，本发明的T细胞有参与NK细胞的活化的可能性，由此，具有在对NK细胞敏感的肿瘤(黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等)的治疗中有用的可能性。此外，可期待通过增强抗肿瘤活性来减少给药细胞数、由此减少CRS(Cytokine Release Syndorome，细胞因子释放综合征)等副作用、降低制造成本的效果。
本发明的指定的细胞因子和趋化因子的组合还发挥如下作用效果：在与CAR基因一起基因导入到全部免疫细胞中、即不仅导入到上述T细胞中还导入到NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等中并进行表达时，可得到抗肿瘤活性高的各种CAR表达免疫细胞。
附图说明
图1示出在实施例(试验例1)中对下述各T细胞通过流式细胞术分析CAR(横轴)和CD8(纵轴)的表达水平的结果。图中的数值(％)表示各分区的细胞群相对于全部细胞的百分比。“转导(-)”为关于比较例1的转导(-)T细胞(未进行转导的T细胞)的结果，“conv.CAR-T”为关于比较例2的conv.CAR-T细胞(抗人CD20CAR-T细胞)的结果，“15LSPx 19CAR-T”为关于实施例1-1的IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞(IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞)的结果，“s15RAx 19CAR-T”为关于实施例1-2的sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(sIL15RA_CCL19_抗人CD20CAR-T细胞)的结果，“mb15RAx 19CAR-T”为关于实施例1-3的mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(mbIL15RA_CCL19_抗人CD20CAR-T细胞)的结果，“sushi15 x 19CAR-T”为关于实施例1-4的sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(sushiIL15_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞)的结果，“18x 19CAR-T”为关于实施例2的IL-18×CCL19CAR-T细胞(IL18_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞)的结果，“21x19CAR-T”为关于实施例3的IL-21×CCL19 CAR-T细胞(IL21_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞)的结果，“sc27 x 19CAR-T”为关于实施例4的scIL27×CCL19 CAR-T细胞(scIL27_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞)的结果。(下述图2～6中也同样。)
图2示出在实施例(试验例1)中对上述各T细胞通过ELISA测定(A)IL-15、(B)IL-18、(C)IL-21、(D)IL-27和(E)CCL19在培养上清中的分泌量的结果。
图3示出在实施例(试验例2)中在与人CD20表达P815肥大细胞瘤(hCD20/P815)共培养而进行活化刺激起3天后、5天后和7天后的上述各T细胞的活细胞数的测定结果。
图4示出在实施例(试验例2)中进行上述各T细胞的利用CytoTell试剂的染色强度的直方图分析的结果。直方图的峰表示细胞分裂所产生的代数，饼状图中的数值(％)表示Thy1.2阳性T细胞群中的设门(gating)的级分(1表示未分裂的第一代，2表示分裂1次后的第二代，3表示分裂2次后的第三代，4表示分裂3次后的第四代，＞5表示分裂4次以上的第五代以后。)的百分比。
图5示出在实施例(试验例3)中通过流式细胞术测定上述各T细胞对(A)靶肿瘤细胞(hCD20/P815)和(B)对照肿瘤细胞(P815)的肿瘤细胞毒活性的结果。
图6示出在实施例(试验例3)中测定与(A)靶肿瘤细胞(hCD20/P815)和(B)对照肿瘤细胞(P815)进行共培养时的、上述各T细胞的培养上清中的IFNγ的浓度的结果。
图7示出序列号1(抗人CD20 CAR DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图8示出序列号3(MCS DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图9示出序列号4(IL15LSP_F2A_CCL19 DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图10示出序列号6(sIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图11示出序列号8(mbIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图12示出序列号10(sushiIL15_F2A_CCL19 DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图13示出序列号12(IL-18_F2A_CCL19 DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图14示出序列号14(IL-21_F2A_CCL19 DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图15示出序列号16(scIL27_F2A_CCL19 DNA片段)的碱基序列中所含的基因等的配置。
图16示出在实施例(试验例4)中测定对小鼠黑色素瘤肿瘤移植模型的抗肿瘤活性(肿瘤体积的变化)的结果。
图17示出在实施例(试验例4)中测定对小鼠大肠癌肿瘤模型的抗肿瘤活性(肿瘤体积的变化)的结果。
具体实施方式
本说明书中，“转染”是指将任意物质导入到细胞内部。细胞内部至少包括细胞质内和核内。
“培养(Culture)”或“进行培养”是指：在组织外或体外、例如培养皿、培养盘、烧瓶或培养槽(罐)中使细胞维持、增殖和/或分化。
“多能性(pluripotency)”表示：能够分化成各种具有不同的形态、功能的组织、细胞，也能够分化成三胚层的任一系统的细胞的能力。“多能性(pluripotency)”不能分化为胚盘，因此不具有形成个体的能力，从这一点来说，与能够分化成包括胚盘在内的生物体的全部组织的“全能性(totipotency)”不同。
“多潜能性(multipotency)”表示：能够分化为有限数量的多个系统的细胞的能力。例如间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞是多潜能干细胞(multipotent)，不是多能干细胞(pluripotent)。
作为“干细胞(stem cell)”，可列举例如多能干细胞(pluripotent stem cell)。
本发明中能够使用的“多能干细胞(pluripotent stem cell)”是指：具有能够分化成生物体的各种具有不同形态、功能的组织、细胞且也能够分化成三胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的任一系统的细胞的能力的干细胞。其没有特别限定，可列举例如胚胎干细胞(ESC)、通过核移植得到的克隆胚来源的胚胎干细胞、精子干细胞、胚胎生殖细胞、诱导多能干细胞(本说明书中有时也称为“iPSC”)等。
另外，本发明中能够使用的“多潜能干细胞(multipotent stemcell)”是指：具有能够分化为有限数量的多个系统的细胞的能力的干细胞。作为本发明中能够使用的“多潜能干细胞(multipotent stem cell)”，可列举例如：牙髓干细胞、口腔粘膜来源的干细胞、毛囊干细胞、培养成纤维细胞、骨髓干细胞来源的体干细胞等。优选的多能干细胞(pluripotent stem cell)为ESC和iPSC。
“诱导多能干细胞(iPSC)”是指：向哺乳动物体细胞或未分化干细胞导入特定的因子(核重编程因子)进行重编程而得到的细胞。目前，“诱导多能干细胞”包括各种类型，除了山中等向小鼠成纤维细胞导入Oct3/4·Sox2·Klf4·c-Myc这4个因子而建立的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)以外，还可以使用将相同的4个因子导入到人成纤维细胞中而建立的人细胞来源的iPSC(Takahashi K,Yamanaka S.,etal.Cell,(2007)131:861-872.)、在上述4个因子导入后以Nanog的表达为指标进行筛选而建立的Nanog-iPS细胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、通过不含c-Myc的方法制作的iPS细胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,etal.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106)、通过无病毒法导入6个因子而建立的iPS细胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011May；8(5):409-12,Okita K et al.StemCells.31(3):458-66.)。另外，还可以使用Thomson等制作的导入了OCT3/4·SOX2·NANOG·LIN28这4个因子而建立的诱导多能干细胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.)、Daley等制作的诱导多能干细胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451:141-146)、樱田等制作的诱导多能干细胞(日本特开2008-307007号)等。此外，还可以使用已公开的所有论文(例如Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；、Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)或专利(例如日本特开2008-307007号、日本特开2008-283972号、US2008-2336610、US2009-047263、WO2007-069666、WO2008-118220、WO2008-124133、WO2008-151058、WO2009-006930、WO2009-006997、WO2009-007852)中记载的本领域中公知的诱导多能干细胞中的任一种。
作为“诱导多能干细胞”，能够利用NIH、理研(理化学研究所)、京都大学等建立的各种iPSC株。例如，在人iPSC株的情况下，可列举理研的HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学的253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株等。或者，可以使用京都大学、Cellular Dynamics International等所提供的临床级别的细胞株、以及使用这些细胞株制作的研究用和临床用的细胞株等。
作为“胚胎干细胞(ESC)”，在小鼠ESC的情况下，能够利用inGenious targetinglaboratory公司、理研(理化学研究所)等建立的各种小鼠ESC株；在人ESC的情况下，能够利用NIH、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ESC株。例如，作为人ESC细胞株，可利用NIH的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等、WisCell Research的H1株、H9株、理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。或者，可以使用临床级别的细胞株以及使用这些细胞株制作的研究用和临床用的细胞株等。
“包含(comprise(s)或comprising)～”是指：虽然表示包括连接在该短语之后的要素、但不限于此。因此，表示包括连接在该短语之后的要素、但不表示排除其它的任意要素。
“由～构成(consist(s)of或consisting of)”是指：包括连接在该短语之后的全部要素、并且仅限于这些。因此，“由～构成”这一短语表示：所列举的要素为需要的或必须的，实质上不存在其它要素。“本质上由～构成”表示：包括连接在该短语之后的任意要素、并且该要素被限定为不影响本发明中规定的活性或作用的其它要素。因此，“本质上由～构成”这一短语表示：所列举的要素为需要的或必须的，其它要素为任意选择，根据它们对所列举的要素的活性或作用是否有影响，有时存在也有时不存在。
就本发明的指定的细胞因子和趋化因子的组合而言，通过与CAR基因一起基因导入到免疫细胞、尤其是承担获得性免疫中的细胞性免疫的T细胞、承担自然免疫的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等中并进行表达，由此能够提供抗肿瘤活性高的CAR表达免疫细胞。换言之，本发明的指定的细胞因子和趋化因子的组合的基因导入和表达能够对分别经CAR的基因导入和表达的T细胞(CAR-T细胞)、NK细胞(CAR-NK细胞)、单核细胞(CAR-单核细胞)、巨噬细胞(CAR-巨噬细胞)、树突细胞(CAR-树突细胞)等赋予进一步的技术特征。
“免疫细胞”只要是具有能够通过某种作用机制抑制癌细胞等靶细胞(病原细胞)的能力的细胞(所谓的免疫效应细胞)就没有特别限制，可列举例如承担获得性免疫中的细胞性免疫的T细胞、承担自然免疫的NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等。一个优选的实施方式中，免疫细胞可以是T细胞。另一方面，另一优选的实施方式中，免疫细胞可以是NK细胞、巨噬细胞、树突细胞等承担自然免疫的细胞。对于T细胞而言，即使在HLA型一致的情况下，通过同种异系(异体)移植也有一定程度的引起GVHD的风险，与此相对地，通常认为异体NK细胞等不会引起GVHD。因此，如果准备各种HLA型的异体免疫细胞，则能够现成(off-the-shelf)使用。CAR-NK细胞记载于例如US2016/0096892、Mol Ther.25(8):1769-1781(2017)等中，CAR-树突细胞、CAR-巨噬细胞等记载于例如WO2017/019848、eLIFE.2018e36688等中。
以下，通过基于采用T细胞作为免疫细胞的代表例时的实施方式的记载来说明本发明。但是，本发明并非仅限于免疫细胞为T细胞的实施方式，免疫细胞为NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突细胞等的实施方式也包括在本发明中。在以下的记载中，“(CAR-)T细胞”也可以适当替换成“(CAR-)NK细胞”、“(CAR-)单核细胞”、“(CAR-)巨噬细胞”、“(CAR-)树突细胞”等。
以下对本发明的T细胞进行详细说明。
本发明的T细胞表达(1)CAR、(2)选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种、以及(3)CCL19。
本发明中的T细胞与通常或公知的表达CAR的T细胞同样地可以为αβT细胞、γδT细胞、CD8+T细胞、CD4+T细胞、肿瘤浸润T细胞、记忆T细胞、初始T细胞、NKT细胞等中的任意一种T细胞。
T细胞可以为从血液、骨髓液等体液、脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或浸润于原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌组织的免疫细胞中分离、纯化而得的T细胞。另外，T细胞也可以为在适宜的条件下培养诱导多能干细胞(iPS细胞)、胚胎干细胞(ES细胞)、或其它干细胞、前体细胞等而诱导分化成T细胞的T细胞。
T细胞可以是人来源的细胞，也可以是人以外的哺乳类(非人哺乳类)来源的细胞。作为非人哺乳类，可列举例如小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠、兔、狗、猫、猪、牛、马、绵羊、猴。
(1)CAR
本发明的T细胞所表达的CAR基本上与通常或公知的CAR同样地，通过将(i)识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体、(ii)跨膜区和(iii)诱导T细胞的活化的信号传递区各部位的肽根据需要介由间隔物连接而构成。
(i)识别癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体典型地为单链可变区片段(scFv)，该单链可变区片段由来自与该抗原特异性结合的单克隆抗体的抗原结合部位的轻链可变区和重链可变区、以及将它们连接的接头肽构成。
CAR所靶向的“癌细胞的细胞表面抗原”为在癌细胞和其前体细胞中特异性表达的生物分子、由于细胞的癌变而新观察到表达的生物分子、或与正常细胞相比在癌细胞中表达水平增加的生物分子即可。这样的抗原通常被称为“肿瘤相关抗原”(TAA)，可列举例如BCMA、B7-H3、B7-H6、CD7、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD34、CD38、CD41、CD44、CD56、CD70、CD74、CD97、CD123、CD133、CD138、CD171、CD248、CAIX、CEA、c-Met、CS1(CD319)、CSPG4、CLDN6、CLD18A2、CYP1B1、DNAM-1、GD2、GD3、GM2、GFRα4、GPC3、GPR20、GPRC5D、globoH、Gp100、GPR20、GPRC5D、EGFR、EGFR变体、EpCAM、EGP2、EGP40、FAP、FITC、HER2、HER3、HPV E6、HPV E7、hTERT、IgGκ链、IL-11Ra、IL-13Ra2、KIT、Lewis A、Lewis Y、豆荚蛋白(Legumain)、LMP1、LMP2、Ly6k、LICAM、MAD-CT-1、MAD-CT-2、MAGE-A1、黑色素瘤相关抗原1、MUC1、MUC16、NA-17、NY-BR-1、NY-ESO-1、O-乙酰基-GD2、h5T4、PANX3、PDGRFb、PLAC1、聚唾液酸、PSCA、PSMA、RAGE1、ROR1、sLe、SSEA-4、TARP、TAG-72、TEM7R、Tn抗原、TRAIL受体、TRP2、TSHR、甲胎蛋白、间皮素、叶酸受体α(FRα)、叶酸受体β(FRβ)、FBP、UPK2、VEGF-R2、WT-1，但不限于这些。
(ii)跨膜区是作为用于将CAR固定于T细胞的细胞膜的区域的多肽。作为这样的跨膜区，可列举例如来自BTLA、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、4-1BB(CD137)、CTLA-4、GITR、ICOS、LAG3、OX40、SLAMF4(CD244、2B4)、或者T细胞受体的α或β链的跨膜区。或者，也可以使用具有相对于上述跨膜区的天然氨基酸序列的同源性为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列的变异型跨膜区。本发明的一个实施方式中，作为跨膜区，优选CD8的跨膜区。
在跨膜区可以连接有铰链区，所述铰链区是由任意的氨基酸序列构成的长度为1～100个氨基酸、优选为10～70个氨基酸的肽(寡肽或多肽)。作为这样的铰链区，可列举例如来自CD3、CD8、KIR2DS2、或IgG4、IgD或者其它免疫球蛋白的铰链区。或者，也可以使用具有相对于上述铰链区的天然氨基酸序列的同源性为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列的变异型铰链区。本发明的一个实施方式中，作为铰链区，优选CD8的铰链区。
(iii)诱导T细胞的活化的信号传递区是作为用于在上述单链抗体识别并结合癌细胞的细胞表面抗原时向T细胞内传递信号的区域的多肽。作为这样的信号传递区，可列举例如选自由MHC簇I分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、活化NK细胞受体、Toll样受体、B7-H3、BAFFR、BTLA、BY55(CD160)、CD2、CD3ζ、CD4、CD7、CD8α、CD8β、CD11a、CD11b、CD11c、CD11d、CD18、CD19、CD19a、CD27、CD28、CD29、CD30、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD84、CD96(Tactile)、CD103、4-1BB(CD137)、CDS、CEACAM1、CRTAM、CNAM1(CD226)、DAP10、Fc受体相关γ链、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICOS(CD278)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、ITGA6、ITGAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB1、ITGB2、ITGB7、KIRDS2、Ly9(CD229)、LAT、LFA-1(CD11a/CD18)、LIGHT、LTBR、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PSGL1、SELPLG(CD162)、SEMA4D(CD100)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、SLAMF4(CD244、2B4)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAMF7、SLAMF8(BLAME)、SLP-76、TNFR2、TRANCE/RANKL、VLA1和VLA-6组成的组中的一种或两种以上细胞内区域。或者，也可以使用具有相对于上述信号传递区(细胞内区域)的天然氨基酸序列的同源性为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列的变异型信号传递区(细胞内区域)。本发明的一个实施方式中，信号传递区优选包含CD28、4-1BB和CD3ζ这3种细胞内区域。
在信号传递区包含多个细胞内区域的情况下，各细胞内区域彼此可以介由由2～10个氨基酸构成的接头肽(寡肽或多肽)连接。作为这样的接头肽，例如可列举由甘氨酸-丝氨酸连续序列构成的肽。
单链抗体与跨膜区、以及跨膜区与信号传递区分别可以包含间隔区域，所述间隔区域为由任意的氨基酸序列构成的长度为1～100个氨基酸、优选为10～50个氨基酸的肽(寡肽或多肽)。作为间隔区域，可列举例如由甘氨酸-丝氨酸连续序列构成的肽。
本发明的T细胞所表达的上述CAR的氨基酸序列只要为适合于T细胞的用途、典型地为作为用于治疗癌症的药物的有效成分的功能的氨基酸序列即可。作为针对癌细胞的细胞表面抗原的单链抗体(i)的氨基酸序列，公知有各种氨基酸序列，可以将它们的氨基酸序列信息用于本发明。或者，也可以按照常规方法重新制作期望的针对癌细胞的细胞表面抗原的抗体，确定该新抗体(优选重链和轻链可变区、尤其是CDR)的氨基酸序列并将其信息用于本发明中。另外，作为跨膜区(ii)和T细胞活化信号传递区(iii)各自的氨基酸序列，也公知有人来源和人以外的哺乳动物来源的各种氨基酸序列，在NCBI(National Center forBiotechnology Information；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/guide/)、UniProt(TheUniversal Protein Resource；https://www.uniprot.org)等数据库中也有登记，因此可以将它们的信息用于本发明。
(2)细胞因子
本发明的T细胞所表达的细胞因子为选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种。本发明的T细胞可以表达上述4种细胞因子中的任一种，也可以表达两种以上。
IL-15为具有与T细胞的存活、活化和向记忆T细胞的分化、以及NK细胞的活化等有关的功能的细胞因子。本发明中的“IL-15”这一术语不仅包括天然的全长IL-15蛋白，还在保持本发明的作用效果内的IL-15的功能的范围内包含各种实施形态。即，本发明中的“IL-15”不仅包含由天然IL-15的氨基酸序列构成的蛋白质(多肽)整体，而且还包括其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然IL-15的整体或其一部分的变体，进一步地，还包含天然IL-15的整体或其一部分或它们的变体与其它蛋白质连接而形成融合蛋白的形态(例如，处于与IL-15Rα的整体或其一部分连接而形成了融合蛋白的状态)的情况。本发明中，T细胞“表达IL-15”包括：在不丧失本发明的作用效果的范围内表达上述各种形态的IL-15(具有天然氨基酸序列的蛋白质的整体或其一部分或它们的变体，可以形成或不形成融合蛋白的形态)。
作为IL-15，可列举例如如下所述的4个实施形态。这些均为公知的(参照前述非专利文献2、非专利文献3、非专利文献4和专利文献4等)。但是，本发明中可以使用的IL-15不限于这些具体例，从序列中的信号肽和接头的有无以及它们的种类、各要素的顺序、其它观点出发，还能够使用各种经改造的IL-15(本说明书中有时称为“改造型”IL-15。)。
IL-15的第一实施形态：IL-15LSP/IL-15(本说明书中有时记作“IL15LSP”。)
“IL-15LSP”为由29个氨基酸构成的长链信号肽，在第一实施形态中结合于IL-15的N末端侧。通过表达第一实施形态的IL-15，CAR-T细胞的抗肿瘤活性得到增强。“IL-15LSP”这一术语也不仅包括由天然IL-15LSP的氨基酸序列构成的多肽的整体，还包括其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然IL-15LSP的整体或其一部分的变体。需要说明的是，作为第一实施形态的改造型的一例，可列举将“IL-15LSP”置换为“IL-2SP”(IL-2的信号肽，与IL-15LSP同样地可以为天然蛋白质的整体或其一部分或它们的变体)者。
IL-15的第二实施形态：IL-15/IL-15Rα胞外结构域(本说明书中有时记作“sIL15RA”。)
“IL-15Rα胞外结构域”是指IL-15Rα(白细胞介素15受体α链)中除跨膜结构域和胞内结构域以外的部分。IL-15Rα胞外结构域中包含sushi结构域(在各种结合性蛋白中均可观察到的基序)。“IL-15Rα胞外结构域”这一术语也不仅包括由天然IL-15Rα胞外结构域的氨基酸序列构成的多肽的整体，还包括其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然IL-15Rα胞外结构域的整体或其一部分的变体。第二实施形态中，IL-15Rα胞外结构域通常介由接头(例如由26个氨基酸构成的甘氨酸-丝氨酸接头)结合于IL-15的C末端侧。另外，第二实施形态中，通常在IL-15的N末端侧结合有IL-2SP(IL-2信号肽，可以为天然蛋白质的整体或其一部分或它们的变体)来代替IL-15LSP。第二实施形态为分泌型，成为与IL-15Rβ(与白细胞介素2受体所共有的白细胞介素15受体β链)和γc(作为白细胞介素2、4、7、9、15、21等受体所共有的共有γ链)强烈结合的激动剂。
IL-15的第三实施形态：IL-15/全长IL-15Rα(本说明书中有时记作“mbIL15RA”。)
“全长IL-15Rα”包含IL-15Rα的胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域这两者，第三实施形态中，通常介由接头(例如由20个氨基酸构成的甘氨酸-丝氨酸接头)结合于IL-15的C末端侧。“全长IL-15Rα”这一术语不仅包括由天然的全长IL-15Rα的氨基酸序列构成的蛋白质(多肽)的整体，而且还包括相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然的全长IL-15Rα的变体。另外，第三实施形态中，通常在IL-15的N末端侧结合有IL-2SP(可以为天然蛋白质的整体或其一部分或它们的变体)来代替IL-15LSP。第三实施形态为膜结合型，通过使其表达，CAR-T细胞的抗肿瘤活性得到增强。
IL-15的第四实施形态：IL-15Rαsushi/IL-15(本说明书中有时记作“sushiIL15”。)
第四实施形态中，包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα通常介由接头(例如由20个氨基酸构成的接头)结合于IL-15的N末端侧。“IL-15Rαsushi”这一术语也不仅包括由天然IL-15Rαsushi的氨基酸序列构成的多肽的整体，而且包括其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然IL-15Rαsushi的整体或其一部分的变体。第四实施形态为分泌型。
本发明中，从后述实施例(试验例)所示的细胞的持续性和增殖性的观点出发，作为IL-15，优选处于与IL-15Rα(具有天然氨基酸序列的蛋白质的整体或其一部分或它们的变体)的融合蛋白的形态的IL-15(具有天然氨基酸序列的蛋白质的整体或其一部分或它们的变体)。例如，优选上述第二、第三或第四实施形态或它们的改造型，更优选上述第三和第四实施形态或它们的改造型。
IL-18为具有与T细胞的活化、NK细胞的活化和树突细胞的活化等有关的功能的细胞因子。本发明中的“IL-18”这一术语不仅包括天然的全长IL-18蛋白，还在保持本发明的作用效果中的IL-18的功能的范围内包含各种实施形态。即，本发明中的“IL-18”不仅包含由天然IL-18的氨基酸序列构成的蛋白质(多肽)的全长，还包括其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然IL-18的整体或其一部分的变体，进一步地，还包含天然IL-18的整体或其一部分与其它蛋白连接而形成融合蛋白的形态的情况。本发明中，T细胞“表达IL-18”包含：在不丧失本发明的作用效果的范围内表达上述各种形态的IL-18(具有天然氨基酸序列的蛋白质的整体或其一部分或它们的变体，可以形成或不形成融合蛋白的形态)。
IL-21为具有与CD8+T细胞的功能和向记忆T细胞的分化、以及NK细胞的存活等相关的功能的细胞因子。本发明中的“IL-21”这一术语不仅包含天然的全长IL-21蛋白，还在保持本发明的作用效果中的IL-21的功能的范围内包含各种实施形态。即，本发明中的“IL-21”不仅包含由天然IL-21的氨基酸序列构成的蛋白质(多肽)的全长，而且还包含其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然IL-21的整体或其一部分的变体，进一步地，还包含天然IL-21的整体或其一部分与其它蛋白连接而形成融合蛋白的形态的情况。本发明中，T细胞“表达IL-21”包含：在不丧失本发明的作用效果的范围内表达上述各种形态的IL-21(具有天然氨基酸序列的蛋白质的整体或其一部分或它们的变体，可以形成或不形成融合蛋白的形态)。
IL-27为具有与T细胞的存活、NK细胞的活化、肿瘤增殖和血管新生的抑制等有关的功能的细胞因子。本发明中的“IL-27”这一术语不仅包含天然的全长IL-27蛋白，而且在保持本发明的作用效果中的IL-27的功能的范围内包含各种实施形态。即，本发明中的“IL-27”不仅包含由天然IL-27的氨基酸序列构成的蛋白质(多肽)的全长，而且包含其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然IL-27的整体或其一部分的变体，进一步地，还包含天然IL-27的整体或其一部分与其它蛋白连接而形成融合蛋白的形态的情况。本发明中，T细胞“表达IL-27”包含：在不丧失本发明的作用效果的范围内表达上述各种形态的IL-27(具有天然氨基酸序列的蛋白质的整体或其一部分或它们的变体，可以形成或不形成融合蛋白的形态)。
作为IL-27，可列举例如将构成IL-27的2个亚单元p28和EBI3(爱泼斯坦-巴尔病毒诱导基因3)介由接头、例如(G4S)3之类的由20～30个氨基酸构成的接头(参照前述非专利文献5等)、由GSTSGSGKPGSGEGSTKG构成的接头(J Immunol.183,6217-26(2009))连接而成的融合蛋白(单链蛋白)。“p28”和“EBI3”这一术语也分别包含具有天然氨基酸序列的多肽的整体或其一部分或它们的变体。
本发明的T细胞所表达的上述细胞因子的氨基酸序列可以在根据本发明的T细胞(CAR-T细胞)的用途、典型地为作为用于治疗癌症的药物的有效成分的功能、并且考虑对包括CAR-T细胞的持续性和增殖性的提高在内的、CAR-T细胞所带来的抗肿瘤活性的增强的效果的前提下合适的氨基酸序列。人来源和人以外的哺乳动物(例如小鼠)来源的天然的IL-15、IL-18、IL-21和IL-27以及IL-15Rα的氨基酸序列是公知的，在NCBI、UniProt等数据库中也有登记，因此可以将其信息用于本发明。作为一例，将登记为UniProtKB-P40933的人的天然IL-15(包含信号肽和前肽部分的全长)的氨基酸序列作为序列号18示出，将登记为UniProtKB-Q13261的人的天然IL-15Rα(包含信号肽、sushi结构域、胞外结构域等的全长)的氨基酸序列作为序列号19示出。在后述的在指定的序列号的氨基酸序列中将小鼠的天然氨基酸序列置换为人的天然氨基酸序列的实施方式中，可以参照序列号18和19所含的对应部分的氨基酸序列。另外，作为IL-15、IL-18、IL-21和IL-27以及IL-15Rα各自的变体、与其它蛋白的融合蛋白以及它们的改造型也是公知的，也可以将它们的氨基酸序列的信息用于本发明。
就IL-15、IL-18、IL-21和IL-27各自的变体而言，作为整体或部分区域(结构域)，可列举例如下述变体：具有以在例如如下那样置换信号肽时除该信号肽以外的区域的同源性计相对于各自的人或人以外的哺乳动物来源的天然氨基酸序列为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的同源性的氨基酸序列。作为相对于某物种来源的天然氨基酸序列具有上述范围内的同源性的变体，有时也相当于(实质上包含)另一物种来源的天然氨基酸序列。另外，IL-15、IL-18、IL-21和IL-27可以为将序列中的信号肽置换为公知的信号肽而成的肽。在本发明的一个方面中，可以在序列号4：IL15LSP_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列号6：sIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列号8：mbIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列号10：sushiIL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)、序列号12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)、序列号14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)、序列号16：scIL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9)各自的碱基序列所表达的蛋白质(多肽)的氨基酸序列中或者在序列号5：包含IL15LSP的融合蛋白、序列号7：包含sIL15RA的融合蛋白、序列号9：包含mbIL15RA的融合蛋白、序列号11：包含sushiIL15的融合蛋白、序列号13：包含IL-18的融合蛋白、序列号15：包含IL-21的融合蛋白、序列号17：包含scIL27的融合蛋白各自的氨基酸序列中，将小鼠的天然的IL-15、IL-18、IL-21或IL-27的氨基酸序列置换为具有上述同源性的变体的氨基酸序列或实质上相当于这样的变体的人的天然的IL-15、IL-18、IL-21或IL-27的氨基酸序列或它们的进一步的变体。
作为IL-15Rα胞外结构域、全长IL-15Rα和IL-15Rαsushi各自的变体，可列举：具有相对于各自的人或人以外的哺乳动物来源的天然氨基酸序列的同源性为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列的变体。在本发明的一个方面中，可以在序列号4：IL15LSP_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列号6：sIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列号8：mbIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列号10：sushiIL15_F2A_CCL19DNA片段(DNA片段#6)各自的碱基序列所表达的蛋白质(多肽)的氨基酸序列中或者在序列号5：包含IL15LSP的融合蛋白、序列号7：包含sIL15RA的融合蛋白、序列号9：包含mbIL15RA的融合蛋白、序列号11：包含sushiIL15的融合蛋白各自的氨基酸序列中，将小鼠的天然的IL-15Rα胞外结构域、全长IL-15Rα或IL-15Rαsushi的氨基酸序列置换为具有上述同源性的变体的氨基酸序列或实质上相当于这样的变体的人的天然的IL-15Rα胞外结构域、全长IL-15Rα或IL-15Rαsushi的氨基酸序列或它们的进一步的变体。
IL-15、IL-18、IL-21和IL-27优选来源于与本发明的T细胞的制作中使用的T细胞(该T细胞所具有的IL-15、IL-18、IL-21和IL-27的受体)相同种类的、人或人以外的哺乳动物(例如小鼠)。关于IL-15、IL-18、IL-21和IL-27各自的融合蛋白所含的IL-15、IL-18、IL-21和IL-27以外的部位(例如IL-15Rα)，也优选来源于与本发明的T细胞的制作中使用的T细胞相同种类的、人或人以外的哺乳动物。在本发明的一个方面中，可以在序列号4：IL15LSP_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列号6：sIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列号8：mbIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列号10：sushiIL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)、序列号12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)、序列号14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)、序列号16：scIL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9)各自的碱基序列所表达的蛋白质(多肽)的氨基酸序列中或者在序列号5：包含IL15LSP的融合蛋白、序列号7：包含sIL15RA的融合蛋白、序列号9：包含mbIL15RA的融合蛋白、序列号11：包含sushiIL15的融合蛋白、序列号13：包含IL-18的融合蛋白、序列号15：包含IL-21的融合蛋白、序列号17：包含scIL27的融合蛋白各自的氨基酸序列中，将小鼠的天然的IL-15、IL-18、IL-21或IL-27的氨基酸序列或IL-15Rα胞外结构域、全长IL-15Rα或IL-15Rαsushi的氨基酸序列置换为各自的人的天然氨基酸序列。
(3)趋化因子
本发明的T细胞所表达的趋化因子为CCL19。CCL19主要由淋巴结的树突细胞、巨噬细胞产生，具有在作为其受体的CCR7介导下引发T细胞、B细胞和成熟树突细胞的迁移的功能。本发明中的“CCL19”不仅包含由天然CCL19的氨基酸序列构成的蛋白质(多肽)的全长，而且还包含其一部分(功能性的部分多肽)、相对于天然氨基酸序列(优选以具有后述那样的同源性的范围)缺失、置换或添加一个或两个以上氨基酸序列而成的天然CCL19的全长或其一部分的变体。
本发明的T细胞所表达的上述趋化因子的氨基酸序列可以在根据本发明的T细胞(CAR)的用途、典型地为作为用于治疗癌症的药物的有效成分的功能、并且考虑对包括CAR-T细胞的持续性和增殖性的提高在内的、CAR-T细胞所带来的抗肿瘤活性的增强的效果的前提下合适的氨基酸序列。人来源和人以外的哺乳动物(例如小鼠)来源的天然CCL19的氨基酸序列是公知的，在NCBI、UniProt等数据库中也有登记，因此可以将其信息用于本发明。另外，也可以将作为CCL19的变体而公知的氨基酸序列的信息用于本发明。
关于CCL19的变体，可列举例如：作为整体或部分区域，具有相对于人或人以外的哺乳动物来源的天然CCL19的氨基酸序列的同源性为80％以上、85％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上或99％以上的氨基酸序列的变体。在本发明的一个方面中，可以在序列号4：IL15LSP_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)、序列号6：sIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)、序列号8：mbIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)、序列号10：sushiIL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)、序列号12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)、序列号14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)、序列号16：scIL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9)各自的碱基序列所表达的蛋白质(多肽)的氨基酸序列中，将小鼠的天然CCL19的氨基酸序列置换为具有上述同源性的变体的氨基酸序列或实质上相当于这样的变体的人的天然CCL19的氨基酸序列或其进一步的变体。
CCL19优选来源于与本发明的T细胞的制作中使用的T细胞(该T细胞所具有的CCL19的受体)相同种类的、人或人以外的哺乳动物(例如小鼠)的CCL19或其变体。
以下对本发明的药物进行详细说明。
本发明的药物含有上述本发明的T细胞，可以根据需要进一步含有其它成分。若为本领域技术人员，则能够在考虑用途(治疗对象)、剂型的前提下使用本发明的T细胞适宜地制备本发明的药物。
本发明的药物是主要以与本发明的T细胞表达的CAR所靶向的癌细胞的细胞表面抗原(癌特异性抗原)对应的癌症为治疗对象的药物(抗癌剂)。因此，只要癌组织中包含表达CAR所靶向的抗原的癌细胞、利用本发明的T细胞可观察到一定水平的治疗效果，则本发明的药物所针对的癌症的种类就没有特别限定。作为本发明的药物所针对的癌症，可列举例如腺癌、鳞癌、腺鳞癌、未分化癌、大细胞癌、小细胞癌、皮肤癌(例如，黑色素瘤、默克尔细胞癌)、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、阴道癌、颈部癌、头颈癌、子宫癌、宫颈癌、肝癌、肾癌、胰腺癌、脾癌、肺癌、非小细胞肺癌、气管癌、支气管癌、结肠癌、直肠癌、小肠癌、大肠癌、胃癌、食管癌、胆嚢癌、睾丸癌、卵巢癌、输卵管癌、鼻咽癌等癌症；骨组织、软骨组织、脂肪组织、肌肉组织、血管组织和造血组织的癌症；软骨肉瘤、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、恶性血管内皮瘤、恶性神经鞘瘤、骨肉瘤、软组织肉瘤等肉瘤；肝母细胞瘤、髄母细胞瘤、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、胰母细胞瘤、胸膜肺母细胞瘤、视网膜母细胞瘤等母细胞瘤；胚细胞肿瘤；淋巴瘤；白血病、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤。优选对NK细胞敏感的肿瘤(黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病等)。更优选列举黑色素瘤、大肠癌、肾癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、白血病。
作为本发明的药物可含有的T细胞以外的成分，可列举例如药学上可接受的添加剂，更具体而言，可列举生理盐水、缓冲生理盐水、细胞培养用培养基、葡萄糖、注射用水、甘油、乙醇、稳定剂、增溶剂、表面活性剂、缓冲剂、防腐剂、等渗剂、填充剂、润滑剂等。
本发明的药物可以通过与公知的表达CAR的T细胞同样的方法给药于需要进行癌症的治疗的对象(癌症患者、患癌动物等)来使用。作为给药方法，可列举例如向肿瘤内、静脉内、动脉内、肌肉内、皮下、腹腔内等注射。
本发明的药物中所含的本发明的T细胞的量可根据用途、剂型和目标治疗效果等、并且考虑例如癌症的种类、位置、严重程度、接受治疗的对象的年龄、体重和状态等而适当地进行调节。例如，本发明的药物可以以在1次给药中给药通常1×104～1×1010个、优选1×105～1×109个、更优选5×106～5×108个本发明的T细胞的方式来制剂化。
本发明的药物的给药间隔没有特别限定，可以考虑每1次所给药的本发明的T细胞的量等而适当调整，例如，可以1天4次、3次、2次或1次、每隔1天、每隔2天、每隔3天、每隔4天、每隔5天、每周1次、每隔7天、每隔8天、每隔9天、每周2次、每月1次或每月2次地独立给药。
本发明的药物(抗癌剂)可以与公知的抗癌剂组合使用。作为抗癌剂，可列举例如环磷酰胺、苯达莫司汀、异环磷酰胺、达卡巴嗪等烷化剂；喷司他丁、氟达拉滨、克拉屈滨、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、依诺他滨等代谢拮抗剂；利妥昔单抗、西妥昔单抗、曲妥单抗等分子靶向药；伊马替尼、吉非替尼、厄洛替尼、阿法替尼、达沙替尼、舒尼替尼、曲美替尼等激酶抑制剂；硼替佐米等蛋白酶体抑制剂；环孢菌素、他克莫司等钙调神经磷酸酶抑制剂；伊达比星、多柔比星、丝裂霉素C等抗癌性抗生素；依立替康、依托泊苷等植物生物碱；顺铂、奥沙利铂、卡铂等铂制剂；他莫昔芬、比卡鲁胺等激素疗法剂；干扰素、纳武利尤单抗、帕博利珠单抗等免疫调节剂。
在将本发明的药物与其它抗癌剂组合使用的情况下，可以为(a)在使用其它抗癌剂后使用本发明的药物、(b)同时使用本发明的药物和其它抗癌剂、(c)使用本发明的药物后使用其它抗癌剂中的任一方式。在将本发明的药物与其它抗癌剂组合使用的情况下，可期待如下效果：癌症的治疗效果进一步提高，并且减少本发明的药物和/或其它抗癌剂各自的给药次数或给药量、从而能够减少各抗癌剂所带来的副作用。
以下对本发明的表达载体进行详细说明。
本发明的表达载体包含(1)编码CAR的核酸、(2)编码选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种的核酸、以及(3)编码CCL19的核酸。
本发明中，表达载体“包含编码IL-15的核酸”不仅是指包含编码天然的全长IL-15蛋白的核酸，而且包含形成了上述各种实施形态的IL-15。表达载体“包含编码IL-18的核酸”、“包含编码IL-21的核酸”、“包含编码IL-27的核酸”、“包含编码CCL19的核酸”也同样。
“核酸”只要为核苷酸和与该核苷酸具有同等功能的分子聚合而成的分子，则可以为任何核酸，可列举例如：作为核糖核苷酸的聚合物的RNA、作为脱氧核糖核苷酸的聚合物的DNA、核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸混合而成的聚合物、以及包含核苷酸类似物的核苷酸聚合物，进一步地，可以为包含核酸衍生物的核苷酸聚合物。另外，核酸可以为单链核酸或双链核酸。另外，双链核酸还包括一条链在严格条件下杂交到另一条链上的双链核酸。
作为核苷酸类似物，只要是与RNA或DNA相比为了提高核酸酶耐性或使其稳定化、为了提高与互补链核酸的亲和性、或为了提高细胞穿透性、或为了使其可见化而对核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、RNA或DNA加以修饰而成的分子，则可以为任意的分子。作为核苷酸类似物，可以为天然存在的分子或非天然的分子，可列举例如糖部修饰核苷酸类似物、磷酸二酯键修饰核苷酸类似物等。
作为糖部修饰核苷酸类似物，只要是对核苷酸的糖的化学结构的一部分或全部附加或取代任意的化学结构物质而成的核苷酸类似物，则可以为任意的核苷酸类似物，作为其具体例，可列举被2’-O-甲基核糖取代而成的核苷酸类似物、2’-O-丙基核糖取代而成的核苷酸类似物、被2’-甲氧基乙氧基核糖取代而成的核苷酸类似物、被2’-O-甲氧基乙基核糖取代而成的核苷酸类似物、被2’-O-[2-(胍)乙基]核糖取代而成的核苷酸类似物、被2’-氟核糖取代而成的核苷酸类似物、通过向糖部导入桥接结构而具有2个环状结构的桥接结构型人造核酸(Bridged Nucleic Acid)(BNA)、更具体地，可以列举2’位的氧原子与4’位的碳原子经由亚甲基而桥接的锁型人造核酸(Locked Nucleic Acid)(LNA)以及亚乙基桥接结构型人造核酸(Ethylene bridged nucleic acid)(ENA)[Nucleic Acid Research,32,e175(2004)]，还可列举肽核酸(PNA)[Acc.Chem.Res.,32,624(1999)]、氧肽核酸(OPNA)[J.Am.Chem.Soc.,123,4653(2001)]、和肽核糖核酸(PRNA)[J.Am.Chem.Soc.,122,6900(2000)]等。
作为磷酸二酯键修饰核苷酸类似物，只要是对核苷酸的磷酸二酯键的化学结构的一部分或全部附加或取代任意的化学物质而成的核苷酸类似物，则可以为任意的核苷酸类似物，作为其具体例，可列举被取代为硫代磷酸酯键的核苷酸类似物、被取代为N3’-P5’磷酰胺酯键的核苷酸类似物等[细胞工程学，16,1463-1473(1997)][RNAi法和反义法、讲谈社(2005)]。
作为核酸衍生物，只要是与核酸相比为了提高核酸酶耐性、为了使其稳定化、为了提高与互补链核酸的亲和性、为了提高细胞穿透性、或为了可见化而在该核酸上附加其他化学物质而成的分子，则可以为任意的分子，作为其具体例，可列举5’-多胺附加衍生物、胆固醇附加衍生物、类固醇附加衍生物、胆汁酸附加衍生物、维生素附加衍生物、Cy5附加衍生物、Cy3附加衍生物、6-FAM附加衍生物和生物素附加衍生物等。
本发明的表达载体只要是可通过与T细胞或其前体接触而导入到细胞内并在T细胞中表达由其编码的指定的蛋白质(多肽)而制作本发明的T细胞的表达载体即可，对于为何种实施形态这一点没有特别限定。本领域技术人员能够设计、制作能够在T细胞中表达期望的蛋白质(多肽)的表达载体。
本发明的表达载体可以为直链状或环状，可以为质粒等非病毒载体、病毒载体、或基于转座子的载体。
作为病毒载体，可列举例如逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体。作为优选的逆转录病毒载体，可列举例如pMSGV载体(Tamada k et al.,ClinCancer Res 18:6436-6445(2002))和pMSCV载体(宝生物公司制)。在使用逆转录病毒载体时，该载体中所含的基因会整合到宿主细胞(本发明中为T细胞)的基因组中，因此能够长期、稳定地表达基因。
本发明的一个实施方式中，在1个表达载体中包含(1)编码CAR的核酸、(2)编码选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种的核酸、以及(3)编码CCL19的核酸中的全部要素。在本发明的另一实施方式中，第一表达载体中包含上述(1)～(3)中的1个或2个要素，在第二表达载体中包含余下的要素。在本发明的另一实施方式中，第一表达载体中包含上述(1)，第二表达载体中包含上述(2)，第三表达载体中包含上述(3)。因此，本发明的表达载体根据实施方式有时是指两个以上表达载体的组合(套组)，即，上述第一表达载体和第二表达载体的组合，或者上述第一表达载体、第二表达载体和第三表达载体的组合。在1个表达载体中包含两个以上要素时，对于从上游侧向下游侧以何种顺序配置上述要素这一点没有特别限定。
本发明的表达载体所包含的指定的3个要素(CAR、细胞因子和趋化因子)的碱基序列可根据选择何种蛋白质(多肽)作为各要素来进行设计，从而使其编码该蛋白质(多肽)的氨基酸序列。表达载体所含的核酸(寡核苷酸)可以通过寡DNA化学合成反应来制作，也可以作为cDNA来制作(克隆)。
本发明的表达载体中，除了包含编码上述指定的要素的序列(基因)以外，还可以根据需要(如上述那样对于两个以上表达载体的组合，各表达载体独立地)包含参与各基因的表达的、启动子、终止子、增强子、起始密码子、终止密码子、聚腺苷酸化信号、核定位信号(NLS)、多克隆位点(MCS)等的序列。
本发明的一个实施方式中，在1个表达载体中包含上述3个要素中的2个以上时，在各要素之间可以插入编码自我剪切型肽(2A肽)或IRES(Internal Ribozyme Entry Site，内部核糖体进入位点)的基因。
2A肽为来源于病毒的自我剪切型肽，具有在氨基酸序列中的指定位置(距离C末端1个残基的位置)被内质网切断的特征(Szymczak et al.,Expert Opin.Biol.Ther.5(5):627-638(2005))。因此，借助2A肽整合到其前后的核酸在细胞内相互独立地进行表达。作为2A肽，可列举例如来源于小核糖核酸病毒、轮状病毒、昆虫病毒、口蹄疫病毒或锥虫病病毒的2A肽。
本发明的表达载体可以还包含编码报告基因(代表性地为编码荧光蛋白的基因)、药剂筛选基因、自杀基因等“功能性基因”的核酸(碱基序列)。
在使用“药剂抗性基因”作为功能性基因时，在本发明的CAR-T细胞的制造方法中，能够通过向培养基添加指定的药剂来筛选导入有包含药剂抗性基因的本发明的表达载体的细胞。作为药剂抗性基因，可列举例如卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、嘌呤霉素抗性基因。可以使用这些基因中的任意一种，也可以使用两种以上。
在使用“编码荧光蛋白的基因”作为功能性基因时，在本发明的CAR-T细胞的制造方法中，能够使用荧光显微镜观察导入有本发明的表达载体的T细胞、或通过流式细胞仪(细胞分选仪)来筛选导入有本发明的表达载体的细胞。作为报告基因的代表例，可列举编码荧光蛋白的基因。作为“编码荧光蛋白的基因”，可列举例如：Sirius、BFP、EBFP等蓝色荧光蛋白；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFP等青色荧光蛋白；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green(例如hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer等绿色荧光蛋白；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBanana等黄色荧光蛋白；KusabiraOrange(例如hmKO2)、mOrange等橙色荧光蛋白；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry等红色荧光蛋白；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed(例如hdKeimaRed)、mRasberry、mPlum等近红外荧光蛋白。可以使用这些基因中的任意一种，也可以使用两种以上。在使用两种以上编码荧光蛋白的基因时，如果使其荧光蛋白的发光波长不同则不会妨碍彼此的辨识性，因此是优选的。
在使用“自杀基因”作为功能性基因时，根据癌症的治疗过程、例如在肿瘤已消失的阶段给药活化自杀基因的功能的药剂，从而能够控制生物体内的本发明的T细胞的数量。作为自杀基因，可列举例如：编码白喉A毒素、单纯疱疹胸苷激酶(HSV-TK)、羧肽酶G2(CPG2)、羧酸酯酶(CA)、胞嘧啶脱氨酶(CD)、细胞色素P450(cyt-450)、脱氧胞苷激酶(dCK)、硝基还原酶(NR)、嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)、胸苷磷酸化酶(TP)、水痘带状疱疹病毒胸苷激酶(VZV-TK)、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)或诱导性胱天蛋白酶9(induciblecaspase 9)的基因。可以使用这些基因中的任意一种，也可以使用两种以上。活化各自杀基因功能的药剂是公知的，例如，对于单纯疱疹胸苷激酶(HSV-TK)，可列举更昔洛韦，对于诱导性胱天蛋白酶9(inducible caspase 9)，可列举作为二聚体诱导化合物的AP1903。
以下对本发明的CAR-T细胞的制造方法进行详细说明。
本发明的CAR-T细胞的制造方法包括将上述本发明的表达载体导入到T细胞中的步骤(以下称为“表达载体导入步骤”。)。
用于将表达载体导入到T细胞中的方法可以设为与表达载体的实施形态相符的合适方法。例如，可以通过病毒感染法、磷酸钙法、脂质体转染法、显微注射法、电穿孔法等公知的方法将表达载体导入到T细胞中。本发明的表达载体可以通过公知的手段、另外适当使用市售的试剂盒(按照其说明书)制备成适合用于各方法的形态。表达载体导入步骤中，使这样的制备物与T细胞接触即可，通常是在添加了包含表达载体的制备物的培养基中培养T细胞。
本发明的一个优选实施方式中，将本发明的表达载体通过病毒感染法而导入到T细胞中。例如可列举下述方法：使用与逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体等各病毒载体相对应的市售试剂盒将本发明的载体和各病毒的包装载体(质粒)转染到宿主细胞中而制作重组病毒后，使得到的重组病毒感染T细胞。作为市售的病毒载体用试剂盒，可列举例如Retrovirus packagin Kit Eco(宝生物公司制)。作为宿主细胞，可列举例如GP2-293细胞(宝生物公司制)、Plat-GP细胞(COSMO BIO公司制)、PG13细胞(ATCCCRL-10686)、PA317细胞(ATCC CRL-9078)等。
本发明的CAR-T细胞的制造方法中，可以在表达载体导入步骤的前后还包含其它步骤。作为其它步骤，可列举例如T细胞的培养步骤、包含使表达载体所含的功能性基因起作用的处理的步骤。
成为导入本发明的表达载体的对象的T细胞通常可以在体外环境下通过公知方法预先进行培养。例如，可以从收集自人或非人动物的血液、髓液等体液、脾脏、胸腺、淋巴结等组织、或原发肿瘤、转移性肿瘤、癌性腹水等癌组织中按照常规方法分离、纯化T细胞，然后用合适的培养基培养T细胞，向该培养基中添加本发明的表达载体(含有本发明的表达载体的制备物)。或者，可以预先经过适当的分化诱导步骤由iPS细胞、ES细胞等多能干细胞制作T细胞(或其前体)并且向其培养基中添加本发明的表达载体(含有本发明的表达载体的制备物)。
另外，在本发明的表达载体包含药剂抗性基因作为功能性基因时，为了筛选导入有该表达载体的T细胞，可以在表达载体导入步骤后进行向培养基中添加与所使用的药剂抗性基因相对应的药剂并培养T细胞的步骤。本领域技术人员可以适当地调整与药剂抗性基因相对应的药剂的使用条件、例如培养基中的浓度、培养时间等。
在本发明的表达载体包含编码荧光蛋白的基因(报告基因)作为功能性基因时，可以在表达载体导入步骤后进行利用荧光显微镜观察导入有表达载体的T细胞的步骤、或用细胞分选仪筛选导入有表达载体的T细胞的步骤。本领域技术人员可以适当地调整利用荧光显微镜的观察和利用细胞分选仪的筛选时的条件、例如与荧光蛋白相对应的激发波长的光的照射、发光波长的光的检测等。
实施例
以下的实施例中的CAR是靶向人CD20的CAR，具体而言为由抗人CD20scFv、小鼠CD8跨膜区和小鼠CD28_4-1BB_CD3ζ细胞内信号基序构成的抗人CD20CAR。另外，以下的实施例中的细胞因子为小鼠IL-15(“IL15LSP”、“sIL15RA”、“mbIL15RA”或“sushiIL15”)；小鼠IL-18；小鼠IL-21；包含小鼠IL-27(p28和EBI3)的单链蛋白“scIL27”中的任意一者。以下的实施例中的趋化因子为小鼠CCL19。在如下所述地制作表达这些CAR、细胞因子和趋化因子的小鼠来源的T细胞后进行试验。
[表1]
实施例/比较例 CAR 细胞因子 趋化因子
实施例1-1 抗人CD20scFv IL15<sub>LSP</sub>(小鼠) CCL19(小鼠)
实施例1-2 抗人CD20scFv <sub>s</sub>IL15<sub>RA</sub>(小鼠) CCL19(小鼠)
实施例1-3 抗人CD20scFv <sub>mb</sub>IL15<sub>RA</sub>(小鼠) CCL19(小鼠)
实施例1-4 抗人CD20scFv <sub>sushi</sub>IL15(小鼠) CCL19(小鼠)
实施例2 抗人CD20scFv IL-18(小鼠) CCL19(小鼠)
实施例3 抗人CD20scFv IL-21(小鼠) CCL19(小鼠)
实施例4 抗人CD20scFv <sub>sc</sub>IL27(小鼠) CCL19(小鼠)
比较例1 - - -
比较例2 抗人CD20scFv - -
[实施例1-1]IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞
载体制作步骤中，首先通过步骤1人工合成3种DNA片段(DNA片段1～3)，然后通过步骤2使用上述3种DNA片段制作包含编码指定的CAR、细胞因子和趋化因子的基因全部的1个表达载体。接着，在CAR-T细胞制造步骤中，首先通过步骤1使用上述表达载体制备逆转录病毒载体，然后通过步骤2使用该逆转录病毒载体制备物向小鼠T细胞中转导上述指定的基因。
[A：载体制作步骤]IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制作
步骤1：DNA片段的合成
DNA片段#1：包含抗人CD20 CAR的DNA片段
人工合成了包含编码抗人CD20 CAR的碱基序列的DNA片段(DNA片段#1)，所述抗人CD20 CAR由抗人CD20scFv、小鼠CD8跨膜区、和小鼠CD28_4-1BB_CD3ζ细胞内信号基序构成。将DNA片段#1整体的碱基序列示于序列号1(图7)。序列号1中，第3位～第785位的碱基为编码抗人CD20scFv的序列、第795位～第1040位的碱基为编码小鼠CD8跨膜区的序列、第1041位～第1637位的碱基为编码小鼠CD28_4-1BB_CD3ζ细胞内信号基序的序列(其中，第1041位～第1163位的碱基编码小鼠CD28的细胞内区域，第1164位～第1298位的碱基编码小鼠4-1BB的细胞内区域，第1299位～第1637位的碱基编码小鼠CD3ζ的细胞内区域的多肽)。将由DNA片段#1的第3位～第1637位的碱基序列表达的融合蛋白的氨基酸序列示于序列号2。
DNA片段#2：包含终止密码子和多克隆位点的DNA片段
人工合成了包含终止密码子的碱基序列和多克隆位点(MCS)的碱基序列的DNA片段(DNA片段#2)。将DNA片段#2整体的碱基序列示于序列号3(图8)。
DNA片段#3：IL15LSP和CCL19用DNA片段
人工合成了包含编码作为自我剪切型肽的2A肽(F2A)、小鼠IL-2信号肽(IL-2SP)、小鼠IL-15构建体“IL15LSP”(由IL-15LSP和IL-15构成的融合肽)、F2A、以及小鼠CCL19的碱基序列的DNA片段(DNA片段#3)。将DNA片段#3整体的碱基序列示于序列号4(图9)。序列号4中，第7位～第81位的碱基为编码第一F2A的序列、第82位～第168位的碱基为编码小鼠IL-15LSP的序列、第169位～第567位的碱基为编码小鼠IL-15(终止密码子除外)的序列、第568位～第642位的碱基为编码第二F2A的序列、第646位～第969位的碱基为编码小鼠CCL19的序列。将由DNA片段#3的第7位～第969位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含IL15LSP的融合蛋白整体的氨基酸序列示于序列号5。
步骤2：逆转录病毒表达载体的制作
将DNA片段#1和DNA片段#2连接而制作构建体(抗人CD20 CAR_MCS)。将得到的构建体通过限制酶(Nco I和Sal I)处理而整合到pMSGV逆转录病毒表达载体(Tamada k etal.,Clin Cancer Res 18:6436-6445(2002))，由此制作含有抗人CD20CAR_MCS的pMSGV逆转录病毒表达载体。
然后，制作将DNA片段#1的第1337位～第1637位的碱基序列与DNA片段#3连接而成的构建体。将得到的构建体通过限制酶(Sbf I和Sal I)处理而整合到含有抗人CD20 CAR_MCS的pMSGV逆转录病毒载体中，由此制作含有抗人CD20CAR_F2A_IL15LSP_F2A_CCL19的pMSGV逆转录病毒表达载体(IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体)。
[B：CAR-T细胞制造步骤]IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞的制造
步骤1：逆转录病毒的制备
使用Lipofectamine3000(Thermo Fisher Scientific公司)，将通过上述载体制作步骤得到的IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体与pCL-Eco质粒(Novus biologicals公司)一起转染于GP2-293包装细胞株(宝生物公司)。需要说明的是，作为GP2-293包装细胞株的培养液，使用加入了10％的经灭活的FBS和抗生素的DMEM。转染起48小时后回收GP2-293包装细胞株的培养液的上清，作为IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体制备物。
步骤2：小鼠T细胞的转导
将来源于小鼠的脾脏和淋巴结的3×106个经纯化的小鼠T细胞在固相化的抗小鼠CD3单克隆抗体(3μg/mL)、抗小鼠CD28单克隆抗体(1μg/mL)和IL-2存在下活化48小时。接着，在固定有25μg/mL的RetroNectin(注册商标：宝生物公司)的板的孔内，将步骤1中得到的含有IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制备物(GP2-293细胞培养液上清)和如上述那样活化的小鼠T细胞混合，以1500rpm离心2小时后，在IL-2存在下培养6小时。为了从培养液中除去逆转录病毒，回收小鼠T细胞并转移到含有IL-2的新的RPMI完全培养基中，再培养42小时，由此得到导入有IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的、即表达抗人CD20CAR、IL15LSP和CCL19的小鼠T细胞(IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中称为“IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞”。)。
需要说明的是，上述T细胞的培养中使用的“RPMI完全培养基”为加入了经灭活的10％FBS、抗生素、50mM的2-巯基乙醇、25mM的HEPES缓冲液的RPMI-1640培养基。以下，作为T细胞的培养液，使用根据需要而进一步添加另行记载的成分而成的RPMI完全培养基。
[实施例1-2]sIL15RA(分泌型IL-15/IL-15RA融合蛋白)×CCL19CAR-T细胞
[A：载体制作步骤]sIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制作
使用与实施例1-1的步骤1同样的DNA片段#1和DNA片段#2以及代替DNA片段#3的下述那样的DNA片段#4，与实施例1-1的步骤2同样地制作构建体后，得到含有抗人CD20CAR_F2A_sIL15RA_F2A_CCL19的pMSGV逆转录病毒表达载体(sIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体)。
DNA片段#4：sIL15RA和CCL19用DNA片段
合成了包含编码F2A、小鼠IL-2SP、小鼠IL-15构建体“sIL15RA”(由IL-15、接头和IL-15Rα胞外结构域构成的融合肽)、F2A、以及小鼠CCL19的碱基序列的DNA片段(DNA片段#4)。将DNA片段#4整体的碱基序列示于序列号6(图10)。序列号6中，第7位～第81位的碱基为编码第一F2A的序列、第82位～第141位的碱基为编码小鼠IL-2SP的序列、第142位～第1137位的碱基为编码sIL15RA的序列(其中，第142位～第540位的碱基编码小鼠IL-15(信号序列和终止密码子除外)，第541位～第618位的碱基为接头，第619位～第1137位的碱基编码小鼠IL-15Rα胞外结构域)、第1138位～第1212位的碱基为编码第二F2A的序列、第1216位～第1539位的碱基为编码小鼠CCL19的序列。将由DNA片段#4的第7位～第1539位的碱基表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含sIL15RA的融合蛋白整体的氨基酸序列示于序列号7。
[B：CAR-T细胞制造步骤]sIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞的制造
作为逆转录病毒表达载体，使用通过上述载体制作步骤而得到的sIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体，除此以外与实施例1-1的CAR-T细胞制造步骤同样地进行，在步骤1中得到含有逆转录病毒的制备物，在步骤2中得到表达该逆转录病毒中所含的抗人CD20 CAR、sIL15RA和CCL19的各基因的小鼠T细胞(sIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中记作sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞)。
[实施例1-3]mbIL15RA(膜结合型IL-15/IL-15RA融合蛋白)×CCL19CAR-T细胞
[A：载体制作步骤]mbIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制作
使用与实施例1-1的步骤1同样的DNA片段#1和DNA片段#2、以及代替DNA片段#3的下述那样的DNA片段#5，与实施例1-1的步骤2同样地制作构建体后，得到含有抗人CD20CAR_F2A_mbIL15RA_F2A_CCL19的pMSGV逆转录病毒表达载体(mbIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体)。
DNA片段#5：mbIL15RA和CCL19用DNA片段
合成了包含编码F2A、小鼠IL-2SP、小鼠IL-15的构建体“mbIL15RA”(由IL-15、接头和全长IL-15Rα构成的融合肽)、F2A、以及小鼠CCL19的碱基序列的DNA片段。将该DNA片段#5整体的碱基序列示于序列号8(图11)。序列号8中，第7位～第81位的碱基为编码第一F2A的序列、第82位～第141位的碱基为编码小鼠IL-2SP的序列、第142位～第1311位的碱基为编码mbIL15RA的序列(其中，第142位～第540位的碱基编码小鼠IL-15(信号序列和终止密码子除外)，第541位～第618位的碱基为接头，第619位～第1311位的碱基编码小鼠IL-15Rα(全长))、第1312位～第1386位的碱基为编码第二F2A的序列、第1390位～第1713位的碱基为编码小鼠CCL19的序列。将由DNA片段#5的第7位～第1713位的碱基表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含mbIL15RA的融合蛋白整体的氨基酸序列示于序列号9。
[B：CAR-T细胞制造步骤]mbIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞的制造
作为逆转录病毒表达载体，使用通过上述载体制作步骤而得到的mbIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体，除此以外与实施例1-1的CAR-T细胞制造步骤同样地进行，在步骤1中得到含有逆转录病毒的制备物，在步骤2中制造表达该逆转录病毒中所含的抗人CD20 CAR、mbIL15RA和CCL19的各基因的小鼠T细胞(mbIL15RA_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中称为“mbIL15×CCL19 CAR-T细胞”。)。
[实施例1-4]sushiIL15(分泌型IL-15RA/IL-15融合蛋白)×CCL19 CAR-T细胞
[A：载体制作步骤]sushiIL15_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制作
使用与实施例1-1的步骤1同样的DNA片段1和DNA片段2、以及代替DNA片段#3的下述那样的DNA片段#6，与实施例1-1的步骤2同样地制作构建体后，得到含有抗人CD20CAR_F2A_sushiIL15_F2A_CCL19的pMSGV逆转录病毒表达载体(sushiIL15_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体)。
DNA片段#6：sushiIL15和CCL19用DNA片段
合成了包含编码F2A、小鼠IL-15构建体“sushiIL15”(由IL-15Rα的sushi结构域、接头和IL-15构成的融合肽)、F2A、以及小鼠CCL19的碱基序列的DNA片段。将该DNA片段#6整体的碱基序列示于序列号10(图12)。序列号10中，第7位～第81位的碱基为编码第一F2A的序列、第82位～第777位的碱基为编码sushiIL15的序列(其中，第82位～第375位的碱基编码小鼠IL-15Rα的SP和sushi结构域，第376位～第435位的碱基为接头，第436位～第777位的碱基编码小鼠IL-15(信号序列和前肽除外))、第778位～第852位的碱基为编码第二F2A的序列、第856位～第1179位的碱基为编码小鼠CCL19的序列。将由DNA片段#6的第7位～第1179位的碱基表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含sushiIL15的融合蛋白整体的氨基酸序列示于序列号11。
[B：CAR-T细胞制造步骤]sushiIL15_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞的制造
作为逆转录病毒表达载体，使用通过上述载体制作步骤而得到的sushiIL15_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体，除此以外与实施例1-1的CAR-T细胞制造步骤同样地进行，在步骤1中得到含有逆转录病毒的制备物，在步骤2中得到表达该逆转录病毒中所含的抗人CD20 CAR、sushiIL15和CCL19的各基因的小鼠T细胞(sushiIL15_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中称为“sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞”。)。
[实施例2]IL-18×CCL19 CAR-T细胞
[A：载体制作步骤]IL18_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制作
使用与实施例1-1的步骤1同样的DNA片段1和DNA片段2、以及代替DNA片段#3的下述那样的DNA片段#7，与实施例1-1的步骤2同样地制作构建体后，得到含有抗人CD20CAR_F2A_IL-18_F2A_CCL19的pMSGV逆转录病毒表达载体(IL18_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体)。
DNA片段#7：IL-18和CCL19用DNA片段
人工合成了包含编码第一F2A、小鼠IL-18、第二F2A和小鼠CCL19的碱基序列的DNA片段。将该DNA片段#7整体的碱基序列示于序列号12(图13)。序列号12中，第7位～第81位的碱基为编码第一F2A的序列、第82位～第657位的碱基为编码小鼠IL-18的序列、第658位～第732位的碱基为编码第二F2A的序列、第736位～第1059位的碱基为编码小鼠CCL19的序列。将由DNA片段#7的第7位～第1059位的碱基表达、在2处F2A进行自我剪切的融合蛋白整体的氨基酸序列示于序列号13。
[B：CAR-T细胞制造步骤]IL18_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞的制造
作为逆转录病毒表达载体，使用通过上述载体制作步骤而得到的IL18_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体，除此以外与实施例1-1的CAR-T细胞制造步骤同样地进行，在步骤1中得到含有逆转录病毒的制备物，在步骤2中得到表达该逆转录病毒中所含的抗人CD20 CAR、IL-18和CCL19的各基因的小鼠T细胞(IL18_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中称为“IL18×CCL19 CAR-T细胞”。)。
[实施例3]IL-21×CCL19 CAR-T细胞
[A：载体制作步骤]IL21_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制作
使用与实施例1-1的步骤1同样的DNA片段1和DNA片段2、以及代替DNA片段#3的下述那样的DNA片段#8，与实施例1-1的步骤2同样地制作构建体后，得到含有抗人CD20CAR_F2A_IL-21_F2A_CCL19的pMSGV逆转录病毒表达载体(IL21_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体)。
DNA片段#8：IL-21和CCL19用DNA片段
人工合成了包含编码第一F2A、小鼠IL-21、第二F2A和小鼠CCL19的碱基序列的DNA片段。将该DNA片段#8整体的碱基序列示于序列号14(图14)。序列号14中，第7位～第81位的碱基为编码第一F2A的序列、第82位～第567位的碱基为编码小鼠IL-21的序列、第568位～第642位的碱基为编码第二F2A的序列、第646位～第969位的碱基为编码小鼠CCL19的序列。将由DNA片段#8的第7位～第969位的碱基表达、在2处F2A进行自我剪切的融合蛋白整体的氨基酸序列示于序列号15。
[B：CAR-T细胞制造步骤]IL21_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞的制造
作为逆转录病毒表达载体，使用通过上述载体制作步骤而得到的IL21_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体，除此以外与实施例1-1的CAR-T细胞制造步骤同样地进行，在步骤1中得到含有逆转录病毒的制备物，在步骤2中得到表达该逆转录病毒中所含的抗人CD20 CAR、IL-21和CCL19的各基因的小鼠T细胞(IL21_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中称为“IL21×CCL19 CAR-T细胞”。)。
[实施例4]scIL27×CCL19 CAR-T细胞
[A：载体制作步骤]scIL27_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体的制作
使用与实施例1-1的步骤1同样的DNA片段1和DNA片段2、以及代替DNA片段#3的下述那样的DNA片段#9，与实施例1-1的步骤2同样地制作构建体后，得到含有抗人CD20CAR_F2A_scIL-27_F2A_CCL19的pMSGV逆转录病毒表达载体(scIL27_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体)。
DNA片段#9：scIL27和CCL19用DNA片段
人工合成了包含编码第一F2A、小鼠IL-27构建体“scIL27”(由p28、接头和EBI3构成的融合肽)、第二F2A以及CCL19的碱基序列的DNA片段。将该DNA片段#9整体的碱基序列示于序列号16(图15)。序列号16中，第7位～第81位的碱基为编码第一F2A的序列、第82位～第1437位的碱基为编码scIL27的序列(其中，第82位～第765位的碱基编码小鼠EBI3，第766位～第819位的碱基为接头，第820位～第1437位的碱基编码小鼠p28)、第1438位～第1512位的碱基为编码第二F2A的序列、第1516位～第1839位的碱基为编码小鼠CCL19的序列。将由DNA片段#9的第7位～第1839位的碱基表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含scIL27的融合蛋白整体的氨基酸序列示于序列号17。
[B：CAR-T细胞制造步骤]scIL27_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞的制造步骤
作为逆转录病毒表达载体，使用通过上述载体制作步骤而得到的scIL27_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体，除此以外与实施例1-1的CAR-T细胞制造步骤同样地进行，在步骤1中得到含有逆转录病毒的制备物，在步骤2中得到表达该逆转录病毒中所含的抗人CD20 CAR、scIL27和CCL19的各基因的小鼠T细胞(scIL27_CCL19_抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中称为“scIL27×CCL19 CAR-T细胞”。)。
[比较例1]转导(-)T细胞
不进行逆转录病毒载体的制作和使用其的向T细胞中的转染，在实施例1-1的步骤B步骤2中，加入等量的用于培养GP2-293细胞的DMEM培养基来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20CAR表达载体制备物的使用，除此以外，通过同样的步骤制造仅进行了活化的小鼠T细胞(本说明书中称为“转导(-)T细胞”。)。
[比较例2]conv.CAR-T细胞
[A：载体制作步骤]抗人CD20 CAR表达载体的制作
通过同样的步骤进行至实施例1-1的步骤A步骤2的中途，使用DNA片段1、DNA片段2和pMSGV逆转录病毒载体制作含有抗人CD20 CAR_MCS的pMSGV逆转录病毒表达载体。将其用作不进行细胞因子和趋化因子的共表达的、对照用的逆转录病毒表达载体(抗人CD20 CAR表达载体)。
[B：CAR-T细胞制造步骤]抗人CD20 CAR-T细胞的制造
作为逆转录病毒表达载体，使用抗人CD20 CAR表达载体来代替IL15LSP_CCL19_抗人CD20 CAR表达载体，除此以外与实施例1-1的CAR-T细胞制造步骤同样地进行，在步骤1中得到含有逆转录病毒的制备物，在步骤2中得到仅表达该逆转录病毒中所含的抗人CD20CAR(不表达细胞因子和趋化因子)的小鼠T细胞(抗人CD20 CAR-T细胞，本说明书中称为“conv.CAR-T细胞”。)。
[试验例1]导入的CAR、细胞因子和趋化因子的表达水平的确认
[A：通过流式细胞术进行的CAR的表达测定]
使用上述实施例和比较例中制造的T细胞，通过下述那样的流式细胞术来分析细胞表面的抗人CD20 CAR的表达水平。
需要说明的是，流式细胞术中，使用流式细胞仪“BD FACSCantoTM II”(BDBiosciences公司)，数据分析中，使用FlowJo软件(BD Biosciences公司)。
使用生物素标记蛋白L(与抗人CD20scFv的κ轻链特异性结合)和结合有BrilliantVioletTM421(BV421)的链霉亲和素处理各T细胞，检测CAR的表达。同时，使用结合有别藻蓝蛋白(APC)的抗小鼠CD8单克隆抗体(BioLegend公司)测定各T细胞群中的CD8阳性率。一般认为CD8阳性T细胞具有直接的细胞毒活性，因此，可以通过显示出CD8阳性T细胞的存在(阳性率)来作为效力(potency)的证据。
将结果示于图1。对于全部实施例(和比较例2)的CAR-T细胞确认了：在细胞群中的60％以上的细胞中表达了抗人CD20 CAR(阳性)。
[B：细胞因子和趋化因子的分泌量的测定]
回收转导起42小时后的各T细胞的培养上清，使用市售的ELISA试剂盒(仅IL-18为MBL公司，其余为R&D systems公司)测定IL-15、IL-18、IL-21、IL-27和CCL19的浓度。
将结果示于图2。关于IL-15(图2A)，从实施例1-1的CAR-T细胞(15LSPx19 CAR-T)的培养上清中检测到浓度为250pg/mL的IL-15。另一方面，实施例1-2(s15RAx19 CAR-T)、实施例1-3(mb15RAx19 CAR-T)和实施例1-4(sushi15x19 CAR-T)的CAR-T细胞的培养上清中的IL-15的浓度与未进行转导的活化T细胞(转导(-)：比较例1)和作为对照的表达抗人CD20CAR的T细胞(conv.CAR-T：比较例2)为同等程度，通过试验例1使用的上述ELISA试剂盒没有确认到IL-15的分泌。但是，在后述的试验例2中，实施例1-2、实施例1-3和实施例1-4显示出显著的细胞增殖效果，因此可说明这些实施例也与实施例1-1同样地表达、分泌IL-15。
关于IL-18(图2B)，从实施例2的CAR-T细胞(18x19 CAR-T)的培养上清中检测到浓度为150pg/mL以上的IL-18。另一方面，作为对照的表达抗人CD20 CAR的T细胞(conv.CAR-T：比较例2)的培养上清中的分泌量与未进行转导的活化T细胞(转导(-)：比较例1)为同等程度的微量。
关于IL-21(图2C)，从实施例3的CAR-T细胞(21x19 CAR-T)的培养上清中检测到浓度为400pg/mL以上的IL-18。另一方面，作为对照的表达抗人CD20 CAR的T细胞(conv.CAR-T：比较例2)的分泌量与未进行转导的活化T细胞(转导(-)：比较例1)均为检测限以下(NotDetected，未检出)。
关于IL-27(图2D)，从实施例4的CAR-T细胞(sc27x19 CAR-T)的培养上清中检测到浓度为250pg/mL以上的作为IL-27的亚单位的p28。另一方面，作为对照的抗人CD20 CAR-T细胞(conv.CAR-T：比较例2)的分泌量与未进行转导的活化T细胞(转导(-)：比较例1)为同等程度(培养上清中的浓度为50pg/mL左右)。
关于CCL19(图2E)，作为对照的抗人CD20 CAR-T细胞(conv.CAR-T：比较例2)和未进行转导的活化T细胞(转导(-)：比较例1)的培养上清中的浓度为检测限以下，与此相对地，各实施例的CAR-T细胞的培养上清中的浓度为150～500pg/mL。
[试验例2]CAR-T细胞的体外增殖能力的评价
使用上述实施例和比较例中制造的T细胞，如下述那样测定CAR-T细胞的细胞数和增殖能力，由此来研究各T细胞所产生的细胞因子(IL-15、IL-18、IL-21和IL-27)是否发挥生物学功能、显示出免疫诱导效果。
将各T细胞用CytoTellTM UltraGreen(AAT Bioquest公司)染色后，与用丝裂霉素C处理后的以表达人CD20的方式进行了基因重组的P815肥大细胞瘤(hCD20/P815)在同一孔内共培养而进行刺激。从刺激开始起培养3天、5天或7天后回收细胞，进行流式细胞术分析。用结合有APC的抗Thy1.2单克隆抗体(eBioscience公司)染色，将各T细胞(淋巴细胞)群中的Thy1.2阳性细胞视为存活的T细胞，测定细胞数。
将结果示于图3。转导(-)T细胞(比较例1)即使与hCD20/P815细胞共培养也不会发生活化刺激或者活细胞数在培养第3天为1/10以下。另一方面，与hCD20/P815细胞共培养后的IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-1)、sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-3)、sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T细胞(实施例2)、IL-21×CCL19CAR-T细胞(实施例3)和scIL27×CCL19 CAR-T细胞(实施例4)均在培养第3天时确认到与对照即conv.CAR-T细胞(比较例2)为同等或同等以上的活细胞数的增殖维持。进一步地，若继续培养到第7天，特别是sIL15RA×CCL19CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-3)、sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)显示出显著的细胞增殖。IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-1)、IL-18×CCL19 CAR-T细胞(实施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T细胞(实施例3)和scIL27×CCL19CAR-T细胞(实施例4)在培养第3天至第7天维持了与对照即conv.CAR-T细胞(比较例2)同等的细胞数。
一并进行了Thy1.2阳性细胞群中的利用CytoTell试剂染色的染色强度的直方图分析。将关于开始刺激起5天后的细胞群的结果示于图4。IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-1)、sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-3)、sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T细胞(实施例2)和IL-21×CCL19 CAR-T细胞(实施例3)与对照即conv.CAR-T细胞(比较例2)相比，第二代(分裂1次后)的细胞群的比例明显减少，另外第五代以后(分裂4次以上后)的细胞群的比例增加。
由图3和图4的结果可知，在增强CAR-T细胞的存活和增殖、发挥生物学功能方面，特别优选sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-3)和sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)中产生的IL-15/IL-15Rα融合蛋白与CCL-19的组合。
[试验例3]CAR-T细胞的肿瘤细胞毒活性的评价
使用上述实施例和比较例中制造的T细胞研究靶抗原特异性肿瘤细胞毒活性。
[A：利用流式细胞术进行的肿瘤细胞毒活性的测定]
使用以表达人CD20的方式进行了基因重组的P815肥大细胞瘤(hCD20/P815)作为靶肿瘤细胞，使用未进行这样的基因重组的P815肥大细胞瘤(P815)作为对照肿瘤细胞。
收集上述靶肿瘤细胞或对照肿瘤细胞并播种于培养板后，加入作为效应T细胞的各实施例的CAR-T细胞(IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-1)、sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-3)、sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T细胞(实施例2)、IL-21×CCL19CAR-T细胞(实施例3)和scIL27×CCL19 CAR-T细胞(实施例4))或比较例2的CAR-T细胞(conv.CAR-T细胞)，进行72小时共培养。以使CAR阳性细胞数达到靶肿瘤细胞的1/3量的方式加入效应T细胞(E∶T比＝1∶3)，根据CAR表达率最低的T细胞的播种数向其它T细胞群添加未进行转导的T细胞，由此使得所播种的总T细胞数在各群中数量相同。在共培养72小时后，回收全部细胞，进行流式细胞术分析和活细胞数的测定。用结合有APC的抗Thy1.2单克隆抗体(eBioscience公司)和Zombie Green Fixable Viability Kit(BioLegend公司)进行染色，由Thy1.2阳性率计算出活细胞群中的T细胞和肿瘤细胞的比例。活细胞数使用NucleoCounter NC-200(chemometec公司)来测定。
将结果示于图5。如图5A所示，由活细胞中的Thy1.2阴性率计算共培养72小时后的hCD20/P815肿瘤细胞数，结果与IL15LSP×CCL19CAR-T细胞(实施例1-1)、sIL15RA×CCL19CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-3)、sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T细胞(实施例2)、IL-21×CCL19CAR-T细胞(实施例3)或scIL27×CCL19 CAR-T细胞(实施例4)进行共培养后的hCD20/P815肿瘤细胞数与转导(-)T细胞(比较例1)相比均显著减少，与conv.CAR-T细胞(比较例2)相比也进一步减少，存活的肿瘤细胞为1％以下。另一方面，如图5B所示，在任一细胞群的情况下，不表达人CD20的P815细胞均未见肿瘤细胞的减少，未确认到对不表达人CD20的肿瘤细胞的非特异性细胞毒。
[B：利用ELISA分析进行的IFNγ产生测定]
使用市售的ELISA分析试剂盒(R&D公司)测定CAR-T细胞所产生的干扰素γ(IFNγ)，来作为靶抗原特异性细胞毒能力的活化的指标。测定与上述的P815细胞(对照肿瘤细胞)或hCD20-P815细胞(靶肿瘤细胞)进行共培养后的各实施例的CAR-T细胞(IL15LSP×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-1)、sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19CAR-T细胞(实施例1-3)、sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T细胞(实施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T细胞(实施例3)和scIL27×CCL19 CAR-T细胞(实施例4))或比较例2的CAR-T细胞(conv.CAR-T细胞)的、共培养4天后的培养上清中的IFNγ的量。
将结果示于图6。如图6A所示，与hCD20-P815细胞进行共培养后的IL15LSP×CCL19CAR-T细胞(实施例1-1)、sIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-2)、mbIL15RA×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-3)、sushiIL15×CCL19 CAR-T细胞(实施例1-4)、IL-18×CCL19 CAR-T细胞(实施例2)、IL-21×CCL19 CAR-T细胞(实施例3)或scIL27×CCL19 CAR-T细胞(实施例4)中的任一者的培养上清中，均检测到高于conv.CAR-T细胞(比较例2)的约15ng/mL以上的IFNγ。与转导(-)T细胞(比较例1)进行共培养后的组中的IFNγ产生量为检测限以下。另一方面，如图6B所示，与P815细胞进行共培养后的各CAR表达细胞培养上清中的IFNγ的浓度为10pg/mL以下。
由以上的试验例3(图5和图6)的结果可确认，上述各实施例和比较例2的T细胞均显示出针对表达人CD20的细胞的、即靶抗原特异性的细胞毒活性。
[试验例4]小鼠肿瘤模型中的治疗效果
使用上述实施例1-3和实施例1-4、比较例2中制造的T细胞，用下述那样的荷瘤小鼠研究对小鼠黑色素瘤肿瘤移植模型或小鼠大肠癌肿瘤模型的治疗效果。
(小鼠黑色素瘤肿瘤移植模型中的治疗效果)
将以表达人CD20的方式进行了基因重组的小鼠黑色素瘤B16F10(B16F10-hCD20)5×105个接种于C57BL/6N小鼠的皮下。接种后第7天，将作为抗癌剂的环磷酰胺(CPA、50mg/kg)给药于腹腔内，在第10天将1×106个实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)或实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15xCCL19 CAR-T)或比较例2(Conv.CAR-T)给药于静脉内。作为对照组，设定仅进行CPA给药的CAR-T未治疗组、接种B16F10-hCD20小鼠黑色素瘤后无处置的非治疗组。每周2次地测定小鼠的肿瘤体积。
将小鼠黑色素瘤肿瘤移植模型的肿瘤体积的结果示于图16。横轴为将向小鼠皮下接种B16F10-hCD20的当天设为第0天的、接种后的天数，纵轴为肿瘤体积(肿瘤的长径×(肿瘤的短径)2/2(mm3))。在各实验组中计算出标准偏差。“no treatment(无处置)”为无处置的组，“CPA”为仅给药CPA的组，“CPA+Conv.”为给药CPA后给药比较例2(Conv.CAR-T)的组，“CPA+mbIL15RAx19”为给药CPA后给药实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)的组，“CPA+sushiIL15RAx19”为给药CPA后给药实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15xCCL19 CAR-T)的组。
如图16所示，与给药比较例2(Conv.CAR-T)时、无处置组(no treatment)和仅给药CPA时相比，在给药实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)和实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15RAxCCL19 CAR-T)时确认到肿瘤体积的减少效果。因此可知，实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)和实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15xCCL19 CAR-T)在小鼠黑色素瘤肿瘤模型中具有优良的抗肿瘤活性。
(小鼠大肠癌肿瘤移植模型中的治疗效果)
将以表达人CD20的方式进行了基因重组的小鼠大肠癌MC38(MC38-hCD20)5×105个接种于C57BL/6N小鼠的皮下。接种后第7天，将作为抗癌剂的环磷酰胺(CPA、50mg/kg)给药于腹腔内，在第10天将1×106个实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)或实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15xCCL19 CAR-T)或比较例2(Conv.CAR-T)给药于静脉内。作为对照组，设定仅进行CPA给药的CAR-T未治疗组、接种MC38-hCD20小鼠大肠癌后无处置的非治疗组。每周2次地测定小鼠的肿瘤体积。
将小鼠大肠癌肿瘤移植模型的肿瘤体积的结果示于图17。横轴为将向小鼠皮下接种MC38-hCD20的当天设为第0天的、接种后的天数，纵轴为肿瘤体积(肿瘤的长径×(肿瘤的短径)2/2(mm3))。在各实验组中计算出标准偏差。“no treatment(无处置)”为无处置的组，“CPA”为仅给药CPA的组，“CPA+Conv.”为给药CPA后给药比较例2(Conv.CAR-T)的组，“CPA+mbIL15RAx19”为给药CPA后给药实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)的组，“CPA+sushiIL15RAx19”为给药CPA后给药实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15xCCL19 CAR-T)的组。
如图17所示，与给药比较例2(Conv.CAR-T)时、无处置组(no treatment)和仅给药CPA时相比，在给药实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)和实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15xCCL19 CAR-T)时确认到肿瘤体积的减少效果。因此可知，实施例1-3的CAR-T细胞(mbIL15RAxCCL19 CAR-T)和实施例1-4的CAR-T细胞(sushiIL15xCCL19 CAR-T)在小鼠大肠癌模型中也具有优良的抗肿瘤活性。
上述的实施例和试验例中，使用了小鼠来源的T细胞、包含小鼠的天然氨基酸序列的细胞因子(在IL-15Rα等上连接有IL-15的融合蛋白等)和趋化因子(CCL19)，另外进行了小鼠的体内试验。但是，本领域技术人员可以理解，在与小鼠以外的哺乳动物、优选人有关的实施方式中，即，使用人来源的T细胞、包含人的天然氨基酸序列的细胞因子(在IL-15Rα等上连接有IL-15的融合蛋白等)和趋化因子(CCL19)时，另外进行人的体内试验时，也同样能够实施本发明且发挥本发明的作用效果。
例如，利用序列号5所示的小鼠的天然氨基酸序列而实施(制作和使用)的包含IL15LSP的融合蛋白可以利用序列号18所示的关于IL-15的人的天然氨基酸序列中的第1位～第29位(信号肽部分)和第49位～第162位(IL-15部分)的氨基酸序列来实施，另外可以利用具有编码这样的氨基酸序列的碱基序列的核酸来实施。
利用序列号7所示的小鼠的天然氨基酸序列而实施的包含sIL15RA的融合蛋白可以利用序列号18所示的关于IL-15的人的天然氨基酸序列中的第49位～第162位(IL-15部分)的氨基酸序列、以及序列号19所示的关于IL-15Rα的人的天然氨基酸序列中的第31位～第205位(IL-15Rα胞外结构域)的氨基酸序列来实施，另外可以利用具有编码这样的氨基酸序列的碱基序列的核酸来实施。
利用序列号9所示的小鼠的天然氨基酸序列而实施的包含mbIL15RA的融合蛋白可以利用序列号18所示的关于IL-15的人的天然氨基酸序列中的第49位～第162位(IL-15部分)的氨基酸序列、以及序列号19所示的关于IL-15Rα的人的天然氨基酸序列中的第1位～第267位(全长IL-15Rα)的氨基酸序列来实施，另外可以利用具有编码这样的氨基酸序列的碱基序列的核酸来实施。
利用序列号11所示的小鼠的天然氨基酸序列而实施的包含sushiIL15的融合蛋白可以利用序列号18所示的关于IL-15的人的天然氨基酸序列中的第49位～第162位(IL-15部分)的氨基酸序列、以及序列号19所示的关于IL-15Rα的人的天然氨基酸序列中的第31位～第95位(sushi结构域)的氨基酸序列来实施，另外可以利用具有编码这样的氨基酸序列的碱基序列的核酸来实施。
产业上的可利用性
本发明的持续性和增殖性优良的CAR-T细胞适合用来制造用于治疗癌症等的药物。另外，本发明的表达载体适合用来制造这样的CAR-T细胞。
序列表自由文本
序列号1：包含抗人CD20 CAR的DNA片段(DNA片段#1)的碱基序列
序列号2：由DNA片段#1的第3位～第1637位的碱基序列表达的融合蛋白的氨基酸序列
序列号3：编码终止密码子和限制酶位点的MCS DNA片段(DNA片段#2)的碱基序列
序列号4：IL15LSP_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#3)的碱基序列
序列号5：由DNA片段#3的第7位～第969位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含IL15LSP的融合蛋白整体的氨基酸序列
序列号6：sIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#4)的氨基酸序列
序列号7：由DNA片段#4的第7位～第1539位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含sIL15RA的融合蛋白整体的氨基酸序列
序列号8：mbIL15RA_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#5)的碱基序列
序列号9：由DNA片段#5的第7位～第1713位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含mbIL15RA的融合蛋白整体的氨基酸序列
序列号10：sushiIL15_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#6)的碱基序列
序列号11：由DNA片段#6的第7位～第1179位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含sushiIL15的融合蛋白整体的氨基酸序列
序列号12：IL-18_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#7)的碱基序列
序列号13：由DNA片段#7的第7位～第1059位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的融合蛋白整体的氨基酸序列
序列号14：IL-21_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#8)的碱基序列
序列号15：由DNA片段#8的第7位～第969位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的融合蛋白整体的氨基酸序列
序列号16：scIL27_F2A_CCL19 DNA片段(DNA片段#9)
序列号17：由DNA片段#9的第7位～第1839位的碱基序列表达、在2处F2A进行自我剪切的、包含scIL27的融合蛋白整体的氨基酸序列
序列号18：登记为UniProtKB-P40933的、人的天然IL-15(包含信号肽和前肽部分的全长)的氨基酸序列
序列号19：登记为UniProtKB-Q13261的人的天然IL-15Rα(包含信号肽、sushi结构域、胞外结构域等的全长)的氨基酸序列

Claims (18)

1.一种T细胞，其表达：
(1)嵌合抗原受体(CAR)；
(2)选自由白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)和白细胞介素-27(IL-27)组成的组中的至少一种；以及
(3)CC趋化因子配体19(CCL19)。
2.根据权利要求1所述的T细胞，其中，所述(2)为IL-15。
3.根据权利要求2所述的T细胞，其中，所述IL-15为处于与IL-15Rα连接而形成了融合蛋白的状态的IL-15。
4.根据权利要求3所述的T细胞，其中，所述融合蛋白为IL-15LSP与IL-15连接而成的融合蛋白(IL15LSP)、IL-15Rα胞外结构域与IL-15连接而成的融合蛋白(sIL15RA)、IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
5.根据权利要求3所述的T细胞，其中，所述融合蛋白为IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
6.一种药物，其含有权利要求1所述的T细胞。
7.根据权利要求6所述的药物，其为癌症的治疗剂。
8.根据权利要求7所述的药物，其中，所述癌症为黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
9.一种表达载体，其包含：
(1)编码CAR的核酸；
(2)编码选自由IL-15、IL-18、IL-21和IL-27组成的组中的至少一种的核酸；以及
(3)编码CCL19的核酸。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其中，所述(2)为IL-15。
11.根据权利要求10所述的表达载体，其中，所述IL-15为处于与IL-15Rα连接而形成了融合蛋白的状态的IL-15。
12.根据权利要求11所述的表达载体，其中，所述融合蛋白为IL-15LSP与IL-15连接而成的融合蛋白(IL15LSP)、IL-15Rα胞外结构域与IL-15连接而成的融合蛋白(sIL15RA)、IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
13.根据权利要求11所述的表达载体，其中，所述融合蛋白为IL-15与全长IL-15Rα连接而成的融合蛋白(mbIL15RA)或者包含信号肽和sushi结构域的IL-15Rα与IL-15连接而成的融合蛋白(sushiIL15)。
14.一种CAR-T细胞的制造方法，其包括将权利要求9所述的表达载体导入到T细胞中的步骤。
15.一种癌症的治疗方法，其包括将权利要求1所述的T细胞给药于需要进行癌症的治疗的对象的步骤。
16.根据权利要求15所述的治疗方法，其中，所述癌症为黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
17.根据权利要求1所述的T细胞，其作为癌症的治疗的有效成分使用。
18.根据权利要求17所述的T细胞，其中，所述癌症为黑色素瘤、默克尔细胞癌、大肠癌、肾癌、乳腺癌、卵巢癌、输卵管癌、宫颈癌、肝癌、肺癌、非小细胞肺癌、头颈癌、小肠癌、前列腺癌、膀胱癌、直肠癌、胰腺癌、尤文肉瘤、横纹肌肉瘤、鼻咽癌、食管癌、胆管癌、神经母细胞瘤、骨肉瘤、急性髓性白血病、多发性骨髓瘤、淋巴瘤或白血病。
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