CN112763474B

CN112763474B - 一种预测或检测急性白血病的生物标志物

Info

Publication number: CN112763474B
Application number: CN202011539457.1A
Authority: CN
Inventors: 梁昊岳; 高瀛岱; 程雪莲; 茹永新; 董树旭
Original assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-12-23
Filing date: 2020-12-23
Publication date: 2022-05-06
Anticipated expiration: 2040-12-23
Also published as: CN112763474A

Abstract

本发明涉及一种预测或检测急性白血病的生物标志物，具体地，本发明涉及基于拉曼光谱检测骨髓上清的1443cm^‑1(蛋白质和/或脂类/胆固醇)、1437cm^‑1(脂类/胆固醇)、1579cm^‑1(血红蛋白和/或核酸)的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病的产品中的应用。本发明筛选了特异性和显著的拉曼位移作为ALs的生物标志物，为更好地将临床生化数据用于急性白血病的诊断和治疗奠定基础。

Description

一种预测或检测急性白血病的生物标志物

技术领域

本发明涉及疾病检测领域，具体涉及一种预测或检测急性白血病的生物标志物。

背景技术

急性白血病(Acute Leukemia，ALs)是源于造血干细胞的一种恶性克隆疾病，按细胞形态可分为急性髓细胞白血病和急性淋巴细胞白血病两大类，每类又分成若干亚型。急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)是成人中最常见的白血病，它是造血细胞在骨髓中异常增殖和分化的结果。英美法(FAB)血液病协作组将AML分型为AML-M1等7型。急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)在儿童和成人中均可见，但其发生率在2至5岁之间较高。ALs的诊断主要依据临床症状表现、外周血象、骨髓穿刺血液学检查。进一步分型需参考细胞免疫学、细胞遗传学、流式细胞和分子生物学检查。探索侵入性、损伤性、主观性更小，有助于早期诊断，过程更简单，成本更低廉，报告结果等待时间更短的诊断方法，成为白血病乃至血液系统疾病诊断研究领域的一个重要课题。在临床实践中，生化指标与急性白血病的分型和预后尚未建立科学的联系，为急性白血病的诊断和治疗提供的信息是有限的。深入挖掘急性白血病患者的海量的生化检查信息，对疾病的快速诊断和预后判断具有重要意义。急性白血病的传统诊断方法成本高、耗时长并且有侵入性。基于分子水平的无需抗体标记的急性白血病快速检测方法的研发将改善疾病诊断的时效性水平，减轻患者的经济负担，推动AML和ALL精准诊断工作进一步发展。

在科学研究领域，拉曼光谱已被用作快速，无创和无标记方法来分析和分类具有位置特异性的细胞。使用拉曼光谱进行诊断的几个优点已经被证明——它可以潜在地替代基于组织学样本的视觉检查的传统诊断方法。该技术已经成功地证明了癌症的早期检测，肿瘤等级的分化，并且提供来自不同活细胞的细胞信息。在血液学研究领域，Ilin等在单细胞水平识别造血干细胞不同分化阶段所形成细胞的拉曼光谱，结合偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)，区分长、短周期干细胞、粒细胞和淋巴细胞。Ramoji等报道了嗜酸性粒细胞和单核细胞等有核细胞的拉曼光谱。Neugebauer等研究了人血液肿瘤细胞的分离和拉曼光谱分析。Chan和他的同事们使用拉曼光谱来研究健康个体和ALL患者之间的差异B和T细胞。González-Solís基于血清生物化学区分正常和白血病血清，并且证明拉曼光谱和超顺磁聚类方法可以用于区分乳腺癌，白血病和宫颈癌样本使用血清样本。M.Féré等从散布在载玻片上的新鲜未染色血液涂片诊断慢性淋巴细胞性白血病，证明拉曼光谱在当前临床实践和工作流程中的适用性。相比之下，基于骨髓上清系统地研究ALs和AML subtypes的拉曼光谱特征的工作尚无报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种预测或检测急性白血病的生物标志物。

本发明采用的技术方案为：

基于拉曼光谱检测骨髓上清的1443cm^-1(蛋白质和/或脂类/胆固醇)、1437cm^-1(脂类/胆固醇)、1579cm^-1(血红蛋白和/或核酸)的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病的产品中的应用。

在上述应用中，通过检测受试者骨髓上清中的1443cm^-1、1437cm^-1、1579cm^-1的峰位强度，并与正常对照平均值相比较，来诊断疾病发生进展，评估病情。

在上述应用中，还包括检测拉曼峰1031cm^-1(蛋白质)、1603cm^-1(蛋白质)、859cm^-1(胶原蛋白)中的一种或两种以上的峰位强度。

在上述应用中，拉曼光谱的检测条件为：785nm激光作为激发光，40倍物镜，输出功率为40mW，测量范围600-1800cm^-1，单次积分时间为100s，积分次数为一次。测定石英玻片拉曼光谱作为本底，应用Labspec6软件进行平滑、去背景和基线校正等数据处理，全部光谱以各自的1450cm^-1拉曼峰为内标完成了强度归一化。

在上述应用中，在急性白血病患者的骨髓上清中拉曼峰1443cm^-1、1437cm^-1、1579cm^-1峰位强度低于正常对照平均值。

在上述应用中，在急性白血病患者的骨髓上清中拉曼峰1031cm^-1、1603cm^-1的峰位强度低于正常对照平均值，拉曼峰859cm^-1的峰位强度高于正常对照平均值。。

基于拉曼光谱检测骨髓上清的1437cm^-1(脂类/胆固醇)、826cm^-1(核酸)峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病AML-M2的产品中的应用。

基于拉曼光谱检测骨髓上清的1603cm^-1(蛋白质)、859cm^-1(胶原蛋白)的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于辅助诊断急性白血病AML-M3的产品中的应用。

基于拉曼光谱检测骨髓上清的1443cm^-1(脂类/胆固醇)、1437cm^-1(脂类/胆固醇)的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病AML-M4的产品中的应用。

基于拉曼光谱检测骨髓上清的1345cm^-1(胶原蛋白)、859cm^-1(胶原蛋白)的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病AML-M5的产品中的应用。

本发明首次应用拉曼光谱学(RS)技术分析不同类型的ALs患者的骨髓上清。通过联合应用RS和OPLS-DA多变量分析，我们能够以高敏感性(85％和85％)和高特异性((90％和100％)区分AML和ALL患者的骨髓上清与对照组的骨髓上清。在AML subtypes分析中，我们以高敏感性(75％、85％、90％和85％)和高特异性(100％、95％、95％和100％)区分AML-M2、AML-M3、AML-M4和AML-M5与对照组的骨髓上清。

本发明结果证实基于拉曼光谱学和多元统计分析的急性白血病骨髓上清分析是可行的，提示了骨髓上清RS在ALs检测和生物标志物挖掘中的潜在作用。我们发现，代表胆固醇、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白、ADA和血红蛋白的1437、1443、1579cm^-1等峰位可以作为ALs的生物标志物，对ALs的诊断、治疗和预后判断具有潜在价值。在Control vs AML vsALL模型中，Control组代表蛋白质的峰位1031、1443和1603cm^-1、代表核酸的峰位1579cm^-1、代表脂类/胆固醇的峰位1437、1443cm^-1和代表胶原的峰位859cm^-1强度高于ALs组，并且分别与血清生化结果相符。在Control vs AML subtypes模型中，Control组代表蛋白质的峰位强度高于ALs组，特别是代表胆固醇的峰位1437cm^-1高于AML subtypes。

本发明所具有的有益效果：

本发明筛选了特异性和显著的拉曼位移作为ALs的生物标志物，为更好地将临床生化数据用于急性白血病的诊断和治疗奠定基础。

本发明基于急性白血病患者骨髓样本，特别是检测方法简便易行的骨髓上清样本，使用不需要抗体的评估方法可以有效降低成本并缩短检测时间。

附图说明

图1为骨髓上清的拉曼测量示意图。通过拉曼光谱法获得拉曼光谱，并使用SIMCA14.1通过多变量统计分析来分析数据集。

图2对照组和急性白血病患者平均骨髓上清光谱图a.(从下到上)Control、AML和ALL平均骨髓上清光谱图b.(从下到上)Control、AML-M2、AML-M3、AML-M4和AML-M5平均骨髓上清光谱图。

图3对照组和急性白血病组骨髓上清样本鉴别模型的建立a.Control,AML和ALL组鉴别OPLS模型聚类分析图b.Control,AML和ALL组鉴别OPLS模型排列图c.Control,AML和ALL组鉴别OPLS模型ROC曲线图，AUC(Control)＝1,AUC(AML)＝1,AUC(ALL)＝0.993065d.Control和AML各亚型鉴别OPLS模型聚类分析图e.Control和AML各亚型鉴别OPLS模型排列图f.Control和AML各亚型鉴别OPLS模型ROC曲线图，AUC(Control)＝1,AUC(AML-M2)＝1,AUC(AML-M3)＝1,AUC(AML-M4)＝1,AUC(AML-M5)＝0.993056。

图4 Control vs ALs或AML subtypes OPLS模型的外部验证a.Control vs AMLOPLS模型的外部验证b.Control vs ALL OPLS模型的外部验证c.Control vs AML-M2 OPLS模型的外部验证d.Control vs AML-M3 OPLS模型的外部验证e.Control vs AML-M4 OPLS模型的外部验证f.Control vs AML-M5 OPLS模型的外部验证。

图5 Control和ALs骨髓上清样本的OPLS-DA鉴别a.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control，AML和ALL通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为ALs，右侧为control，R²X＝0.428,R²Y＝0.781and Q²＝0.362b.Control，AML和ALL鉴别载荷线图c.Control，AML和ALL鉴别V+S图d.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control和AML通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为control，右侧为AML，R²X＝0.415,R²Y＝0.933and Q²＝0.527e.Control和AML鉴别载荷线图f.Control和AML鉴别V+S图g.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control和ALL通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为ALL，右侧为control，R²X＝0.4,R²Y＝0.953and Q²＝0.716h.Control和ALL鉴别载荷线图i.Control和ALL鉴别V+S图j.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的AML和ALL通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为AML，右侧为ALL，R²X＝0.504,R²Y＝0.958and Q²＝0.329k.AML和ALL鉴别载荷线图l.AML和ALL鉴别V+S图。

图6 Control和AML subtypes骨髓上清样本的OPLS-DA鉴别a.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control和AML subtypes通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为AML subtypes，右侧为control，R²X＝0.701,R²Y＝0.723and Q²＝0.292b.Control和AML subtypes鉴别载荷线图c.Control和AML subtypes鉴别V+S图d.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control和AML-M2通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为control，右侧为AML-M2，R²X＝0.532,R²Y＝0.999and Q²＝0.928e.Control和AML-M2鉴别载荷线图f.Control和AML-M2鉴别V+S图g.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control和AML-M3通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为AML-M3，右侧为control，R²X＝0.676,R²Y＝0.998and Q²＝0.641h.Control和AML-M3鉴别载荷线图i.Control和AML-M3鉴别V+S图j.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control和AML-M4通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为control，右侧为AML-M4，R²X＝0.548,R²Y＝0.994and Q²＝0.708k.Control和AML-M4鉴别载荷线图l.Control和AML-M4鉴别V+S图m.用Hotelling的95％置信椭圆绘制的Control和AML-M5通过OPLS-DA鉴别得分图，左侧为AML-M5，右侧为control，R²X＝0.525,R²Y＝0.996and Q²＝0.856n.Control和AML-M5鉴别载荷线图o.Control和AML-M5鉴别V+S图

图7 Control vs AML vs ALL潜在生物标志物统计。

其中7a.Control vs AML vs ALL潜在生物标志物，每一个峰位下从左往右依次为Control、AML、ALL；图7b.Control vs AML潜在生物标志物，每一个峰为下，从左往右依次为Control、AML，图7c.Control vs ALL潜在生物标志物，每一个峰为下，从左往右依次为Control、ALL，图7d.AML vs ALL潜在生物标志物,每一个峰为下，从左往右依次为AML、ALL。

图8 Control vs AML vs ALL血清生化结果。

图9 Control vs AML subtypes潜在生物标志物统计。

图9a.Control vs AML subtypes潜在生物标志物，每一个峰位下从左往右依次为Control,AML-M2,AML-M3,AML-M4,AML-M5；图9b.Control vs AML-M2潜在生物标志物，每一个峰位下从左往右依次为Control,AML-M2；图9c.Control vs AML-M3潜在生物标志物，每一个峰位下从左往右依次为Control,AML-M3；图9d.Control vs AML-M4潜在生物标志物，每一个峰位下从左往右依次为Control,AML-M4；图9e.Control vs AML-M5潜在生物标志物，每一个峰位下从左往右依次为Control,AML-M5。

图10 Control vs AML subtypes血清生化结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不限定本发明的保护范围。

1.样品采集

选取中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)2016年急性细胞白血病患者，主要为2016年1月到2016年6月在我院就诊住院的患者，其中男48例，女35例，年龄最小1岁，最大67岁。所有病例都经骨髓穿刺，进行骨髓细胞形态学、流式细胞术、组织细胞化学、染色体、融合基因和电子显微镜检查，临床主要以细胞形态和组织细胞化学为依据，结合其他检查，根据FAB确诊。其中ALL患者22例，AML患者61例，包括AML-M2患者19例，AML-M3患者12例，AML-M4患者5例，AML-M5患者25例。选取5例无血液肿瘤供者作为对照(3例为造血干细胞移植健康供者，1例为贫血患者，1例为骨髓纤维化患者)。本研究经中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)伦理委员会(KT2019016-EC-1)批准。所有急性白血病患者及对照组进行常规血清生化检测。血清生化检测数据来自中国医学科学院血液病医院(中国医学科学院血液学研究所)病案室。

2.拉曼光谱

将5μL骨髓上清滴在氟化钙玻片(或石英玻片)上，选用共聚焦拉曼光谱仪XploRARaman microscope测定量。选取785nm激光作为激发光，输出功率为40mW，物镜选取40倍，标本固定在XYZ三维平台上。拍摄过程使用×40 0.75NA尼康镜头，样品上约2×2μm的光斑大小范围接收输出功率为40mW的激光束照射，单次积分时间为100s，积分次数为一次，测量范围600-1800cm^-1，每组测量6个位点，分辨率为1cm^-1。同时测定石英玻片拉曼光谱作为本底。应用Labspec6软件进行平滑、去背景和基线校正等数据处理，全部光谱以各自的1450cm^-1拉曼峰为内标完成了强度归一化。

3.拉曼光谱数据分析及诊断模型建立

采用SIMCA14.1软件对急性白血病患者和对照组的骨髓上清拉曼光谱数据进行OPLS-DA分析。使用拟合优度参数R²和Q²分别对OPLS模型的性能进行评价。在零假设条件下，通过y矩阵的随机变化对模型进行200次重采样，进行模型验证。进行聚类分析及ROC曲线分析。为寻找分类模型中的统计学上具有显著差异的拉曼峰位作为潜在生物学标志物，我们使用了V+S分析。选择Variable Importance(VIP)>1.5并且相关系数(或在V+S图中与中心的距离)处在对等前列范围内的峰位作为潜在生物标志物。将得到的潜在生物标志物进行显著性检验，p<0.05的潜在生物标志物被认为具有统计学意义。使用Origin软件进行相关数据处理。使用IBM SPSS Statistics 20进行统计学分析，Graphpad Prism 5绘制统计相关图形。

4.结果

4.1急性白血病患者组和对照组骨髓上清的拉曼光谱分析

本研究共获得对照组骨髓上清拉曼特征光谱38份、急性淋巴细胞白血病患者骨髓上清拉曼特征光谱135份，急性髓细胞白血病患者骨髓上清拉曼特征光谱371份，其中包括AML-M2患者118份，AML-M3患者73份，AML-M4患者31份，AML-M5患者149份。表1为骨髓上清拉曼光谱的峰位归属。在600～1800cm^-1的范围内可见对照组和急性白血病患者骨髓上清拉曼光谱，形态相近，可以很好地反映出正常对照组和不同类型急性白血病患者骨髓上清中物质的含量、成分(Fig.2)。依据上述光谱图形无法鉴别急性白血病患者组和对照组的样本差异，因此需要使用多变量统计方法建立分类模型。

4.2基于拉曼光谱技术鉴别急性白血病的方法的建立

从Control、AML和ALL三种骨髓上清拉曼光谱结果中随机抽取36张特征光谱(每类12张)，构成三组数据资料。从Control、AML-M2、AML-M3、AML-M4和AML-M5五种骨髓上清拉曼光谱结果中随机抽取30张特征光谱(每类6张)，构成五组数据资料。分别对样本数据应用有监督的正交-偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)展开详细分析比照。OPLS-DA模型下聚类分析分别以97.2％的正确率将Control、AML、ALL三种骨髓上清样本拉曼光谱进行区分(Fig.3a)，以100％的正确率将Control与AML subtypes(AML-M2、AML-M3、AML-M4、AML-M5)骨髓上清样本拉曼光谱进行区分(Fig.3d)。Permutation分析显示，OPLS-DA模型成立，且未过度拟合(Fig.3b、3e)。ROC曲线提示判别分析结果准确性高(Fig.3c、3f)。

4.3基于拉曼光谱技术鉴别急性白血病的方法的验证

方法验证模型的训练集包括10个急性白血病患者光谱和10个对照组光谱。预测集包括另外10个急性白血病患者光谱和10个对照组光谱的OPLS-DA模型，分别组成AML、ALL、AML-M2、AML-M3、AML-M4、AML-M5六个验证模型。根据训练集和预测集的分类得分，绘制一个同时显示训练集和预测集样本的点图。将预测值设为0作为截止值，就可以得到急性白血病诊断模型的敏感性和特异性。AML模型的敏感性为85％，特异性为90％(Fig.4a)。ALL模型的敏感性为85％，特异性为100％(Fig.4b)。AML-M2模型的敏感性为75％，特异性为100％(Fig.4c)。AML-M3模型的敏感性为85％，特异性为95％(Fig.4d)。AML-M4模型的敏感性为90％，特异性为95％(Fig.4e)。AML-M5模型的敏感性为85％，特异性为100％(Fig.4f)。

潜在生物标志物的确定

Control vs AML vs ALL

Fig.5a表明运用有监督的OPLS-DA方法可以很好地甄别Control、AML和ALL患者的骨髓上清光谱数据。在Control vs AML vs ALL模型基础上，将Control、AML、ALL三组样本两两组合，进行OPLS-DA并分析拟合参数情况(Fig.5d-l)。样本被两两成功区分，Permutation分析显示，OPLS-DA模型成立，且未过度拟合，ROC曲线提示判别分析结果准确性高，对急性白血病的诊断具有很好的价值(Fig.S2)。OPLS-DA可以更好地提取光谱中的差异信息，散点图中样本分群明显，说明所建立的模式识别方法使得骨髓上清样本在代谢成分上有明显差异，模型分类效果好，具有很好的鉴别能力(Fig.5d、5g、5j)。在Control vsAML vs ALL模型和三个两两组合模型中，我们分别综合考虑了载荷(Fig.5b、5e、5h、5k)、VIP、相关系数、在V+S图中与中心的距离等相关参数，发现了影响样本分类的重要的拉曼峰位(Table 1)。载荷图显示，Control组中代表胆固醇、蛋白质和核酸的峰位强度普遍高于ALs组，代表胶原的峰位强度低于ALs组。

Control vs AML subtypes

Fig.6a表明运用有监督的OPLS-DA方法可以很好地甄别Control、AML-M2、AML-M3、AML-M4和AML-M5患者的骨髓上清光谱数据。在Control vs AML subtypes模型基础上，将Control与四组AML subtypes样本分别组合，进行OPLS-DA并分析拟合参数情况(Fig.6d-o)。样本被两两成功区分，Permutation分析显示，OPLS-DA模型成立，且未过度拟合，ROC曲线提示判别分析结果准确性高(Fig.S3)。OPLS-DA模型质量参数表示该模型归纳了较多的第一、第二两种主成分的整体信息，概括了因变量较大比例的变异信息，预估精确度较高(Fig.6d、6g、6j、6m)。在Control vs AML subtypes模型和四个两两组合模型中，我们分别综合考虑了载荷(Fig.6b、6e、6h、6k、6n)、VIP、相关系数、在V+S图中与中心的距离等相关参数，发现了对样本分类起主要贡献的拉曼峰位(Table 1)。载荷图显示，Control组中代表胆固醇、蛋白质和核酸的峰位强度普遍高于AML subtypes组，代表胶原的峰位强度低于AMLsubtypes组。

Table 1 Potential biomarkers for OPLS-DA model screening

生物标志物的验证

Control vs AML vs ALL

对来源于Control vs AML vs ALL模型中的潜在生物标志物进行验证，在模型涉及的病种全部拉曼数据范围内进行统计学分析(Fig.7)。Control组代表蛋白质的峰位强度高于ALs组，其中1031、1443和1603cm^-1中Control组与AML、ALL组比较，具有统计学差异(Fig.7a)，与血清生化结果相符(Fig.8a-b)。由于急性白血病患者骨髓存在着细胞增生，细胞的新陈代谢率增加，导致更多的参与特定酶促反应的氨基酸和蛋白质的消费，如酪氨酸激酶。这种酶具有蛋白质底物的磷酸化功能，例如髓过氧化物酶，存在于某些类型的AML中。因此与白血病组相比，对照组的一些氨基酸，特别是Tyr(例如1603cm^-1)和Trp有关的峰值具有更高的强度。Control组代表核酸的峰位1579cm^-1强度高于AML、ALL组(Fig.7a)。这与ALs患者肝损伤导致的ADA升高有关(Fig.8g)。Control组代表脂类/胆固醇的峰位强度高于ALs组，其中1437、1443cm^-1中Control组与AML、ALL组比较，具有统计学差异(Fig.7a)，与血清生化结果一致(Fig.8d-f)。ALs患者因白血病细胞过度生长，需要大量TC合成浆膜，因此血浆TC下降。LDL是TC的主要载体，转运肝合成的内源性TC至全身组织供细胞利用，HDL具有将TC从肝外组织运到肝内代谢的作用，因为TC降低，HDL和LDL因来源减少而降低。Control组代表胶原的峰位859cm^-1强度低于ALs组，并且具有统计学差异(Fig.7a)，这可能与白血病的发生发展中造血微环境在白血病细胞广泛增生和浸润后影响其细胞基质改变，致使胶原合成增多和/或降解减少有关。代表血红蛋白的峰位1579cm^-1强度高于ALs组(Fig.7a)，与血清生化结果相符(Fig.8a)，提示ALs患者存在贫血风险。

在Control/AML/ALL两两组合模型中，代表胶原的峰位859cm^-1在Control组与AML组鉴别中有重要作用，反映AML患者骨髓上清中胶原含量明显高于Control组(Fig.7b)。代表蛋白质的峰位(643、1443、1603cm^-1)、胆固醇的峰位(1437、1443cm^-1)和代表核酸的峰位(1078cm^-1)强度比较结果与Control vs AML vs ALL模型一致(Fig.7b-d)。

AML患者预后相对好于ALL，其血清胆固醇、HDL、LDL含量高于ALL，ADA含量低于ALL(Fig.8d-g)，表明血清胆固醇和ADA含量具有潜在的ALs预后价值。

Control vs AML subtypes

对来源于Control vs AML subtypes模型中的潜在生物标志物进行验证，在模型涉及的病种全部拉曼数据范围内进行统计学分析(Fig.9)。Control组代表蛋白质的峰位1003、1221和1230cm^-1强度高于AML subtypes组，特别是代表胆固醇的峰位1437cm^-1高于AML subtypes，并且与AML-M2、AML-M4、AML-M5相比具有统计学差异(Fig.9a)，与血清生化结果相符(Fig.10a-b,d-f)。

在Control vs AML-M2模型中，代表脂类/胆固醇的峰位1437cm^-1具有显著统计学差异(Fig.9b,p<0.001)。代表核酸的峰位826cm^-1具有统计学差异(Fig.9b，p<0.05)。这与AML患者肝损伤导致的ADA升高有关(Fig.10g)。Control组中代表蛋白质的峰位(621、643、848、1003、1221、1230、1603cm^-1)强度高于AML-M2组，并且具有统计学差异(Fig.9b)。在Control vs AML-M3模型中，代表蛋白质的峰位(1603cm^-1)和代表胶原的峰位(859cm^-1)在鉴别模型中起主要贡献，峰位强度比较情况与前文一致(Fig.9c)。在Control vs AML-M4模型中，代表脂类/胆固醇的峰位(1437、1443cm^-1)具有统计学差异(Fig.9d)。在Control vsAML-M5模型中，代表胶原的峰位(859、1345cm^-1)具有显著统计学差异(Fig.9e)。这些结果分别与生化指标统计结果相一致(Fig.10a-b,d-f)。

AML-M3患者预后好于其他亚型的AML，其血清胆固醇、HDL、LDL含量高于其他亚型的AML，ADA含量低于其他亚型的AML(Fig.10d-g)，表明血清胆固醇和ADA含量具有潜在的AML预后价值。

Claims

1.基于拉曼光谱检测骨髓上清的蛋白质的1443cm^-1和/或脂类的1443cm^-1或胆固醇的1443cm^-1、脂类的1437cm^-1或胆固醇的1437cm^-1、血红蛋白的1579cm^-1和/或核酸的1579cm^-1的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病的产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在急性白血病患者的骨髓上清中蛋白质的1031cm^-1和/或蛋白质的1603cm^-1拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值，胶原蛋白的859cm^-1拉曼峰的的峰位强度高于正常对照平均值。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：拉曼光谱的检测条件为：785nm激光作为激发光，40倍物镜，输出功率为40mW，测量范围600-1800cm^-1，单次积分时间为100s，积分次数为一次，测定石英玻片拉曼光谱作为本底，应用Labspec6软件进行平滑、去背景和基线校正等数据处理，全部光谱以各自的1450cm^-1拉曼峰为内标完成了强度归一化。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在急性白血病患者的骨髓上清中蛋白质的1443cm^-1和/或脂类的1443cm^-1或胆固醇的1443cm^-1、脂类的1437cm^-1或胆固醇的1437cm^-1、血红蛋白的1579cm^-1和/或核酸的1579cm^-1的拉曼峰的峰位强度低于正常对照平均值。

5.基于拉曼光谱检测骨髓上清的脂类的1437cm^-1或胆固醇的1437cm^-1、核酸的826cm^-1峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病AML-M2的产品中的应用。

6.基于拉曼光谱检测骨髓上清的蛋白质的1603cm^-1、胶原蛋白的859cm^-1的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于辅助诊断急性白血病AML-M3的产品中的应用。

7.基于拉曼光谱检测骨髓上清的脂类的1443cm^-1或胆固醇的1443cm^-1、脂类的1437cm^-1或胆固醇的1437cm^-1的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病AML-M4的产品中的应用。

8.基于拉曼光谱检测骨髓上清的胶原蛋白的1345cm^-1、胶原蛋白的859cm^-1的峰位强度的水平作为生物标志物在制备用于预测或检测急性白血病AML-M5的产品中的应用。