CN112740043A - Vista受体 - Google Patents
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Abstract
本公开提供了用于调节(例如，预防、抑制、阻断)PSGL‑1和VISTA与试剂(例如，抗体)相互作用的方法，所述试剂与PSGL‑1和/或VISTA结合。
Description
概述
免疫疗法已成为癌症治疗领域的游戏规则改变者。基于免疫检查点的疗法的发展正以惊人的速度前进。尽管如此，只有小部分患者对免疫疗法有反应。癌症免疫疗法中的一个具体挑战是基于机制鉴定生物标志物，该标志物可用于鉴定此类治疗的候选物并指导疾病的管理决策(Topalian等人，N Engl J Med，366(26)：2443-54(2012))。因此，一个重要的问题是选择患者，因为它可以避免治疗相关的毒性和不太可能受益的患者的花费。
为了确保一旦肿瘤抗原刺激反应，不会持续活化免疫炎性反应，多个控制或“检查点”就位(in place)或被活化。这些检查点大多数由T细胞受体代表，其与周围肿瘤微环境中细胞上的配体结合，形成免疫突触，然后调节T细胞的功能。
VISTA(T细胞活化的V结构域Ig抑制子(Suppressor))是一种负检查点控制蛋白，其调节T细胞活化和免疫反应。它是一种I型跨膜蛋白，其包含单个Ig样V型结构域(该结构域与B7和CD28家族的相似结构域具有同源性)和一个胞内结构域。VISTA胞质尾结构域包含两个潜在的蛋白激酶C结合位点和可以充当停靠位点的脯氨酸残基，表明VISTA可能既作为受体又作为配体。
VISTA与PDL-1同源，但显示出一种仅限于造血区室的独特的表达模式。VISTA在髓样细胞和粒细胞上最高表达，在T细胞上较低水平表达，在B细胞上不存在(Wang等人，JEM208(3)：577-592(2011)；Flies等人，J.Immunology 187(4)：1537-1541(2011))。经过活化或免疫后，在T细胞和髓样细胞群上诱导VISTA，表明炎症诱导VISTA表达(Wang等人，同上)。另一方面，尽管有报道说人胃癌细胞以低频率表达VISTA(
等人，OncoImmunology，6：4，e1293215(2017))，但在肿瘤细胞中未检测到VISTA表达(Le Mercier等人，Cancer Res；74：1933-44(2014))。当存在时，VISTA表达似乎仅限于结肠癌或肺癌的肿瘤微环境中的浸润性CD11b+细胞。但是，需要注意的是，需要进一步的研究来鉴定可能与肿瘤微环境中VISTA表达相关的肿瘤表征(Lines等人，Cancer Immunol Res； 2(6)：510-7(2014))。
VISTA似乎既作为T细胞上的负受体，又作为在APC上表达的与T细胞上未知受体相互作用的配体。
一些发现表明，VISTA通过作为配体与T细胞上未知受体相互作用，负调节T细胞应答。像PD-L1一样，VISTA是显著抑制免疫的配体(Lines等人，Cancer Res；74：192432(2014))，并且像PD-L1一样，阻断VISTA可以在临床前的肿瘤学模型中形成对癌症的治疗性免疫(参见Le Mercier等人，见上文)。尽管阻断VISTA增强免疫，尤其是CD8+和CD4+介导的T细胞免疫，但是用VISTA(VISTA-Ig)的细胞外结构域的可溶性Ig融合蛋白处理，可在体外抑制(inhibit)T细胞增殖和细胞因子产生，而且VISTA在MCA105肿瘤细胞上的过表达干扰小鼠保护性抗肿瘤免疫(Wang等人，同上)。此外，施用VISTA特异性单克隆抗体增强了体内CD4+T细胞应答并在小鼠中形成自身免疫(Wang等人，同上)。另一方面，VISTA似乎具有与其他Ig超家族成员非冗余的功能活性，并且可能在癌症中自身免疫形成和免疫监视中发挥作用。具体而言，虽然使用Fc融合蛋白的研究清楚地表明VISTA具有配体活性(Wang等人，同上，Lines等人，同上)，还已经描述了受体样信号传导活性(Flies等人，JClin Invest；124：1966-75(2014))。事实上，许多研究支持VISTA作为T细胞上的受体的直接负作用。
众所周知，免疫细胞浸润物的组成不仅在不同的肿瘤实体之间不同，而且在相同解剖部位的肿瘤内也不同。作者推测，对不同免疫治疗组合的反应可能取决于患者的免疫环境(Farkona等人，BMC Medicine 14：73(2016))。在此方面，已知可以诱导PDL-1表达逃避免疫攻击(Sharma等人Cell，168：707-23(2017))。PDL-1表达显示出肿瘤内和肿瘤间不同(Mino-Kenudson，Cancer Biol Med，13(2)：157-70(2016))，但与对抗PD-1抗体的客观反应相关(Topalian等人，同上)。另一方面，尚未鉴定出介导蛋白质作用的VISTA结合伴侣(LeMercier等人，Frontiers in Immunology，6：418(2015))。尽管已经启动两项针对抗VISTA分子的I期临床试验，但尚无能够预测患者对这些治疗反应的生物标志物。因此，有必要确定VISTA的结合伴侣，因为这将有助于治疗形成，并能够选择对抗VISTA治疗剂治疗易感的患者。
与本文描述的那些类似或等同的所有方法和材料都可以用于本发明的实践或测试中，其中本文描述了合适的方法和材料。除非另有说明，否则本发明的实践采用本领域技术范围内的常规技术或蛋白质化学、分子病毒学、微生物学、重组DNA技术和药理学。这样的技术在文献中得到充分阐述(参见，例如，Ausubel等人，Short Protocols in MolecularBiology，Current Protocols；第5版，2002；Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Co.Easton，Pa.，1985年；和Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press；第三版，2001年)。本文描述的与分子和细胞生物学、蛋白质生物化学、酶学以及医疗化学和药物化学结合使用的命名法以及实验室程序和技术是本领域公知和通常使用的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、和其他参考文献通过引用其整体并入本文。此外除非另有说明，否则材料、方法和实施例仅用于阐述目的而并不旨在限制本发明。
根据以下具体说明和权利要求，本发明的其他特征和优势将是显而易见的。
附图说明
图1显示使用TRICEPS试剂的CAPTIRECTM筛选过程的流程图。目的配体是VISTA-Fc融合蛋白。对照配体是抗CD28抗体。
图2显示PSGL-1的Protter图示。N-糖基化位点由正方形圈住的残基表示，实验观察到的肽由在圆圈内填充表示。
图3显示VISTA-Fc与PSGL-1构建体A的胞外结构域的示例性结合测定的结果。
图4显示VISTA-Fc与PSGL-1构建体B的胞外结构域的示例性结合测定的结果。
图5显示通过流式细胞术检测HL-60细胞中PSGL-1的示例性直方图。同种型和背景由灰色阴影峰表示，而表达PSGL-1的细胞由白色阴影峰表示。
图6显示示例性蛋白质印迹，其检测VISTA和PSGL-1之间的相互作用。PSGL-1用箭头表示；已知PSGL-1不完全还原会导致多于一个的条带。
图7显示抗VISTA抗体减弱VISTA和PSGL-1之间相互作用的条形图。每个棒代表对应于PSGL-1蛋白的条带强度。“-”号表示未添加抗VISTA抗体。“+”号代表与抗VISTA抗体的预孵育。
图8显示通过流式细胞术检测PBMC中的PSGL-1的示例性直方图。同种型和背景由灰色阴影峰表示，而表达PSGL-1的细胞由白色阴影峰表示。
图9显示示例性蛋白质印迹，其显示使用抗VISTA和抗PSGL-1抗体进行的PSGL-1的免疫共沉淀。PSGL-1如箭头所指。
图10显示在初始的和静止的、效应性和耗竭性效应子T细胞子集的示例性流式细胞术测定中的PSGL-1表达。
图11显示在循环中央记忆和循环效应记忆T细胞子集的示例性流式细胞术测定中的PSGL-1表达。
图12显示在鳞状肺肿瘤上对PSGL1、VISTA和PDL1的mRNA进行多重染色的例子。
图13显示PSGL-1抑制从CD4+T细胞中释放VISTA依赖性IL-2的条形图。
发明内容
定义
除非另有定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。所有专利、申请、公开的申请和其他出版物均通过引用全文并入。如果本文的术语有多种定义，除非另有说明，否则以本节中的定义为准。
术语“约(about)”或“大约(approximately)”是指对于本领域技术人员已知的给定值或范围的正常误差范围。它通常表示在给定值或范围的20％之内，例如10％之内，或5％(或1％或更少)之内。
如本文所用，“施用(administer)”或“施用(administration)”是指将存在于体外的物质(例如，本文提供的抗PSGL-1抗体和/或抗VISTA抗体)通过注射或以其他物理递送的方式进入患者的行为，诸如通过粘膜、皮内、静脉内、肌内递送和/或本文所述或本领域已知的任何其他物理递送方法。当治疗疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作之后施用该物质。当预防疾病或其症状时，通常在疾病或其症状发作之前施用该物质。
如本文所用，“拮抗剂”或“抑制剂”是指能够抑制或以其他方式降低靶蛋白(例如，PSGL-1、VISTA或本文所述的不同共抑制分子)的一种或多种生物活性的分子。在一些实施方案中，PSGL-1的拮抗剂(例如，本文提供的拮抗性抗体)可以例如通过抑制或以其他方式降低表达PSGL-1的细胞(例如，T细胞)和/或表达VISTA的细胞(例如，携带VISTA的肿瘤细胞、调节性T细胞、髓系来源的抑制细胞、或树突状抑制细胞)的活化和/或细胞信号传导途径而起作用，从而相对于在没有拮抗剂情况下的生物活性抑制该细胞的生物活性。在一些实施方案中，本文提供的抗体是拮抗性抗PSGL-1抗体。在一些实施方案中，共抑制分子的拮抗剂(例如，针对VISTA、CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2、B7-H3、B7-H4、嗜乳脂蛋白(butyrophilin)、CD48、CD244、TIM-3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、HVEM、LAIR1、TIM1、半乳凝素9(半乳糖蛋白9)、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113或TIGIT的拮抗性抗体)可以例如通过抑制或以其他方式降低表达共抑制分子的细胞(例如，T细胞或抗原提呈细胞)的活化和/或细胞信号传导途径而起作用，从而相对于在没有拮抗剂情况下的生物活性抑制该细胞的生物活性。在一些实施方案中，拮抗剂分子是拮抗性抗体，即抑制或降低抗原(例如PSGL-1、VISTA或本文所述的不同共抑制分子)的一种或多种生物活性的抗体。某些拮抗性抗体基本上或完全抑制所述抗原的一种或多种生物活性。
如本文所用，“激动剂”或“活化剂”是指能够活化或以其他方式增加靶蛋白(例如共刺激分子)的一种或多种生物活性的分子。在一些实施方案中，共刺激分子的激动剂(例如，CD154、TNFRSF25、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD28、CD40、TL1A、GITRL、41BBL、OX40L、CD70、HHLA2、ICOSL、细胞因子、LIGHT、HVEM、CD30、CD30L、B7-H2、CD80、CD86、CD40L、TIM4、TIM1、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、DR3、GITR、CD2和CD226的激动性抗体)，例如，通过活化或以其他方式增加表达共刺激分子的细胞(例如，T细胞或抗原提呈细胞)的活化和/或细胞信号传导途径来起作用，从而相对于没有激动剂时的生物活性提高细胞的生物活性。在一些实施方案中，激动剂分子是激动性抗体，即活化或增加抗原(例如，PSGL-1、VISTA或本文所述的不同的共抑制分子)的一种或多种生物活性的抗体。某些激动性抗体基本或完全活化所述抗原的一种或多种生物活性。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”或“Ig”在本文可互换使用。这些术语在广义上用于本文，具体涵盖任何同种型的单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)(例如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE)、多克隆抗体、多特异性抗体、嵌合抗体和抗体片段，只要所述片段保留所想要的生物功能。与特定抗原反应的抗体可以通过重组方法产生，例如在噬菌体或类似载体中选择重组抗体的文库，或通过用抗原或编码抗原的核酸对动物进行免疫。这些术语旨在包括多肽的免疫球蛋白类别内的B细胞多肽产物，其能够与特定分子抗原结合并由两对相同的多肽链组成，其中每对具有一条重链(约50-70kDa)和一条轻链(约25kDa)，并且每条链的每个氨基末端部分都包含约100至约130个或更多氨基酸的可变区，每条链的每个羧基末端部分均包含一个恒定区(参见，Borrebaeck(编)(1995)Antibody Engineering，第二版，OxfordUniversity Press.Kuby(1997)Immunology，第三版，W.H.Freeman and Company，纽约)。在一些实施方案中，本文提供的抗体可以结合的特异性分子抗原包括靶标PSGL-1多肽、片段或表位。
抗体还包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、驼源化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、抗独特型抗体(抗Id)抗体、以及上述任何一项的功能片段(其指抗体重链或轻链多肽的一部分，其保留了衍生该片段的抗体的部分或全部结合活性)。功能片段的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，例如包含与VISTA抗原结合的抗原结合位点的抗原结合结构域或分子(例如，抗VISTA抗体的一个或多个互补决定区(CDR))。此类抗体片段可见于描述，例如，Harlow and Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，纽约(1989)；Myers(编)，Molec.Biology and Biotechnology：A Comprehensive Desk Reference，纽约：VCH Publisher，Inc.；Huston等人，Cell Biophysics，22：189-224(1993)；Plückthun和Skerra，Meth.Enzymol.，178：497-515(1989)和Day，E.D.，Advanced Immunochemistry，第二版，Wiley-Liss，Inc.，纽约，纽约州(1990)。本文提供的抗体可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、任何类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)、或任何亚类(例如，IgG2a和IgG2b)。本文提供的抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体可以是激动性抗体或拮抗性抗体。
术语“抗PSGL-1抗体”、“与PSGL-1结合的抗体”、“与PSGL-1表位结合的抗体”和类似术语在本文中可互换使用，是指与PSGL-1多肽(例如PSGL-1抗原或表位)结合的抗体。这样的抗体包括人源化抗体。与PSGL-1抗原结合的抗体可能与相关抗原发生交叉反应。在一些实施方案中，结合PSGL-1的抗体不与其他抗原交叉反应。在一些实施方案中，本文所述的抗PSGL-1抗体不阻断或抑制PSGL-1与P-选择蛋白、L-选择蛋白或E-选择蛋白的结合。可以例如通过免疫测定、BIAcore、或本领域技术人员已知的其他技术来鉴定与PSGL-1结合的抗体。例如，如使用放射免疫测定(RIA)和酶联免疫吸附测定(ELISA)等实验技术所确定的，例如当抗体与PSGL-1结合的亲和力比与任何交叉反应性抗原的亲和力更高时，所述抗体结合PSGL-1，例如抗体特异性性结合PSGL-1。通常，特异性或选择性反应将是背景信号或噪声的至少两倍，并且可能是背景的十倍以上。关于抗体特异性的讨论，参见，例如，Paul编辑，1989，Fundamental Immunology第二版，Raven Press，纽约，第332-336页。在一些实施方案中，“结合”目的抗原的抗体是以足够的亲和力结合抗原的抗体，以使得该抗体可用作靶向表达该抗原的细胞或组织的诊断和/或治疗剂，而不与其他蛋白质发生明显的交叉反应。在此类实施方案中，如通过荧光活化细胞分选(FACS)分析或放射免疫沉淀法(RIA)所测定，抗体与“非靶标”蛋白的结合程度将小于抗体与其特定靶标蛋白的结合的约10％。关于抗体与靶分子的结合，术语“特异性结合”、或“特异性结合”、或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位指可测量的与非特异性相互作用不同的结合。例如，可以通过分子与对照分子的结合相比确定分子的结合来测量特异性结合，所述对照分子通常是不具有结合活性的具有相似结构的分子。例如，可以通过与靶标相似的对照分子(例如，过量的未标记靶标)竞争来确定特异性结合。在这种情况下，如果过量的未标记的靶标竞争性抑制标记的靶标与探针的结合，则表明特异性结合。本文所用的术语“特异性结合”或“特异性结合到”或“特异于”特定多肽或特定多肽靶标上的表位，例如，可以通过对靶标具有以下KD的分子来表现：至少约10-4M、或者至少约10-5M、或者至少约10-6M、或者至少约10-7M、或者至少约10-8M、或者至少约10-9M、或者至少约10-10M、或者至少约10-11M、或者至少约10-12M、或者更大。在一些实施方案中，术语“特异性结合”指分子结合至特定多肽或特定多肽上的表位而基本上不结合任何其他多肽或多肽表位的结合。在一些实施方案中，与PSGL-1或VISTA结合的抗体具有解离常数(KD)为≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、或≤0.1nM。在一些实施方案中，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体结合PSGL-1或VISTA的表位，该表位在不同物种的PSGL-1或VISTA中是保守的。
“抗原”是抗体可以选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其他天然存在或合成的化合物。在一些实施方案中，靶抗原是多肽，包括例如PSGL-1多肽。
术语“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗原结合区域”和类似术语是指抗体的部分，其包含与抗原相互作用并赋予结合剂对抗原的特异性和亲和力的氨基酸残基(例如，互补决定区(CDR))。
术语“抗原提呈细胞”或“APC”是指免疫细胞的异质性组，其通过加工和呈递某些淋巴细胞(例如T细胞)识别的抗原来介导细胞免疫应答。APC包括但不限于树突状细胞、巨噬细胞、朗格汉斯细胞和B细胞。
如本文所用，术语“结合”或“结合”是指分子之间形成复合物的相互作用。相互作用可以是，例如非共价相互作用，包括氢键、离子键、疏水相互作用、和/或范德华相互作用。复合物还可包括通过共价或非共价键、相互作用或作用力结合在一起的两个或多个分子的结合。抗体上的单个抗原结合位点与靶标分子(例如PSGL-1)的单个表位之间的总非共价相互作用的强度是抗体或功能片段对该表位的亲和力。抗体对单价抗原的结合(k1)与解离(k-1)之比(k1/k-1)为结合常数K，其是亲和力的量度。K的值因抗体和抗原复合物的不同而异，并且取决于k1和k-1。可以使用本文提供的任何方法或本领域技术人员众所周知的任何其他方法来确定本文提供的抗体的结合常数K。在一个结合位点的亲和力并不总是反映出抗体和抗原之间相互作用的真实强度。当包含多个重复抗原决定簇的复杂抗原(例如多价PSGL-1)与包含多个结合位点的抗体接触时，抗体在一个位点与抗原的相互作用将增加在第二个位点发生反应的概率。多价抗体和抗原之间这种多重相互作用的强度称为亲合性(avidity)。抗体的亲合性可以比其单个结合位点的亲和力更好地测量其结合能力。例如，高的亲合性可以弥补低亲和力，就像有时会发现在五聚体IgM抗体中，其可具有比IgG较低的亲和力，但是由于其多价性使其能够有效结合抗原，使得五聚体IgM抗体具有高的IgM亲合性。
术语“生物样本”是指已经从诸如患者或受试者的生物来源获得的样本。在一些实施方案中，生物样本包括但不限于全血、部分纯化的血液、PBMC、组织活检等。优选地，生物样本是肿瘤样本。在一些优选的实施方案中，通过组织活检(例如，可以包括免疫浸润物的肿瘤活检)获得生物样本。
当在抗体的背景中使用时，术语“阻断”或其语法等同物，是指预防或阻止该抗体结合的抗原的生物活性的抗体。阻断抗体包括与抗原结合而不会引起反应的抗体，其阻断另一种蛋白质随后与该抗原结合或复合。抗体的阻断作用可能是导致抗原的生物活性发生可测量变化的一种。在一些实施方案中，本文所述的抗PSGL-1抗体阻断VISTA结合PSGL-1的能力，这可以导致抑制或阻断VISTA的抑制信号。本文所述的某些抗PSGL-1抗体抑制或阻断表达VISTA的细胞上VISTA的抑制信号，与适当的对照(例如，对照是未经待测试的抗体处理的细胞)相比包括抑制或阻断约98％至约100％。在一些实施方案中，本文所述的抗PSGL-1抗体阻断PSGL-1与细胞外结构域VISTA的结合和/或阻断表达VISTA的细胞与表达PSGL-1的细胞的结合。在一些实施方案中，本文所述的抗PSGL-1抗体不阻断PSGL-1与除VISTA以外的蛋白质(例如，P-选择蛋白、L-选择蛋白、和/或E-选择蛋白)结合。
术语“VISTA”或“VISTA多肽”和类似术语是指由人染色体10开放阅读框54(OpenReading Frame 54)(VISTA)基因编码的多肽(“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用)，在本领域中也称为B7-H5、血小板受体Gi24、GI24、应激诱导分泌蛋白1(StressInduced Secreted Protein1)、SISP1和PP2135，例如，其包含以下氨基酸序列：
和相关的多肽，包括其SNP变体。已显示或预测VISTA多肽在氨基酸序列内包含几个不同的区域，包括：信号序列(残基1-32；参见Zhang等人，Protein Sci.13：2819-2824(2004))；免疫球蛋白结构域-IgV样(残基33-162)；和跨膜区(残基195-215)。成熟的VISTA蛋白包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基33-311。VISTA蛋白的细胞外结构域包括SEQ ID NO：1的氨基酸残基33-194。相关多肽包括等位基因变体(例如，SNP变体)；剪接变体；片段；衍生物；取代、删除、和插入变体；融合多肽；物种间的同源物，优选地，其保留VISTA活性和/或足以产生抗VISTA免疫应答。VISTA可以天然或变性形式存在。本文所述的VISTA多肽可从多种来源分离，例如从人组织类型或另一种来源分离，或通过重组或合成方法制备。“天然序列VISTA多肽”包括具有与源自自然的相应VISTA多肽相同氨基酸序列的多肽。这样的天然序列VISTA多肽可以从自然中分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列VISTA多肽”具体涵盖特定VISTA多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，细胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和天然存在的多肽的等位基因变体。
编码VISTA多肽的cDNA核酸序列，例如，包括：
如本文所述，VISTA是免疫调节子，其是免疫应答的负检查点调节子(例如，抑制或抑制免疫应答)。如本文所述，PSGL-1是VISTA的受体。如本文所述，用于调节(例如，预防、抑制、阻断)PSGL-1和VISTA与结合PSGL-1和/或VISTA的试剂(例如抗体)相互作用的方法是有用的，包括例如，用于抑制或阻断VISTA的抑制信号。调节VISTA和PSGL-1的相互作用可导致免疫反应增强，包括免疫活化(例如，T细胞活化，如T细胞增殖)增强。在本文所述方法中有用的与VISTA结合的抗体包括WO2014/197849(PCT/US2014/041388)中公开的那些。
VISTA多肽的直系同源物也是本领域众所周知的。例如，VISTA多肽的小鼠直系同源物是含V区免疫球蛋白的T细胞活化的抑制子(V-region Immunoglobulin-containingSuppressor of T cell Activation，VISTA)(也称为PD-L3、PD-1H、PD-XL、Pro1412和UNQ730)，与人多肽具有约70％序列同一性。VISTA的直系同源物也可以在其他生物中找到，包括黑猩猩、牛、大鼠和斑马鱼。
“表达VISTA的细胞”、“具有VISTA表达的细胞”、或其语法等同物是指在细胞表面表达内源或转染的VISTA的细胞。表达VISTA的细胞包括携带VISTA的肿瘤细胞，调节性T细胞(例如CD4+Foxp3+调节性T细胞)、髓系来源的抑制细胞(例如，CD11b+或CD11b高髓系来源的抑制细胞)和/或抑制性树突状细胞(例如，CD11b+或CD11b高树突状细胞)。表达VISTA的细胞在其表面上产生足够水平的VISTA，使得抗VISTA抗体可以与其结合和/或PSGL-1或表达PSGL-1的细胞可以与其结合。在一些方面，抑制或阻断这种结合可以具有治疗作用。与已知表达VISTA的相同组织类型的细胞相比，“过表达”VISTA的细胞是在其细胞表面具有显著更高水平VISTA的细胞。可能是由于基因扩增或通过增加转录或翻译导致这种过表达。通过评估细胞表面上存在的VISTA蛋白增加的水平，可以在诊断或预后测定中确定VISTA过表达(例如，通过免疫组织化学测定；FACS分析)。可选择的、或另外的，可以测量细胞中编码VISTA的核酸或编码VISTA的mRNA的水平，例如，通过荧光原位杂交；(FISH；参见1998年10月发布的W098/45479)、Southern印迹、Northern印迹、或聚合酶链反应(PCR)技术，如实时定量PCR(RT-PCR)。除上述测定之外，技术人员还可以进行各种体内测定。例如，可以使患者体内的细胞暴露于任选用可检测试剂标记的抗体，并且可以评估该抗体与患者体内细胞的结合，例如，通过外部扫描放射活性或通过分析从之前暴露至抗体的患者处获得的活检。表达VISTA的肿瘤细胞包括，但不限于急性髓系白血病(AML)肿瘤细胞。
“VISTA介导的疾病”、“VISTA介导的病症”和“VISTA介导的病状”可互换使用，是指完全或部分由VISTA引起或导致的任何疾病、病症或病状。此类疾病、病症或病状包括由VISTA引起或以其他方式与其相关的那些，包括由表达VISTA的细胞(例如，肿瘤细胞、髓系来源的抑制细胞(MDSC)，抑制性树突状细胞(抑制性DC)、和/或调节性T细胞(T-reg))所引起的或与其相关的那些。在一些实施方案中，VISTA在细胞表面上异常地(例如，高度地)表达。在一些实施方案中，VISTA可以在特定细胞类型上异常上调。在其他实施方案中，由VISTA与(可以结合或以其他方式与VISTA相互作用的)VISTA受体(例如，PSGL-1)结合引起正常、异常或过度的细胞信号传导。
术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”是指与某种程度的异常细胞增殖相关的病症。在一些实施方案中，细胞增殖性病症是肿瘤或癌症。如本文所用，“肿瘤”是指所有赘生性细胞生长和增殖(无论是恶性还是良性)，以及所有癌前和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性病症”、“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中并不互相排斥。术语“癌症”和“癌性”是指或描述哺乳动物中通常以细胞生长不受控制为特征的生理状况。癌症的示例包括但不限于癌、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病、或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体示例包括鳞状细胞癌(例如，上皮鳞状细胞癌)、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃或胃的癌症(包括胃肠道癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、子宫颈癌、卵巢癌、口腔癌、肝癌、膀胱癌、泌尿道癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜或子宫癌、唾液腺癌、肾或肾脏癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、黑素瘤、多发性骨髓瘤、和B细胞淋巴瘤、脑癌、以及头部和颈部癌症、以及相关的转移。在一些实施方案中，所述癌症是血液癌症，其是指始于血液形成组织(例如，骨髓)、或免疫系统的细胞中的癌症。血液癌症的示例是白血病(例如，急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、或急性单核细胞性白血病(AMoL))、淋巴瘤(霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤)、和骨髓瘤(多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、局限性骨髓瘤或髓外骨髓瘤)。
“共抑制分子”(也称为“负检查点调节子”或“NCR”)是指这样的分子，其通过与配体或反受体结合之后向T细胞递送负信号来下调免疫应答(例如，T细胞活化)。共抑制分子的示例性功能是防止不成比例的免疫活化、最小化附带损害、和/或维持外周自我耐受。在一些实施方案中，共抑制分子是抗原提呈细胞表达的配体或受体。在一些实施方案中，共抑制分子是由T细胞表达的配体或受体。在一些实施方案中，共抑制分子是抗原提呈细胞和T细胞两者都表达的配体或受体。
“共刺激分子”是指这样的分子，其通过与配体或反受体结合之后向T细胞递送负信号来上调免疫应答(例如，T细胞活化)。为了使T细胞完全活化，需要两个信号：1)通过T细胞受体与抗原提呈细胞上的肽-MHC分子相互作用提供抗原特异性信号；2)共刺激信号(其是抗原非特异性的)，由抗原提呈细胞膜上表达的共刺激分子与T细胞之间的相互作用提供。T细胞共刺激可提供T细胞增殖、分化和存活。在一些实施方案中，共刺激分子是配体或抗原提呈细胞表达的受体。在一些实施方案中，共刺激分子是配体或由T细胞表达的受体。在一些实施方案中，共刺激分子是抗原提呈细胞和T细胞两者表达的配体或受体。
“化学治疗剂”是可用于治疗癌症的化学或生物学试剂(例如，包括小分子药物或生物制剂(例如抗体或细胞)的试剂)，而与作用机理无关。化学治疗剂包括用于靶向治疗和常规化疗的化合物。化学治疗剂的示例包括但不限于烷化剂，例如噻替帕和
环磷酰胺；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮杂环丙烷，例如苯佐替哌(benzodopa)、卡波醌、米得哌(meturedopa)、和乌得哌(uredopa)；乙烯亚胺和甲基蜜胺类包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑密胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫化磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)以及三羟甲基密胺(trimethylolomelamine)；多聚乙酰(特别是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)；δ-9-四氢大麻酚(屈大麻酚(Dronabinol)，
)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙碱；白桦脂酸；喜树碱(包括合成的类似物拓扑替康(topotecan)
、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，
)，乙酰喜树碱，东莨菪碱(scopolectin)、和9-氨基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；callVstatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素；鬼臼酸；替尼泊苷；隐藻素(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司汀；杜卡霉素(包括合成类似物；KW-2189和CB1-TM1)；软珊瑚醇(eleutherobin)；潘克拉汀(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海绵抑制素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlomaphazine)、氯磷酰胺(chlorophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆固醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝基脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类(enediyne)抗生素(例如，加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ11和加利车霉素ω1I(参见，例如Angew，Chem.Intl.编.Engl.33：183-186(1994))；达内霉素(dynemicin)，包括达内霉素A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌菌素(neocarzinostatin)生色团和相关生色蛋白烯二炔类抗生素生色团)、阿克拉霉素类(aclacinomysins)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(authramycin)、重氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(caminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、更生霉素(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、
多柔比星(doxorubicin)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、依达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素(mitomycins)，诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(mbercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、环硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；氨苯吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依氟鸟氨酸(eflornithine)；依利醋铵(elliptinium acetate)；埃博霉素(epothilone)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼；丙卡巴肼(procarbazine)；
多糖复合物(JHSNatural Products，Eugene，Oreg.)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofuran)；锗螺胺(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2”-三氯三乙胺；单端孢菌烯类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、verracurin A、杆孢菌素(roridin)A和蛇形菌素(anguidine))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(
)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)("Ara-C")；噻替哌(thiotepa)；紫杉醇类(taxoids)，例如
紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)、ABRAXANETM(不含克列莫佛(Cremophor-free))、紫杉醇的白蛋白工程化纳米颗粒制剂(American Pharmaceutical Partners，Schaumberg，IL.)和
多西他塞(Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥(chloranmbucil)；吉西他滨(gemcitabine)
6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨喋呤；铂类似物，诸如顺铂和卡铂；长春碱(vinblastine)
铂；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)
奥沙利铂；四氢叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)
能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤；伊班膦酸钠；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(difluoromethylomithine)(DMFO)；类视黄醇，诸如视黄酸；卡培他滨
以及上述任何的药学上可接受的盐、酸或衍生物；以及上述两个或多个的组合，例如CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和泼尼松龙的联合疗法的缩写)、和FOLFOX(使用奥沙利铂(ELOXATINTM)与5-FU以及亚叶酸组合治疗方案的缩写)。其他化学治疗剂包括可用作抗体药物缀合物的细胞毒剂，例如美登木素生物碱(例如，DM1和DM4)和耳他汀类药物(例如，MMAE和MMAF)。
化疗治疗剂的定义中还包括：(i)能够调节或抑制激素对肿瘤作用的抗激素试剂，例如抗雌激素药和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括，例如他莫昔芬(包括
；柠檬酸他莫昔芬)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、三恶昔芬、keoxifene，LY 117018、Onapristone和
(柠檬酸托米芬)；ii)抑制酶芳香化酶的芳香化酶抑制剂，其调节肾上腺中雌激素产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、
(醋酸甲孕甾酮)、
(依西美坦；辉瑞)、甲福斯汀、法倔唑(fadrozole)、
(伏氯唑(vorozole))、
(letrozole；Novartis)和
(anastrozole；AstraZeneca)；(iii)抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)和戈舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧杂环戊烷核苷胞嘧啶类似物)；(iv)蛋白激酶抑制剂，例如ME抑制剂(WO2007/044515)；(v)脂质激酶抑制剂；(vi)反义寡核苷酸，具体为抑制牵涉异常细胞增殖的信号传导途径中的基因表达的那些，例如PKC-α、Raf和H-Ras，例如oblimersen(
Genta Inc.)；(vii)核酶，诸如VEGF表达抑制剂(例如，
)和HER2表达抑制剂；(viii)疫苗，诸如基因疗法疫苗，例如，
和
rIL-2；拓扑异构酶1抑制剂，诸如
rmRH；(ix)抗血管生成剂，例如贝伐单抗(
Genentech)；(x)免疫调节剂，例如双特异性T细胞结合(BITE)抗体和嵌合抗原受体(CAR)T细胞；以及上述任何的药学上可接受的盐、酸和衍生物。
“CDR”是指免疫球蛋白(Ig或抗体)VH β-片层框架的非框架区内的三个高变区(H1、H2或H3)之一，或抗体VL β-片层框架的非框架区内的三个高变区(L1、L2或L3)之一。因此，CDR是散布在框架区序列内的可变区序列。CDR区是本领域技术人员众所周知的，并且已经由例如Kabat定义为抗体可变(V)结构域内最具高变性的区域(Kabat等人，J.Biol.Chem.252：6609-6616(1977)；Kabat，Adv.Prot.Chem.32：1-75(1978))。Chothia还将CDR区序列结构上定义为不属于保守的β-片层框架部分的那些残基，因此能够适应不同的构象(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。两种术语在本领域中是众所周知的。CDR区序列也已由AbM、Contact和IMGT定义。已通过比较众多结构确定了典型抗体可变结构域中CDR的位置(Al-Lazikani等人，J.Mol.Biol.273：927-948(1997)；Morea等人，Methods 20：267-279(2000))。由于高变区中的残基数在不同的抗体中会有所不同，因此相对于典型位置的其他残基通常在典型可变结构域编号方案中，在残基编号旁边用a、b、c等编号(Al-Lazikani等人，同上(1997))。类似地，这样的命名对于本领域技术人员是众所周知的。
当在本文中使用时，术语“高变区”、“HVR”或“HV”是指序列高变和/或形成结构上定义的环的抗体可变结构域的区域。通常，抗体包含六个高变区；三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。许多高变区描述(delineation)正在使用中，并且包括在本文中。Kabat CDR基于序列变异性，是最常用的(Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版。美国国立卫生研究院公共卫生服务，Bethesda，MD(1991))。而Chothia指结构环的位置(Chothia和LeskJ Mol.Bioi.196：901-917(1987))。当使用Kabat编号规则编号时，Chothia CDR-HI环的末端在H32至H34之间，这取决于环的长度(这是因为Kabat编号方案将插入放置在H35A和H35B上；如果35A和35B都不存在，则该环在32处结束；如果仅存在35A，则该环在33处结束；如果同时存在35A和35B，则该环在34处结束)。AbM高变区代表Kabat CDR和Chothia结构环之间的折衷，并被Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”高变区基于对可用复合晶体结构Res.的分析。来自这些高变区的每个的残基在下面指出。
最近，已经开发并广泛采用通用编号系统ImMunoGeneTics(IMGT)Information
(Lafranc等人，Dev.Comp.Immunol.27(1)：55-77(2003))。IMGT是一个专门针对人类和其他脊椎动物的免疫球蛋白(IG)、T细胞受体(TR)和主要组织相容性复合体(MHC)的集成信息系统。在本文中，CDR是既指氨基酸序列又指轻链或重链内位置的术语。因为免疫球蛋白可变结构域的结构内CDR的“位置”在物种之间是保守的、并且存在于称为环的结构中，所以通过使用比对可变结构域序列的编号系统，根据结构特征，可以容易地鉴定CDR和框架残基。该信息可用于将一个物种的免疫球蛋白的CDR残基嫁接和替换至通常来自人抗体的受体框架中。Kabat编号和IMGT唯一编号系统之间的对应关系也是本领域技术人员众所周知的(例如，Lefranc等人，同上)。本文所示的示例性系统结合了Kabat和Chothia。
表1：CDR定义
高变区可以包括“扩展高变区”，如下所示：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)和VH中的26-35或26-35A(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102、或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基根据上文Kabat等人25编号。如本文所用，术语“HVR”和“CDR”可互换使用。
术语“恒定区”或“恒定结构域”指轻链和重链的羧基末端部分，其不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出多种效应子功能，例如与Fc受体的相互作用。该术语是指免疫球蛋白分子的部分，其相对于免疫球蛋白的其他部分(即包含抗原结合位点的可变结构域)具有更保守的氨基酸序列。恒定结构域包含重链的CH1、CH2和CH3结构域，以及轻链的CL结构域。
在多肽的上下文中，如本文所用，术语“衍生物”是指通过引入氨基酸残基取代、缺失或添加而改变的包含PSGL-1多肽的氨基酸序列的多肽、PSGL-1多肽的片段、或与PSGL-1多肽结合的抗体。如本文所用，术语“衍生物”还指已被化学修饰的PSGL-1多肽、PSGL-1多肽的片段、或与PSGL-1多肽结合的抗体，所述化学修饰例如，将任何类型的分子通过共价连接至多肽。例如，但不限于，可以化学修饰(例如，通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、通过已知保护/封闭基团的衍生化、蛋白水解切割、连接到细胞配体或其它蛋白等)PSGL-1多肽、PSGL-1多肽的片段或PSGL-1抗体。以与天然存在或起始的肽或多肽不同方式(无论是所连接分子的类型或位置)修饰衍生物。衍生物还包括缺失在肽或多肽上天然存在的一个或多个化学基团。PSGL-1多肽的衍生物、PSGL-1多肽的片段、或PSGL-1抗体可以使用本领域技术人员已知的技术(包括但不限于特定化学切割、乙酰化、制剂、衣霉素的代谢合成等)通过化学修饰来进行化学修饰。此外，PSGL-1多肽的衍生物、PSGL-1多肽的片段、或PSGL-1抗体可以包含一种或多种非经典氨基酸。多肽衍生物具有与本文所述的PSGL-1多肽、PSGL-1多肽的片段、或PSGL-1抗体相似或相同的功能。
如本文所用，术语“可检测探针”是指提供可检测信号的组合物。该术语包括，但不限于通过其活性提供可检测信号的任何荧光团、生色团、放射性标记、酶、抗体或抗体片段等。
术语“诊断剂”是指施加给受试者的有助于疾病诊断的物质。此类物质可用于揭示、查明、和/或限定致病过程的定位。在一些实施方案中，诊断剂包括与本文提供的抗体缀合的物质，当诊断剂施用至受试者或其与受试者的样本接触时，其有助于癌症、肿瘤形成、或任何其他VISTA介导的疾病、病症或病状的诊断。
术语“可检测的试剂”是指可用于确定样本或受试者中所想要分子(例如本文提供的抗体)出现或存在的物质。可检测的试剂可以是能够被可视化的物质、或者可以被确定和/或测量(例如，通过定量)的物质。
如本文所用，术语“检测”涵盖定量或定性检测。
如本文所用，术语“编码”或其语法等同物涉及核酸分子时，是指处于天然状态或者当通过本领域技术人员公知的方法操作时可转录产生mRNA的核酸分子，然后将mRNA翻译成多肽和/或其片段。反义链是这种核酸分子的互补序列，并且可以由此推导出编码序列。
如本文所用，术语“表位”是指抗体结合的抗原(例如，PSGL-1多肽或PSGL-1多肽片段)的区域。优选地，本文所用的表位是抗原(例如PSGL-1多肽或PSGL-1多肽片段)表面上的定位区域，其能够与抗体的一个或多个抗原结合区域结合，并且其在动物(如哺乳动物，(例如人))中具有抗原活性或免疫原性活性，其能够引发免疫应答。具有免疫原性活性的表位是在动物中引发抗体应答的多肽的一部分。具有抗原活性的表位是通过本领域公知的任何方法(例如通过免疫测定法)确定的抗体结合的多肽的一部分。抗原表位不必一定是免疫原性的。表位通常由分子的化学活性表面基团(例如氨基酸或糖侧链)组成，并具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。表位可以由连续的残基或通过抗原蛋白的折叠紧密接近的非连续残基形成。由连续氨基酸形成的表位通常在暴露于变性溶剂时保留，而由非连续氨基酸形成的表位通常在所述暴露下丢失。在一些实施方案中，PSGL-1表位是PSGL-1多肽的三维表面特征。在其他实施方案中，PSGL-1表位是PSGL-1多肽的线性特征。通常，抗原具有几个或许多不同的表位，并与许多不同的抗体反应。
如本文所用，术语“赋形剂”是指通常用作稀释剂、载剂、防腐剂、结合剂或稳定剂的惰性物质，包括、但不限于蛋白质(例如，血清白蛋白等)、氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、甘氨酸、组氨酸等)、脂肪酸和磷脂(例如，烷基磺酸盐、辛酸盐等)、表面活性剂(例如，SDS、聚山梨酸酯、非离子表面活性剂等)、糖类(例如，蔗糖、麦芽糖、海藻糖等)和多元醇(例如，甘露糖醇、山梨醇等)。还可参见Remington′s Pharmaceutical Sciences，(1990年)，Mack PublishingCo.Easton，PA，其全部内容通过引用并入本文。
在肽或多肽的上下文中，本文所用的术语“片段”是指包含少于全长氨基酸序列的肽或多肽。这样的片段可以，例如来自氨基末端的截短、羧基末端的截短、和/或氨基酸序列的残基的内部缺失。片段可以，例如由选择性RNA剪接或体内蛋白酶活性产生。在一些实施方案中，PSGL-1或VISTA片段包含多肽，所述多肽包含PSGL-1或VISTA多肽、或与PSGL-1或VISTA多肽结合的抗体的氨基酸序列的至少5个连续氨基酸残基、至少10个连续氨基酸残基、至少15个连续氨基酸残基、至少20个连续氨基酸残基、至少25个连续氨基酸残基、至少40个连续氨基酸残基、至少50个连续氨基酸残基、至少60个连续氨基酸残基、至少70个连续氨基酸残基、至少80个连续氨基酸残基、至少90个连续氨基酸残基、至少连续100个氨基酸残基、至少125个连续氨基酸残基、至少150个连续氨基酸残基、至少175个连续氨基酸残基、至少200个连续氨基酸残基或至少250个连续氨基酸残基的氨基酸序列。在一些实施方案中，PSGL-1或VISTA多肽、或与PSGL-1或VISTA抗原结合的抗体的片段保留该多肽或抗体的至少1、至少2、或至少3个功能。
术语“框架”或“FR”残基是指除本文定义的高变区残基以外的那些可变结构域残基。FR残基是CDR侧翼的那些可变结构域残基。FR残基存在于，例如，嵌合的、人源化的、人的、结构域抗体、双抗体、线性抗体、和双特异性抗体中。
抗体的“功能片段”将表现出归因于完整抗体的生物学功能的至少一种(如果不是一些或全部)，该功能至少包括与靶抗原的特异性结合。
如本文所用，术语“融合蛋白”是指包含抗体的氨基酸序列和异源多肽或蛋白质(例如，通常不是抗体的一部分的多肽或蛋白质(例如，非抗PSGL-1抗体或非抗VISTA抗体))的氨基酸序列的多肽。当与PSGL-1、VISTA、抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体结合使用时，术语“融合”是指肽或多肽、或其片段、变体和/或衍生物与异源肽或多肽结合。在一些实施方案中，融合蛋白保留PSGL-1、VISTA、抗PSGL-1抗体、或抗VISTA抗体的生物活性。在一些实施方案中，融合蛋白包含抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体VH结构域、VL结构域、VH CDR(一个，两个或三个VH CDR)和/或VL CDR(一个、两个或三个VL CDR)，其中融合蛋白与PSGL-1或VISTA表位结合。
当指抗体时，术语“重链”是指约50-70kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约120个至130个或更多氨基酸的可变区和羧基末端部分包括恒定区。基于重链恒定区的氨基酸序列，恒定区可以是五种不同类型(称为α(α)、δ(δ)、ε(ε)、γ(γ)和μ(μ))之一。不同的重链大小不同：α、δ和γ包含约450个氨基酸，而μ和ε包含约550个氨基酸。当与轻链结合时，这些不同类型的重链分别产生五种公知类型的抗体，分别为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，包括IgG的四个亚类，称为IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。重链可以是人的重链。
术语“铰链区”在本文中是指IgG和IgA免疫球蛋白类别的重链的中心部分中的柔性氨基酸区段，其通过二硫键连接这两个链。铰链区通常定义为从人IgG1的Glu216延伸到Pro230(Burton，Mol Immunol，22：161-206，1985)。通过将形成重链间S-S键的第一个和最后一个半胱氨酸残基置于相同位置，可以将其他IgG同种型的铰链区与IgG1序列进行比对。人IgG Fc部分的“CH2结构域”(也称为“Cγ2”结构域)通常从约氨基酸231延伸至约氨基酸340。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一个结构域紧密配对。而是，两个N-连接分支碳水化合物链插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。据推测，碳水化合物可以为结构域-结构域配对提供替代物，并有助于稳定CH2结构域(Burton，Mol Immunol，22：161-206，1985)。“CH3结构域”包括在Fc部分中C末端残基至CH2结构域的区段(即，从IgG的约氨基酸残基341到约氨基酸残基447)。
如本文所用，术语“宿主”是指动物，例如哺乳动物(例如，人)。
如本文所用，术语“宿主细胞”是指用核酸分子转染的特定受试者细胞以及这种细胞的后代或潜在后代。由于可能在后续世代中或核酸分子整合入宿主细胞基因组中发生突变或环境影响，这种细胞的后代可能与用核酸分子转染的亲本细胞不同。
非人类(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是包括人免疫球蛋白(受体抗体)的嵌合抗体，其中所述人免疫球蛋白的天然CDR残基被来自非人类物种(例如，具有期望特异性、亲和力和能力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的相应CDR(供体抗体)的残基所取代。在一些情况下，人免疫球蛋白的一个或多个FR区残基被相应的非人残基取代。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。人源化抗体重链或轻链可以包含至少一个或多个可变结构域的基本上全部，其中CDR的全部或基本上全部对应于非人免疫球蛋白的那些，FR的全部或基本上全部是人免疫球蛋白序列的那些。在一些实施方案中，人源化抗体将包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的那些。有关更多细节，请参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature，332：323-329(1988)；以及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)；Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：4285-4289(1992)；以及美国专利号：6,800,738(2004年10月5日发布)、6,719,971(2005年9月27日发布)、6,639,055(2003年10月28日发布)、6,407,213(2002年6月18日发布)和6,054,297(2000年4月25日发布)。
“有效量”是足以产生有益或期望结果的量。有效量可以一个或多个施用、应用或剂量施用。这样的递送取决于许多变量，包括使用单个剂量单位的时间段、试剂的生物利用度、施用途径等。在一些实施方案中，有效量还指本文提供的抗体实现特定结果(例如，抑制细胞的PSGL-1或VISTA的生物活性，如调节T细胞活化)的量。在一些实施方案中，该术语是指足以减少和/或改善指定疾病、病症或病状和/或相关症状的严重性和/或持续时间的疗法(例如，本文提供的抗体)的量。该术语还涵盖减少或改善指定疾病、病症或病状的进展(advancement)或进程(progression)所必须的量，减少或改善指定疾病、病症或病状的复发、发展或发作所必须的量，和/或改善或增强另一种疗法(例如，除本文提供的抗PSGL-1抗体以外的疗法)的预防或治疗效果所必须的量。在一些实施方案中，抗体的有效量为约0.1mg/kg(mg抗体/kg受试者体重)至约100mg/kg。在一些实施方案中，其中提供的抗体的有效量为约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、3mg/kg、5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约60mg/kg、约70mg/kg、约80mg/kg、约90mg/kg或约100mg/kg(或其中的范围)。
当在抗体的上下文中使用时，术语“抑制”或其语法等同物是指抑制、限制或降低与抗体结合的抗原的生物活性的抗体。抗体的抑制作用可以是导致抗原生物活性发生可测量变化的一种。在一些实施方案中，本文所述的抗PSGL-1抗体抑制VISTA结合PSGL-1的能力，这可以导致抑制VISTA的共抑制活性。与合适的对照(例如，对照是未用待测抗体处理的细胞)相比，本文所述的某些抗PSGL-1抗体抑制或阻断表达VISTA的细胞上VISTA的抑制信号大于5％，例如，从约5％至约50％，或大于50％(例如，从约50％到约98％)。在一些实施方案中，本文所述的抗PSGL-1抗体抑制PSGL-1与细胞外结构域VISTA的结合和/或抑制表达VISTA的细胞与表达PSGL-1的细胞的结合。另外，在一些实施方案中，本文所述的抗PSGL-1抗体不抑制PSGL-1与除VISTA以外的蛋白质(例如，P-选择蛋白、L-选择蛋白和/或E-选择蛋白)结合。
术语“免疫浸润物”或“肿瘤免疫细胞”是指浸润肿瘤的微环境的细胞，包括但不限于，淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)、树突状细胞、肥大细胞和巨噬细胞。
如本文所用，在施用其他疗法的上下文中术语“组合”是指使用多于一种疗法(例如，抗PSGL-1抗体和抗VISTA抗体)。术语“组合”的使用不限制向受试者施用疗法的顺序或时间(例如，一种疗法在另一种疗法之前、同时、或之后)。对曾经患有、现在患有或易感VISTA介导的疾病、病症或病状的受试者施用第二疗法(例如，1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周)之前、同时、或(例如，1分钟、45分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、或12周)之后施用第一疗法。任何附加(additional)疗法都可以与其他附加疗法(例如，抗PSGL-1抗体和抗VISTA抗体)以任何顺序或时间进行施用。在一些实施方案中，可以将抗体与一种或多种疗法(例如，该疗法不是当前施用以预防、治疗、控制和/或改善VISTA介导的疾病、病症或病状的抗体)组合施用。可以与抗体组合施用的疗法的非限制性实例包括共抑制分子的拮抗剂、共刺激分子的激动剂、化学治疗剂、放射线、止痛剂、麻醉剂、抗体、或免疫调节剂、或在U.S.Pharmacopoeia和/或Physician’s Desk Reference列出的任何其他试剂。
“分离的”抗体基本上不含来自细胞或组织来源的细胞材料或其他污染蛋白质、和/或抗体所来源的其他污染物组分，或者当化学合成时基本上不含化学前体或其他化学物质。术语“基本上不含细胞材料”包括抗体制剂，其中抗体从细胞分离或重组产生抗体的细胞组分中分离。因此，基本上不含细胞材料的抗体包括具有少于约30％、20％、10％、或5％(以干重计)的异源蛋白质(在本文中也为“污染蛋白质”)的抗体制剂。在一些实施方案中，当重组产生抗体时，其基本上不含培养介质，例如，培养介质占蛋白质制剂体积的小于约20％、10％、或5％。在一些实施方案中，当通过化学合成产生抗体时，其基本上不含化学前体或其他化学物质，例如，其与蛋白质合成中涉及的化学前体或其他化学物质分离。因此，这样的抗体制剂具有除目的抗体之外的少于约30％、20％、10％、5％(以干重计)的化学前体或化合物。污染组分还可以包括但不限于，干扰抗体治疗用途的物质，可以包括酶、激素、和其他蛋白质的或非蛋白质的溶质。在一些实施方案中，(1)如通过Lowry方法所确定的，将抗体纯化至大于抗体重量的95％(Lowry等人J.Bio.Chem.193：265-275，1951)(例如，重量的99％)，(2)将抗体纯化至足以通过使用旋转杯测序仪(spinning cup sequenator)获得N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)将抗体纯化至通过还原或非还原条件下的SDS-PAGE使用考马斯亮蓝或优选银染色的均质。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为至少一种抗体天然环境的组分不会存在。然而，通常分离的抗体将通过至少一个纯化步骤来制备。在一些实施方案中，本文提供的抗体是分离的。
“分离的”核酸分子是与存在于核酸分子的天然来源中的其他核酸分子分离的核酸分子。此外，“分离的”核酸分子(例如，cDNA分子)，当通过重组技术生产时可以基本上不含其他细胞材料、或培养介质，或者当化学合成时可以基本上不含化学前体或其他化学物质。在一些实施方案中，分离或纯化编码本文提供的抗体的核酸分子。
当用于抗体时，术语“轻链”是指约25kDa的多肽链，其中氨基末端部分包括约100至约110或更多个氨基酸的可变区、以及羧基末端部分包括恒定区。轻链的大约长度是211至217个氨基酸。基于恒定结构域的氨基酸序列，存在两种不同的类型，称为λ(λ)的κ(κ)。轻链氨基酸序列是本领域众所周知的。轻链可以是人的轻链。
如本文所用，术语“管理(manage)”、“管理(managing)”和“管理(management)”是指受试者从疗法(例如，预防剂或治疗剂)中获得的有益效果，其不会导致疾病治愈。在一些实施方案中，向受试者施用一种或多种疗法(例如，预防剂或治疗剂，例如，本文提供的抗体)以“管理”VISTA介导的疾病、病症或病状(包括其一种或多种症状)，从而以防止疾病、病症或病状的进程或恶化。
术语“单克隆抗体”是指从均质或基本均质的抗体群体中获得的抗体，即，形成该群体的抗体除了可能少量存在的可能天然存在的突变以外，基本上是相同的。换句话说，单克隆抗体是源自生长的单细胞克隆(例如，杂交瘤、编码均质抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、编码均质抗体的DNA分子转染的原核宿主细胞等)的均质抗体，其通常表征为一类和仅一类和亚类的重链、和仅一种类型的轻链。这些抗体是高度特异性的，并且针对单一抗原。另外，与通常包括针对各种决定簇、或表位的各种抗体的多克隆抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原的单个表位。在一些实施方案中，如本文所用，“单克隆抗体”是由单个杂交瘤或其他细胞产生的抗体，其中该抗体仅结合(例如，通过本领域已知的ELISA或其他抗原结合或竞争性结合测定来确定的)VISTA表位。术语“单克隆”不限于制备抗体的任何特定方法。例如，本文提供的单克隆抗体可以通过如Kohler等人Nature，256：495(1975)所述的杂交瘤方法制备，或者可以使用技术从噬菌体文库中分离。制备克隆细胞系和由此表达的单克隆抗体的其他方法是本领域众所周知的(参见，例如，第11章：Short Protocols in Molecular Biology，(2002)第五版.，Ausubel等人编，John Wiley and Sons，纽约)。本文实施例中提供了产生其他单克隆抗体的其他示例性方法。
当与诸如核酸分子、多肽、宿主细胞等的生物材料结合使用时，术语“天然”是指在自然界中发现并且未被人类操作的那些。
如本文所用，术语“药学上可接受的”是指经联邦或州政府的监管机构批准的，或在美国药典、欧洲药典或其他公认的药典中列出的，用于动物以及更具体用于人类的。
如本文所用，“多克隆抗体”是指在对具有许多表位的蛋白质的免疫原性应答中产生的抗体群体，因此包括针对该蛋白质内相同和不同表位的多种不同抗体。产生多克隆抗体的方法是本领域已知的(参见，例如，参见第11章：Short Protocols in Molecular Biology，(2002)第五版，Ausubel等人编，John Wiley and Sons，纽约)。
如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”，“核酸”、“核酸分子”和其他类似术语可互换使用，并且包括DNA、RNA、mRNA等。
如本文所用，术语“预防(prevent)”、“预防(preventing)”和“预防(prevention)”是指由施用本文提供的疗法或疗法的组合(例如，预防剂或治疗剂，例如本文提供的抗体的组合)产生的完全或部分抑制VISTA介导的疾病、病症或病状和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散。
如本文所用，术语“预防剂”是指可以在受试者中完全或部分抑制VISTA介导的疾病、病症或病状和/或与其相关的症状的发展、复发、发作或扩散的任何试剂。在一些实施方案中，术语“预防剂”是指本文提供的抗PSGL-1抗体。在一些其他实施方案中，术语“预防剂”是指除本文提供的抗PSGL-1抗体以外的试剂。在一些实施方案中，预防剂是已知可用于或已经用于或目前正用于预防VISTA介导的疾病、病症或病状和/或与之相关的症状的试剂、或阻碍VISTA介导的疾病、病症或病状和/或与其相关的症状的发作、发展、进程和/或严重性的试剂。在一些实施方案中，预防剂是人源化抗PSGL-1抗体，例如人源化抗PSGL-1单克隆抗体。
术语“P-选择蛋白糖蛋白配体1”(也称为PSGL-1、PSGL1、选择蛋白P配体、SELPLG、CLA、和CD162)是指由SELPLG基因编码的多肽(“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用)，例如包含以下氨基酸序列：
和相关的多肽，包括其SNP变体。PSLG-1是人粘蛋白型糖蛋白配体，已知可以结合所有三种选择蛋白(P-选择蛋白、E-选择蛋白和L-选择蛋白)，但它以最高的亲和力结合P-选择蛋白(McEver等人，J.Clin.Invest.，100(3)：485-492(1997)和Carlow等人，Immunological Reviews，230：75-96(2009))。PSGL-1是具有两个120kD亚基的二硫键同二聚体，在单核细胞、淋巴细胞、粒细胞、和某些CD34+干细胞的表面表达。因此，已知该蛋白通过将白细胞束缚到活化的血小板中或表达选择蛋白的内皮中，而在炎症过程的白细胞运输中起作用。PSGL-1通常具有两个翻译后修饰，酪氨酸硫酸化和将唾液酸路易斯×四糖(sLex)添加到其O连接的聚糖中，以实现其高亲和力结合活性。SELPLG基因的异常表达和该基因的多态性与先天性和适应性免疫反应中的缺陷有关。
如本领域技术人员将理解的，由于表位是较大抗原的一部分，因此本文提供的抗PSGL-1抗体可以结合PSGL-1多肽、多肽片段、抗原和/或表位，例如，表位是较大多肽片段的一部分，而较大多肽片段又是例如较大多肽的一部分。PSGL-1可以天然或变性形式存在。本文所述的PSGL-1多肽可从多种来源分离，例如从人类组织类型或另一种来源分离，或通过重组或合成方法制备。“天然序列PSGL-1多肽”包含与自然来源的对应PSGL-1多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。这种天然序列PSGL-1多肽可以从自然界中分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列PSGL-1多肽”特别涵盖特定PSGL-1多肽的天然存在的截短形式或分泌形式(例如，细胞外结构域序列)、多肽的天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。
编码PSGL-1多肽的cDNA核酸序列，例如包括：
人PSGL-1多肽的直系同源物也是本领域众所周知的。例如，可以在生物体，诸如小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattus norvegicus)、狗(Canis lupusfamiliaris)、牛(BosTaurus)、斑马鱼(Danio rerio)、马(Equus caballus)、黑猩猩(Pan troglodytes)等中发现PSGL-1的直系同源物。
“PSGL-1介导的疾病”、“PSGL-1介导的病症”和“PSGL-1介导的病状”可互换使用并且指完全或部分由PSGL-1所导致的、或者是PSGL-1结果的任何疾病、病症或病状。此类疾病、病症或病状包括由PSGL-1引起的那些或在其他方面与PSGL-1相关的那些，包括由表达PSGL-1的细胞(例如，肿瘤细胞、髓系来源的抑制细胞(MDSC)、抑制性树突状细胞(抑制性DC))、和/或调节性T细胞(T-reg))引起的那些或存与其相关的那些。在一些实施方案中，PSGL-1在细胞表面上异常表达(例如，高度表达)。在一些实施方案中，PSGL-1可以在特定细胞类型上异常上调。在其他实施方案中，正常、异常或过度的细胞信号传导是由PSGL-1与PSGL-1配体(例如，VISTA)的结合引起的，所述PSGL-1配体可以与PSGL-1结合或以其他方式与PSGL-1相互作用。在优选的实施方案中，PSGL-1介导的疾病是由PSGL-1与特定PSGL-1配体(例如VISTA)的结合而不与其他配体(例如选择蛋白)的结合所导致的。
当在治疗环境中使用时，术语“放射”是指使用强能量束杀死靶细胞(例如癌细胞)的一种治疗。放射疗法包括使用X射线、质子或其他形式的能量，这些能量通过外部光束进行施用。放射疗法还包括放置在患者体内的放射治疗(例如，近距离放射疗法)，其中放射性物质的小容器直接植入肿瘤中或在肿瘤附近。
术语“相对表达水平”是指给定样本中的蛋白质表达水平相对于相同样本和/或另一参考样本中的另一参考蛋白质的定量。在本文描述的方法的上下文中，PSGL-1的表达水平可以以绝对数表示(例如，基于标准曲线)，或者可以相对于在样本中测定的一种或多种其他蛋白质(例如，VISTA、CD11b、CD33、CD4、或CD8)的相对表达水平表示。
术语“重组抗体”是指通过重组方式制备、表达、产生或分离的抗体。重组抗体可以是使用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体，从重组、组合抗体文库中分离的抗体，从对人免疫球蛋白基因而言是转基因和/或转染色体的动物(例如，小鼠或牛)分离的抗体(参见，例如Taylor，L.D等人(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295)，或通过涉及将免疫球蛋白基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方式制备、表达、产生或分离的抗体。此类重组抗体可具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区(参见Kabat，E.A.等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，U.S.Departmentof Health and Human Services，NIH出版编号91-3242)。然而，在一些实施方案中，将此类重组抗体进行体外突变(或，当使用人Ig序列转基因的动物时，进行体内体细胞诱变)，并因此重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是衍生自人类种系VH和VL并与之相关的序列，但是其可能不是天然存在于体内人类抗体种系库中的序列。
如本文所用，术语“副作用”涵盖疗法(例如，预防剂或治疗剂)的不想要的且是不利的作用。不想要的作用不一定是不利的。疗法(例如，预防剂或治疗剂)的不利作用可能是有害的、不适的或有风险的。副作用的示例包括腹泻、咳嗽、肠胃炎、喘息、恶心、呕吐、厌食、腹部绞痛、发烧、疼痛、体重减轻、脱水、脱发、呼吸困难、失眠、头晕、粘膜炎、神经和肌肉效应、疲劳、口干、食欲不振、在施用部位的皮疹或肿胀、类似流感的症状(如发烧、发冷和疲倦)、消化道问题和过敏反应。患者经历的其他不想要的作用很多并且在本领域中是已知的。许多描述在Physician’s Desk Reference(第67版，2013)中。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”可互换使用。如本文所用，在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)，或灵长类动物(例如，猴和人)。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者是患有VISTA介导的疾病、病症或病状和/或与其相关的症状的哺乳动物(例如，人)。在另一个实施方案中，受试者是处于发展成VISTA介导的疾病、病症或病状和/或与其相关的症状的风险中的哺乳动物(例如，人)。
如本文所用，“基本上全部”是指至少约60％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％、或约100％。
如本文所用，术语“治疗剂”是指可用于治疗、预防或缓解疾病、病症或病状的任何试剂，包括用于治疗、预防或缓解VISTA介导的疾病、病症、或病状中的一种或多种症状和/或与其相关的症状的任何试剂。在一些实施方案中，治疗剂是指本文提供的抗PSGL-1抗体。在一些实施方案中，治疗剂是指除本文提供的抗PSGL-1抗体以外的试剂。在一些实施方案中，治疗剂是已知可用于、或已经用于、或目前用于治疗、预防或缓解VISTA介导的疾病、病症、病状中的一种或多种症状和/或与其相关的症状的试剂。
疗法的组合(例如，使用多种治疗剂)与任何两种或更多种单一疗法的累加作用相比可以更有效。例如，治疗剂组合的协同作用允许使用较低剂量的一种或多种试剂和/或以较低频率将试剂施用至患有VISTA介导的疾病、病症或病状和/或与其相关的症状的受试者。利用较低剂量的治疗疗法的能力和/或以较低频率施用疗法的能力降低了向受试者施用疗法相关的毒性，而不降低疗法在预防、治疗或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状中的一种或多种症状和/或与其相关的症状的功效。另外，在预防、治疗或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状中的一种或多种症状和/或与其相关的症状方面，协同作用可以导致治疗功效提高。最后，疗法(例如，治疗剂)组合的协同作用可以避免或减少与使用任何单一疗法相关的不利或不想要的副作用。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指治疗剂(例如，抗PSGL抗体或任何其他治疗剂，包括本文所描述的，包括例如抗VISTA抗体)的量，其足以减少和/或改善给定疾病、病症或病状和/或与其相关的症状的严重性和/或持续时间。治疗剂的治疗有效量可以是减少或改善给定疾病、病症或病状的进展或进程所必须的量，减少或改善给定疾病、病症或病状的复发、发展或发作所必须的量，和/或改善或增强另一疗法(例如，除了施用抗PSGL-1抗体之外的疗法，包括本文所述的疗法)的预防或治疗效果所必须的量。
如本文所用，术语“疗法”是指可用于预防、管理、治疗和/或改善VISTA介导的疾病、病症或病状的任何方案、方法和/或试剂。在一些实施方案中，术语“疗法(therapies)”和“疗法(therapy)”是指生物疗法、支持性疗法、和/或本领域技术人员(例如，医疗人员)已知的可用于治疗、预防和/或改善VISTA介导的疾病、病症或病状的其他疗法。
如本文所用，术语“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指由于施用一种或多种疗法(包括但不限于，施用一种或多种治疗剂，例如，包括本文所述抗PSGL-1抗体)而导致的VISTA介导的疾病、病症或病状的进程、严重性和/或持续时间的减少或改善。在一些实施方案中，这样的术语是指减少或抑制癌症(例如，血液癌症)。在一些实施方案中，这样的术语是指响应免疫调节的疾病、病症或病状的进程、严重性和/或持续时间的减少或改善，这种调节是由增加的T细胞活化所导致的。
术语“肿瘤微环境”是指肿瘤存在的细胞环境。肿瘤微环境可以包括周围血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、淋巴细胞、信号传导分子和细胞外基质。
术语“可变结构域”或“可变区”是指抗体的轻链或重链的一部分，其通常位于轻链或重链的氨基末端，并且在重链中具有约120至130个氨基酸，在轻链中具有约100至110个氨基酸的长度，并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性中。可变结构域在不同抗体之间的序列差异很大。序列的可变性集中在CDR中，而在可变结构域中可变性较低的部分称为框架区(FR)。每个可变区包括与四个FR相连的三个CDR。轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用。尽管不直接参与抗原结合，但FR决定了分子的折叠，从而决定了可变区表面上与抗原相互作用的CDR的量。在一些实施方案中，可变区是人可变区。
术语“如Kabat中的可变结构域残基编号”或“如Kabat中的氨基酸位置编号”及其变形，指Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)中用于汇编抗体的重链可变结构域或轻链可变结构域的编号系统。使用该编号系统，实际的线性氨基酸序列可以包含对应于可变结构域的FR或CDR的短缩或插入的较少或额外的氨基酸。例如，重链可变结构域可以包括在H2的残基52之后单个氨基酸插入(根据Kabat为残基52a)，以及在重链FR残基82之后插入的残基(例如，根据Kabat为残基82a、82b、和82c等)。可以通过在抗体的序列的同源性区域与“标准”Kabat编号的序列进行比对来确定给定抗体的残基的Kabat编号。当提及可变结构域中的残基(大约轻链的残基1-107和重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号系统(例如，Kabat等人，Sequences of ImmunologicalInterest.第五版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。当提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时，通常使用“EU编号系统”或“EU索引”(例如，Kabat等人(见上文)报道的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG 1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则提及抗体可变结构域中的残基编号是指通过Kabat编号系统的残基编号。已经描述了其他编号系统，例如包括AbM、Chothia、Contact和IMGT。
当与PSGL-1、VISTA或抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体结合使用时，术语“变体”指与天然或未修饰的序列相比包含一个或多个(例如，如约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、或约1至约5)个氨基酸序列取代、缺失和/或添加的肽或多肽。例如，PSGL-1或VISTA变体可以分别由对天然PSGL-1或VISTA的氨基酸序列的一个或多个(例如，约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、或约1至约5)改变所产生。又例如，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体的变体可以由对天然的或之前未修饰的抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体的氨基酸序列的一个或多个(例如，约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10、或约1至约5)个改变所产生。变体可以是天然存在的(例如等位基因或剪接变体)，或者可以是人工构建的。多肽变体可以从编码变体的相应核酸分子制备。在一些实施方案中，PSGL-1变体、VISTA变体或抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体变体分别至少保留PSGL-1、VISTA、抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体的功能活性。在一些实施方案中，抗PSGL-1抗体变体结合PSGL-1和/或拮抗PSGL-1活性。在一些实施方案中，抗VISTA抗体变体结合VISTA和/或拮抗VISTA活性。在一些实施方案中，变体由编码PSGL-1、VISTA、抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体VH或VL区或亚区的核酸分子的单核苷酸多态性(SNP)变体编码。
术语“载体”是指用于将核酸分子引入宿主细胞的物质。适用的载体包括，例如表达载体、质粒、噬菌体载体、病毒载体、附加体和人工染色体，它们可以包括选择序列或可稳定整合入宿主细胞染色体的可操作标志物。另外，载体可以包括一种或多种可选择的标记基因和适当的表达控制序列。可以包括的可选择的标记基因，例如，提供对抗生素或毒素的抗性、补充营养缺陷、或提供培养介质中没有的关键营养素。表达控制序列可以包括本领域熟知的组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等。当两个或更多个核酸分子要被共表达时(例如，抗体重链和轻链两者)，两个核酸分子可以被插入、例如单个表达载体中或分开表达载体中。对于单个载体表达，可以将编码核酸可操作地连接至一个共同的表达控制序列或连接至不同的表达控制序列，例如一个诱导型启动子和一个组成型启动子。可以使用本领域众所周知的方法确认将核酸分子引入宿主细胞。此类方法包括，例如，核酸分析(例如，RNA印迹或mRNA的聚合酶链式反应(PCR)扩增)、或用于基因产物表达的免疫印迹法，或用于测试导入的核酸序列或其相应的基因产物表达的其他合适的分析方法。本领域技术人员应理解，核酸分子以足够的量表达以产生所想要的产物(例如，本文提供的抗PSGL-1抗体)，并且进一步应理解，使用本领域公知的方法可以优化表达水平，以获得足够的表达。
详细说明
除非另有说明，否则本公开的实践采用分子生物学、微生物学、遗传分析、重组DNA、有机化学、生物化学、PCR、寡核苷酸合成和修饰、核酸杂交以及本领域技术范围内的相关领域的常规技术。这些技术在本文引用的参考文献中进行了描述，并在文献中进行了充分说明。参见，例如，Maniatis等人(1982)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，ColdSpringHarbor Laboratory Press；Sambrook等人(1989)，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Sambrook等人(2001)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wilev&Sons(1987以及每年更新)；Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons(1987以及每年更新)Gait(编)(1984)Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Eckstein(编)(1991)Oligonucleotides and Analogues：A Practical Approach，IRL Press；Birren等人(编)(1999)Genome Analysis： A Laboratorv Manual，Cold Sprine Harbor Laboratory Press。
PSGL-1是VISTA的受体
在癌变过程中，肿瘤细胞与复杂的微环境相互作用，该微环境由细胞外基质和非瘤宿主细胞(包括间充质细胞、血管内皮细胞以及炎性或免疫细胞)组成。微环境在抑制肿瘤特异性T细胞应答中起着至关重要的作用。为了确保在肿瘤抗原刺激应答后，免疫炎症反应不会持续活化，多个检查点就位或被活化。这些检查点大多数由T细胞受体代表，其与周围微环境中细胞上的配体结合，形成免疫突触，然后调节T细胞的功能。
VISTA是这些免疫检查点之一。该蛋白质限于造血系统，并且在多种癌症模型中，其仅在浸润肿瘤的白细胞上检测到而在肿瘤细胞上未检测到。VISTA通过与不同的受体/配体结合而直接作用于T细胞从而负调节T细胞免疫，这在免疫检查点蛋白中是独特的，它既充当配体又充当受体(Le Mercier，同上)。
本发明人现已鉴定出PSGL-1为VISTA蛋白的结合伴侣(例如，配体或受体)。PSGL-1是带有O-和N-连接聚糖的同二聚体120-kDa跨膜糖蛋白，其最著名的作用是通过选择蛋白结合在免疫细胞运输中的作用。PSGL-1在淋巴样、髓样细胞、和树突状谱系的细胞中表达(Laszik等人，Blood，88(8)：3010-21(1996))。初始(naive)T细胞表达PSGL-1的非选择蛋白结合形式，可以与其他潜在目前未知的结合伴侣结合(Veerman等人，Nat.Immunol.8(5)，532-539(2007))。还已经观察到在肿瘤细胞中的表达。最近已证明PSGL-1通过诱导未知伴侣来促进T细胞耗竭，从而促进黑素瘤肿瘤生长(Tinoco等人，Immunity，44：1190-03(2016))。
发明人已经证明了两种蛋白质之间的直接结合，并且表明PSGL-1和VISTA在防止T细胞活化中共同发挥作用。确实，VISTA和PSGL-1之间的物理相互作用是功能相互作用的基础，因为这两种基因在许多肿瘤中都共同表达。其他假定的VISTA受体均未显示出这种共定位，强调了这种关系的特异性。此外，VISTA和PSGL-1在肿瘤细胞微环境中表达。更具体地，原位杂交揭示了两种基因均在肿瘤微环境中的相邻细胞内表达。在免疫浸润物中每个表达PSGL-1的细胞都与表达VISTA的细胞相邻，这表明PSGL-1是活化的VISTA的可靠代理(proxy)。
诊断VISTA介导的病症
以上数据表明PSGL-1是用于诊断VISTA介导的病症(例如，VISTA介导的癌症)的可靠生物标志物。与PSGL-1核酸或蛋白质结合的试剂(例如，标记的核酸探针或本文提供的抗体)，因此可以用于诊断目的以检测、诊断或监测VISTA介导的疾病、病症或病状。
因此，在第一方面，本发明涉及用于检测受试者中VISTA介导的癌症的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述受试者的生物样本与能够结合PSGL-1蛋白或核酸的试剂接触；以及
b)检测所述试剂与所述生物样本的结合。
根据本方法，PSGL-1的结合表明存在VISTA介导的癌症。优选地，在肿瘤微环境的免疫浸润物中PSGL-1的结合表明存在VISTA介导的癌症。
能够结合PSGL-1蛋白或核酸的试剂可以是本领域技术人员已知的能够特异性结合PSGL-1的任何试剂或化合物。例如，技术人员将立即意识到与PSGL-1特异性杂交的DNA或RNA探针与PSGL-1特异性结合。同样地，技术人员将立即认识到，如本文所述的那些抗PSGL-1抗体特异性结合PSGL-1。
本发明还涉及用于检测受试者中VISTA介导的癌症的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述受试者的生物样本与能够结合PSGL-1蛋白或核酸的试剂接触；以及
b)定量所述试剂与所述生物样本的结合。
根据本方法，PSGL-1的结合表明存在VISTA介导的癌症。优选地，在肿瘤微环境的免疫浸润物中PSGL-1的结合表明存在VISTA介导的癌症。
对于本领域技术人员显而易见的是，可以通过本领域技术人员已知的任何方式来定量试剂与PSGL-1的结合水平，详见下文。优选的方法包括使用免疫酶分析(例如ELISA或ELISPOT)、免疫荧光、免疫组织化学(IHC)、放射免疫分析(RIA)、或FACS。
本方法的步骤b)的定量是样本中(特别是在肿瘤微环境的免疫浸润物中)PSGL-1表达水平的直接反映。因此，如上所述，本方法允许通过测定PSGL-1的表达水平来鉴定VISTA介导的癌症。在一个优选的实施方案中，将所述样本中尤其是肿瘤微环境的免疫浸润物中的PSGL-1的表达水平与参考水平进行比较。
根据另一个优选的实施方案，本发明涉及用于检测受试者中VISTA介导的癌症的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的生物样本中PSGL-1的表达水平；以及
b)将步骤a)的表达水平与参考水平进行比较；
其中步骤a)中PSGL-1的测定水平与参考水平相比增加指示VISTA介导的疾病、病症或病状。
本发明还涉及用于诊断受试者中的VISTA介导的癌症的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的生物样本中PSGL-1的表达水平；以及
b)将步骤a)的表达水平与参考水平进行比较；
其中步骤b)中PSGL-1的测定水平与参考水平相比增加指示VISTA介导的疾病、病症或病状。
有利地比较或测量PSGL-1的表达水平相对于对照细胞或样本中的水平，也称为“参考水平”或“参考表达水平”。在本说明书中，“参考水平”、“参考表达水平”、“对照水平”和“对照”可互换使用。“对照水平”是指在可比较的对照细胞(其通常无疾病或癌症)中测得的单独的基线水平。所述对照细胞可以来自同一个体，因为即使在癌性患者中，肿瘤位点的组织中仍然包含非肿瘤健康组织。它也可来源于另一正常的或不存在与获得疾病或测试样本的个体相同的疾病的个体。在本发明的上下文中，术语“参考水平”是指PSGL-1表达的“对照水平”，其用于评估患者的含癌细胞样本中PSGL-1表达的测试水平。例如，当患者的生物样本中的PSGL-1水平高于PSGL-1的参考水平时，细胞将被认为具有PSGL-1的高水平表达或过表达。参考水平可以通过多种方法确定。因此，表达水平可以定义携带PSGL-1的细胞、或者PSGL-1的表达水平，而不依赖于表达PSGL-1的细胞数目。因此，可以通过PSGL-1的参考比例来规定每个患者的参考水平，其中可以通过本文所述的用于确定参考水平的任何方法来确定所述参考比例。
例如，对照可以是可采用多种形式的预定值。它可以是单个截止值，例如中位数或平均值。“参考水平”可以是同等适用于每个单独患者的单一数字，或者参考水平可以根据患者的特定子集变化而变化。因此，例如，对于相同的癌症，年长者可能与年轻人具有不同的参考水平，而对于相同癌症，女人可能具有与男人不同的参考水平。可选择地，可以通过测量来自与待测试赘生性细胞的组织相同组织的非致瘤性癌细胞中的PSGL-1的表达水平来确定“参考水平”。同样，“参考水平”可能是患者赘生性细胞中PSGL-1相对于同一患者非肿瘤细胞中PSGL-1水平的一定比例。“参考水平”也可以是体外培养细胞的PSGL-1水平，所述体外培养细胞可以被操纵以模拟肿瘤细胞，或者可以以任何其他方式操纵以产生精确确定参考水平的表达水平。另一方面，可以基于可比较的组来确定“参考水平”，例如在不具有升高的PSGL-1水平的组和具有升高的PSGL-1水平的组中。可比较的组的另一个示例是具有特定疾病、病状或症状的组以及没有所述疾病的组。例如，可以设定预定值，其中将被测试的人群均等(或不均等)地划分为组，例如低风险组、中风险组和高风险组。
也可以通过比较患有相同癌症的患者人群中PSGL-1的水平来确定参考水平。例如，这可以通过直方图分析来实现，其中以图形方式显示患者的整个队列，其中第一轴表示PSGL-1的水平，以及第二轴表示在该队列中其肿瘤细胞以给定水平表达PSGL-1的患者的数目。可以通过鉴定具有相同或相似PSGL-1水平的队列的子集人群，来确定两个或更多个单独的患者组。然后，可以基于最能区分这些单独组的水平确定参考水平。参考水平也可以表示两个或多个标志物(其中之一是PSGL-1)的水平。例如，可以通过每个标志物水平的值的比率来表示两个或更多个标志物。
同样，显然健康的人群将具有与已知患有PSGL-1表达相关病状的人群不同的“正常”范围。因此，所选择的预定值可以考虑个体所属的类别。本领域普通技术人员仅仅使用常规实验就可以选择适当的范围和类别。“升高”、“增加”是指相对于所选对照是高的。通常，对照将基于适当年龄段中明显健康的正常个体。
还应当理解，除了预定值以外，根据本发明的对照可以是与实验材料平行的测试材料样本。示例包括从相同受试者相同时间获得的组织或细胞，例如，单个活检的一部分、或来自该受试者的单个细胞样本的一部分。
优选地，PSGL-1的参考水平是正常组织样本中PSGL-1的表达水平(例如，来自没有VISTA介导的疾病、病症或病状的患者，或者来自在疾病发作之前的相同患者)。
在一些实施方案中，给定蛋白质的表达指示样本中某种类型细胞的存在。例如，样本中细胞的PSGL-1、CD4和/或CD8表达可以表明样本中T细胞的存在。同样，样本中的细胞单独表达VISTA或者VISTA与CD11b或CD33组合表达可指示存在携带VISTA的肿瘤细胞、调节性T细胞(例如，CD4+、Foxp3+调节性T细胞)，髓系来源的抑制细胞(例如，CD11b+或CD11b高和/或CD33+髓系来源的抑制细胞)和/或抑制性树突状细胞(例如，CD11b+或CD11b高树突状细胞)。优选地，VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8的表达，特别是在肿瘤微环境的免疫浸润物中的表达，指示在受试者中存在VISTA介导的癌症。
根据这些特定的实施方案，用于检测受试者中VISTA介导的癌症的体外方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的生物样本中PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中至少一种的表达水平；和
b)比较步骤a)的PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平与参考水平；
其中步骤b)中PSGL-1的测定水平与参考水平相比增加指示VISTA介导的疾病、病症或病状。
本发明还涉及用于诊断受试者中的VISTA介导的癌症的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述受试者的生物样本中PSGL-1的表达水平以及VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中至少一种的表达水平；以及
b)比较步骤a)的PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平与参考水平；
其中步骤b)中PSGL-1的测定水平与参考水平相比增加指示VISTA介导的疾病、病症或病状。
对VISTA介导的疾病、病症或病状更明确的诊断可以使卫生专业人员更早地采取预防措施或激进治疗，从而预防VISTA介导的疾病、病症或病状的发展或进一步进程。
识别易对抗VISTA治疗剂应答的患者
以上数据表明PSGL-1是用于诊断VISTA介导的病症(例如VISTA介导的癌症)的可靠生物标志物。这样鉴定的患者易对抗VISTA治疗剂应答。
在另一方面，本发明涉及一种体外方法，其用于鉴定易被抗VISTA治疗剂所治疗的肿瘤患者。有利地，所述患者(特别是在免疫浸润物中)表达PSGL-1，并且PSGL-1的表达指示所述患者易于被抗VISTA治疗剂所治疗。
在第一个实施方案中，本发明涉及一种诊断患者中易受VISTA-阻断剂治疗的癌症的体外方法，所述方法包括以下步骤：
a)确定所述患者的生物样本中PSGL-1的表达水平；和
b)将步骤a)的表达水平与参考水平进行比较；和
c)从所述比较中诊断癌症易受VISTA-阻断剂治疗。
在另一个实施方案中，所述参考水平是来自具有与第一患者相同的VISTA介导的癌症的第二患者的第二生物样本中PSGL-1的表达水平，其中第二患者对治疗有应答。在优选的实施方案中，与第二生物样本中PSGL-1的表达水平相比，第一生物样本中PSGL-1的表达水平相似，指示第一患者将对治疗有应答。
在另一个实施方案中，步骤a)包括确定所述生物样本(优选通过免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4、和CD8中的至少一种的表达水平。有利地，将第一生物样本中的PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平与来自第二患者中第二生物样本中的PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平进行比较，所述第二患者与第一患者具有相同的VISTA介导的癌症，其中所述第二患者对治疗有应答。在一个优选的实施方案中，将第一生物样本中的PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平与第二生物样本中的PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平进行比较，相似的表达水平指示所述第一患者将对治疗有应答。
测量PSGL-1的表达
PSGL-1表达可以通过本领域技术人员可用的任何手段来测量。因此，可以通过测量PSGL-1核酸(例如，PSGL-1 mRNA或相应的cDNA)的水平或通过测量PSGL-1蛋白的水平来测量PSGL-1的表达。
在这种情况下，根据本发明的方法可以包括在对生物样本进行采样和测量PSGL-1表达之间的一个或多个中间步骤，所述步骤对应于从所述生物样本中提取mRNA样本(或相应的cDNA)或蛋白质样本。从细胞样本中制备或提取mRNA(及其逆转录成cDNA)或蛋白质只是本领域技术人员熟知的常规方法。
一旦获得mRNA(或相应的cDNA)或蛋白质样本，可以测量针对mRNA(即在样本中存在的所有mRNA或cDNA)的PSGL-1表达、或针对蛋白质(即，在样本中存在的所有蛋白质)的PSGL-1表达。然后，用于此目的方法取决于转化类型(mRNA、cDNA或蛋白质)和可用样本的类型。
当针对mRNA(或相应的cDNA)测量标志物的表达时，可以应用本领域技术人员通常使用的任何方法。这些用于分析基因表达水平的技术，例如，如转录组分析包括众所周知的方法，例如PCR(聚合酶链反应，如果使用DNA)、RT-PCR(逆转录PCR，如果使用RNA)、或定量RT-PCR、或用于更高的通量的核酸阵列(包括DNA阵列和寡核苷酸阵列)。
如本文所用，术语“核酸阵列”是指附着于基底的多个不同核酸探针，所述基底可以是微芯片、载玻片或具有微球尺寸的珠子。微芯片可以由聚合物、塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅、碳、金属、无机玻璃、或硝化纤维素的材料组成。
探针可以是核酸，例如cDNA(“cDNA阵列”)、mRNA(“mRNA阵列”)、或寡核苷酸(“寡核苷酸阵列”)，所述寡核苷酸通常适合于具有约25至60个核苷酸之间的长度。
为了确定特定基因的表达谱，标记与所述基因的全部或部分相对应的核酸，然后在杂交条件下将其与阵列接触，使得所述标记的靶核酸与附着在芯片表面的与该核酸互补的探针之间形成复合物。然后检测标记的杂交复合物的存在。
这些技术适用于监测生物样本(细胞、组织等)中基因组(全基因组或全转录组)中的尤其是一个基因、或多个基因、或甚至所有基因的表达水平。
在优选的实施方案中，使用定量PCR确定表达谱。定量、或实时PCR是本领域技术人员众所周知的且容易获得的技术，不需要精确的描述。
在不应被认为是限制本发明范围的具体实施方案中，使用定量PCR确定表达谱可以如下进行。简而言之，实时PCR反应是使用TaqMan Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)进行的。将6μL cDNA添加到9μL PCR混合物，所述混合物含有7.5μL TaqManUniversal PCR Master Mix、0.75μL的20×的探针和引物的混合物以及0.75μl水。该反应由以下组成：在50℃(deg.C)下2分钟的一个起始步骤、接着在95℃下10分钟以及40个扩增循环(包括在95℃下15秒和在60℃下1分钟)。可使用ABI PRISM 7900序列检测系统(Sequence Detection System)(Applied Biosystems)进行反应和数据采集。通过在指数期(循环阈值或CT)中记录扩增循环，确定样本中模板转录物分子的数量，在指数期可以检测到背景荧光以上的荧光信号。因此，模板转录物分子的起始数目与CT成反比。
在另一个优选的实施方案中，通过使用核酸微阵列来确定表达谱。
本发明进一步涉及专用于实施根据本发明的方法的微阵列，其包括最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针，其中至少1个与PSGL-1 mRNA(或相应的cDNA)或蛋白质特异性结合。在一个优选的实施方案中，所述微阵列是核酸微阵列，其包含最多500个、优选最多300个、最多200个、更优选最多150个、最多100个、甚至更优选最多75个、最多50个、最多40个、最多30个、最多20个、最多10个不同的探针(因此，不包括例如泛基因组微阵列)，其中至少1个与PSGL-1 mRNA(或相应的cDNA)特异性杂交。除了与PSGL-1特异性杂交的探针之外，所述微阵列还可包含至少一个与持家基因特异性杂交的探针。例如，持家基因是β-2-微球蛋白基因。
可选择的，可以使用任何当前或未来的技术，其适用于基于样本中mRNA的量来确定基因表达。例如，本领域技术人员可以通过与标记的核酸探针杂交来测量基因的表达，例如，如借助于RNA印迹(mRNA)或DNA印迹(用于cDNA))，但是也可以使用诸如基因表达的连续分析(SAGE)方法及其衍生的技术，例如LongSAGE、SuperSAGE、DeepSAGE等。
也可以使用组织微阵列(也称为TMA)作为起始材料。TMA由石蜡块组成，其中以阵列方式组装多达1000个独立的组织核心，以进行多重组织学分析。在所述组织微阵列技术中，空心针用于从石蜡包埋的组织(例如，临床活检组织或肿瘤样本)的目标区域中除去直径小至0.6mm的组织核心。然后，将这些组织核心以精确间隔、阵列模式插入到受体石蜡块中。使用切片机切割该块的切片，将其安装在显微镜载玻片上，然后通过任何标准组织学分析方法进行分析。每个微阵列块可以切成100500个切片，其可以进行独立测试。组织微阵列中常用的测试包括免疫组织化学、和荧光原位杂交。为了在mRNA水平进行分析，可以将组织微阵列技术与荧光原位杂交相结合。在实施例中显示使用RNAscope 2.5(Advanced CellDiagnostics，Hayward，CA)进行原位杂交的示例。
最后，大规模平行测序可用于确定样本中的mRNA量(RNA-Seq或“全基因组鸟枪测序(Whole Transcriptome Shotgun Sequencing)”)。为此目的，可以使用多种大规模平行测序方法。这样的方法描述在，例如，US4,882,127、U.S.4,849,077；U.S.7,556,922；U.S.6723,513；WO 03/066896；WO 2007/111924、US 2008/0020392；WO 2006/084132；US2009/0186349；US 2009/0181860；US 2009/0181385；US 2006/0275782；EP-B1-1141399；Shendure&Ji，Nat Biotechnol.，26(10)：1135-45(2008)；Pihlak等人，Nat Biotechnol.，26(6)：676-684(2008)；Fuller等人，Nature Biotechnol.，27(11)：1013-1023(2009)；Mardis，Genome Med.，1(4)：40(2009)；Metzker，Nature Rev.Genet.，11(1)：31-46(2010)。
当测量针对蛋白质的标志物的表达时，可以使用针对PSGL-1的特异性抗体。可以通过本领域技术人员可利用的各种测定法(例如，免疫沉淀、免疫化学(IHC)、蛋白质印迹、斑点印迹(Dot Blot)、ELISA、ELISPOT、蛋白质阵列、抗体阵列、或与免疫组织化学结合的组织阵列)来检测和/或定量和/或确定抗PSGL-1抗体的结合。可以使用的其他技术包括荧光活化细胞分选(Fluorescence Activated Cell Sorting)(FACS)、FRET或BRET技术、显微镜或组织化学方法，尤其包括共聚焦显微镜和电子显微镜方法，基于使用一个或多个激发波长的方法、以及合适的光学方法，例如电化学方法(伏安法和安培法技术)、原子力显微镜法、和射频方法(例如多极、共焦和非共焦共振光谱法)、荧光检测、发光、化学发光、吸光度、反射率、透射率、和双折射或折光率(例如，通过表面等离子体共振的手段、通过椭圆偏振法、通过共振镜法的手段等)、流式细胞仪、放射性同位素或磁共振成像、通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行的分析(SDS-PAGE)；通过HPLC-质谱法的手段、通过液相色谱/质量分光光度法/质量光谱测定法(LC-MS/MS)。所有这些技术对于本领域技术人员而言是众所周知的，并且在这里不必对其进行详细描述。
尽管上述方法中的任何一种都适合于执行本方法，但是可以特别提及FACS、ELISA、ELISPOT、蛋白质印迹和IHC。优选的方法包括ELISPOT、FACS和IHC。
确定肿瘤的PSGL-1状态
确定试剂与PSGL-1的结合(如上所述)允许确定待治疗肿瘤的PSGL-1状态。通过本领域技术人员已知或当前使用的任何方法或技术，通常可以基于确定PSGL-1表达水平确定PSGL-1状态。然后可以基于肿瘤的PSGL-1状态预测患者是否会对抗VISTA治疗剂产生应答。
最近，变得明显的是免疫学数据(肿瘤样本中免疫细胞的类型，密度和位置)比目前用于分期结直肠癌的组织病理学方法能更好地预测患者的生存。
此外，来自临床试验的越来越多的证据支持在某些类型的癌症中靶向免疫活性的治疗的潜力(Robert等人，Stagg等人)。这导致了开发表征在癌症中肿瘤免疫浸润物的更加标准化的方法，例如，除标准化的临床参数以外，旨在定量原位免疫浸润物的“免疫评分”，以帮助预测和选择各种癌症中用于免疫治疗的患者(例如，Galen等人，JPathol232(2)：199-209(2014)；Galon等人，J Transl Med 14：273(2016))。
因此，本文所述的检测或诊断VISTA介导的癌症的方法包括确定肿瘤的PSGL-1评分。
根据该实施方案，所述方法包括以下步骤：
a)使所述受试者的生物样本与能够结合PSGL-1蛋白或核酸的试剂接触；
b)定量所述试剂与所述生物样本的结合；和
c)通过将步骤a)中获得的定量水平与基于两个参数(即，染色强度和阳性细胞百分比)的合适的量表进行比较，对肿瘤细胞进行评分。
在一个优选的实施方案中，步骤b)包括定量所述试剂与所述生物样本中肿瘤微环境的免疫浸润物中的PSGL-1的结合。
根据该优选的实施方案，该方法包括以下步骤：
a)使所述受试者的生物样本与能够结合PSGL-1蛋白或核酸的试剂接触；
b)定量所述试剂与所述生物样本的结合；和
c)通过将步骤a)中获得的定量水平与基于两个参数(即染色强度和阳性细胞百分比)的合适的量表进行比较，对肿瘤免疫细胞进行评分。
肿瘤免疫细胞(或免疫浸润物)包括存在于肿瘤微环境中的免疫细胞，特别是肿瘤微环境的免疫抑制细胞，如一些巨噬细胞、单核细胞等。在一个优选的实施方案中，免疫浸润物包括淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)、树突状细胞、肥大细胞、和巨噬细胞。因此，在该实施方案中，步骤b)包括定量所述试剂与所述生物样本中的肿瘤微环境中的淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)、树突状细胞、肥大细胞和巨噬细胞上的PSGL-1的结合。
任何常规的危害分析方法都可用于估计PSGL-1的预后值。代表性的分析方法包括Cox回归分析，其是一种半参数方法，用于在存在删除病例的情况下对生存或时间-事件数据进行建模(Hosmer和Lemeshow，1999；Cox，1972)。与其他生存分析(例如，Life Tables orKaplan-Meyer)相反，Cox允许在模型中包含预测变量(协变量)。使用常规分析方法，例如，Cox，可以能够测试关于以下的假说：原发性肿瘤中PSGL-1表达状态与疾病复发的发作时间(无疾病生存时间、或转移性疾病的时间)、或疾病致死时间(总生存时间)的相关性。Cox回归分析也称为Cox比例风险分析。该方法是测试肿瘤标志物对患者生存时间的预后价值的标准。在多变量模式下使用时并行测试多个协变量的效果，以便可以识别具有独立预后价值的个体协变量，即最有用的标志物。术语阴性或阳性“PSGL-1状态”也可以称为[PSGL-1(-)]或[PSGL-1(+)]。
在癌症的诊断或监测过程中，样本可能会被“评分”。以其最简单的形式，评分可以是如通过免疫组织化学对样本进行目视检查所判断的阴性或阳性分类。更加定量的评分涉及判断两个参数：染色强度和所采样的染色(“阳性”)细胞的比例。
在一个实施方案中，为了确保标准化，可以对样本在不同量表上进行PSGL-1表达水平评分，其中大多数是基于对反应产物的强度和阳性细胞的百分比的评估(Payne等人，Predictive markers in breast cancer-the present，Histopathology 2008，52，82-90)。
在另一个实施方案中，所述评分包括使用基于染色的强度和阳性细胞的百分比的适当的量表。
作为第一个示例，根据雌激素受体和孕激素受体IHC评估的Quick Allred评分类推，可以对样本的PSGL-1表达水平在0到8的整体量表上进行评分，结合了反应强度和细胞染色比例的评分((Harvey JM，Clarck GM，Osborne CK，Allred DC；J.Clin.Oncol.1999；17；1474-1481)。更特别地，反应强度的第一标准以从0到3的量表评分，0对应于“无反应性”以及3对应于“强反应性”。反应性比例的第二标准在0到5的量表上评分，0对应于“无反应性”，而5则为“67-100％比例的反应性”。然后将反应强度评分与反应比例评分相加，得到0到8的总评分。0-2的总评分视为阴性，而3-8的总评分视为阳性。
根据该量表，在本说明书中使用的肿瘤的术语阴性或阳性“PSGL-1状态”，是指分别对应于Allred量表的评分0-2或3-8的PSGL-1的表达水平。
下文表2说明根据AUred方法解释IHC结果的指南。
表2
根据本发明，所述合适的量表可以是0至8的量表，其中无反应性评分0，67-100％反应比例的强反应性比例被评分为8。
换句话说，描述了体外或离体确定来自受试者的肿瘤的状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)根据Allred量表对来自受试者的肿瘤进行评分；以及(b)Allred评分为3至8，确定肿瘤状态为[PSGL-1(+)]；或(c)Allred评分为0到2，确定肿瘤状态为[PSGL-1(-)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为3的[PSGL-1(+)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为4的[PSGL-1(+)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为5的[PSGL-1(+)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为6的[PSGL-1(+)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为7的[PSGL-1(+)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是Allred评分为8的[PSGL-1(+)]。
在本发明的另一个具体方面，肿瘤是Allred评分为3至8的[PSGL-1(+)]。
本文描述了用于体外或离体确定受试者中肿瘤细胞的PSGL-1状态的另一种具体方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)如上所述对PSGL-1肿瘤细胞进行评分；以及
(b)当评分为3至8时，确定肿瘤细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(+)]；或
(c)当评分为0至2时，确定肿瘤细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(-)]。
本文描述了用于体外或离体确定受试者中肿瘤免疫细胞的PSGL-1状态的另一种具体方法，其特征在于包括以下步骤：
(a)如上所述对PSGL-1肿瘤免疫细胞进行评分；以及
(b)当评分为3至8时，确定肿瘤免疫细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(+)]；或者
(c)当评分为0至2时，确定肿瘤免疫细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(-)]。
在一个优选的实施方案中，肿瘤免疫细胞(即，免疫浸润物)包括淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)、树突状细胞、肥大细胞和巨噬细胞。因此，在该实施方案中，步骤a)包括定量所述试剂与PSGL-1的结合，所述PSGL-1在所述生物样本的肿瘤微环境中存在的淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)、树突状细胞、肥大细胞和巨噬细胞上。
作为第二个示例，例如，根据对HER-2受体IHC评估的常规评分类推，可以采用一种在一定程度上比较简单的评分方法对样本的PSGL-1表达水平进行评分，该评分方法将染色强度(优先是膜染色)和显示染色的细胞比例整合成从0到3+的组合量表。
在此量表(称为简化量表)中，0和1+为阴性而2+和3+代表阳性染色。但是，评分1+-3+可以记录为阳性，因为与评分0(阴性)相比，每个阳性评分可能与复发和致命疾病的显著更高风险显著相关，但是增加在阳性评分的强度可能会提供其他风险降低。
一般而言，在本说明书中使用的术语肿瘤的阴性或阳性“PSGL-1状态”是指分别对应于简化量表上的评分0-1+或2+-3+的PSGL-1的表达水平。仅应考虑侵袭性肿瘤的完全周膜性反应性，并且通常类似于“鸡丝”外观。根据目前的指南，要求对PSGL-1评分为临界值(评分2+或3+)的样本进行进一步评估。作为非限制性示例，如果对照没有达到预期效果、伪影累及了大部分样本、以及样本具有正常乳腺导管(内部对照)的强膜阳性(这提示过度抗原修复(antigen retrieval))，则应拒绝进行IHC分析，并应通过FISH或任何其他方法进行重复或测试。
为了更清楚，下文表3总结了这些参数。
表3
合适的量表可以是0至3+的量表，其中将肿瘤细胞或肿瘤免疫细胞中无膜反应性评分为0，以及将超过10％的肿瘤细胞的强完全反应性评分为3+。
更详细地，如上所述，所述合适的量表是0至3的量表，其中将肿瘤细胞或肿瘤免疫细胞的无膜反应性评分为0；在超过10％的肿瘤细胞或肿瘤免疫细胞中微弱察觉到的膜反应性评分为1+；在超过10％的肿瘤细胞或肿瘤免疫细胞中的弱至中度的完全膜反应性评分为2+；以及在超过10％的肿瘤细胞或肿瘤免疫细胞中的强完全反应性评分为3+。
换句话说，描述体外或离体确定来自受试者的肿瘤的状态的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)根据上述简化的量表对来自受试者的肿瘤进行评分；以及(b)当评分为2+或3+，确定肿瘤状态为[PSGL-1(+)]；或(c)当评分为0或1+，确定肿瘤状态为[PSGL-1(-)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是评分为2+的[PSGL-1(+)]。
在本发明的一个具体方面，肿瘤是评分为3+的[PSGL-1(+)]。
在本发明的另一个具体方面，肿瘤是评分为2+或3+的[PSGL-1(+)]。
在另一个实施方案中，用于在体外或离体确定受试者中的肿瘤细胞的PSGL-1状态的方法可以包括以下步骤：
(a)根据上述方法对来自所述受试者的PSGL-1肿瘤细胞进行评分；以及
(b)当评分为2+或3+时，确定肿瘤细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(+)]；或者
(c)当评分为0或1+时，确定肿瘤细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(-)]。
在另一个实施方案中，用于体外或离体确定在受试者中肿瘤免疫细胞的PSGL-1状态的方法，可包括以下步骤：
(a)根据上述方法对来自所述受试者的PSGL-1肿瘤免疫细胞进行评分；以及
(b)当评分为2+或3+时，确定肿瘤免疫细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(+)]；或者
(c)当评分为0或1+时，确定肿瘤免疫细胞的PSGL-1状态为[PSGL-1(-)]。
在一个优选的实施方案中，肿瘤免疫细胞(即，免疫浸润物)包括淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)、树突状细胞、肥大细胞和巨噬细胞。因此，在该实施方案中，步骤a)包括定量所述试剂与PSGL-1的结合，所述PSGL-1在所述生物样本的肿瘤微环境中存在的淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞)、树突状细胞、肥大细胞和巨噬细胞上。
通常，测试或测定的结果可以以多种格式中的任何一种显示。结果可以定性显示。例如，测试报告可以仅指示是否检测到特定多肽，也许还指示检测极限。结果可以作为半定量显示。例如，可以限定各种范围，以及为范围指定一个评分(例如，取决于所用量表，0至3+或0至8)，其提供某种程度的定量信息。这种评分可反应各种因素，例如，从其中检测到PSGL-1的细胞数目、信号的强度(其可指PSGL-1的表达水平或携带PSGL-1细胞)等。结果可以作为定量方式显示，例如，作为从其中检测到PSGL-1的细胞的百分比、或者作为蛋白浓度等。
本领域普通技术人员将会理解，由测试提供的输出类型将随着测试的技术限制以及与多肽检测相关的生物显著性变化而变化。例如，在某种多肽的情况下，纯定性的输出(例如，在某个检测水平是否检测到多肽)提供显著信息。在其他情况下，更加定量的输出(例如，在待测试样本中多肽表达水平相对正常水平的比率)是必须的。
抗PSGL-1抗体
在本方法中使用的抗体是与PSGL-1(包括PSGL-1多肽、PSGL-1多肽片段、或PSGL-1表位)结合的抗体。抗PSGL-1抗体包括人源化的抗PSGL-1抗体。还提供抗体(例如，人源化的抗PSGL-1抗体)，其完全阻断本文提供的抗PSGL-1抗体与PSGL-1多肽结合。
本公开还提供抗体，其结合PSGL-1并激动或拮抗PSGL-1和VISTA之间的相互作用。优选地，抗PSGL-1抗体抑制或阻断PSGL-1与VISTA的结合，尤其是与VISTA的细胞外结构域的结合。在一些实施方案中，抗PSGL-1抗体抑制或阻断表达VISTA的细胞与表达PSGL-1的T细胞结合，例如，如髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞、或T细胞。在一些实施方案中，抗PSGL-1抗体不阻断或抑制PSGL-1与P-选择蛋白、L-选择蛋白或E-选择蛋白的结合。
本文提供的抗PSGL-1抗体(例如，人源化的抗PSGL-1抗体)还可缀合或重组融合至诊断剂、检测剂或治疗剂(例如，抗体-药物缀合物)。例如，检测剂可以是可检测探针。还提供组合物，包括药物组合物，其包含抗PSGL-1抗体(例如，人源化的抗PSGL-1抗体)。
可以通过本领域已知的任何用于合成抗体的方法生产本文提供的与抗原(例如，PSGL-1)结合的抗体，特别是通过化学合成或通过重组表达技术。例如，若干抗PSGL-1抗体和生产这种抗体的方法已经在之前描述(参见，例如，WO 2005/110475、WO 2003/013603；美国专利申请公开号2009/0198044，2005/0266003、2009/0285812、2013/0011391和2015/0183870；和美国专利号7,833,530和8,361,472)。
可以通过各种本领域公知的方法生产与抗原结合的多克隆抗体。例如，人抗原可以施用至各种宿主动物，包括、但不限于，兔子、小鼠、大鼠等，以诱导生产含有对人抗原特异的多克隆抗体的血清。根据宿主物种的不同，可以使用各种佐剂来增强免疫应答，包括但不限于弗氏(完全和不完全)、矿物凝胶(例如，氢氧化铝)、表面活性物质(例如，溶血卵磷脂)、普朗尼克多元醇、聚阴离子、肽、油乳剂、匙孔血蓝蛋白、二硝基苯酚，以及可能有用的人佐剂(例如，BCG(卡介苗)和小棒杆菌(Corynebacterium parvum))。这样的佐剂在本领域也是众所周知的。
可以使用本领域已知的多种技术制备单克隆抗体，包括使用杂交瘤、重组、和噬菌体展示技术、或其组合。例如，可以使用杂交瘤技术来产生单克隆抗体，所述杂交瘤技术包括本领域已知的并且教导的那些，例如在Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual.(Cold SpringHarbor Laboratory Press.第二版，1988)；Hammerling等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563681(Elsevier，N.Y.，1981)(通过引用以其整体并入引用)。如本文所用，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。产生单克隆抗体的其他示例性方法在本文其他地方讨论，例如使用KM mouseTM。本文实施例中提供了产生单克隆抗体的其他示例性方法。可选择地，也可以使用抗PSGL-1抗体，例如WO 2003/013603、WO 2005/110475、WO2009/140623、Dimitroff等人，Cancer Res，65(13)：5750-60(2005)，Veerman等人，Nature Immunol 8(5)：532-9(2007)，Tinocco等人，Immunity44：1190-1203(2016)中所述的抗体。
使用杂交瘤技术产生和筛选特异性抗体的方法是常规的并且是本领域众所周知的。简而言之，可以用PSGL-1抗原免疫小鼠，并且一旦检测到免疫应答，例如，在小鼠血清中检测到对PSGL-1抗原特异的抗体，就收集小鼠脾脏并分离脾细胞。然后通过众所周知的技术将脾细胞融合至任何合适的骨髓瘤细胞，例如，从ATCC可获得的细胞系SP20的细胞。选择杂交瘤并通过有限稀释克隆。
另外，RIMMS(重复免疫多个位点)技术可以用于免疫动物(Kilptrack等人，1997Hybridoma 16：381-9，通过引用整体并入)。然后，通过本领域已知的方法测定杂交瘤克隆中分泌能结合给定多肽的抗体的细胞。可以通过用阳性杂交瘤克隆免疫小鼠来产生通常含有高水平抗体的腹水。
因此，本文还提供了通过培养分泌本文提供的修饰抗体的杂交瘤细胞来产生抗体的方法，其中，在一些实施方案中，所述杂交瘤通过融合脾细胞与骨髓瘤细胞产生，然后筛选融合产生的杂交瘤，以寻找分泌能够结合PSGL-1的抗体的杂交瘤克隆，所述脾细胞是从用PSGL-1(包括PSGL-1多肽、PSGL-1多肽片段、或PSGL-1表位)免疫的小鼠中分离的脾细胞。
可以通过本领域技术人员已知的任何方法来鉴定能够调节(例如，增加或抑制)PSGL-1和VISTA之间相互作用的抗PSGL-1抗体。实验部分描述用于检测和测量PSGL-1与VISTA之间相互作用的测定的实例。这些分析中的任何一种均可用于测试抗PSGL-1抗体是否可以调节PSGL-1与VISTA之间的相互作用。
可以通过本领域技术人员已知的任何技术来产生识别(例如结合)PSGL-1的抗体片段。例如，本文提供的Fab和F(ab’)2片段可以通过使用例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab’)2片段)的酶通过蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生。F(ab’)2片段包含可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。此外，本文提供的抗体也可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生。
例如，还可以使用各种噬菌体展示方法产生抗体。在噬菌体展示方法中，功能性抗体结构域被展示在带有编码它们的多核苷酸序列的噬菌体颗粒的表面上。特别地，从动物cDNA文库(例如，人或鼠患病组织的cDNA文库)扩增编码VH和VL结构域的DNA序列。通过PCR，将编码VH和VL结构域的DNA与scFv接头重组在一起，并克隆到噬菌粒载体中。所述载体通过电穿孔进入大肠杆菌，并且大肠杆菌被辅助噬菌体感染。这些方法中使用的噬菌体通常是包括fd和M13的丝状噬菌体，以及VH和VL结构域通常重组融合到噬菌体基因III或基因VIII中。可以使用抗原选择或鉴定噬菌体，所述噬菌体表达与特定抗原结合的抗原结合结构域，例如，使用标记的抗原或结合或捕获至固体表面或珠子的抗原。可用于制备本文提供的抗体的噬菌体展示方法的实例包括以下公开的那些：在Brinkman等人，1995，J.Immunol.Methods182：41-50；Ames等人，1995，J.Immunol.Methods 184：177-186；Kettleborough等人，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等人，1997，Gene 187：9-18；Burton等人，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT/GB9I/01134；WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO 93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401、以及WO97/13844；以及U.S.专利号.5,698,426、5,223,409、5,403,484，5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743以及5,969,108；其中的每一个都通过整体引用并入本文。
如以上参考文献中所述，在噬菌体选择后，可以分离来自噬菌体的抗体编码区并用于产生完整的抗体(包括人抗体、或任何其他所想要的抗原结合片段)，并在任何所想要的宿主中表达，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞、酵母、和细菌，例如，如下所述。重组产生Fab、Fab’和F(ab’)2片段的技术也可以使用本领域已知的方法来进行，例如在以下公开的那些：PCT公开号WO 92/22324；Mullinax等人，1992，BioTechniques 12(6)：864-869；Sawai等人，1995，AJRI 34：26-34；以及Better等人，1988，Science 240：1041-1043(这些参考文献通过引用其整体并入)。
为了产生完整的抗体，可以使用PCR引物来扩增scFv克隆中的VH或VL序列，所述PCR引物包括VH或VL核苷酸序列、限制性酶切位点和保护该限制性酶切位点的侧翼序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达VH恒定区(例如，人γ4恒定区)的载体中，而PCR扩增的VL结构域可以克隆到表达VL恒定区(例如，人κ或λ恒定区)的载体中。VH和VL结构域也可以克隆到表达必需恒定区的一种载体中。然后，例如，使用本领域技术人员已知的技术，将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，以产生表达全长抗体(例如，IgG)的稳定或瞬时细胞系。
对于某些用途，包括在人体中体内使用抗体和体外检测测定，可以使用人抗体或嵌合抗体。完全人抗体对于人受试者的治疗处理是特别理想的。可以通过本领域已知的多种方法来制备人抗体，包括上述使用源自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。还参见美国专利号4,444,887和4,716,111；和WO 98/46645、WO 98/50433、WO 98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735、和WO 91/10741；其中的每一个均通过引用其整体并入本文。
在一些实施方案中，产生人抗体。可以使用本领域已知的任何方法来产生人抗体和/或完全人抗体。例如，不能表达功能性内源性免疫球蛋白、但可以表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠。例如，可以将人重链和轻链免疫球蛋白基因复合物随机引入或通过同源重组引入小鼠胚胎干细胞中。或者，除人重链和轻链基因外，还可将人可变区、恒定区和多样性区引入小鼠胚胎干细胞中。可单独使小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因变为无功能，或可在通过同源重组引入人免疫球蛋白基因座的同时进行。特别地，JH区的纯合缺失阻止内源性抗体产生。将修饰的胚胎干细胞扩增并显微注射到胚泡中以产生嵌合小鼠。然后繁殖嵌合小鼠以产生表达人抗体的纯合后代。用选择的抗原(例如，全部或部分多肽)以正常方式免疫转基因小鼠。可以使用常规杂交瘤技术从免疫的、转基因小鼠中获得针对抗原的单克隆抗体。转基因小鼠携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化过程中会重排，然后进行类别转换和体细胞突变。因此，使用这种技术可能产生治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。有关产生人抗体的这项技术的综述，请参见Lonberg和Huszar(1995，Int.Rev.Immunol.13：65-93)。关于产生人抗体和人单克隆抗体的这种技术以及产生这种抗体的操作方案的详细讨论，参见，例如，WO 98/24893、WO 96/34096和WO 96/33735；以及美国专利号5,413,923、5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806、5,814,318和5,939,598，通过引用将其全部内容并入本文。其他方法在本文的实施例中详述。另外，诸如Abgenix，Inc.(Freemont，CA)和Genpharm(San Jose，CA)的公司使用与上述相似的技术来提供针对所选抗原的人抗体。
嵌合抗体是其中抗体的不同部分来源自不同免疫球蛋白分子的分子。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison，1985，Science 229：1202；Oi等人，1986，BioTechniques 4：214；Gillies等人，1989，J.Immunol.Methods125：191-202；以及美国专利号5,807,715、4,816,567、4,816,397和6,331,415，其全部内容通过引用并入本文。
人源化抗体是一种能够结合预定抗原的抗体或其变体或其片段，其包含框架区和CDR，所述框架区基本上具有人免疫球蛋白的氨基酸序列、以及所述CDR基本上具有非人免疫球蛋白的氨基酸序列。人源化抗体包含至少一个、以及通常是两个可变结构域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)的基本上全部，其中所有或基本上所有CDR区均对应于非人免疫球蛋白(例如，供体抗体)的那些、以及所有或基本上所有框架区是人免疫球蛋白共有序列的那些。在一些实施方案中，人源化抗体还包含免疫球蛋白恒定区(Fc)(通常是人免疫球蛋白的恒定区)的至少一部分。通常，抗体将包含轻链和至少重链的可变结构域。抗体还可以包含重链的CH1、铰链、CH2、CH3和CH4区域。人源化抗体可以选自免疫球蛋白的任何种类，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。通常，恒定结构域是补体固定恒定结构域，其中人源化抗体表现出细胞毒性活性所需要的，该类别通常是IgG1。在不需要这种细胞毒性活性的情况下，恒定结构域可以是IgG2类。可以在一些实施方案中使用的VL和VH恒定结构域的实例包括，但不限于C-κ和C-γ-1(nG1m)，描述于Johnson等人(1997)J.Infect.Dis.176，1215-1224以及在美国专利号5,824,307中描述的那些。人源化抗体可包含来自一种以上类型或同种型的序列，并且选择特定的恒定结构域以优化所想要的效应子功能在本领域普通技术人员能力范围内。人源化抗体的框架区和CDR区不必精确地对应于亲本序列，例如，可通过取代、插入或缺失至少一个残基来突变供体CDR或共有框架，从而使该位点的CDR或框架残基既不对应共有抗体也不对应引入(import)抗体。但是，此类突变不会广泛存在。通常，至少75％的人源化抗体残基将对应于亲本FR和CDR序列的残基，更通常为90％、或大于95％。人源化抗体可以使用本领域中已知的多种技术来产生，包括但不限于，CDR移植(EP 239400；WO 91/09967；以及美国专利号5,225,539、5,530,101，以及5,585,089)，镶面或重修(veneering or resurfacing)(EP 592106和EP519596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等人，1994，ProteinEngineering 7(6)：805-814；和Roguska等人，1994，Proc Natl Acad Sci91：969-973)，链改组(chain shuffling)(美国专利号5,565,332)，以及以下公开的技术，例如，美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、WO 93/17105，Tan等人，J.Immunol.169：111925(2002)，Caldas等人，Protein Eng.13(5)：353-60(2000)，Morea等人，Methods 20(3)：26779(2000)，Baca等人，J.Biol.Chem.272(16)：10678-84(1997)，Roguska等人，Protein Eng.9(10)：895904(1996)，Couto等人，CancerRes.55(23附刊)：5973-5977(1995)，Couto等人，Cancer Res.55(8)：1717-22(1995)，Sandhu JS，Gene 150(2)：409-10(1994)，以及Pedersen等人，J.Mol.Biol.235(3)：959-73(1994)。另见美国专利公开号2005/0042664A1，其全部内容通过引用并入本文。通常，框架区中的框架残基将被来自CDR供体抗体的相应残基所取代以改变(例如，改善)抗原结合。通过本领域熟知的方法来鉴定这些框架取代，例如通过对CDR和框架残基的相互作用进行建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基，以及通过序列比较以鉴定在特定位置的异常框架残基。(参见，例如，Queen等人，美国专利号5,585,089；以及Reichmann等人，1988，Nature 332：323，其全部内容通过引用并入本文。)
可以通过本领域众所周知的方法产生单结构域抗体，例如，缺少轻链的抗体。参见Riechmann等人，1999，J.Immunol.231：25-38；Nuttall等人，2000，Curr.Pharm.Biotechnol.1(3)：253-263；Muylderman，2001，J.Biotechnol.74(4)：277302；美国专利号6,005,079；和WO 94/04678、WO 94/25591、和WO 01/44301，其全部内容通过引用并入本文。
此外，可以使用本领域技术人员众所周知的技术，反过来使用与PSGL-1结合的抗体来生成“模拟”抗原的抗独特型抗体。(参见，例如Greenspan&Bona，1989，FASEB J.7(5)：437-444；Nissinoff，1991，J.Immunol.147(8)：2429-2438)。
本文提供的抗体包括但不限于合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体、嵌合抗体、胞内抗体、抗独特型抗体(抗Id)抗体，以及以上任何一种的功能片段。功能片段的非限制性实例包括单链Fv(scFv)(例如，包括单特异性、双特异性等)、Fab片段、F(ab′)片段、F(ab)2片段、F(ab′)2片段、二硫键连接的Fvs(sdFv)、Fd片段、Fv片段、双抗体、三抗体、四抗体和微型抗体。
特别地，本文提供的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫学活性部分，例如，包含与PSGL-1(例如，PSGL-1多肽、PSGL-1多肽片段、PSGL-1表位)结合的抗原结合位点的分子。本文提供的免疫球蛋白分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
抗体的变体和衍生物包括保留与PSGL-1(例如，PSGL-1多肽、PSGL-1多肽片段、PSGL-1表位)结合能力的抗体功能片段。示例性功能片段包括Fab片段(抗体片段，其包含抗原结合结构域以及包含通过二硫键桥接的轻链和重链的一部分)；Fab′(抗体片段，其包含含有Fab的单个抗结合结构域、以及包含通过铰链区的重链的其它部分)；F(ab′)2(通过重链的铰链区域中的链间二硫键连接的两个Fab′分子；Fab′分子可针对相同或不同的表位)；双特异性Fab(具有两个抗原结合结构域的Fab分子，其中每一个可以针对不同的表位)；包含可变区的单链Fab链，也称为sFv(通过10-25个氨基酸的链连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；二硫键连接的Fv或dsFv(通过二硫键连接在一起的抗体的单个轻链和重链的可变抗原结合决定区)；骆驼化的VH(抗体的单个重链的可变抗原结合决定区，其中VH界面上的某些氨基酸是在天然骆驼抗体的重链中发现的氨基酸)；双特异性sFv(具有两个抗原结合结构域的sFv或dsFv分子，每个结构域可以针对不同的表位)；双抗体(当第一sFv的VH结构域与第二sFv的VL结构域组装在一起且第一sFv的VL结构域与第二sFv的VH结构域组装在一起时形成的二聚体sFv；双抗体的两个抗原结合区可以针对相同或不同的表位)；三抗体(三聚体sFv，以类似于双抗体的方式形成，但其中在单个复合物中形成三个抗原结合结构域；这三个抗原结合结构域可针对相同或不同的表位)。抗体的衍生物还包括抗体组合位点的一个或多个CDR序列。当存在两个或更多个CDR序列时，CDR序列可以在支架上连接在一起。在一些实施方案中，抗体包含单链Fv(“scFv”)。scFv是包含抗体VH和VL结构域的抗体片段，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，scFv多肽在VH和VL结构域之间进一步包含多肽接头，其使scFv能够形成抗原结合所需要的结构。有关scFv的综述，请参阅Pluckthun在The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，纽约，269-315页(1994)。
本文提供的抗体可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多多特异性。多特异性抗体可以对PSGL-1多肽的不同表位具有特异性，也可以对PSGL-1多肽以及异源表位(例如，异源多肽或固体支持材料)都具有特异性。在一些实施方案中，本文提供的抗体对PSGL-1多肽的给定表位是单特异性的，并且不结合其他表位。
本文还提供了融合蛋白，其包含本文提供的与PSGL-1结合的抗体和异源多肽。在一些实施方案中，与抗体融合的异源多肽可用于将抗体靶向在细胞表面具有PSGL-1表达的细胞。
本文还提供与PSGL-1结合的抗体组。在一些实施方案中，抗体组具有不同的结合速率常数、不同的解离速率常数、对PSGL-1的不同亲和力、和/或对PSGL-1的不同特异性。在一些实施方案中，所述组包含或由以下组成：约10、约25、约50、约75、约100、约125、约150、约175、约200、约250、约300、约350、约400、约450、约500、约550、约600、约650、约700、约750、约800、约850、约900、约950、或约1000个抗体或更多。抗体组可以在例如96孔或384孔板中使用，例如，用于如ELISA的测定。
PSGL-1结合试剂的诊断用途
使用本文所述的或本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，本文提供的抗PSGL-1抗体可用于测定生物样本中的PSGL-1水平(例如，参见Jalkanen等人，1985，J.Cell.Biol.101：976-985；和Jalkanen等人，1987，J.Cell.Biol.105：3087-3096)。可用于检测蛋白质基因表达的其他基于抗体的方法包括免疫测定、例如酶联免疫吸附测定(ELISA)和放射免疫测定(RIA)。合适的抗体测定标记是本领域已知的，并且包括酶标记，例如，葡萄糖氧化酶；放射性同位素，例如，碘(125I、121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(121In)、以及锝(99Tc)；发光标记，例如鲁米诺；以及荧光标记，如荧光素和若丹明，和生物素。
本文还提供了对人中VISTA介导的疾病、病症或病状的检测和诊断。在一些实施方案中，诊断包括：a)向受试者施用(例如，肠胃外、皮下、或腹膜内)有效量的结合PSGL-1的标记抗体；b)在施用后等待一个时间间隔，以允许标记的抗体优先集中在受试者表达PSGL-1的位点上(以及将未结合的标记分子清除至背景水平)；c)确定背景水平；以及d)在受试者中检测标记的抗体，从而检测到标记的抗体在背景水平以上，指示受试者患有VISTA介导的疾病、病症或病状。可以通过各种方法确定背景水平，包括将检测到的标记分子的量与之前为特定系统确定的标准值进行比较。
在本领域中将理解，受试者的尺寸和所使用的成像系统将决定产生诊断图像所需要的成像部分的数量。在放射性同位素部分的情况下，对于人受试者而言，注入的放射性量通常将在约5至20毫居里的99Tc范围内。然后，标记的抗体将优先聚集在含有特定蛋白质的细胞的位置。体内肿瘤成像描述见于S.W.Burchiel等人，“Immunopharmacokinetics ofRadiolabeled Antibodies and Their Fragments.”(13章in Tumor Imaging：TheRadiochemical Detection of Cancer，S.W.Burchiel和B.A.Rhodes编，MassonPublishing Inc.(1982)。
取决于几个变量，包括所用标记的类型和施用方式，施用后允许标记的抗体优先集中在受试者部位，以及将未结合的标记抗体清除至背景水平的时间间隔为6至48小时、或6至24小时、或6至12小时。在另一个实施方案中，施用后的时间间隔是5至20天、或5至10天。
在一些实施方案中，通过重复用于诊断VISTA介导的疾病、病症或病状的方法，来监测VISTA介导的疾病、病症或病状，例如，在初次诊断后一个月、初次诊断后六个月、初次诊断后一年等。
可以使用本领域已知的体内扫描的方法在受试者中检测标记分子的存在。这些方法取决于所用标记的类型。技术人员将能够确定用于检测特定标记的适当方法。可以在本文提供的诊断方法中使用的方法和设备包括、但不限于，计算机断层摄影(CT)、全身扫描(例如，位置发射断层摄影(PET))、磁共振成像(MRI)、和超声检查)。
在一些实施方案中，分子用放射性同位素标记，并使用辐射响应性手术器械在患者中检测(Thurston等人，美国专利号5,441,050)。在另一个实施方案中，分子用荧光化合物标记，并使用荧光响应扫描仪在患者中检测。在另一个实施方案中，分子用正电子发射金属标记，并使用正电子发射断层摄影术在患者中检测。在又一个实施方案中，分子用顺磁性标记标记并且使用磁共振成像(MRI)在患者中检测。
抗病毒治疗剂
在第一实施方案中，抗VISTA治疗剂是抑制VISTA检查点抑制功能的试剂。可以在DNA、RNA或蛋白质水平上抑制VISTA抑制功能。在实施方案中，抑制性核酸(例如，dsRNA、siRNA或shRNA)可用于抑制VISTA的表达。在其他实施方案中，VISTA抑制信号的抑制剂是与VISTA结合的多肽，例如，可溶性配体(例如，PSGL-1-Fc)、或抗体或其抗原结合片段(在本文中也称为“抗体分子”)。优选地，抗VISTA治疗剂是抗体。
抑制VISTA功能的抗体对于治疗癌症特别有用。本发明人之前已经描述了针对VISTA的抗体，其诱导强烈的肿瘤生长抑制(参见WO 2014/197849和WO 2016/094837，两者均通过引用并入本文)。具有抗癌特性的其他抗VISTA抗体在本领域中也已有描述(参见，例如WO 2014/039983A1、WO 2015/145360A1、WO 2015/097536、WO 2017/137830、WO 2017/181139，所有通过引用其整体并入本文)。
尽管对于治疗用途，此类高度特异性和/或特异性的抗VISTA抗体(在本文中称为“抗VISTA抗体”)可以是多克隆抗体(“抗VISTA PAb”)或单克隆抗体(“抗VISTA MAb”)，但是，在某些情况下，在诊断或其他体外用途中，单克隆抗体是优选的。
在具体的实施方案中，抗体是人源化抗体、单克隆抗体、重组抗体、抗原结合片段或其任何组合。在具体实施方案中，抗体是如WO 2016/094837中所述的人源化单克隆抗体(例如，其中描述的5B、46A、97A、128A、146C、208A、215A、26A、164A、230A、76E1、53A、259A、33A、39A、124A、175A、321D、141A、51A、353A、或305A(例如，WO2016/094837的表12-33)，与VH结构域、VL结构域、VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和/或VLCDR3)、或其抗原结合片段，其结合至VISTA多肽(例如，细胞表面表达的或可溶性的VISTA)、VISTA片段或VISTA表位。
在其他实施方案中，本发明方法中使用的抗VISTA抗体是这样的抗体，(i)其竞争性阻断(例如，以剂量依赖方式)如WO 2016/094837中所述的抗VISTA抗体与VISTA多肽(例如，细胞表面表达的或可溶性的VISTA)、VISTA片段、或VISTA表位的结合；和/或(ii)其结合如WO 2016/094837中所述的抗VISTA抗体(例如，人源化抗VISTA抗体)结合的VISTA表位。在其他实施方案中，抗体竞争性阻断(例如，以剂量依赖方式)本文描述的单克隆抗体5B、46A、97A、128A、146C、208A、215A、26A、164A、230A、76E1、53A、259A、33A、39A、124A、175A、321D、141A、51A、353A、或305A(例如，表12-33中)、或其人源化变体与VISTA多肽(例如，细胞表面表达的或可溶性的VISTA)、VISTA片段、或VISTA表位的结合。在其他实施方案中，抗体结合至VISTA表位，所述表位是被以下结合(例如，识别)：在WO 2016/094837(例如，WO 2016/094837的表12-33中)中描述的单克隆抗体5B、46A、97A、128A、146C、208A、215A、26A、164A、230A、76E1、53A、259A、33A、39A、124A、175A、321D、141A、51A、353A或305A或其人源化变体(例如，人源化抗VISTA抗体)。
更优选地、本发明方法的抗VISTA抗体是WO 2016/094837中描述的抗体26A。在第一个实施方案中，该抗体包含含有3个CDR的重链和含有3个CDR的轻链，其中所述CDR如表4所示。在另一个实施方案中，所述抗VISTA抗体包含含有3个CDR的重链和含有3个CDR的轻链，其中所述CDR如表5所示。
表4：
表格5：
本公开的抗VISTA单克隆抗体包括完整分子、和能够特异性结合VISTA的抗体片段(例如，Fab和F(ab′)2片段)。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，从动物或植物的循环中清除得更快，并且可能比完整抗体具有更少的非特异性组织结合(Wahl等人，1983，J.Nucl.Med.24：316)。因此，抗体片段在其他应用中可用于治疗应用。
术语“抗体片段”是指全长抗体的一部分，通常是靶结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab′、F(ab′)2和Fv片段。“Fv”片段是包含完整靶识别和结合位点的最小抗体片段。该区域由紧密和非共价结合的一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的二聚体组成(VH-VL二聚体)。以此配置，每个可变结构域的三个CDR相互作用以在VH-VL二聚体的表面上限定靶结合位点。通常，六个CDR赋予抗体靶结合特异性。然而，在一些情况下，即使是单个可变结构域(或仅包含对靶标特异的三个CDR的Fv的一半)也具有识别和结合靶标的能力，尽管亲和力比整个结合位点低。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，其使得scFv能够形成靶标结合所需要的结构。“单结构域抗体”由表现出对VISTA足够亲和力的单个VH或VL结构域组成。在一个具体的实施方案中，单结构域抗体是骆驼化的抗体(参见，例如，Riechmann，1999，Journal of Immunological Methods 231：25-38)。
Fab片段包含轻链的恒定结构域和重链的第一恒定结构域(CH1)。Fab′片段与Fab片段的区别在于在重链CH1结构域的羧基末端添加了一些残基，其包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。F(ab′)片段是通过在F(ab′)2胃蛋白酶消化产物的铰链半胱氨酸上切割二硫键而产生的。抗体片段的其他化学偶联是本领域普通技术人员已知的。
本公开的抗VISTA单克隆抗体可以是嵌合抗体。如本文所用，术语“嵌合”抗体是指具有可变序列以及人类免疫球蛋白恒定区的抗体，所述可变序列源自非人免疫球蛋白(例如，大鼠或小鼠抗体)，所述人免疫球蛋白恒定区通常选自人免疫球蛋白模板。产生嵌合抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Morrison，1985，Science 229(4719)：1202-7；Oi等人，1986，BioTechniques 4：214-221；Gillies等人，1985，J.Immunol.Methods 125：191-202；美国专利号5,807,715；4,816,567；和4,816397，其通过整体引用并入本文。
本公开的抗VISTA单克隆抗体可以被人源化。非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如，Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗体的其他靶结合亚序列)，其包含来自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗体将包含至少一个、以及通常是两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，以及全部或基本上全部的FR区是人免疫球蛋白共有序列的序列，可以称为“CDR移植”。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白共有序列。抗体人源化的方法，包括设计人源化抗体的方法是本领域已知的。参见，例如，Lefranc等人，2003，Dev.Comp.Immunol.27：55-77；Lefranc等人，2009，Nucl.AcidsRes.37：D1006-1012；Lefranc，2008，Mol.Biotechnol.40：101-111；Riechmann等人，1988，Nature 332：323-7；美国专利号5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370，Queen等人；EP239400；PCT公开WO 9I/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan，1991，Mol.Immunol.，28：489-498；Studnicka等人，1994，Prot.Eng.7：805-814；Roguska等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.91：969-973；以及美国专利号5,565,332，其全部内容通过引用其整体并入本文。
编码抗体的多核苷酸
本文还提供多核苷酸，其包含编码如本文提供的与PSGL-1(例如，PSGL-1多肽、PSGL-1多肽片段、PSGL-1表位)结合的抗体的核苷酸序列。本文还提供了在高严谨、中等、或较低严谨杂交条件下(例如，如上文所定义)与编码本文提供的抗体或修饰的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。
本文还提供多核苷酸，所述多核苷酸包含编码本文提供与VISTA(例如，VISTA多肽、VISTA多肽片段、VISTA表位)结合的抗体的核苷酸序列。本文还提供了在高严谨、中等、或较低严谨杂交条件下(例如，如上文所定义)与编码本文提供的抗体或修饰的抗体的多核苷酸杂交的多核苷酸。
在某些实施方案中，本文提供的核酸分子包含或由以下组成：编码本文公开的VH和/或VL氨基酸序列、或其任何组合的核酸序列(例如，编码本文提供的抗体的核苷酸序列，例如，全长抗体、抗体的重链和/或轻链、或本文提供的单链抗体)。
抗体的重组表达
可用多种表达系统表达本发明的抗体，例如，本文所述的抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体。一方面，这样的表达系统代表为载体，通过其可以产生目的编码序列并随后纯化，但也可代表为细胞，当用合适的核苷酸编码序列瞬时转染时，所述细胞可以原位表达本发明的抗体。
本发明提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。在一个实施方案中，载体包含编码本发明的IgG抗体(即在Fc结构域中携带突变的抗体)重链的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述多核苷酸编码本发明的IgG抗体的轻链。本发明还提供了载体，其包含编码融合蛋白、修饰的抗体、抗体片段的多核苷酸分子、和其探针。
为了表达本文公开的抗体(例如，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体)的重链和/或轻链，将编码所述重链和/或轻链的多核苷酸插入表达载体，使得这些基因可操作性地连接至转录和翻译序列。
“可操作地连接”序列包括与目的基因邻接的表达控制序列、和以反式或远距离作用来控制目的基因的表达控制序列。如本文所用，术语“表达控制序列”是指实现与其所连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号，例如，剪接和聚腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，增强蛋白质分泌的序列。这种控制序列的性质取决于宿主生物不同；在原核生物中，这种控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，这种控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在最小程度包括：其存在对于表达和加工必不可少的所有组分，并且还可以包括其存在是有利的其他组分，例如前导序列和融合伴侣序列。
如本文所用，术语“载体”意欲指能够运输已与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”，其是指环状双链DNA环，其中可以连接其他DNA区段。载体的另一种类型是病毒载体，其中可以将其他DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。将载体导入宿主细胞后，可以将其他载体(例如，非游离的哺乳动物载体)整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
某些载体能够指导与其可操作连接的基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用的载体形式。然而，本发明旨在包括表达载体的此类形式，例如细菌质粒、YAC、粘粒、逆转录病毒、EBV衍生的附加体，以及本领域技术人员将知道的所有其他载体，以方便确保表达本发明抗体的重链和/或轻链。技术人员将认识到，可以将编码重链和轻链的多核苷酸克隆到不同的载体中或相同的载体中。在一个优选的实施方案中，将所述多核苷酸克隆到两个载体中。
本发明的多核苷酸和包含这些分子的载体可以用于转化合适的宿主细胞。如本文所用，术语“宿主细胞”旨在指已导入重组表达载体以表达本发明的抗体(例如，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体)的细胞。应当理解，这些术语不仅旨在指特定的受试者细胞，而且还指这种细胞的后代。因为由于突变或环境影响而在后代中可能发生某些修饰，所以这种后代实际上可能与亲本细胞不同，但仍包括在本文所用的术语“宿主细胞”的范围内。
可以通过用于将多核苷酸引入细胞宿主的任何已知方法进行转化。这样的方法是本领域技术人员众所周知的，包括葡聚糖介导的转化、磷酸钙沉淀、聚乙烯介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸包封到脂质体中、生物弹射和将DNA直接显微注射到核中。
宿主细胞可以是用两个或更多个表达载体(包括表达本发明蛋白的载体)共转染。特别地，其他表达载体可以编码参与翻译后修饰(例如糖基化)的酶。例如，可以用编码如上所述抗体(例如，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体)的第一载体和编码糖基转移酶多肽的第二载体对宿主细胞进行转染。可选择地，可以用如上所述的编码抗体(例如，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体)的第一载体、编码糖基转移酶的第二载体、以及编码另一糖基转移酶的第三载体对宿主细胞进行转化。哺乳动物细胞通常用于表达重组治疗性免疫球蛋白，尤其是表达完整重组抗体。例如，哺乳动物细胞(例如，HEK293或CHO细胞)与含有表达信号的载体相结合是表达本发明抗体的有效系统，所述表达信号例如一个携带来自人巨细胞病毒的主要中间早期基因启动子元件，所述本发明抗体特别是抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体(Foecking等人，1986，Gene 45：101；Cockett等人，1990，Bio/Technology 8：2)。
还可以选择宿主细胞，其以所想要的特定方式调节插入序列的表达、或修饰和加工基因产物。蛋白质产物的这种修饰(例如，糖基化)和加工对于蛋白质的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的特征和特定机制。选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的目的抗体的正确修饰和加工。因此，可以使用真核宿主细胞，其具有用于初级转录物的适当加工、基因产物的糖基化的细胞机制。此类哺乳动物宿主细胞包括、但不限于CHO、COS、HEK293、NS/0、BHK、Y2/0、3T3或骨髓瘤细胞，所有这些细胞系均可从公共保藏机构获得，所述公共保藏机构例如国立培养物保藏中心物(Collection Nationale des Cultures de Microorganismes，巴黎，法国)、或美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas，VA，美国)。
为了长期、高产量地生产重组蛋白，优选稳定表达。在本发明的一个实施方案中，可以工程化稳定表达抗体(例如，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体)的细胞系。除了使用含有病毒复制起点的表达载体、还可以在合适的表达调控元件控制下用DNA转化宿主细胞，所述表达调控元件包括启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点、和本领域技术人员已知的其他合适序列、以及可选的标志物。引入外源DNA后，允许使工程化的细胞在富集介质中生长一到两天，然后移至选择性介质中。重组质粒上的选择标志物赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定整合到染色体中并扩增成细胞系。用于构建稳定细胞系的其他方法是本领域已知的。特别地，已经开发了用于特定位点整合的方法。根据这些方法，在合适的表达调控元件(包括启动子、增强子、转录终止子、聚腺苷酸化位点、和其他合适的序列)的控制下，将转化的DNA整合到宿主细胞基因组中之前已经经过切割的特定靶位点上(Moele等人，Proc.Natl.Acad.Sci.US.A.，104(9)：3055-3060；美国5,792,632；US 5,830,729；6,238,924；WO 2009/054985；WO 03/025183；WO 2004/067753，其全部通过引用并入本文)。
可以使用许多选择系统，包括、但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等人，Cell11：223，1977)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalska等人，Proc Natl AcadSci USA 48：202,1992)、在甲硫氨酸亚磺酰亚胺(methionine sulfoximide)存在下选择谷氨酸合酶(Adv Drug Del Rev，58：671，2006，以及Lonza Group Ltd.的网站或文献)以及分别在tk、hgprt或aprt细胞中的腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，Cell 22：817，1980)基因。同样地，抗代谢物抗性可以用作选择以下基因的基础：dhfr，其赋予对甲氨蝶呤的抗性(Wigler等人，Proc Natl Acad Sci USA 77：357，1980)；gpt，其赋予了对麦考酚酸的抗性(Mulligan等人，Proc NatlAcad Sci USA 78：2072，1981)；neo，其赋予对氨基糖苷G-418的抗性(Wu等人，Biotherapy 3：87，1991)；和hygro，其赋予对潮霉素的抗性(Santerre等人，Gene 30：147，1984)。重组DNA技术领域中的已知方法可以常规地用于选择所想要的重组克隆，并且这种方法描述在，例如在Ausubel等人编辑的Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons(1993)中。抗体的表达水平可以通过载体扩增来增加。当表达抗体的载体系统中的标志物是可扩增的时，培养物中存在的抑制剂水平增加将增加标记基因的拷贝数。由于扩增的区域与编码目的抗体的基因(例如，抗PSGL-1抗体或抗VISTA抗体)相关，因此所述抗体的产生也将增加(Crouse等人，Mol Cell Biol 3：257，1983)。表达本发明基因的可选择的方法存在，并且是本领域技术人员已知的。例如，可工程化修饰的锌指蛋白，以使得其能够结合本发明基因上游的表达调控元件。在本发明的宿主细胞中的所述工程化的锌指蛋白(ZFN)的表达导致蛋白产量的增加(参见，例如，Reik等人，Biotechnol.Bioeng.，97(5)，1180-1189,2006)。此外，ZFN可以刺激DNA整合到预定的基因组位置，导致高效的位点特异性基因添加(Moehle等人，Proc Natl Acad Sci USA104：3055，2007)。
可以通过在表达所想要的抗体所必需的培养条件下，培养转化的宿主细胞的培养物来制备本发明的抗体。然后，可以从培养介质或细胞提取物中纯化得到的表达的抗体。可以从培养物上清液中回收抗体的可溶性形式。然后，可以通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法进行纯化，例如，通过色谱法(例如，离子交换、亲和力、特别是通过对Fc的蛋白A亲和力等等)、离心、微分溶解度(differential solubility)、或通过用于纯化蛋白质的任何其他标准技术。合适的纯化方法对本领域普通技术人员将是显而易见的。
抗体缀合物和融合蛋白
在一些实施方案中，本文提供的抗体缀合至或重组融合至诊断剂、可检测试剂、或治疗剂或任何其他分子。缀合的或重组融合的抗体可用于，例如用于监测或预测VISTA介导的疾病、病症或病状的发作、发展、进程和/或严重性，作为临床测试程序的一部分，例如，确定特定治疗的疗效。
可以实现这样的诊断和检测，例如，通过将抗体(例如，抗PSGL-1抗体)与可检测物质偶联，所述可检测物质包括、但不限于各种酶，例如，但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；辅基，例如，但不限于，链霉亲和素/生物素和抗生物素蛋白/生物素；荧光物质，例如，但不限于伞形酮、荧光素、异硫氰酸荧光素、若丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯、或藻红蛋白；发光物质，例如，但不限于鲁米诺；生物发光物质，例如，但不限于萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；化学发光物质，例如，但不限于基于吖啶的化合物或HALOTAG；放射性物质，例如，但不限于碘(131I、125I、123I、和121I)、碳(14C)、硫(35S)、氚(3H)、铟(115In、113In、112In、和111In，)、锝(99Tc)、铊(201Ti)、镓(68Ga，67Ga)、钯(103Pd)、钼(99Mo)，氙(133Xe)、氟(18F)、153Sm、177Lu、159Gd、149pm、140La、175Yb、166Ho、90Y、47Sc、186Re、188Re、142pr、105Rh、97Ru、68Ge、57Co、65Zn、85Sr、32p、153Gd、169yb、51Cr、54Mn、75Se、113Sn、和117Sn；以及使用各种正电子发射断层扫描的正电子发射金属和非放射性顺磁性金属离子。
本文还提供了与治疗部分(或一个或多个治疗部分)缀合或重组融合的抗体及其用途。抗体可以缀合至或重组融合至治疗部分，例如细胞毒素(例如，细胞生长抑制或杀细胞剂)、治疗剂或放射性金属离子，例如，α-放射体。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害的任何试剂。治疗部分包括、但不限于抗代谢物(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶脱卡巴嗪)；烷基化剂(例如，甲氯乙胺、噻菌灵苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BCNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲佐菌素、丝裂霉素C和顺二氯二胺铂(II)(DDP)和顺铂)；蒽环类药物(例如，柔红霉素(以前为道诺霉素)和阿霉素)；抗生素(例如，d放线菌素(以前称放线菌素)、博来霉素、光辉霉素(mithramycin)和蒽霉素(AMC))；澳瑞他汀(Auristatin)分子(例如，澳瑞他汀PHE、澳瑞他汀F、单甲基澳瑞他汀E、苔藓抑素1(bryostatin 1)和solastatin 10；参阅Woyke等人、Antimicrob.AgentsChemother.46：3802-8(2002)，Woyke等人，Antimicrob.Agents Chemother.45：3580-4(2001)，Mohammad等人，Anticancer Drugs 12：735-40(2001)，Wall等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.266：76-80(1999)，Mohammad等人，Int.J.Oncol.15：367-72(1999)，将其全部内容通过引入并入本文作为参考)；激素(例如，糖皮质激素、孕激素、雄激素和雌激素)、DNA修复酶抑制剂(例如，依托泊苷(etoposide)或拓扑替康)、激酶抑制剂(例如，化合物ST1571、甲磺酸伊马替尼(Kantarjian等人，Clin Cancer Res.8(7)：2167-76(2002))；细胞毒性剂(例如，紫杉醇、细胞松弛素B、杆菌肽D、溴化乙锭、依美丁碱(emetine)、丝裂霉素、依托泊苷、替诺泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基蒽醌二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-二氢睾酮(1-dehydrotestosterone)、糖皮质激素类、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌呤霉素及其类似物或同系物以及在美国专利号6,245,759、6,399,633、6,383,790、6,335,156、6,271,242、6,242,196、6,218,410、6,218,372、6,057,300、6,034,053、5,985,877、5,958,769、5,925,376、5,922,844、5,911,995、5,872,223、5,863,904、5,840,745、5,728,868、5,648,239、5,587,459中公开的那些化合物；法呢基转移酶抑制剂(例如，R115777、BMS-214662，和例如在以下美国专利号中公开的那些：6,458,935、6,451,812、6,440,974、6,436,960，6,432,959、6,420,387、6,414,145、6,410,541、6,410,539、6,403，581、6,399,615、6,387,905、6,372,747、6,369,034、6,362,188、6,342,765、6,342,487、6,300,501、6,268,363、6,265,422、6,248,756、6,239,140、6,232,338、6,228,865、6,228,856、6,225,322、6,218,406、6,211,193、6,187,786、6,169,096、6,159,984、6,143,766、6,133,303、6,127,366、6,124,465、6,124,295、6,103,723、6,093,737、6,090,948、6,080,870、6,077,853、6,071,935、6,066,738、6,063,930、6,054,466、6,051,582、6,051,574、以及6,040,305)；拓扑异构酶抑制剂(例如，喜树碱；伊立替康；SN-38；托泊替康；9-氨基喜树碱；GG-211(GI 147211)；DX-8951f；IST-622；鲁比替康；吡唑啉吖啶；XR-5000；saintopin；UCE6；UCE1022；TAN-1518A；TAN 1518B；KT6006；KT6528；ED-110；NB-506；ED-110；NB-506和若贝霉素)；bulgarein；DNA小沟结合剂，例如，Hoescht染料33342和Hoechst染料33258；两面针碱；花椒路宁；表小檗碱；康尼碱；β-lapachone；BC-4-1；二膦酸盐类(例如，阿伦膦酸盐、英卡膦酸二钠(cimadronte)、氯膦酸盐、替鲁膦酸盐、依替膦酸、伊班膦酸盐、奈立膦酸盐、奥帕膦酸盐、利塞膦酸盐、吡膦酸盐、帕米膦酸盐、唑来膦酸盐)；HMG-CoA还原酶抑制剂(例如，洛伐他汀、辛伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、他汀类(statin)、西立伐他汀、来适可、lupitor、罗苏伐他汀(rosuvastatin)和阿托伐他汀(atorvastatin))；反义寡核苷酸(例如，公开于美国专利号6,277,832、5,998,596、5,885,834、5,734,033，和5,618,709的那些)；腺苷脱氨酶抑制剂(例如，磷酸氟达拉滨(Fludarabine)和2-二氯脱氧腺苷)；替伊莫单抗
托西莫单抗
)及其药学上可接受的盐、溶剂合物、包合物和其前药。
此外，本文提供的抗体可以是缀合至或重组融合至修饰给定生物学应答的治疗部分或药物部分。治疗部分或药物部分不应解释为限于经典化学治疗剂。例如，药物部分可以是具有所想要的生物活性的蛋白质、肽或多肽。这类蛋白质可包括，例如毒素，例如，相思豆毒蛋白、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、霍乱毒素、或白喉毒素；蛋白质，例如，肿瘤坏死因子、γ-干扰素、α-干扰素、神经生长因子、血小板衍生生长因子、组织纤溶酶原激活物、凋亡剂(例如，TNF-γ、TNF-γ、AIM I(参见国际公布号WO 97/33899)、AIM II(参见，国际公布号WO97/34911))、Fas配体(Takahashi等人，1994，J.Immunol.，6：1567-1574)、和VEGF(参见，国际公布号WO 99/23105)、抗血管生成剂(例如，血管生长抑素、内皮生长抑素、或凝血途径的组分(例如，组织因子)；或生物反应调节剂，例如，淋巴因子(例如，干扰素γ、白介素-1(“IL-1”)、白介素-2(“IL-2”)、白介素-5(“IL-5”)、白介素-6(“IL-6”)、白介素-7(“IL-7”)、白介素9(“IL-9”)、白介素-10(“IL-10”)、白介素-12(“IL-12”)、白介素-15(“IL-15”)、白介素-23(“IL-23”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、和粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”))、或生长因子(例如，生长激素(“GH”))、或凝血剂(例如，钙、维生素K、组织因子，例如但不限于凝血因子(因子XII)、高分子量激肽原(HMWK)、前激肽释放酶(PK)、凝血蛋白因子II(凝血酶原)、因子V、XIIa、VIII、XIIIa、XI、XIa、IX、IXa、X、磷脂和纤维蛋白单体)。
本文还提供抗体，其重组融合至或化学缀合(共价或非共价缀合)至异源蛋白质或多肽(或其片段，例如，约10、约20、约30、约40、约50、约60、约70、约80、约90、或约100个氨基酸的多肽)以产生融合蛋白，以及其用途。特别地，本文提供的融合蛋白包含本文提供的抗体的抗原结合片段(例如，Fab片段、Fd片段、Fv片段、F(ab)2片段、VH结构域、VH CDR、VL结构域或VL CDR)和异源蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，与抗体融合的异源蛋白质、多肽或肽可用于将抗体靶向特定的细胞类型，例如，表达PSGL-1或VISTA的细胞。例如，可以将由特定细胞类型(例如，免疫细胞)表达的细胞表面受体结合的抗体融合至或缀合至本文提供的修饰抗体。
另外，本文提供的抗体缀合至治疗性部分：例如，放射性金属离子，例如α-辐射剂，例如213Bi或大环螯合剂，其可用于将放射金属离子(包括，但不限于131In、131LU、131Y、131Ho、131Sm)缀合至多肽。在某些实施方案中，大环螯合剂为1，4，7，10-四氮环十二烷-N,N’，N”，N”’-四乙酸(DOTA)，其可通过接头分子与抗体连接。这类接头分子通常是本领域已知的，描述于Denardo等人.，1998，Clin CancerRes 4(10)：2483-90；Peterson等人，1999，Bioconjug.Chem.10(4)：553-7；和Zimmerman等人，1999，Nucl.Med.Biol.26(8)：943-50，每个通过引用整体并入。
此外，本文提供的抗体可以与标志物序列(例如肽)融合以促进纯化。在一些实施方案中，标志物氨基酸序列是六组氨酸肽，例如pQE载体(QIAGEN,Inc.)提供的标签，其中许多是商业上可获得的。描述见于Gentz等人，1989，Proc Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824中，例如，六组氨酸可方便地纯化融合蛋白。用于纯化的其他肽标签包括、但不限于血凝素(“HA”)标签，其对应于源自流感血凝素蛋白的表位(Wilson等人，1984，Cell 37：767)，和“FLAG”标签。
使治疗性部分(包括多肽)与抗体融合或缀合的方法是众所周知的，参见例如，Amon等人，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In CancerTherapy”，Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy，Reisfeld等人(编)243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等人，“Antibodies For Drug Delivery”，Controlled Drug Delivery(第二版)，Robinson等人(编)，623-53页(Marcel Dekker，Inc.1987)；Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：AReview”，Monoclonal Antibodies 84：Biological And Clinical Applications，Pinchera等人(编)，475-506页(1985)；“Analysis，Results，And Future Prospective OfThe Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”，MonoclonalAntibodies For Cancer Detection And Therapy，Baldwin等人(编)，303-16页(AcademicPress 1985)，Thorpe等人，1982，Immunol.Rev.62：119-58；美国专利号5,336,603、5,622,929、5,359,046、5,349,053、5,447,851、5,723,125、5,783,181、5,908,626、5,844,095、和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；EP 394,827；PCT公开WO 91/06570、WO 96/04388、WO96/22024、WO 97/34631、以及WO 99/04813；Ashkenazi等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：10535-10539，1991；Traunecker等人，Nature，331：84-86，1988；Zheng等人，J.Immunol.，154：5590-5600，1995；Vil等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：11337-11341，1992，其全部内容通过引用并入本文。
融合蛋白可以例如，通过基因改组、基序改组、外显子改组和/或密码子改组(统称为“DNA改组”)的技术产生。DNA改组可用于改变本文提供的抗体(例如，具有更高亲和力和更低解离速率的抗体)的活性。通常参见美国专利号5,605,793、5,811,238、5,830,721、5,834,252、和5,837,458；Patten等人，1997，Curr.Opinion Biotechnol.8：724-33；Harayama，1998，Trends Biotechnol.16(2)：76-82；Hansson等人，1999，J.Mol.Biol.287：265-76；以及Lorenzo和Blasco，1998，Biotechniques 24(2)：308-313(这些专利和出版物中的每一个都通过引用其整体并入本文)。在重组之前，可以通过易错PCR、随机核苷酸插入或其他方法进行随机诱变来改变抗体或编码的抗体。可以将编码本文提供的抗体的多核苷酸与一种或多种异源分子的一种或多种组分、基序、区段、部分、结构域、片段等重组。
本文提供的抗体也可以与第二抗体缀合以形成抗体异源缀合物，其如美国专利No.4,676,980中所述，该专利以引用其整体的方式并入本文。
应选择与本文提供的与PSGL-1结合的抗体缀合或重组融合的治疗部分或药物，以实现所想要的预防或治疗效果。在一些实施方案中，抗体是修饰的抗体。当决定哪个治疗部分或药物时要缀合或重组融合至本文所述抗体时，临床医生或其他医务人员应考虑以下事项：疾病的性质、疾病的严重程度和受试者的病状。
本文提供的抗体(例如，抗-PSGL-1抗体或抗-VISTA)也可以附着于固体支持物，其对于免疫测定或靶抗原的纯化特别有用。这样的固体支持物包括、但不限于玻璃、纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚氯乙烯或聚丙烯。
药物组合物
通过混合具有所想要的纯度的抗体与任选的生理上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂(Remington′s Pharmaceutical Sciences)(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，PA)，可以制备以冻干制剂或水溶液形式的药物组合物用于储存，所述药物组合物(包括治疗制剂)含有一种或多种本文提供的治疗剂(例如，抗VISTA治疗剂，例如抗VISTA抗体)。可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(例如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(例如小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它糖，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖，例如蔗糖、甘露糖、海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子，例如钠；金属络合物(例如，锌蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂，例如TWEENTM、PLURONICSTM和聚乙二醇(PEG)。
本文提供的抗VISTA治疗剂，特别是抗VISTA抗体，也可以例如配制在脂质体中。含有目的分子的脂质体是通过本领域已知的方法制备的，例如描述见于在Epstein等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688；Hwang等人，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4030；和美国专利号4,485,045和4,544,545中。在美国专利号5,013,556中公开了具有延长的循环时间的脂质体。
特别有用的脂质体可用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发方法产生。脂质体可通过限定孔径尺寸的过滤器挤出以得到具有所想要直径的脂质体。通过二硫键交换反应，使得本文提供的抗体的Fab′片段与脂质体缀合，描述见于Martin等人，1982，J.Biol.Chem.257：286-88。脂质体内任选地包含化学治疗剂(例如，阿霉素)；参见Gabizon等人，(1989)J.National Cancer Inst.81(19)：1484。
根据所治疗的特定适应症的需要，如本文所述的那些制剂还可包含一种以上的活性化合物。在一些实施方案中，制剂包含本文提供的抗-VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)和一种或多种具有互补活性的彼此之间没有不良影响的活性化合物。此类分子合适地以对于预期目的有效的量组合存在。例如，本文提供的抗体可以与一种或多种其他治疗剂组合。可以将这种组合疗法连续地或同时地或顺序地施用于患者。
也可以将本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)包埋进，例如，通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊，例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基甲基丙烯酸酯)微胶囊，分别在胶体药物递送系统(例如，脂质体、白蛋白微球、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)中或在大乳剂中。这样的技术公开在Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishine Co.，Easton，PA中。
用于体内施用的制剂可以是无菌的。通过，例如，无菌过滤膜过滤很容易实现。
也可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适实例包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质，该基质呈定型制品的形式，例如薄膜、或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟乙酯)、或聚(乙烯醇)、聚丙交酯(美国专利号3,773，919)、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物，如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球)、和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸之类的聚合物可以持续100天以上释放分子，但某些水凝胶却在较短的时间内释放蛋白质。当封装的抗体在体内保留长时间时，由于暴露于37℃的湿气中，它们可能会变性或聚集，从而导致生物活性丧失和免疫原性可能改变。可以根据所涉及的机制设计合理的策略用于稳定。例如，如果发现聚集机理是通过硫代-二硫键交换形成的分子间S-S键，则可以通过以下实现稳定：修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制水分含量、使用适当的添加剂、以及开发特定的聚合物基质组合物。
在一些实施方案中，本文提供的药物组合物包含治疗有效量的一种或多种本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)，和任选地一种或多种其他在药学上可接受载体中的预防性治疗剂。这样的药物组合物可用于预防、治疗或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状。
适用于施用本文提供的化合物的药物载体包括本领域技术人员已知的适合于特定施用方式的任何此类载体。
另外，本文提供的抗VISTA治疗剂(特别是抗VISTA抗体)，可以配制成组合物中的唯一药物活性成分，或者可以与其他活性成分(例如，一种或多种其他预防或治疗剂)组合。
该组合物可以包含一种或多种本文提供的抗体。在一些实施方案中，将本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)配制成合适的药物制剂，例如溶液、悬浮剂、片剂、分散片、丸剂、胶囊剂、散剂、缓释制剂或酏剂(elixirs)，用于口服施用或在无菌溶液或悬浮剂中用于肠胃外施用，以及透皮贴剂和干粉吸入剂。在一些实施方案中，使用本领域公知的技术和步骤将上述本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)配制成药物组合物(参见，例如，Ansel(1985)Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms，第4版，第126页)。
在组合物的一些实施方案中，将有效浓度的一种或多种抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)与合适的药物载体混合。在一些实施方案中，在组合物中化合物的浓度有效递送施用后治疗、预防或改善VISTA介导的疾病、病症或病状或其症状的量。
在一些实施方案中，将组合物配制用于单剂量施用。为了配制组合物，将化合物的重量分数以有效浓度溶解、悬浮、分散或以其他方式混合在选择的载体中，从而缓解、预防所治疗的病状，或改善一种或多种症状。
在一些实施方案中，本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)以有效量包含在药学上可接受的载体中，所述有效量是在治疗的患者中不存在不想要的副作用，且足以产生治疗有用的效果。可以通过使用常规方法在体外和体内系统中测试化合物从而凭经验确定治疗有效浓度，然后从中推断出人用剂量。
在药物组合物中的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的浓度将取决于，例如，治疗剂的理化特性、剂量方案、施用量以及本领域技术人员已知的其他因素。
在一些实施方案中，治疗有效剂量产生的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的血清浓度为从约0.1ng/ml至约50-100μg/ml。在另一个实施方案中，药物组合物提供的剂量为：每天每千克体重约0.001mg至约2000mg的治疗剂(例如，抗体)。可制备药物剂量单位形式以提供约0.01mg、0.1mg或1mg至约500mg、1000mg或2000mg，在一些实施方案中为约10mg至约500mg的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)和/或每个剂量单位形式的其他可选必需成分的组合。
抗-VISTA治疗剂(例如，抗-VISTA抗体)可一次施用，或可分为许多较小的剂量每隔一段时间施用。应当理解，治疗的精确剂量和持续时间是所治疗疾病的函数，并且可以使用已知的测试方案或通过从体内或体外测试数据凭经验确定。要注意的是，浓度和剂量值也可以随着待缓解的病状的严重性而变化。还应理解，对于任何特定的受试者，可以根据个体需要和施用或监督组合物的施用者的专业判断随时间调整具体的剂量方案，并且本文列出的浓度范围是仅作为示例，并不旨在限制要求保护的组合物的范围或实践。
在混合或添加抗VISTA治疗剂时，所得混合物可以是溶液、悬浮液、乳剂等。所得混合物的形式取决于许多因素，包括预期的施用方式、和化合物在所选载体或载剂中的溶解度。有效浓度足以缓解所治疗的疾病、病症或病状的症状，并且可以凭经验确定。
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其以单位剂型施用至人和动物，所述单位剂型例如片剂、胶囊、丸剂、散剂、颗粒剂、无菌肠胃外溶液、或悬浮剂、以及口服溶液或悬浮剂，以及包含合适量的化合物或其药学上可接受的衍生物的水油乳剂。在一些实施方案中，抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)以单位剂型型或多剂型配制和施用。如本文所用，“单位剂量”形式是指适用于人和动物受试者的物理上离散的单位，并且如本领域中已知的那样单独包装。每个单位剂量包含预定量的足以产生所想要的治疗效果的治疗剂，以及所想要的药物载体、载剂或稀释剂。单位剂型的实例包括安瓿和注射器以及单独包装的片剂或胶囊。单位剂型可以其分数或倍数施用。“多剂量”形式是包装在单个容器中以分开的单位剂型施用的多个相同的单位剂型。多剂型的实例包括小瓶、片剂瓶、或胶囊瓶、或品脱、或加仑瓶。因此，多剂型是没有分开包装的多个单位剂量。
在一些实施方案中，本文提供的一种或多种抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)在液体药物制剂中。例如，可以将液体药物施用组合物通过以下方式制备：溶解、分散、或者以其他方式混合如上定义的活性化合物、和任选的载体中的药物佐剂，例如水、盐水、水性右旋葡萄糖、甘油、乙二醇、乙醇等，从而形成溶液或悬浮液。如果需要的话，待施用的药物组合物还可包含少量的无毒辅助物质，例如润湿剂、乳化剂、增溶剂、pH缓冲剂等，例如，乙酸盐、柠檬酸钠、环糊精衍生物、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺乙酸钠、三乙醇胺油酸酯和其他此类试剂。
制备这种剂型的实际方法对于本领域技术人员而言是已知的或显而易见的；例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(1990)Mack Publishing Co.，Easton，PA.。
可以制备含有0.005％至100％范围内的治疗剂(特别是抗体)并且其余部分由无毒载体组成的剂型或组合物。这些组合物的制备方法是本领域技术人员已知的。
口服药物剂型可以是固体、凝胶或液体。固体剂型包括片剂、胶囊剂、颗粒剂和散装粉末。口服片剂的类型包括压制的、可咀嚼的锭剂和可以是肠溶衣、糖衣或薄膜衣的片剂。胶囊可以是硬明胶胶囊或软明胶胶囊，而颗粒剂和粉末剂可以非泡腾或泡腾的形式与本领域技术人员已知的其他成分组合提供。
在一些实施方案中，制剂是固体剂型。在一些实施方案中，制剂是胶囊剂或片剂。片剂、丸剂、胶囊剂、锭剂等可包含一种或多种以下成分、或性质相似的化合物：结合剂；润滑剂；稀释剂；助流剂；崩解剂；着色剂；甜味剂；调味剂；润湿剂；催吐包衣；和薄膜包衣。结合剂的实例包括微晶纤维素、黄蓍胶、葡萄糖溶液、阿拉伯胶(acacia mucilage)、明胶溶液、糖蜜、聚乙烯吡咯烷酮、聚维酮、交聚维酮、蔗糖和淀粉糊。润滑剂包括滑石粉、淀粉、硬脂酸镁或硬脂酸钙、石蒜和硬脂酸。稀释剂包括例如乳糖、蔗糖、淀粉、高岭土、盐、甘露醇和磷酸二钙。助流剂包括、但不限于，胶体二氧化硅。崩解剂包括交联羧甲基纤维素钠、羟乙酸淀粉钠、海藻酸、玉米淀粉、马铃薯淀粉、膨润土、甲基纤维素、琼脂和羧甲基纤维素。着色剂包括、例如，任何经批准认证的水溶性FD和C染料、其混合物；以及悬浮在水化氧化铝中的水不溶性FD和C染料。甜味剂包括蔗糖、乳糖、甘露醇和人造甜味剂(如糖精)以及任何数量的喷雾干燥香料。调味剂包括从植物(如水果)中提取的天然香料和产生愉悦感的化合物的合成混合物，例如，但不限于薄荷和水杨酸甲酯。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、山梨聚糖单油酸酯、二甘醇月桂酸酯、和聚氧乙烯月桂醚。催吐包衣包括脂肪酸、脂肪、蜡、虫胶、氨化虫胶和邻苯二甲酸乙酸纤维素。薄膜包衣包括羟乙基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙二醇4000和邻苯二甲酸乙酸纤维素。
本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)可以以保护其免受胃的酸性环境侵害的组合物的形式提供。例如，可以将组合物配制成肠溶衣，该肠溶衣在胃中保持其完整性并在肠道中释放活性化合物。该组合物也可以与抗酸剂或其他此类成分组合配制。
当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料外，其还可包含液体载体(例如，脂肪油)。另外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其他材料，例如糖和其他肠试剂的包衣。化合物也可以作为酏剂、悬浮剂、糖浆剂、薄片剂、洒剂、咀嚼剂等的组分施用。除了活性化合物之外，糖浆还可包含蔗糖作为甜味剂以及某些防腐剂、染料、着色剂和调味剂。
还可以将治疗剂与以下混合：其他不损害所想要的作用的活性物质、或与补充所想要的作用的物质，例如，抗酸剂、H2阻滞剂和利尿剂。活性成分是抗VISTA治疗剂，尤其是本文所述的抗体或其药学上可接受的衍生物。可以包括更高浓度(高达约98重量％)的活性成分。
在一些实施方案中，片剂和胶囊制剂可以如本领域技术人员已知的那样包衣，以改变或维持活性成分的溶解度。例如，因此它们可以用常规的肠可消化的包衣进行包衣，例如水杨酸苯酯、蜡和邻苯二甲酸乙酸纤维素。
在一些实施方案中，所述制剂是液体剂型。液体口服剂型包括水溶液、乳剂、悬浮液、溶液和/或由非泡腾颗粒重构的悬浮液以及由泡腾颗粒重构的泡腾制剂。水溶液包括，例如，酏剂和糖浆。乳剂是水包油或油包水。
酏剂是澄清、甜味的水醇制剂。酏剂中使用的药学上可接受的载体包括溶剂。糖浆剂是糖(例如蔗糖)的浓缩水溶液，并且可以包含防腐剂。乳剂是两相系统，其中一种液体以小球形式分散在另一种液体中。乳剂中使用的药学上可接受的载体是非水液体、乳化剂和防腐剂。悬浮液使用药学上可接受的悬浮剂和防腐剂。重构为口服液剂型的非泡腾颗粒中使用的药学上可接受的物质包括稀释剂、甜味剂和湿润剂。将被重构为液体口服剂型的泡腾颗粒中使用的药学上可接受的物质包括有机酸和二氧化碳源。着色剂和调味剂用于所有以上剂型中。
溶剂包括甘油、山梨醇、乙醇和糖浆。防腐剂的实例包括甘油、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸、苯甲酸钠和醇。乳液剂中使用的非水性液体的实例包括矿物油、和棉籽油。乳化剂的实例包括明胶、阿拉伯胶、黄芪胶、膨润土和表面活性剂，如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、果胶、黄芪胶、veegum和阿拉伯胶。甜味剂包括蔗糖、糖浆、甘油和人造甜味剂，如糖精。润湿剂包括丙二醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇单油酸酯、二甘醇单月桂酸酯、和聚氧乙烯月桂基醚。有机酸包括柠檬酸和酒石酸。二氧化碳源包括碳酸氢钠和碳酸钠。着色剂包括任何批准认证的水溶性FD和C染料、及其混合物。调味剂包括从植物(如水果)中提取的天然调味剂、以及产生令人愉悦的口感的化合物的合成混合物。
对于固体剂型，在一些实施方案中，在例如碳酸亚丙酯、植物油或甘油三酸酯中的溶液或悬浮液被封装在明胶胶囊中。这样的溶液及其制备和其封装公开在美国专利号4,328,245；4,409,239；和4,410,545中。对于液体剂型，可以将(例如，在聚乙二醇中的)溶液用足够量的药学上可接受的液体载体(例如水)稀释，以易于测量以用于施用。
可选择的，液体或半固体口服制剂可通过将活性化合物或盐溶解或分散在植物油、乙二醇、甘油三酸酯、丙二醇酯(例如，碳酸亚丙酯)和其他此类载体中、并将这些溶液或悬浮剂封装在硬或软明胶胶囊壳中制备。其他有用的制剂包括美国专利号RE28,819和4,358,603中列出的那些。简而言之，此类制剂包括、但不限于，含有本文提供的化合物的那些，二烷基化的单或聚亚烷基二醇，包括，但不限于，1，2-二甲氧基甲烷、二甘醇二甲醚、三甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚、聚乙二醇-350-二甲醚、聚乙二醇-550-二甲醚、聚乙二醇-750-二甲醚，其中350、550和750是指聚乙二醇的近似平均分子量、以及一种或多种抗氧化剂，例如，丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基羟基茴香醚(BHA)、没食子酸丙酯、维生素E、对苯二酚、羟基香豆素、乙醇胺、卵磷脂、脑磷脂、抗坏血酸、苹果酸、山梨醇、磷酸、硫代二丙酸及其酯和二硫代氨基甲酸酯。
其他制剂包括、但不限于，包含药学上可接受的乙缩醛的醇水溶液。这些制剂中使用的醇是具有一个或多个羟基(包括但不限于丙二醇和乙醇)的任何药学上可接受的水混溶性溶剂。缩醛包括、但不限于，低级烷基醛的二(低级烷基)缩醛，例如乙醛二乙基缩醛。
在一些实施方案中，本文也考虑特征在于皮下、肌内、肿瘤内或静脉内注射的肠胃外施用。注射剂可以常规形式制备，作为液体溶液、或悬浮液、适于在注射前用于液体中的溶液或悬浮液的固体形式、或乳剂。注射剂、溶液和乳剂还包含一种或多种赋形剂。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、甘油或乙醇。另外，如果需要的话，待施用的药物组合物还可包含少量的无毒辅助物质，例如，湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、溶解度增强剂、和其他此类试剂，例如乙酸钠、脱水山梨醇单月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯和环糊精。
本文还考虑了缓释或缓释系统的植入，从而维持恒定的剂量水平(参见，例如，美国专利号3,710,795)。简而言之、将本文提供的化合物分散在固体内部基质中，例如聚甲基甲基丙烯酸酯、聚丁基甲基丙烯酸酯、增塑或未增塑的聚氯乙烯、增塑的尼龙、增塑的聚乙烯对苯二甲酸(polyethyleneterephthalate)、天然橡胶、聚异戊二烯、聚异丁烯、聚丁二烯、聚乙烯、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、碳酸硅酮共聚物、亲水性聚合物，例如，丙烯酸和甲基丙烯酸酯的水凝胶、胶原蛋白、交联的聚乙烯醇和交联的部分水解的聚乙酸乙烯酯、它们被外部聚合物膜包围，例如，聚乙烯、聚丙烯、乙烯/丙烯共聚物、乙烯/丙烯酸乙酯共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯共聚物、硅橡胶、聚二甲基硅氧烷、氯丁橡胶、氯化聚乙烯、聚氯乙烯、氯乙烯与乙酸乙烯酯的共聚物、偏二氯乙烯、乙烯和丙烯、离聚物聚乙烯对苯二甲酸酯、丁基橡胶表氯醇橡胶、乙烯/乙烯醇共聚物、乙烯/乙酸乙烯酯/乙烯醇三元共聚物和不溶于体液的乙烯/乙烯氧基乙醇共聚物。治疗剂(例如，抗体)在释放速率控制步骤中通过外部聚合物膜扩散。此类肠胃外组合物中包含的治疗剂的量高度取决于其具体性质，以及化合物的活性和受试者的需求。
肠胃外施用的制剂包括准备注射的无菌溶液、准备在使用前与溶剂组合的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉)(包括皮下注射片剂)、准备注射的无菌悬浮液、准备在使用前与载剂组合的无菌干燥不溶产品、以及无菌乳剂。溶液可以是水性或非水性的。
如果静脉内施用，合适的载体包括生理盐水或磷酸盐缓冲盐水(PBS)，以及含有增稠剂和增溶剂(例如葡萄糖、聚乙二醇、和聚丙二醇及其混合物的)溶液。
肠胃外制剂中使用的药学上可接受的载体包括水性载剂、非水性载剂、抗微生物剂、等渗剂、缓冲剂、抗氧化剂、局部麻醉剂、悬浮剂和分散剂、乳化剂、螯合剂或螯合剂以及其他药学上可接受的物质。
水性载剂的实例包括氯化钠注射剂、林格注射剂、等渗右旋糖注射剂、无菌水注射剂、右旋糖和乳酸林格注射剂。非水性肠胃外载剂包括植物来源的不挥发油、棉籽油、玉米油、芝麻油和花生油。可以将抑细菌或抑真菌浓度的抗微生物剂添加到多剂量容器中包装的肠胃外制剂中，其包括苯酚或甲酚、汞、苯甲醇、氯丁醇、对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙基酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。等渗剂包括氯化钠和右旋糖。缓冲剂包括磷酸盐和柠檬酸盐。抗氧化剂包括硫酸氢钠。局部麻醉药包括盐酸普鲁卡因。悬浮剂和分散剂包括羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷酮。乳化剂包括聚山梨酯80(
80)。金属离子的螯合剂(sequestering)或螯合剂(chelating agent)包括EDTA。药物载体还包括用于水混溶性载剂的乙醇、聚乙二醇和丙二醇；以及用于调节pH的氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。
调节药物活性抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的浓度，使得注射剂提供有效量以产生所想要的药理作用。如本领域中已知的，确切的剂量取决于患者或动物的年龄、体重和状况。
单位剂量的肠胃外制剂可以包装在安瓿瓶、小瓶或带针头的注射器中。如本领域已知和实践的，用于肠胃外施用的所有制剂可以是无菌的。
说明性地、静脉内或动脉内输注含有活性化合物的无菌水溶液是有效的施用方式。另一个实施方案是无菌的水性或油性溶液、或悬浮液，其包含根据需要注入以产生所想要的药学作用的活性物质。
注射剂设计用于局部和全身施用。在一些实施方案中，将治疗有效剂量配制成包含至少约0.1w/w至高达约90％w/w或更高的活性化合物浓度、在一些实施方案中配制成大于1w/w的活性化合物浓度，用于治疗的组织。
治疗剂(例如抗体)，可以以微粉化或其他合适的形式悬浮。所得混合物的形式取决于许多因素，包括预期的施用方式、和化合物在所选载体或载剂中的溶解度。有效浓度足以缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的症状，并且可以凭经验确定。
在一些实施方案中，药物制剂是冻干粉剂，其可以被重构以溶液、乳液和其他混合物形式施用。它们也可以被重构并配制成固体或凝胶。
通过将治疗剂(如本文提供的抗体)或其药学上可接受的衍生物溶解在合适的溶剂中制备冻干粉剂。在一些实施方案中，冻干粉是无菌的。溶剂可包含赋形剂，其改善粉末或由粉末制备的重构溶液的稳定性或其他药理学成分。可以使用的赋形剂包括、但不限于，右旋糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或任何其他合适的试剂。溶剂还可以包含缓冲剂，例如，柠檬酸盐、磷酸钠或磷酸钾、或本领域技术人员已知的其他此类缓冲剂，在一些实施方案中，约为中性pH。随后溶液的无菌过滤、以及然后在本领域技术人员已知的标准条件下的冻干，提供了所想要的制剂。在一些实施方案中，将所得溶液分装到小瓶中以冻干。每个小瓶将包含单剂量或多剂量的化合物。冻干的粉末可以在适当的条件下，例如在约4℃至室温下储存。
用注射用水将该冻干粉重构，以提供用于肠胃外施用的制剂。为了重构，将冻干的粉末添加到无菌水或任何其他合适的载体中。精确的量取决于所选的化合物。该量可以根据经验确定。
如局部和全身施用所述制备局部混合物。所得混合物可以是溶液、悬浮剂、乳剂等，并且可以配制成乳膏、凝胶、软膏、乳剂、溶液、酏剂、洗剂、悬浮剂、酊剂、糊剂、泡沫剂、气雾剂、冲洗剂、喷雾剂、栓剂、绷带、皮肤贴剂或任何其他适合局部施用的制剂。
可以将本文提供的治疗剂配制成用于局部应用的气雾剂，例如通过吸入(参见，例如，美国专利号4,044,126、4,414,209和4,364,923，其描述用于递送类固醇的气雾剂，其可用于治疗炎性疾病，特别是哮喘)。这些用于施用至呼吸道的制剂可以是用于喷雾器的气雾剂形式、或溶液形式、或者是吹入用的微细粉末形式，可以单独使用，也可以与惰性载体(如乳糖)组合使用。在这种情况下，在一些实施方案中，制剂的颗粒的直径小于50微米，在一些实施方案中小于10微米。
可以将治疗剂配制成用于局部或局地施用，例如以凝胶、乳膏和洗剂的形式局部施用于皮肤和粘膜(例如眼中)，并且施用于眼或用于颅内或椎内应用。预期局部施用用于透皮递送并且还用于眼或粘膜施用，或用于吸入疗法。活性化合物的鼻溶液可以单独施用、或与其他药学上可接受的赋形剂组合地施用。
这些溶液，特别是打算用于眼科用途的溶液，可以与适当的盐一起配制为pH为约5-7的0.01％至10％的等渗溶液。
本文也考虑其他施用途径(例如透皮贴剂)，包括离子电渗疗法和电泳装置、以及直肠施用。
包括离子电渗疗法和电泳装置的透皮贴剂是本领域技术人员众所周知的。例如，在美国专利号6,267,983、6,261,595、6,256,533、6,167,301、6,024,975、6,010715、5,985,317、5,983,134、5,948,433和5,860,957中公开了这种贴剂。
用于直肠施用的药物剂型是具有全身作用的直肠栓剂、胶囊和片剂。本文使用的直肠栓剂是指用于插入直肠的固体，其在体温下熔化或软化，释放一种或多种药理上或治疗活性成分。直肠栓剂中使用的药学上可接受的物质是基质或载剂以及提高熔点的试剂。基质的实例包括可可脂(可可油)、甘油-明胶、聚乙二醇(聚氧乙二醇)和脂肪酸的甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯的适当混合物。可以使用各种基质的组合。提高栓剂熔点的试剂包括鲸蜡和蜡。直肠栓剂可以通过压缩方法或通过模制来制备。在一些实施方案中，直肠栓剂的重量为约2至3gm。
可以使用与口服施用的制剂相同的药学上可接受的物质并通过相同的方法来制造用于直肠施用的片剂和胶囊。
本文提供的治疗剂(例如抗体)和其他组合物也可以配制为靶向待治疗受试者的特定组织、受体或身体的其他区域。许多这样的靶向方法是本领域技术人员众所周知的。本文考虑了所有此类靶向方法用于本发明组合物中。对于靶向方法的非限制性实例，参见，例如美国专利号6,316,652、6,274,552、6,271,359、6,253,872、6,139,865、6,131,570、6.120,751、6,071,495、6,060,082、6,048,736、6,039,975、6,004,534、5,985,307、5,972,366、5,900,252、5,840,674、5,759,542和5,709,874。
在一些实施方案中，脂质体悬浮液，包括靶向组织的脂质体(例如靶向肿瘤的脂质体)，也可以适合作为药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备。例如，脂质体制剂可以如美国专利号4,522,811中所述制备。简而言之，可以通过干燥烧瓶内部的卵磷脂酰胆碱和脑磷脂酰丝氨酸(摩尔比为7∶3)来形成脂质体，例如多层囊泡(MLV)。加入本文提供的化合物在缺乏二价阳离子的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的溶液，摇动烧瓶直至脂质膜分散。洗涤所得的囊泡以除去未包囊的化合物，通过离心沉淀，然后重悬于PBS中。
治疗、预防和/或缓解方法
在另一方面，本发明还涉及用于在患者中治疗VISTA介导的疾病、病症或病状的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)。本文提供的是本文提供的抗VISTA治疗(例如，抗VISTA抗体)用于预防、治疗和/或缓解疾病、病症或病状的一种或多种症状，例如VISTA介导的疾病、病症或病状，尤其是VISTA介导的癌症。有利地，之前已经通过本文提供的方法之一检测或诊断所述VISTA介导的疾病、病症或病状。
在一个实施方案中，本发明涉及用于在患者中治疗VISTA介导的疾病、病症或病状的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)，其中所述VISTA介导的疾病、病症或病状之前已经通过本文提供的方法之一检测或诊断了。换句话说，本发明因此涉及抗VISTA治疗剂用于在患者中治疗VISTA介导的疾病、病症或病状，其中抗VISTA治疗剂施用于已经通过上述方法诊断为患有VISTA介导的疾病、病症或病状的患者。
在一些实施方案中，本文提供了包含本文提供的一种或多种抗体(例如，抗VISTA抗体)的组合物，其用于管理、预防、或治疗VISTA介导的疾病、病症或病状和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状。示例性VISTA介导的疾病、病症或病状包括细胞增殖性病症、肿瘤和移植物抗宿主病(GVHD)或其症状。优选地，所述VISTA介导的疾病、病症或病状是癌症。
因此，本文提供抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)治疗患者中VISTA介导的癌症的用途，所述用途包括：
a)使所述受试者的生物样本与能够特异性结合PSGL-1核酸或蛋白质的试剂接触；以及
b)定量所述试剂与所述生物样本的结合，从而确定在所述样本中PSGL-1的表达水平。
根据一个优选的实施方案，本发明的用途还包括通过将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与基于两个参数(染色强度和阳性细胞百分比)的合适量表进行比较，对肿瘤进行评分的步骤。
在另一实施方案中，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于治疗患者中VISTA介导的癌症的用途，其中所述用途包括如上所述，预先确定所述肿瘤的PSGL-1的状态。根据该实施方案，[PSGL-1(+)]的肿瘤指示VISTA介导的癌症，因此易于对使用抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的治疗产生应答。
根据另一个优选的实施方案，本发明的用途还包括将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与参考水平进行比较。
根据该优选实施方案，所述抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于治疗患者中VISTA介导的癌症的用途，所述用途包括：
a)测定所述受试者的生物样本(例如，通过所述生物样本中肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平；
b)将步骤a)的表达水平与参考水平进行比较；和
c)当步骤a)的表达水平高于参考水平时，确定VISTA介导的癌症。
根据另一优选实施方案，所述抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于治疗患者中VISTA介导的癌症的用途，所述用途包括：
a)测定所述受试者的生物样本(例如，通过所述生物样本中肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平；
b)将步骤a)的表达水平与参考水平进行比较；以及
c)当步骤a)的表达水平高于参考水平时，诊断为VISTA介导的癌症。
有利地，本发明的方法包括以下两步骤：
·通过将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与基于两个参数(染色强度和阳性细胞百分比)的合适量表进行比较，对肿瘤进行评分；以及
·将所述受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与参考水平进行比较。
有利地，上述抗VISTA治疗剂的用途还包括如上所述，确定VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平。在这样的情况下，PSGL-1的表达水平以及VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平高于参考水平，指示为VISTA介导的癌症。
根据另一个实施方案，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于治疗患者中VISTA介导的癌症中的用途，所述用途包括：
a)使所述受试者的生物样本与能够特异性结合PSGL-1核酸或蛋白质的试剂接触；以及
b)定量所述试剂与所述生物样本的结合，从而确定在所述样本中PSGL-1的表达水平；以及
c)基于步骤a)的水平调整抗VISTA治疗剂的治疗。
根据一个优选的实施方案，本发明的用途还包括通过将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与基于两个参数(染色强度和阳性细胞百分比)的合适量表进行比较，对肿瘤进行评分的步骤。
在另一实施方案中，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)在用于治疗患者中VISTA介导的癌症中的用途，其中所述用途包括如上所述，预先确定所述肿瘤的PSGL-1的状态。根据该实施方案，[PSGL-1(+)]的肿瘤指示VISTA介导的癌症，因此易于对使用抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的治疗产生应答。
根据另一个优选的实施方案，本发明的用途还包括将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与参考水平进行比较。
所述抗VISTA治疗剂治疗的调整可以包括：
-如果患者已诊断出对抗VISTA治疗剂无应答，则减少或抑制所述抗VISTA治疗剂的治疗，或
-如果患者已经诊断出对抗VISTA治疗剂有应答，则继续所述抗VISTA治疗剂治疗。
如果步骤a)的表达水平和参考水平之间存在PSGL-1表达差异，则患者对上述治疗有应答。例如，步骤a)的表达水平与在治疗之前从患者获得的第二生物样本中PSGL-1的表达水平之间的PSGL-1表达差异指示所述患者是否对所述治疗有应答。有利地，步骤a)的PSGL-1表达水平高于在治疗之前从患者获得的第二生物样本中PSGL-1的表达水平，指示所述患者对所述治疗有应答。
在一些实施方案中，上述用途包括确定除PSGL-1之外VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平，以及比较第一生物样本中PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平，与在治疗之前从患者获得的第二生物样本中PSGL-1的表达水平和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平。在这种情况下，第一生物样本中PSGL-1和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或相对表达水平，与第二生物样本中PSGL-1和VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平的差异，指示患者对治疗有应答。
在该方法的一些方面，所述治疗包括施用本文所述的抗VISTA抗体和/或抗PSGL-1抗体。
在一些方面，所述方法包括其中所述第一生物样本包含肿瘤微环境的免疫浸润物。
在一些实施方案中，本文提供通过向受试者施用治疗有效量的抗VISTA治疗剂((例如，抗VISTA抗体)，包括如本文所述，或其组合物)来预防或治疗本文所述的疾病、病症或病状的方法。在一些实施方案中，用于治疗疾病、病症或病状的方法包括向受试者施用治疗有效量的药物组合物，所述药物组合物包含抗VISTA抗体和药学上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。本文提供的方法还可以任选地包含至少一种其他治疗剂，例如本文所述的那些(例如，抗VISTA抗体)，作为单独的治疗或组合治疗。本文还描述组合物，包括药物组合物，其包含本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)，其用于治疗、预防和/或缓解疾病、病症或病状的一种或多种症状，例如VISTA介导的疾病、病症或病状。示例性的VISTA介导的疾病、病症或病状包括细胞增殖性病症(例如，癌症或肿瘤)或其症状。
在一些实施方案中，本文描述包含抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的组合物，其用于预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状(例如，细胞增殖病症)的一种或多种症状。细胞增殖性病症包括癌症或肿瘤形成或其症状。在一些实施方案中，细胞增殖性病症与VISTA的表达增加和/或活性增加相关。在一些实施方案中，细胞增殖性病症与癌细胞表面上的VISTA表达增加有关。
在另一方面，本发明还涉及用于治疗患者中PSGL-1介导的疾病、病症或病状的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)。本文提供的是本文提供的抗VISTA治疗(例如，抗VISTA抗体)用于预防、治疗和/或缓解疾病、病症或病状(例如PSGL-1介导的疾病、病症或病状，尤其是PSGL-1介导的癌症)的一种或多种症状。有利地，之前已经通过本文提供的方法之一检测或诊断所述PSGL-1介导的疾病、病症或病状。
在一个实施方案中，本发明涉及用于治疗患者中PSGL-1介导的疾病、病症或病状的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)，其中所述PSGL-1介导的疾病、病症或病状之前已经通过本文提供的方法之一检测或诊断。换句话说，因此本发明涉及抗VISTA治疗剂用于在患者中治疗PSGL-1介导的疾病、病症或病状，其中该抗VISTA治疗剂施用于已经通过上述方法诊断为患有PSGL-1介导的疾病、病症或病状的患者。
在一些实施方案中，本文提供了包含本文提供的一种或多种抗体(例如，抗VISTA抗体)的组合物，其用于管理、预防、或治疗PSGL-1介导的疾病、病症或病状和/或缓解PSGL-1介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状。示例性PSGL-1介导的疾病、病症或病状包括细胞增殖性疾病、肿瘤和移植物抗宿主病(GVHD)或其症状。优选地，所述PSGL-1介导的疾病、病症或病状是癌症。
因此，本文提供抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于治疗患者中PSGL-1介导的癌症的用途，所述用途包括：
c)使所述受试者的生物样本与能够特异性结合PSGL-1核酸或蛋白质的试剂接触；以及
d)定量所述试剂与所述生物样本的结合，从而确定在所述样本中PSGL-1的表达水平。
根据一个优选的实施方案，本发明的用途还包括通过将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与基于两个参数(染色强度和阳性细胞百分比)的合适量表进行比较，对肿瘤进行评分的步骤。
在另一实施方案中，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于治疗患者中PSGL-1介导的癌症中的用途，其中所述用途包括如上所述，预先确定所述肿瘤的PSGL-1的状态。根据该实施方案，[PSGL-1(+)]的肿瘤指示PSGL-1介导的癌症，因此易于对使用抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的治疗产生应答。
根据另一个优选的实施方案，本用途还包括将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与参考水平进行比较。
根据该优选实施方案，所述抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于在患者中治疗PSGL-1介导的癌症的用途，所述用途包括：
d)测定所述受试者的生物样本(例如，通过所述生物样本中肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平；
e)将步骤a)的表达水平与参考水平进行比较；以及
f)当步骤a)的表达水平高于参考水平时，确定PSGL-1介导的癌症。
根据另一优选实施方案，所述抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于在患者中治疗PSGL-1介导的癌症的用途，所述用途包括：
d)测定所述受试者的生物样本(例如，通过所述生物样本中肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平；
e)将步骤a)的表达水平与参考水平进行比较；以及
f)当步骤a)的表达水平高于参考水平时，诊断为PSGL-1介导的癌症。
有利地，本发明的方法包括以下两步骤：
·通过将受试者的生物样本中PSGL-1的表达水平(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)与基于两个参数(染色强度和阳性细胞百分比)的合适量表进行比较，对肿瘤进行评分；以及
·将所述受试者的生物样本中PSGL-1的表达水平(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)与参考水平进行比较。
有利地，上述抗VISTA治疗剂的用途还包括如上所述确定VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平。在这样的情况下，PSGL-1的表达水平以及VISTA、CDllb、CD33、CD4和CD8中的至少一种的表达水平、或其相对表达水平高于参考水平，指示为PSGL-1介导的癌症。
根据另一优选方案，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于在患者中治疗PSGL-1介导的癌症中的用途，所述用途包括：
d)使所述受试者的生物样本与能够特异性结合PSGL-1核酸或蛋白质的试剂接触；以及
e)定量所述试剂与所述生物样本的结合，从而确定在所述样本中PSGL-1的表达水平；以及
f)基于步骤a)的水平调整抗VISTA治疗剂的治疗。
根据一个优选的实施方案，本发明的用途还包括通过将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与基于两个参数(染色强度和阳性细胞百分比)的合适量表进行比较，对肿瘤进行评分的步骤。
在另一实施方案中，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)用于治疗患者中PSGL-1介导的癌症中的用途，其中所述用途包括如上所述的预先确定所述肿瘤的PSGL-1的状态。根据该实施方案，[PSGL-1(+)]的肿瘤指示PSGL-1介导的癌症，因此易于对使用抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的治疗产生应答。
根据另一个优选的实施方案，本发明的用途还包括将受试者的生物样本(例如，通过肿瘤微环境的免疫浸润物)中PSGL-1的表达水平与参考水平进行比较。
所述抗VISTA治疗剂治疗的调整可以包括：
-如果患者已诊断出对所述抗VISTA治疗剂无应答，则减少或抑制所述抗VISTA治疗剂的治疗，或
-如果患者已经诊断出对所述抗VISTA治疗剂有应答，则继续所述抗VISTA治疗剂治疗。
如果步骤a)的表达水平和参考水平之间存在PSGL-1表达差异，则患者对所述治疗有应答。例如，步骤a)的表达水平与在治疗之前从患者获得的第二生物样本中PSGL-1的表达水平之间PSGL-1表达的差异指示所述患者是否对所述治疗有应答。有利地，步骤a)的PSGL-1表达水平高于在治疗之前从患者获得的第二生物样本中PSGL-1的表达水平，指示所述患者对所述治疗有应答。
通过本文提供的抗体可以治疗、预防的细胞增生性疾病、或可缓解其症状的实例包括、但不限于，血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤或骨髓瘤)、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结缔组织癌、直肠癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉癌、肾癌、口腔癌、卵巢癌、或前列腺癌、或肉瘤、黑素瘤、或神经胶质瘤、或任何这些癌的转移。示例性血液癌症包括、但不限于，急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性单核细胞性白血病(AMoL)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、局限性骨髓瘤或髓外骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述血液癌症是淋巴瘤。在其他实施方案中，所述血液癌症是白血病。在一些实施方案中，所述血液癌症是骨髓瘤。在另一个实施方案中，所述血液癌症是急性髓系白血病(AML)。在另一个实施方案中，所述血液癌症是急性淋巴细胞白血病(ALL)。在另一个实施方案中，所述血液癌症是慢性粒细胞性白血病(CML)。在另一个实施方案中，所述血液癌症是慢性淋巴细胞性白血病(CLL)。在另一个实施方案中，所述血液癌症是急性单核细胞性白血病(AMoL)。在另一个实施方案中，所述血液癌症是霍奇金淋巴瘤。在另一个实施方案中，所述血液癌症是非霍奇金淋巴瘤。在另一个实施方案中，所述血液癌症是多发性骨髓瘤。在另一个实施方案中，所述血液癌症是浆细胞瘤。在另一个实施方案中，所述血液癌症是局限性骨髓瘤。在另一个实施方案中，所述血液癌症是髓外骨髓瘤。
在一些实施方案中，所述血液癌症是骨髓增生异常综合症、急性白血病、例如急性T细胞白血病、急性髓系白血病(AML)、急性早幼粒细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性巨核细胞白血病、B前体急性淋巴细胞白血病、T前体急性淋巴细胞性白血病、伯基特氏白血病(伯基特氏淋巴瘤)、或急性双表型白血病；慢性白血病、例如，慢性髓样淋巴瘤、慢性粒细胞性白血病(CML)、慢性单核细胞白血病、小淋巴细胞性淋巴瘤、或B细胞前淋巴细胞白血病；毛细胞淋巴瘤；T细胞前淋巴细胞白血病；或淋巴瘤，例如组织细胞性淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤(例如，
巨球蛋白血症)、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞瘤(例如，浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、或重链病)、结外边缘B细胞淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、淋巴结边缘B区细胞淋巴瘤(NMZL)、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性积液淋巴瘤、T细胞大颗粒性淋巴细胞白血病、侵袭性NK细胞白血病、成年T细胞白血病/淋巴瘤、结外NK/T细胞淋巴瘤、鼻腔类型、肠病型T细胞淋巴瘤、肝脾性T细胞淋巴瘤、原始NK细胞淋巴瘤、蕈状真菌病(Sezary综合征)、原发性皮肤CD30阳性T细胞淋巴增生性疾病(例如，原发性皮肤间变性大细胞淋巴瘤、或淋巴瘤样丘疹病)、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤、外周性T细胞淋巴瘤、未指明的间变性大细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤或结节性淋巴细胞为主的霍奇金淋巴瘤。
本文所述的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)可以出于治疗目的而施用于人。此外，可以向表达与抗体交叉反应的VISTA的非人类哺乳动物(例如，灵长类、猪、大鼠、或小鼠)施用抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)，以用于兽医目的或作为人类疾病的动物模型。关于后者，此类动物模型可用于评估本文提供的抗体的治疗疗效(例如，测试剂量和施用时程)。
在一些实施方案中，所述抗VISTA治疗剂是可以用于调节由VISTA与PSGL-1结合介导的T细胞功能的方法中的抗体。此类方法可包括使T细胞与本文所述的抗VISTA抗体接触。在一些实施方案中，抗PSGL-1抗体不阻断或抑制PSGL-1与P-选择蛋白、L-选择蛋白或E-选择蛋白的结合。在一些实施方案中，调节T细胞功能的方法包括向受试者施用有效量的包含本文提供的抗VISTA抗体的组合物。在一些方面，被调节的T细胞功能包括增加T细胞活化。这种T细胞活化可以进一步包括增加T细胞增殖。用于测定免疫应答调节的方法是本领域技术人员众所周知的，并且应理解，技术人员将能够容易地进行此类测定。
在一些实施方案中，抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)或包含抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)的组合物，包括如本文所述，可以单独使用或与另一种化合物或治疗组合使用。例如，在一些实施方案中，另一种化合物是共抑制分子的拮抗剂或共刺激分子的激动剂。在这样的实施方案中，组合治疗通过活化的T细胞导致免疫系统的重新活化或从头活化，该T细胞的活化大于单独施用化合物或治疗。免疫系统的这种活化将在治疗VISTA介导的疾病、病症或病状中产生高度有益的生理反应，包括在癌症治疗(例如，血液癌症治疗)的情况下。
在一些实施方案中，本文描述的方法可以包括施用治疗有效量的抗VISTA抗体与治疗有效量的针对共抑制分子的拮抗剂的组合。在一些实施方案中，共抑制分子选自CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2、B7-H3、B7-H4、嗜乳脂蛋白、CD48 CD244、TIM-3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、HVEM、LAIR1、TIM1、半乳糖蛋白9、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113和TIGIT。所述共抑制分子的拮抗剂包括针对所述共抑制分子的抗体。已经认识到，其他共抑制分子的拮抗剂是本领域众所周知的，例如，描述见于Mercier等人，Frontiers in Immunology，6：418(2015)，Kyi等人，FEBS Letters，588：368-376(2014)和Pardoll，Nature Reviews，12：252-264(2012)。根据该实施方案，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)在用于治疗如上所述VISTA介导的肿瘤中的用途，所述用途进一步包括施用共抑制分子的拮抗剂，其中所述共抑制分子选自CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2、B7-H3、B7-H4、嗜乳脂蛋白、CD48、CD244、TIM-3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、HVEM、LAIR1、TIM1、半乳糖蛋白9、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113和TIGIT。
在一些实施方案中，本文描述的方法可以包括施用治疗有效量的抗VISTA抗体与治疗有效量的针对共刺激分子的拮抗剂的组合。在一些实施方案中，所述共刺激分子选自CD154、TNFRSF25、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD28、CD40、TL1A、GITRL、41BBL、OX40L、CD70、HHLA2、ICOSL、细胞因子、LIGHT、HVEM、CD30、CD30L、B7-H2、CD80、CD86、CD40L、TIM4、TIM1、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、DR3、GITR、CD2和CD226。共刺激分子的激动剂包括针对共刺激分子的激动性抗体。公认的是对共刺激分子的激动剂是本领域众所周知的，例如，描述见于Mercier等人，Frontiers in Immunology，6：418(2015)，Kyi等人，FEBSLetters，588：368-376(2014)和Capece等人，J.Biomed.Biotechnol.2012：926321，17页(2012)。根据该实施方案，本发明涉及抗-VISTA治疗剂(例如，抗-VISTA抗体)在治疗如上所述的VISTA介导的肿瘤中的用途，所述用途还包括施用共刺激分子的激动剂，其中所述共刺激分子选自CD154、TNFRSF25、GITR、4-1BB、OX40、CD27、TMIGD2、ICOS、CD28、CD40、TL1A、GITRL、41BBL、OX40L、CD70、HHLA2、ICOSL、细胞因子、LIGHT、HVEM、CD30、CD30L、B7-H2、CD80、CD86、CD40L、TIM4、TIM1、SLAM、CD48、CD58、CD155、CD112、DR3、GITR、CD2和CD226。
在一些实施方案中，本文描述的方法可以包括施用治疗有效量的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)组合用于治疗癌症的疗法的常规形式，例如，治疗有效量的本文所述的化学治疗剂、或本文所述的放疗剂。根据该实施方案，本发明涉及抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)在用于治疗如上所述的VISTA介导的肿瘤中的用途，所述用途还包括施用用于治疗癌症的疗法的常规形式，例如，治疗有效量的本文所述的化学治疗剂、或本文所述的放射疗法。
各种递送系统是已知的，并且可以用于施用抗VISTA治疗剂(例如，如本文所述的抗VISTA抗体)，包括、但不限于，封装在脂质体、微粒、微胶囊、能够表达抗体的重组细胞中、受体介导的胞吞作用(参见，例如，Wu和Wu，J.BiolChem.262：4429-4432(1987))，作为逆转录病毒或其他载体一部分的核酸构建体等。施用治疗剂(例如，本文提供的抗VISTA抗体)、或药物组合物的方法包括、但不限于，肠胃外施用(例如，皮内、肌内、腹膜内、静脉内、肿瘤内和皮下)、硬膜外、和粘膜(例如，鼻内和口服途径)。在一些实施方案中，鼻内、肌内、静脉内、肿瘤内或皮下施用治疗剂(例如，本文提供的抗VISTA抗体)、或药物组合物。治疗剂、或组合物可以通过任何方便的途径施用，例如，通过输注、或弹丸式注射、通过上皮或粘膜衬里(lining)(例如，口腔粘膜、鼻内粘膜、直肠和肠粘膜等)吸收，并且可以与其他生物活性剂一起施用。施用可以是全身的或局部的。另外，还可以，例如，通过使用吸入器或雾化器以及与雾化剂一起配制来进行肺部施用。参见，例如，美国专利号6,019,968、5,985,320、5,985,309、5,934,272、5,874,064、5,855,913、5,290,540和4,880,078；以及PCT公开号WO92/19244、WO 97/32572、WO 97/44013、WO 98/31346、和WO 99/66903，在此将其全部内容引入作为参考。
在一些实施方案中，可能需要将本发明提供的治疗剂、或药物组合物局部施用于需要治疗的区域。这可以通过以下实现：例如，但不限于局部输注、局部施用(例如，通过鼻内喷雾)、通过注射(特别是肿瘤内注射)、或通过植入物的方式，所述植入物是多孔、无孔、或凝胶状材料，包括膜，例如硅胶膜(sialastic membranes)或纤维。在一些实施方案中，当施用本文提供的抗体时，必须注意使用不吸收抗体的材料。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂可以在囊泡中递送，特别是在脂质体中递送(参见Langer，1990，Science 249：1527-1533；Treat等人，Liposomes in the Therapyof Infectious Disease and Cancer，Lopez-Berestein and Fidler(编)，Liss，纽约，353-365页(1989)；Lopez-Berestein，同上，317-327页；一般参见同上)。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂可以在控释或缓释系统中递送。在一些实施方案中，可以使用泵来实现控释或缓释(参见Langer，同上；Sefton，1987，CRCCrit.Ref.Biomed.Eng.14：20；Buchwald等人，1980，Surgery 88：507；Saudek等人.，1989，N.Engl.J.Med.321：574)。在另一个实施方案中，聚合材料可用于实现治疗剂(例如，本文提供的抗体)或本文提供的组合物的控释或缓释(参见，例如，Medical Applications ofControlled Release，Langer and Wise(eds.)，CRC Pres.，Boca Raton，Florida(1974)；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design and Performance，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，New York(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.，MacroMol.Sci.Rev.MacroMol.Chem.23：61；还参见Levy等人，1985，Science 228：190；During等人，1989，Ann.Neurol.25：351；Howard等人，1989，J.Neurosurg.71：105)；美国专利号5,679,377；美国专利号5,916,597；美国专利号5,912,015；美国专利号5,989,463；美国专利号5,128,326；PCT公开号WO 99/15154；以及PCT公开号WO 99/20253。用于缓释制剂的聚合物的实例包括、但不限于聚(2-羟乙基甲基丙烯酸酯)、聚(甲基甲基丙烯酸酯)、聚(丙烯酸)、聚(乙烯-共-乙酸乙烯酯)、聚(甲基丙烯酸)、聚乙交酯(PLG)、聚酸酐、聚(N-乙烯基吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚丙烯酰胺、聚(乙二醇)、聚丙交酯(PLA)、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLGA)和聚原酸酯。在一些实施方案中，用于缓释制剂的聚合物是惰性的、不含可浸出的杂质、在储存时稳定、无菌且可生物降解的。在又一个实施方案中，可将控释或缓释系统放置在治疗靶标附近，例如，鼻腔通道或肺部，因此仅需要全身剂量的一小部分(参见，例如，Goodson，MedicalApplications of Controlled Release，同上，卷2115-138页(1984))。Langer(1990，Science 249：1527-1533)的综述中讨论了控释系统。可以使用本领域技术人员已知的任何技术来产生包含一种或多种本文提供的抗体的缓释制剂。参见，例如，美国专利号4,526,938、PCT公开号WO 9I/05548、PCT公开号WO 96/20698，Ning等人，1996，“IntratumoralRadioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel，”Radiotherapy&Oncology 39：179-189，Song等人，1995，“AntibodyMediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions，”PDA Journal ofPharmaceutical Science&Technology 50：372-397，Cleek等人，1997，“BiodegradablePolymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application，”Pro.Int’l.Symp.Control.Rel.Bioact.Mater.24：853-854，和Lam等人，1997，“Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for LocalDelivery，”Proc.Int’l.Symp.Control Rel.Bioact.Mater.24：759-760。
在一些实施方案中，可用于本文提供的方法的组合物包含一种、两种或更多种本文提供的抗体(例如，抗VISTA抗体)。在另一个实施方案中，可用于本文提供的方法的组合物包含一种、两种或更多种本文提供的抗体和除本文提供的抗体以外的治疗剂。在一些实施方案中，已知所述试剂可用于或已经用于或目前用于预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状。除治疗剂外，本文提供的组合物还可包含载体。
本文提供的组合物包括总组分(bulk composition)，其用于制造可用于制备单位剂型的药物组合物(例如，适合施用至受试者或患者的组合物)。在一些实施方案中，本文提供的组合物是药物组合物。这样的组合物包含预防有效量或治疗有效量的一种或多种治疗剂(例如，抗-VISTA治疗剂，例如本文提供的抗-VISTA抗体、或其他治疗剂)、以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，将药物组合物配制成适于施用至受试者的途径。
在一些实施方案中，根据常规程序将组合物配制为适于静脉内施用给人类的药物组合物。通常，用于静脉内施用的组合物是在无菌等渗水性缓冲液中的溶液。必要时，组合物还可包含增溶剂和局部麻醉剂(例如利多卡因(lidocaine)或利多卡因(lignocaine))以缓解注射部位的疼痛。尽管如此，此类组合物可以通过静脉注射施用以外的途径施用。
本文提供的组合物的成分可以单独或混合在单位剂型中供应，例如，作为干燥的冻干粉或无水浓缩物放在指示活性剂含量的密闭容器中，例如安瓿、或小袋中。当组合物要通过输液施用时，可以用装有无菌药物级水或盐水的输液瓶分装。在通过注射施用组合物的情况下，可以提供用于注射的无菌水或盐水的安瓿瓶，以便可以在施用之前将成分混合。
在一些实施方案中，本文提供的抗体包装在指示抗体量的密闭容器中，例如安瓿、或小袋。在一些实施方案中，抗体以干燥的无菌冻干粉或无水浓缩物提供在密闭容器中，并且可以(例如，用水或盐水)重构至合适的浓度以施用于受试者。在一些实施方案中，抗体以在密闭容器中的干燥无菌冻干粉形式提供，其单位剂量为至少0.1mg、至少0.5mg、至少1mg、至少2mg、或至少3mg，例如至少5mg、至少10mg、至少15mg、至少25mg、至少30mg、至少35mg、至少45mg、至少50mg、至少60mg、至少75mg、至少80mg、至少85mg、至少90mg、至少95mg、或至少100mg。冻干的抗体可以在2至8℃之间储存在其原始容器中，并且抗体可以在重构后的12小时内，例如，6小时内、5小时内、3小时内或1小时内施用。在另一个实施方案中，将抗体以液体形式提供在指示抗体的量和浓度的密闭容器中。在一些实施方案中，将液体形式的抗体以以下的量供应在密闭容器中：至少0.1mg/ml、至少0.5mg/ml、或至少1mg/ml、例如，至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少15mg/ml、至少25mg/ml、至少30mg/ml、至少40mg/ml、至少50mg/ml、至少60mg/ml、至少70mg/ml、至少80mg/ml、至少90mg/ml、或至少100mg/ml。
可以通过标准临床技术确定本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)或组合物的量，所述量将有效预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状。
因此，可以向人施用一定剂量的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)或组合物以用于预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状，所述剂量产生的血清滴度为从约0.1μg/ml至约450μg/ml，并且在一些实施方案中至少为0.1μg/ml、至少0.2μg/ml、至少0.4μg/ml、至少0.5μg/ml、至少0.6μg/ml、至少0.8μg/ml、至少lμg/ml、至少1.5μg/ml，例如至少2μg/ml、至少5μg/ml、至少10μg/ml、至少15μg/ml、至少20μg/ml、至少25μg/ml、至少30μg/ml、至少35μg/ml、至少40μg/ml、至少50μg/ml、至少75μg/ml、至少100μg/ml、至少125μg/ml、至少150μg/ml、至少200μg/ml、至少250μg/ml、至少300μg/ml、至少350μg/ml、至少400μg/ml、或至少450μg/ml。另外，可任选地采用体外测定法以帮助鉴定最佳剂量范围。制剂中使用的确切剂量还取决于施用途径、以及VISTA介导的疾病、病症或病状的严重性，并应根据从业者的判断和每个患者的情况来决定。
有效剂量可以从源自体外或动物模型测试系统的剂量反应曲线中推断出来。
对于本文提供的抗体而言，在一些实施方案中，施用至患者的剂量可以是患者体重的0.1mg/kg至100mg/kg。在一些实施方案中，施用至患者的剂量为患者体重的约1mg/kg至约75mg/kg。在一些实施方案中，施用至患者的剂量为患者体重的1mg/kg至20mg/kg，例如，患者体重的1mg/kg至5mg/kg。通常，由于对外源多肽的免疫应答，在人体内人抗体的半衰期比来自其他物种的抗体要长。因此，较低剂量的人抗体和较低频率的施用通常是可能的。此外，可通过修饰(例如，脂质化)来增强抗体的摄取和组织渗透从而降低本文提供的抗体的剂量和施用频率。
在一些实施方案中，5次、4次、3次、2次或1次施用约100mg/kg或更少、约75mg/kg或更少、约50mg/kg或更少、约25mg/kg或更少、约10mg/kg或更少、约5mg/kg或更少、约1mg/kg或更少、约0.5mg/kg或更少、或约0.1mg/kg或更少的本文提供的抗体的以预防、治疗或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状。在一些实施方案中、本文提供的抗体施用约1-12次、其中剂量可以根据需要由医生确定施用，例如，每周、每两周、每月、每两个月、每三个月等。在一些实施方案中，可以更频繁地(例如，3-6次)施用较低剂量(例如，1-15mg/kg)。在其他实施方案中，可以较低频率(例如，1-3次)施用较高剂量(例如，25-100mg/kg)。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，其他施用量和时间表可以容易地确定并且在本公开的范围内。
在一些实施方案中，约100mg/kg或更少、约75mg/kg或更少、约50mg/kg或更少、约25mg/kg或更少、约10mg/kg或更少、约5mg/kg或更少、约1mg/kg或更少、约0.5mg/kg或更少、或约0.1mg/kg或更少的本文提供的抗体以缓释制剂施用至受试者(例如，人)以预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病的一种或多种症状。在另一些实施方案中，约100mg/kg、约75mg/kg或更少、约50mg/kg或更少、约25mg/kg或更少、约10mg/kg或更少、约5mg/kg或更少、约1mg/kg或更少、约0.5mg/kg或更少、或约0.1mg/kg或更少的本文提供的抗体以弹丸式而不是以缓释制剂施用至受试者(例如，人)以预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状，并且在一段时间之后约100mg/kg、约75mg/kg或更少、约50mg/kg或更少、约25mg/kg或更少、约10mg/kg或更少、约5mg/kg或更少、约1mg/kg或更少、约0.5mg/kg或更少、或约5mg/kg或更少的本文提供的抗体以缓释一次、二次、三次或四次施用至受试者(例如，鼻内或肌内)。根据该实施方案，一段时间可以是1至5天、一周、两周、或一个月。
在一些实施方案中，将单一剂量的本文提供的抗体施用于患者以预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状，包括一个或多个剂量，例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、十五、十六、十七、十八、十九、二十、二十一、二十二、二十三、二十四、二十五或二十六个剂量，包括在一年中以每两周(例如，约14天)的间隔，其中剂量选自约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(例如，每个月的每个剂量可能相同也可能不同)。
在一些实施方案中，将单一剂量的本文提供的抗体施用至患者以预防、治疗和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状，包括一次或多次，例如二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、或十二次，包括一年中以大约每月(例如，约30天)的间隔，其中剂量选自：约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1 mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(例如，每个月的每个剂量可能相同或不同)。
在一些实施方案中，向患者施用单一剂量的本文提供的抗体以治疗、预防和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的症状，包括一次或多次，例如二、三、四、五或六次，包括在一年中以大约两个月(例如，大约60天)的间隔，其中剂量选自约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(例如，每两个月的剂量可以相同或可以不相同)。
在一些实施方案中，向患者施用单一剂量的本文提供的抗体以治疗、预防和/或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状的一种或多种症状，包括一次或多次，例如二、三、四次，包括在一年中以大约三个月(例如，大约120天)的间隔，其中剂量选自约0.1mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、约50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg、约100mg/kg或其组合(例如，每三个月的剂量可以相同或可以不相同)。
在一些实施方案中，向患者施用本文提供的剂量的抗体的途径是鼻内、肌内、静脉内、或其组合，但是本文所述的其他途径也是可接受的。每个剂量可以或可以不通过相同的施用途径来施用。在一些实施方案中，本文提供的抗体可以经由多种施用途径与其他剂量的本文提供的相同或不同抗体同时或相继施用。
在一些实施方案中，本文提供的抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)是预防性或治疗性地施用至受试者。可以预防性或治疗性地将抗VISTA治疗剂(例如，抗VISTA抗体)施用于受试者，以预防、减轻或缓解VISTA介导的疾病、病症或病状或其症状。
试剂盒
本文还提供了一种药物包装或试剂盒，其包括一个或多个装有本发明提供的药物组合物的一种或多种成分的容器，例如，一种或多种本文提供的抗体(例如，抗PSGL-1和/或抗VISTA抗体)。任选地，与这样的容器相关联的可以是由政府机构规定的用于规范药品或生物产品生产、使用或销售的通知，该通知反映了该生产、使用、或销售机构对人类施用的批准。在一些实施方案中，试剂盒包含包装说明书。术语“包装说明书”用于指通常包含在治疗产品的商业包装中的说明，其包含有关使用此类治疗产品的适应症、用法、剂量、施用、禁忌症和/或警告的信息，以及使用说明。
本文还提供了可用于上述方法的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含本文提供的抗体(例如，抗PSGL-1和/或抗VISTA抗体)，例如，装在一个或多个容器中分离的抗体(例如，抗PSGL-1和/或抗VISTA抗体)。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包含基本上分离的PSGL-1或VISTA作为对照。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒进一步包含不与PSGL-1和/或VISTA反应的对照抗体。在一些实施方案中，本文提供的试剂盒包含用于检测修饰的抗体与PSGL-1和/或VISTA的结合的装置(例如，抗体可以缀合至可检测的底物，例如，荧光化合物、酶促底物、放射性化合物或发光化合物，或识别第一抗体的第二抗体可缀合至可检测的底物上)。在一些实施方案中，试剂盒可包括重组产生或化学合成的PSGL-1和/或VISTA。试剂盒中提供的PSGL-1和/或VISTA也可以附着到固体支持物上。在一些实施方案中，上述试剂盒的检测装置包括PSGL-1和/或VISTA附着的固体支持物。这样的试剂盒还可包含未附着的报告子标记的抗人抗体。在一些实施方案中，可以通过报告子标记的抗体的结合来检测抗体与PSGL-1和/或VISTA的结合。
应当理解，本文还提供了基本上不影响本公开的各个实施方案的活性的修饰。因此，以下实施例旨在说明而非限制本公开。
实施例
实施例1
识别VISTA的受体
该实施例首次描述了使用CAPTIRECTM(一种基于TRICEPSTM的配体-受体捕获系统(Dualsystems Biotech AG))识别VISTA受体。
在从人原代T细胞中分离的初始(naive)T细胞上进行CAPTIRECTM方法，其中VISTA-Fc融合蛋白作为目标配体，抗CD28抗体作为对照配体。以下实验中使用的VISTA-Fc融合蛋白构建体的核苷酸和氨基酸序列如下所示：
VISTA-Fc融合蛋白核苷酸序列(下划线的序列编码VISTA；黑体的序列编码人IgG1抗体的Fc片段)
VISTA-Fc融合蛋白氨基酸序列(带下划线的序列是VISTA；粗体序列是人IgG1抗体的Fc片段)
在图1中概述了CAPTIRECTM程序。简而言之，将VISTA-Fc融合蛋白和抗CD28抗体分别与TRICEPSTM偶联。从商业上可获得的原代人T细胞中分离出初始人T细胞。初始T细胞的表面糖蛋白被选择性氧化。对氧化的初始T细胞的细胞表面进行配体结合和受体偶联。然后裂解反应的T细胞，并将所得裂解物进行亲和纯化以得到配体-受体蛋白复合物。然后通过胰蛋白酶消化将纯化的蛋白质裂解，从而释放受体肽。通过液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)分析所得的受体肽。为了进行统计分析，实验在一式三份生化反应中进行。
通过从健康供体的人原代T细胞(购自ALLCELLS(Alameda，CA))中负性选择初始T细胞来进行初始T细胞的分离。为负选择所想要的细胞，根据制造商的协议，使用Miltenyi’s
Pan T-cell分离试剂盒(#130-097-095)。简而言之，将外周血单个核细胞(PBMC)重悬于MACS运行缓冲液中，并与针对HLA-DR、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD36、CD56、CD57、CD45RO、CD123、CD244、CD235a和抗TCRγ/δ的生物素缀合的单克隆抗人抗体混合物孵育5分钟，然后与单克隆抗CD61和抗生物素抗体缀合的抗生物素磁珠孵育10分钟。然后，使用autoMACS Separator(Miltenyi Biotech，San Diego CA)对初始T细胞进行负选择。每个TRICEPSTM配体捕获反应使用100x106初始T细胞。
CAPTIRECTM程序的其余步骤包括VISTA-Fc融合蛋白或抗CD28抗体与TRICEPSTM偶联、选择性氧化初始T细胞的表面糖蛋白、配体结合和受体偶联至氧化T细胞的细胞表面、裂解T细胞、亲和纯化细胞裂解物、以及用胰蛋白酶消化，这些根据Frei等人，Nat.Protoc.，8(7)：1321-1336(2013)和Frei等人，Nat.Biotechnol.，30(10)：997-1001(2012)描述的改良程序进行。
在装有电喷雾离子源的Thermo LTQ Orbitrap XL光谱仪上通过LC-MS/MS分析所得的受体肽。使用10cm C18填充柱以120分钟的梯度在数据依赖的采集模式下测量样本。用统计ANOVA模型分析CAPTIRECTM数据集中的六个独立的样本。该模型假设测量误差遵循高斯分布，并将各特征视为蛋白质丰度的重复，并明确说明了这种冗余。它在配体和对照样本的所有成对比较中测试每种蛋白质的差异丰度，并报告p值。接下来，调整p值以进行多次比较，以控制整个实验范围内的错误发现率(FDR)。
将肽鉴定物过滤至＜＝1％的FDR，并使用基于MS1的无标记方法进行定量。对于MS1定量，使用了蛋白质组学软件的非线性DYNAMICS Progenesis QI，设置为考虑所有独特的肽。使用Uniprot提供的信息，过滤出已鉴定的蛋白质，使其与术语膜、分泌、糖基化相关联。不考虑对仅依赖一种肽鉴定的蛋白质进行分析。
处理后的CAPTIRECTM数据以蛋白质水平上的火山图的形式作图，该图绘制倍数变化与统计显著性。将每种蛋白质获得的调整p值在两个实验条件之间相对倍数富集幅度进行作图。受体候选空间由＞4倍的富集因子和统计学显著性(FDR调整的p值＜0.01)定义。
在观察到的糖蛋白中，对照数据集中鉴定出CD28的5个肽。这表明CAPTIRECTM工作流程成功。在VISTA-Fc融合蛋白数据集中，鉴定出PSGL-1的6个肽，VISTA本身也鉴定出12个肽(见表6)。
表6
| 基因名称 | 蛋白质名称 | Log2 FC | AdJ.p值 |
| SELPLG | PSGL-1 | 2.33 | 1.83E-13 |
| 染色体10开放阅读框54 | VISTA | 7.38 | 0 |
对于已鉴定的结合伴侣PSGL-1，生成了Protter插图(图2)，其注释了N-糖基化位点(由正方形包围的残基)和实验观察到的肽(在圆圈内填充)(Omasits等人，Bioinformatics：在线发布，十月，2013)。该图显示所有六个检测到的肽均位于PSGL-1的胞内结构域。对PSGL-1胞外结构域的分析表明，尽管结构域的尺寸如此，胞外结构域中几乎没有胰蛋白酶肽切割位点。PSGL-1包含三个N-糖基化位点，具有这些位点的肽将从上述LC-MS/MS分析中丢失。剩余的潜在肽或者太大、或者太小或在蛋白质分选过程中被加工，这为发现仅检测到对应于PSGL-1的胞内结构域的肽提供了理论基础。
鉴于以上分析，确定PSGL-1是VISTA的异嗜的结合伴侣。因为，之前证明VISTA是在造血细胞上表达的广谱负检查点调节子(Lines等人，Cancer Res.，74(7)1924-1932(2014))，所以上述结果表明VISTA与PSGL-1的相互作用可能导致T细胞被抑制。因此，干扰(例如，抑制或阻断)靶向PSGL-1和/或VISTA的试剂的相互作用，例如，抗PSGL-1和/或抗VISTA抗体，可能通过活化的T细胞导致免疫系统重新活化或从头活化。免疫系统的这种活化将在治疗VISTA介导的疾病、病症或病状中产生高度有益的生理反应，包括在癌症治疗(例如，血液癌症治疗)的背景下。
实施例II
VISTA与PSGL-1的结合
本实施例描述了VISTA与PSGL-1的结合特性。
将VISTA-Fc融合蛋白(例如，实施例I中所述)固定在固体表面上，并测定其与PSGL-1的细胞外结构域的结合。为了这些实验，产生了两个包含PSGL-1胞外结构域的不同构建体。两种构建体均与IgGκ信号序列和Fc片段融合。另外，添加了对于适当的功能可能很重要的前肽序列或串联重复单元(参见，例如，Cummings R.D.，Brazilian JMedBiolRes，32：519-28(1999))。将表达GCNT1和FUT3糖基转移酶的构建体共转染细胞，以确保正确的蛋白质翻译后修饰，已知这对于PSGL-1与P-选择蛋白的高亲和力结合非常重要(Sako等人，Cell，75(6)：1179-86(1993)；Yang等人，Thrombosis和Haemostasis，81(1)：1-7(1999)；Carlow等人，Immunol Rev 230(1)：75-96(2009)；Kumar等人，Blood，88(10)：3872-9(1996)；Cummings R.D.，Brazilian JMed Biol Res，32：519-28(1999))。PSGL-1构建体的氨基酸序列如下所示：
PSGL-1构建体A-氨基酸序列(Fc融合的PSGL-1，具有IgG κ信号序列和前肽序列)。IgG κ信号序列＝斜体；前肽序列＝粗体；Fc序列＝下划线。
PSGL-1构建体B-氨基酸序列(Fc融合的PSGL-1，具有IgG κ信号序列和串联重复单元)。IgG κ信号序列＝斜体；串联重复单元＝粗体；Fc序列＝下划线。
对于这些实验，测试PSGL-1构建体A(PSGL-1A)和构建体B(PSGL-1B)对固定的VISTA-Fc的作用。
在含有钙(1.5mM氯化钙)和镁(1.0mM氯化镁)的HEPES缓冲盐水(HBS)中平衡固定的VISTA-Fc样本。相同的缓冲夜用作运行缓冲液。含有PSGL-1A或PSGL-1B(也含有钙和镁)的样本以60μl/min的流速流过含有固定的VISTA-Fc的固体表面，接触时间为120秒，用3秒的甘氨酸脉冲(pH 1.5)再生表面后，解离时间300秒。测定了六种不同浓度的PSGL-1A和PSGL-1B(0.3μM、0.60μM、1.20μM、2.4μM、4.8μM和9.6μM)。
对实验进行了两种不同的分析：(1)两种状态结合模型；(2)平衡亲和力分析(1∶1模型)。对于PSGL-1A，两种状态结合模型显示出32.1μM的结合亲和力(KD)，而1∶1模型显示出3.01μM的KD(图3)。对于PSGL-1B，两种状态结合模型显示出5.09μM的KD，而1∶1模型显示出4.76μM的KD(图4)。
以上分析表明，PSGL-1A和PSGL-1B构建体均具有净信号应答。所得感测图(sensograms)显示与结合和解离相关的特征。注意，亲和力估计是定性的。当表面活性大于本实验的活性时(例如，使用纯化的PSGL-1构建体＞0.5％)，可以对结合进行定量估计。另外，在这些使用PSGL-1A注射的实验中，导致样本在后续运行中残留。在这些实验中，VISTA和PSGL-1之间的估计亲和力相当相似，分别为PSGL-1A(约3μM)和PSGL-1B(约5μM)。
实施例III
VISTA与PSGL-1在细胞上结合
该实施例描述了使用双功能交联方法使得VISTA与早幼粒细胞系(HL-60；ATCC、CCL-240)上表达的PSGL-1结合。
在这些实验中，使用称为KPL-1的PE缀合的抗PSGL1单克隆抗体(Abcam；ab78188)评估PSGL-1的表达。使用标准方法通过流式细胞术检测HL-60细胞的PSGL-1表达(图5)。PSGL-1蛋白的拷贝数估计约为每个细胞中263,000±2,800。
同样在这些实验中，使用制造推荐的条件，将VISTA-Fc融合蛋白(实施例I中所述)的样本和抗CD28抗体的阴性对照(BioXcell，BE0248)和IgG1-Fc(R&D Systems；110-HG-100)共价偶联至双功能接头(Sulfo-SBED-ThermoFisher Scientific；33073)。将所得样本与HL-60细胞在室温下、在黑暗处一起孵育30分钟。用UV光源进行20分钟交联的光活化。然后裂解细胞，并进行蛋白A Sepharose的拉下实验(pull-down assay)。在样本上使用抗PSGL-1多克隆抗体(R&D Systems；AF3345)或链霉亲和素-HRP进行免疫印迹。
如图6所示，VISTA-Fc与PSGL-1相互作用，但VISTA-Fc不与阴性同种型对照IgG-Fc或抗CD28抗体相互作用。
进行了另外的实验证实了这种相互作用的特异性。重复上述实验，除了在HL-60细胞与Sulfo-SBED标记的蛋白孵育之前，将抗VISTA单克隆抗体加入到细胞中。使用ImageQuant进行分析。
如图7所示。用抗VISTA抗体接种导致VISTA和PSGL-1之间的相互作用减弱。
这些实验表明在HL-60细胞上表达的PSGL-1是VISTA的结合伴侣。这些实验还表明，这种相互作用是特异性的，并被抗VISTA阻断抗体减弱。
实施例IV
VISTA与PBMC上PSGL-1的结合
该实施例描述了使用交联方法使得VISTA与外周血单个核细胞(PBMC)上表达的PSGL-1结合。
在这些实验中，使用称为KPL-1的PE缀合的抗PSGL1单克隆抗体(Abcam；ab78188)评估PSGL-1的表达。使用标准方法通过流式细胞术检测PBMC的PSGL-1表达(图8)。PSGL-1蛋白的拷贝数估计为每个细胞约38,000。
此外，PBMC或者未处理或者与交联剂(10mM BS3；ThermoFisher Scientific；21580)在冰上孵育90分钟。在需要时使交联反应淬灭后，裂解细胞，并用赫赛汀(Herceptin)和GammaBind Plus Sepharose(GE Healthcare；17-0886-01)预先澄清所得裂解物。将得到的样本用抗VISTA抗体或抗PSGL-1抗体(KPL-1)免疫沉淀过夜。使用抗PSGL-1多克隆抗体(R&D Systems；AF3345)通过蛋白印迹测定免疫沉淀的样本。
如图9第4行所示，交联后，用抗VISTA抗体进行免疫沉淀后未检测到PSGL-1特异性条带。例如，这可能是由于阻断了VISTA-PSGL-1复合物形成时的特定表位，从而阻止免疫沉淀。抗PSGL-1抗体在BS3处理的PBMC中(图9，最后一个泳道)沉淀若干较高分子量的复合物(～250-450kDa)，其也是PSGL-1阳性。
在这些实验中，抗VISTA和抗PSGL-1抗体均从未经任何交联剂处理的PBMC中沉淀出～240kDa的蛋白质。该复合物是PSGL-1阳性的，表明PSGL-1与VISTA相互作用(图9、第3和5泳道)。用同种型对照抗体进行免疫沉淀不会产生这样的条带(图9，第1和2泳道)。
该实验表明，PBMC上表达的PSGL-1是VISTA的结合伴侣。
实施例V
PSGL-1的表达
该实施例描述PSGL-1在各种T细胞子集中的表达。
在这些实验中，使用PE缀合的抗人CD162抗体评估PSGL-1的表达。评估了以下T细胞子集：初始&静止细胞(例如，报告的表型：CD45RO-/CD45RA+/CCR7+/CD62L+/CD27+/CD28+/CD127+)，效应子细胞(例如，报告的表型：CD45RO+/CD57+/CD279-/CD95+/CCR7-/CD62L-)，耗竭性效应子细胞(例如，报告的表型：CD45RO+/CD57+/CD279+/CD95+/CD45RA-/CCR7-/CD62L-)和循环记忆的细胞(例如，报告的表型：中央：CD45RO+/CD45RA-/CCR7+/CD62L+或效应子：CD45RO+/CD45RA-/CCR7-/CD62L+)。
在这些实验中，人PBMC样本获自ALLCELLS(Emeryville，CA)。如下制备了两个T细胞标记物小组：
a.小组1：T细胞标志物+效应子/耗竭性效应子特定标志物
i.CD45RA-FITC
ii.CD45RO-PerCP-eFluor 710
iii.CD197(CCR7)-Brilliant Violet 510
iv.CD62L-APC-eFluor 780
v.CD57-Pacific Blue
vi.CD95(Fas)-PE-Cy7
vii.CD279-APC
viii.CD162-PE
b.小组2：T细胞标志物+初始/静止的特定标志物
ix.CD45RA-FITC
x.CD45RO-PerCP-eFluor 710
xi.CD197(CCR7)-Brilliant Violet 510
xii.CD62L-APC-eFluor 780
xiii.CD27-Pacific Blue
xiv.CD28-PE-Cy7
xV.CU12/-APC
xvi.CD162-PE
在这些实验中，将大约1E6细胞和FcR阻断剂(Miltenyl-Biotec，130-092-247)与针对每种抗体的适当的同种型对照添加到每个小组中，并在黑暗中4℃下孵育30分钟。然后洗涤细胞，并在MACSQuant Analyzer上计算每个样本的中值荧光强度(MedianFluorescence Intensities)(MFI)。使用Quantum Simply Cellular抗小鼠IgG试剂盒(Bangs Laboratories，815B)定量MFI值。从存活群(DAPI阴性)中收集每个荧光团的1E5事件，并输出到FlowJo中进行分析。
如图10和11所示，PSGL-1存在于初始/静止、效应子、耗竭性效应子以及循环中央和效应子T细胞子集中。还显示在图10和11中，相对于初始和耗竭性T细胞，PSGL-1表达在效应子亚型中升高。在效应子子集中的表达水平最高，而在初始/静止子集中的表达水平最低。表7显示每个子集中PSGL-1表达的拷贝数。
表7
这些实验表明PSGL-1在人PBMC中的各种T细胞子集中差异表达。
实施例VI
由电脑模拟分析VISTA和PSGL-1表达。
该实施例显示在一些适应症中，VISTA表达与PSGL1相关。
癌症基因组图谱(TCGA)通过高通量技术(包括下一代测序和基于微阵列的方法)可以对癌症基因组图谱进行全面分析。TCGA存放的数据包含有关核苷酸序列和基因表达的信息。因此，癌症基因组学的cBioportal网站(http：//www.cbioportal.org/)提供了可视化、分析和下载大规模癌症基因组学数据集的功能。其包括来自TCGA的基因组学、转录组学研究。
对于每个TCGA适应症，都查询cBioportal网站，以鉴定其表达与VISTA最相关的mRNA。使用Spearman检验进行该相关性分析。统计结果(p值＜0.05)记录在表8中；根据mRNA与VISTA的相关性对mRNA进行排名。
表8
表8显示在几种癌症中，PSGL1表达与VISTA表达高度相关。在NSCCLC中相关性最高。相比之下，其他推定的受体(即VSIG3和VSIG8)仅显示出较弱的相关性。
实施例VII
用RNA范围评估VISTA和PSGL1 mRNA表达
该实施例显示肺鳞状细胞癌(SCC)和腺癌(ADK)组织微阵列(TMA)中，VISTA和PSGL1的mRNA表达和共定位模式。
材料和方法
在进行原位杂交(ISH)技术步骤之前，将石蜡包埋的肺SCC和ADK TMA块(每个3块)新鲜切片并加工成载玻片。解剖后的组织样本在室温(RT)下放置在新鲜的10％中性福尔马林缓冲液(NBF)中1632小时。然后将样本脱水，包埋在石蜡中，切成5±1μm的切片，然后将其安装在
Plus载玻片上。将载玻片在60℃的干燥炉中烘烤1小时。
将厚度为5μm的组织切片在二甲苯中脱蜡，接着在乙醇系列中脱水。然后，将组织切片在柠檬酸盐缓冲液(10nmol/L，pH 6)中使用热板在沸腾温度(100℃至103℃)下孵育15分钟，在去离子水中冲洗，接着立即用10μg/mL蛋白酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、在HybEZ杂交烤箱(Advanced Cell Diagnostics，Hayward，CA)中于40℃处理30分钟。
然后按照制造商的说明，使用
2.5Assay(Advanced CellDiagnostics，Hayward，CA)将处理过的组织切片与PSGL-1或VISTA探针杂交。
用苏木精和曙红对载玻片染色，以进行质量检查和每个核心的显微镜评估。使用标准光学显微镜以20-40X放大倍数进行检查。Excel工作表用于数据采集。
使用2种特异性探针产生阴性和阳性对照检查。评估这些评分以确认不存在污染(阴性探针)和泛mRNA的存在(阳性探针)。该操作方案是手动运行的。
使用半定量方法对每个靶标使用双重评分系统评估标记的组织。
组织分布评分系统的范围是0到3，代表群体(免疫浸润物)中阳性细胞的程度以及认为是免疫评分。
免疫评分等级系统：范围从0到3，如下所示：
·0：不存在
·1：低
·2：中等
·3：高
ACD等级系统，即由
2.5Assay制造商(Advanced Cell Diagnostics，Hayward，CA)推荐的等级系统，用于估算细胞内RNA点的数量。每个点代表一个RNA分子，因为RNAscope检测单个RNA分子。该系统的范围从0到4不等，与细胞质中点和/或簇的数量相关(0：无点；4：许多点和簇)，可以被认为是细胞内评分系统。
结果
肺SCC TMA
分析了三个肺SCC TMA。对每个患者都呈现一式三份的核心(core)。
表9
| 分析的样本 | QC前 | QC之后 |
| 患者数量 | 55 | 37 |
| 核心的数量 | 165 | 68 |
VISTA和PSGL-1mRNA的标记大多在肿瘤微环境(免疫细胞浸润物)中观察到。阳性标记的细胞显示出髓样形态(与巨噬细胞有关)。但是，偶尔会在淋巴细胞(两个mRNA)和嗜中性粒细胞(仅VISTA)中注意到一些阳性点。
VISTA mRNA主要在肿瘤微环境浸润物中。所有肺SCC核心都在一定程度上表达该靶点。在细胞质内点显得小而众多。偶尔，内皮细胞会显示VISTA点。在超过80％的核心中观察到阳性mRNA VISTA肿瘤细胞。
与VISTA相比，肿瘤微环境浸润内PSGL-1 mRNA表达较低。在细胞质内，PSGL-1mRNA的点与VISTA的点相比更大但更少。肿瘤细胞偶尔表达PSGL-1 mRNA(核心的30％)；在大多数情况下，ACD等级(即，细胞质内的点数)非常低。
与PSGL-1 mRNA的35％相比，几乎所有核心都显示中度至高度的阳性VISTA-mRNA标记。没有一个核心对两个靶标均表现为阴性，即每个核心或者对VISTA、PSGL-1阳性，或者对两者均呈阳性。结果总结在表10中。
表10
结论：
·在肿瘤微环境中观察到了VISTA和PSGL-1 mRNA的共定位，其一个示例如图12所示；
·几乎所有PSGL1阳性细胞都与VISTA阳性细胞相邻；
·在每个核心中，至少观察到一些细胞同时表达PSGL-1和VISTA。
·可以观察到没有相邻的PSGL-1阳性细胞的VISTA阳性细胞。可以观察到一些VISTA阳性细胞没有明显相邻的PSGL-1阳性细胞。然而，观察到没有不与VISTA阳性细胞相邻的PSGL-1阳性细胞，这意味着PSGL-1阳性细胞通常与VISTA阳性细胞相邻。部分原因是由于VISTA阳性细胞在免疫浸润物中占主导地位。
肺ADKTMA
分析了三种肺ADK TMA。对每个患者都呈现一式四份的核心。
表11
| 分析样本 | QC之前 | QC之后 |
| 患者数量 | 31 | 25 |
| 核心的数量 | 124 | 61 |
至于肺SCC，在肿瘤微环境(免疫细胞浸润物)中注意到VISTA和PSGL-1 mRNA标记。阳性标记细胞显示出髓样形态(与巨噬细胞有关)。但是，在淋巴细胞(为两者的靶标)和嗜中性粒细胞(仅VISTA)中偶尔发现一些阳性点。
在肺ADK中的VISTA和PSGL-1的表达模式与在肺SCC中观察到的非常相似。
超过50％的核心显示VISTA mRNA的高阳性标记，而约50％的核心显示阳性PSGL1mRNA标记。对于PSGL-1，一些核心显示为阴性(7％)。结果总结在表12中。
表12
在肺ADK中观察到的VISTA和PSGL-1 mRNA之间的共定位或关系模式与肺SCC中相似。
通过双重RNAscope对VISTA和PSGL-1 mRNA表达模式的半定量分析显示，在肿瘤微环境中靶标经常在相邻细胞内共定位或表达。VISTA mRNA似乎比PSGL1表达更多。但是，所有肺SCC核心和83％的肺ADK核心都表达了两个靶标。
RNAscope显示可以在与表达VISTA的细胞相同的细胞或附近表达PSGL-1。
实施例VIII
在PSGL-1Fc+/-抗VISTA或抗PSGL1抗体存在下从CD4+T细胞中释放IL-2(72h)
该实施例描述了PSGL-1介导的对T细胞活化的抑制。
方法：
实验一式三份进行。
通过使用Milenyi Kits进行负选择，从两名人健康供体中分离出CD4+T细胞。
将抗CD3抗体(由eBiosciences商业化，BioxCell ref BE0001-2克隆OKT3批号640417J1(mIgG2a))在100ul中以2.5μg/ml的浓度，在37℃下放置4小时以包被在96孔板中。然后将板用PBS洗涤2次。将C9G4抗体和PSGL-1-Fc融合蛋白在4℃下以在100μl中224nM的浓度一式三份包被过夜。
将板用PBS洗涤4次。如WO 2014/197849中所述，将100.000CD4+T细胞添加到含有200μl介质的每个孔中，所述介质含有抗CD28抗体(2.5μg/ml)以及具有或没有抗VISTA抗体26A(10μg/ml)(更具体地，所使用的抗体是具有以下CDR序列的人源化抗体：CDRH1：SEQ IDN°1297，CDRH2：SEQ ID N°1559，CDRH3：SEQ ID N°1394，CDRL1：SEQ ID N°1432，CDRL2：SEQID N°1477和CDRL3：SEQ ID N°1499或对照抗体C9G4(描述见于WO 2015/162292A))。
孵育72小时后，除去上清液，并以1200rpm旋转5分钟。离心后，将上清液转移至新的96孔板中，并于-80℃冷冻直至测定IL-2。
使用商业试剂盒(BDTMCBA Human IL2 Flex Set，Ref#558270)测量上清液中的IL-2浓度。
结果：
为测试PSGL-1的免疫抑制特性，在存在或不存在蛋白质的刺激下检查T细胞的活化状态。为此，首先工程改造PSGL-1-Fc融合蛋白，其由PSGL-1的细胞外结构域和人IgG的Fc区组成。然后，在存在PSGL-1-Fc或对照IgG的情况下，使用抗CD3抗体和CD28活化CD4+T细胞。监测IL-2的释放，作为这些细胞活化的标志物。
如图13所示，与对照(即，以相同浓度包被的无关蛋白(c9G4))相比，在PSGL-1存在下孵育T细胞触发IL-2释放(T细胞活化的标志物)减少2倍。对于两个不同的供体，获得的结果相似。因此，PSGL-1抑制T细胞活化。
添加抗VISTA抗体可部分逆转这种抑制(参见图13)。实际上，通过抗VISTA抗体可缓解50％以上的抑制作用。加入对照抗体(c9G4)不会影响PSGL1-Fc抑制IL-2释放，强调了用抗VISTA抗体观察到的效果的特异性。添加抗VISTA抗体后的这种特异性逆转表明，PSGL-1依赖性T细胞活化抑制至少部分由VISTA介导。
这些结果证实VISTA和PSGL1在物理和功能上都相互作用。这种相互作用的破坏(此处是抗VISTA抗体)增强IL-2的释放，从而使得T细胞活化。
序列表
<110> 皮埃尔法布雷医药公司
P·费尔
F·克吕扎勒圭
N·洛科利
<120> VISTA受体
<130> B3764799PCTD38601
<150> PCT IB2018/000983
<151> 2018-07-20
<160> 40
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 311
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala
20 25 30
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
50 55 60
Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp
85 90 95
Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp
100 105 110
Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
115 120 125
Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
130 135 140
Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val
145 150 155 160
His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser
165 170 175
Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Thr
180 185 190
Ala Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Cys Ile Val Gly Ile Leu Cys Leu
195 200 205
Pro Leu Ile Leu Leu Leu Val Tyr Lys Gln Arg Gln Ala Ala Ser Asn
210 215 220
Arg Arg Ala Gln Glu Leu Val Arg Met Asp Ser Asn Ile Gln Gly Ile
225 230 235 240
Glu Asn Pro Gly Phe Glu Ala Ser Pro Pro Ala Gln Gly Ile Pro Glu
245 250 255
Ala Lys Val Arg His Pro Leu Ser Tyr Val Ala Gln Arg Gln Pro Ser
260 265 270
Glu Ser Gly Arg His Leu Leu Ser Glu Pro Ser Thr Pro Leu Ser Pro
275 280 285
Pro Gly Pro Gly Asp Val Phe Phe Pro Ser Leu Asp Pro Val Pro Asp
290 295 300
Ser Pro Asn Phe Glu Val Ile
305 310
<210> 2
<211> 936
<212> DNA
<213> ?
<400> 2
atgggcgtcc ccacggccct ggaggccggc agctggcgct ggggatccct gctcttcgct 60
ctcttcctgg ctgcgtccct aggtccggtg gcagccttca aggtcgccac gccgtattcc 120
ctgtatgtct gtcccgaggg gcagaacgtc accctcacct gcaggctctt gggccctgtg 180
gacaaagggc acgatgtgac cttctacaag acgtggtacc gcagctcgag gggcgaggtg 240
cagacctgct cagagcgccg gcccatccgc aacctcacgt tccaggacct tcacctgcac 300
catggaggcc accaggctgc caacaccagc cacgacctgg ctcagcgcca cgggctggag 360
tcggcctccg accaccatgg caacttctcc atcaccatgc gcaacctgac cctgctggat 420
agcggcctct actgctgcct ggtggtggag atcaggcacc accactcgga gcacagggtc 480
catggtgcca tggagctgca ggtgcagaca ggcaaagatg caccatccaa ctgtgtggtg 540
tacccatcct cctcccagga tagtgaaaac atcacggctg cagccctggc tacgggtgcc 600
tgcatcgtag gaatcctctg cctccccctc atcctgctcc tggtctacaa gcaaaggcag 660
gcagcctcca accgccgtgc ccaggagctg gtgcggatgg acagcaacat tcaagggatt 720
gaaaaccccg gctttgaagc ctcaccacct gcccagggga tacccgaggc caaagtcagg 780
caccccctgt cctatgtggc ccagcggcag ccttctgagt ctgggcggca tctgctttcg 840
gagcccagca cccccctgtc tcctccaggc cccggagacg tcttcttccc atccctggac 900
cctgtccctg actctccaaa ctttgaggtc atctag 936
<210> 3
<211> 402
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu
20 25 30
Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr
35 40 45
Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg
50 55 60
Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser
65 70 75 80
Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly
85 90 95
Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu
100 105 110
Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala
115 120 125
Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr
130 135 140
Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu
145 150 155 160
Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro
165 170 175
Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln
180 185 190
Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala
195 200 205
Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu
225 230 235 240
Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro
245 250 255
Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu
260 265 270
Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met
275 280 285
Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro Val Gly Ala Pro Asp His
290 295 300
Ile Ser Val Lys Gln Cys Leu Leu Ala Ile Leu Ile Leu Ala Leu Val
305 310 315 320
Ala Thr Ile Phe Phe Val Cys Thr Val Val Leu Ala Val Arg Leu Ser
325 330 335
Arg Lys Gly His Met Tyr Pro Val Arg Asn Tyr Ser Pro Thr Glu Met
340 345 350
Val Cys Ile Ser Ser Leu Leu Pro Asp Gly Gly Glu Gly Pro Ser Ala
355 360 365
Thr Ala Asn Gly Gly Leu Ser Lys Ala Lys Ser Pro Gly Leu Thr Pro
370 375 380
Glu Pro Arg Glu Asp Arg Glu Gly Asp Asp Leu Thr Leu His Ser Phe
385 390 395 400
Leu Pro
<210> 4
<211> 2226
<212> DNA
<213> 智人
<400> 4
atggggtgtg ggctgtcaca tggccctgcc taagtaacca cattctcgct tcctccttcc 60
acacacagcc attgggggtt gctcggatcc gggactgccg cagggggtgc cacagcagtg 120
cctggcagcg tgggctggga ccttgtcact aaagcagaga agccacttct tctgggccca 180
cgaggcagct gtcccatgct ctgctgagca cggtggtgcc atgcctctgc aactcctcct 240
gttgctgatc ctactgggcc ctggcaacag cttgcagctg tgggacacct gggcagatga 300
agccgagaaa gccttgggtc ccctgcttgc ccgggaccgg agacaggcca ccgaatatga 360
gtacctagat tatgatttcc tgccagaaac ggagcctcca gaaatgctga ggaacagcac 420
tgacaccact cctctgactg ggcctggaac ccctgagtct accactgtgg agcctgctgc 480
aaggcgttct actggcctgg atgcaggagg ggcagtcaca gagctgacca cggagctggc 540
caacatgggg aacctgtcca cggattcagc agctatggag atacagacca ctcaaccagc 600
agccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacaa ctcgactgac 660
ggccacggag gcacagacca ctccactggc agccacagag gcacagacca ctccaccagc 720
agccacggaa gcacagacca ctcaacccac aggcctggag gcacagacca ctgcaccagc 780
agccatggag gcacagacca ctgcaccagc agccatggaa gcacagacca ctccaccagc 840
agccatggag gcacagacca ctcaaaccac agccatggag gcacagacca ctgcaccaga 900
agccacggag gcacagacca ctcaacccac agccacggag gcacagacca ctccactggc 960
agccatggag gccctgtcca cagaacccag tgccacagag gccctgtcca tggaacctac 1020
taccaaaaga ggtctgttca tacccttttc tgtgtcctct gttactcaca agggcattcc 1080
catggcagcc agcaatttgt ccgtcaacta cccagtgggg gccccagacc acatctctgt 1140
gaagcagtgc ctgctggcca tcctaatctt ggcgctggtg gccactatct tcttcgtgtg 1200
cactgtggtg ctggcggtcc gcctctcccg caagggccac atgtaccccg tgcgtaatta 1260
ctcccccacc gagatggtct gcatctcatc cctgttgcct gatgggggtg aggggccctc 1320
tgccacagcc aatgggggcc tgtccaaggc caagagcccg ggcctgacgc cagagcccag 1380
ggaggaccgt gagggggatg acctcaccct gcacagcttc ctcccttagc tcactctgcc 1440
atctgttttg gcaagacccc acctccacgg gctctcctgg gccacccctg agtgcccaga 1500
ccccattcca cagctctggg cttcctcgga gacccctggg gatggggatc ttcagggaag 1560
gaactctggc cacccaaaca ggacaagagc agcctggggc caagcagacg ggcaagtgga 1620
gccacctctt tcctccctcc gcggatgaag cccagccaca tttcagccga ggtccaaggc 1680
aggaggccat ttacttgaga cagattctct cctttttcct gtcccccatc ttctctgggt 1740
ccctctaaca tctcccatgg ctctccccgc ttctcctggt cactggagtc tcctccccat 1800
gtacccaagg aagatggagc tcccccatcc cacacgcact gcactgccat tgtcttttgg 1860
ttgccatggt caccaaacag gaagtggaca ttctaaggga ggagtactga agagtgacgg 1920
acttctgagg ctgtttcctg ctgctcctct gacttggggc agcttgggtc ttcttgggca 1980
cctctctggg aaaacccagg gtgaggttca gcctgtgagg gctgggatgg gtttcgtggg 2040
cccaagggca gacctttctt tgggactgtg tggaccaagg agcttccatc tagtgacaag 2100
tgacccccag ctatcgcctc ttgccttccc ctgtggccac tttccagggt ggactctgtc 2160
ttgttcactg cagtatccca actgcaggtc cagtgcaggc aataaatatg tgatggacaa 2220
acgata 2226
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 5
Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn
1 5 10
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 6
Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr Thr
1 5
<210> 7
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 7
Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr
1 5
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
Thr Gly Tyr Thr Met Asn
1 5
<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 10
Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 11
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 11
Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr
1 5
<210> 12
<211> 4
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
Pro Tyr Asn Gly
1
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 13
Trp Ile Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 14
Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 15
Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 16
Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 17
Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp
1 5
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 18
Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp
1 5 10
<210> 19
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 19
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 20
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 20
Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 21
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 21
Ser Ser Ser Val Ser Tyr
1 5
<210> 22
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 22
Ser Tyr Met Tyr Trp Tyr
1 5
<210> 23
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 23
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 24
<211> 3
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 24
Asp Thr Ser
1
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 25
Leu Leu Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 26
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 27
Trp Ser Ser Tyr Pro Phe
1 5
<210> 28
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 28
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe
1 5
<210> 29
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 29
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 30
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 30
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Arg Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Leu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Phe Thr
85 90 95
Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 31
Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 32
Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr
1 5
<210> 33
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 33
Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 34
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 34
Trp Ile Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser
1 5 10
<210> 35
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 35
Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser
1 5 10
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 36
Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Val Lys Asn Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Leu Ile Ser Pro Tyr Asp Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Ala Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 1260
<212> DNA
<213> 人工
<220>
<223> VISTA-Fc 融合蛋白
<400> 37
atgggcgtgc ccacagccct ggaagctggc agctggaggt ggggaagcct gctgttcgcc 60
ctgtttctgg ccgcctccct gggacctgtg gccgccttta aggtcgccac cccttacagc 120
ctgtacgtgt gccccgaggg ccagaacgtg accctgacct gcagactgct gggccctgtg 180
gacaagggcc acgacgtgac cttctacaag acctggtaca ggagcagcag gggcgaggtc 240
cagacctgca gcgagaggag gcccatcagg aacctgacct tccaggacct gcacctgcac 300
cacggaggcc atcaggccgc caacacctcc cacgacctgg ctcagaggca cggactggag 360
agcgccagcg atcaccacgg caacttcagc atcaccatga ggaacctcac cctgctggac 420
agcggcctgt actgttgcct ggtggtggag atcaggcacc accacagcga gcacagagtg 480
cacggcgcca tggaactgca ggtgcagacc ggaaaggacg cccccagcaa ctgcgtggtg 540
taccccagca gctcccagga cagcgagaac atcaccgccg ccagatctgt ggagtgccca 600
ccttgcccag caccacctgt ggcaggacct tcagtcttcc tcttcccccc aaaacccaag 660
gacaccctca tgatctcccg gacccctgag gtcacatgcg tggtggtgga cgtgagccac 720
gaagaccctg aggtcaagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag 780
acaaagccgc gggaggagca gtacaacagc acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc 840
ctgcaccagg actggctgaa tggcaaggag tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc 900
ccatcctcca tcgagaaaac catctccaaa gccaaagggc agccccgaga accacaggtg 960
tacaccctgc ccccatcccg ggaggagatg accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg 1020
gtcaaaggct tctatcccag cgacatcgcc gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag 1080
aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg gactccgacg gctccttctt cctctacagc 1140
aagctcaccg tggacaagag caggtggcag caggggaacg tcttctcatg ctccgtgatg 1200
catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag aagagcctct ccctgtctcc gggtaaatga 1260
<210> 38
<211> 416
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> VISTA-Fc 融合蛋白
<400> 38
Met Gly Val Pro Thr Ala Leu Glu Ala Gly Ser Trp Arg Trp Gly Ser
1 5 10 15
Leu Leu Phe Ala Leu Phe Leu Ala Ala Ser Leu Gly Pro Val Ala Ala
20 25 30
Phe Lys Val Ala Thr Pro Tyr Ser Leu Tyr Val Cys Pro Glu Gly Gln
35 40 45
Asn Val Thr Leu Thr Cys Arg Leu Leu Gly Pro Val Asp Lys Gly His
50 55 60
Asp Val Thr Phe Tyr Lys Thr Trp Tyr Arg Ser Ser Arg Gly Glu Val
65 70 75 80
Gln Thr Cys Ser Glu Arg Arg Pro Ile Arg Asn Leu Thr Phe Gln Asp
85 90 95
Leu His Leu His His Gly Gly His Gln Ala Ala Asn Thr Ser His Asp
100 105 110
Leu Ala Gln Arg His Gly Leu Glu Ser Ala Ser Asp His His Gly Asn
115 120 125
Phe Ser Ile Thr Met Arg Asn Leu Thr Leu Leu Asp Ser Gly Leu Tyr
130 135 140
Cys Cys Leu Val Val Glu Ile Arg His His His Ser Glu His Arg Val
145 150 155 160
His Gly Ala Met Glu Leu Gln Val Gln Thr Gly Lys Asp Ala Pro Ser
165 170 175
Asn Cys Val Val Tyr Pro Ser Ser Ser Gln Asp Ser Glu Asn Ile Arg
180 185 190
Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser
195 200 205
Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg
210 215 220
Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro
225 230 235 240
Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala
245 250 255
Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val
260 265 270
Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr
275 280 285
Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr
290 295 300
Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu
305 310 315 320
Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys
325 330 335
Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser
340 345 350
Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp
355 360 365
Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser
370 375 380
Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala
385 390 395 400
Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
405 410 415
<210> 39
<211> 521
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Fc-融合的PSGL-1，具有IgG κ信号序列和前肽序列
<400> 39
Met Pro Leu Gln Leu Leu Leu Leu Leu Ile Leu Leu Gly Pro Gly Asn
1 5 10 15
Ser Leu Gln Leu Trp Asp Thr Trp Ala Asp Glu Ala Glu Lys Ala Leu
20 25 30
Gly Pro Leu Leu Ala Arg Asp Arg Arg Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr
35 40 45
Leu Asp Tyr Asp Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg
50 55 60
Asn Ser Thr Asp Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser
65 70 75 80
Thr Thr Val Glu Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly
85 90 95
Gly Ala Val Thr Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu
100 105 110
Ser Thr Asp Ser Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala
115 120 125
Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr
130 135 140
Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Thr Glu
145 150 155 160
Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro
165 170 175
Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln
180 185 190
Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala
195 200 205
Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr
210 215 220
Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Ala Thr Glu
225 230 235 240
Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu Ala Leu Ser Thr Glu Pro
245 250 255
Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro Thr Thr Lys Arg Gly Leu
260 265 270
Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr His Lys Gly Ile Pro Met
275 280 285
Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Ala Arg Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys
290 295 300
Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys
305 310 315 320
Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val
325 330 335
Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr
340 345 350
Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu
355 360 365
Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His
370 375 380
Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys
385 390 395 400
Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln
405 410 415
Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met
420 425 430
Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro
435 440 445
Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn
450 455 460
Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu
465 470 475 480
Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val
485 490 495
Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln
500 505 510
Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520
<210> 40
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工
<220>
<223> Fc-融合的PSGL-1，具有IgGκ信号序列和串联重复单元
<400> 40
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Gln Ala Thr Glu Tyr Glu Tyr Leu Asp Tyr Asp
20 25 30
Phe Leu Pro Glu Thr Glu Pro Pro Glu Met Leu Arg Asn Ser Thr Asp
35 40 45
Thr Thr Pro Leu Thr Gly Pro Gly Thr Pro Glu Ser Thr Thr Val Glu
50 55 60
Pro Ala Ala Arg Arg Ser Thr Gly Leu Asp Ala Gly Gly Ala Val Thr
65 70 75 80
Glu Leu Thr Thr Glu Leu Ala Asn Met Gly Asn Leu Ser Thr Asp Ser
85 90 95
Ala Ala Met Glu Ile Gln Thr Thr Gln Pro Ala Ala Thr Glu Ala Gln
100 105 110
Thr Thr Gln Pro Val Pro Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala
115 120 125
Thr Glu Ala Gln Thr Thr Arg Leu Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr
130 135 140
Pro Leu Ala Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Pro Ala Ala Thr Glu
145 150 155 160
Ala Gln Thr Thr Gln Pro Thr Gly Leu Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro
165 170 175
Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln
180 185 190
Thr Thr Pro Pro Ala Ala Met Glu Ala Gln Thr Thr Gln Thr Thr Ala
195 200 205
Met Glu Ala Gln Thr Thr Ala Pro Glu Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr
210 215 220
Gln Pro Thr Ala Thr Glu Ala Gln Thr Thr Pro Leu Ala Ala Met Glu
225 230 235 240
Ala Leu Ser Thr Glu Pro Ser Ala Thr Glu Ala Leu Ser Met Glu Pro
245 250 255
Thr Thr Lys Arg Gly Leu Phe Ile Pro Phe Ser Val Ser Ser Val Thr
260 265 270
His Lys Gly Ile Pro Met Ala Ala Ser Asn Leu Ser Val Asn Tyr Pro
275 280 285
Val Gly Ala Pro Asp His Ile Ser Val Ala Arg Ser Val Glu Cys Pro
290 295 300
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
305 310 315 320
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr
325 330 335
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
340 345 350
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
355 360 365
Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
370 375 380
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
385 390 395 400
Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
405 410 415
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu
420 425 430
Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
435 440 445
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
450 455 460
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
465 470 475 480
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
485 490 495
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
500 505 510
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
515 520
Claims (26)
1.一种用于体外诊断受试者中VISTA介导的肿瘤的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述受试者的生物样本与能够特异性结合PSGL-1核酸或蛋白质的试剂接触；以及
b)定量所述试剂与所述生物样本的结合，从而确定在所述样本中PSGL-1的表达水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述试剂选自DNA探针、RNA探针和抗PSGL-1抗体。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的方法，其中定量肿瘤微环境的免疫浸润物中的PSGL-1的结合。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其进一步包括通过将步骤(B)的水平与基于两个参数的合适量表进行比较从而对肿瘤进行评分的步骤，所述两个参数是染色强度和阳性细胞的百分比。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，还包括将步骤b)的表达水平与参考水平进行比较的步骤，其中与参考水平相比，步骤(b)中的PSGL-1的测定水平增加指示为VISTA介导的肿瘤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述参考水平是正常组织样本中PSGL-1的表达水平。
7.根据权利要求5或6中任一项所述的方法，其中：
·步骤a)还包括测量所述生物样本中的所述免疫浸润物的VISTA、CD11b、CD33、CD4和CD8中至少一种的表达水平；以及
·步骤b)包括将步骤a)的表达水平与对照水平进行比较，
与PSGL-1和/或VISTA、CD11b、CD33、CD4或CD8的对照水平相比，PSGL-1和/或VISTA、CD11b、CD33、CD4或CD8的测定水平增加指示为VISTA介导的癌症。
8.根据权利要求5至7中任一项所述的方法，其中所述VISTA介导的肿瘤选自：血液癌症(例如，白血病、淋巴瘤、或骨髓瘤)、膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、结缔组织癌、直肠癌、胃癌、食道癌、肺癌、喉癌、肾癌、口腔癌、卵巢癌、或前列腺癌、或肉瘤、黑素瘤、或神经胶质瘤、或这些癌症中任何一种的转移。
9.一种抗VISTA治疗剂用于治疗患者中的VISTA介导的癌症中的用途，所述用途包括根据权利要求1至8所述诊断所述患者的所述VISTA介导的癌症的在先步骤。
10.根据权利要求9所述的抗VISTA治疗剂的用途，其中所述试剂是抗VISTA抗体。
11.根据权利要求10所述的抗VISTA治疗剂的用途，其中所述抗VISTA抗体选自：
a)抗VISTA抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含由Kabat定义的序列SEQ ISNO:1296、1354和1393的3个CDR；以及所述轻链包含由Kabat定义的序列SEQ IS NO:1432、1477和1499的3个CDR；以及
b)抗VISTA抗体，所述抗体包含重链和轻链，所述重链包含由Kabat定义的序列SEQ ISNO:1296、1559和1393的3个CDR；以及所述轻链包含由Kabat定义的序列SEQ IS NO:1432、1633和1499的3个CDR。
12.根据权利要求10所述的抗VISTA治疗剂的用途，其中所述抗VISTA抗体是人源化的抗体。
13.根据权利要求9至12中任一项所述的抗VISTA治疗剂的用途，还包括调整使用抗VISTA治疗剂治疗的步骤，其中所述调整治疗是：
-如果所述患者已诊断出对抗VISTA治疗剂无应答，则减少或抑制所述抗VISTA治疗剂治疗，或
-如果所述患者已经诊断出对抗VISTA治疗剂有应答，则继续所述抗VISTA治疗剂治疗。
14.一种抗体，其激动或拮抗VISTA和PSGL-1的相互作用。
15.根据权利要求14所述的抗体，其是激动性抗PSGL-1抗体或抗体片段。
16.根据权利要求14所述的抗体，其是拮抗性抗PSGL-1抗体或抗体片段。
17.根据权利要求16所述的抗体，所述抗体能够抑制或阻断PSGL-1与VISTA的细胞外结构域的结合。
18.根据权利要求16所述的抗体，所述抗体能够抑制或阻断表达VISTA的细胞与表达PSGL-1的T细胞的结合。
19.根据权利要求18所述的抗体，其中所述表达VISTA的细胞是髓样细胞、树突状细胞、巨噬细胞或T细胞。
20.根据权利要求18或19中任一项所述的抗体，其中所述表达VISTA的细胞是肿瘤细胞。
21.根据权利要求18至20中任一项所述的抗体，其中所述表达PSGL-1的细胞是T细胞。
22.根据权利要求14至21中任一项所述的抗体，其中所述抗体不阻断或抑制PSGL-1与P-选择蛋白、L-选择蛋白或E-选择蛋白的结合。
23.一种药物组合物，其包含权利要求14至22中任一项所述的抗体和生理上可接受的载体、赋形剂和/或稳定剂。
24.根据权利要求23所述的药物组合物，其进一步包含针对共抑制分子的拮抗剂、或针对共刺激分子的激动剂。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其中所述拮抗剂是针对共抑制分子的抗体。
26.根据权利要求24或25中任一项所述的药物组合物，其中所述共抑制分子选自CD86、CD80、PDL-1、PDL-2、CTLA-4、PD1、LAG3、BTNL2、B7-H3、B7-H4、嗜乳脂蛋白、CD48、CD244、TIM-3、CD200R、CD200、CD160、BTLA、HVEM、LAIR1、TIM1、半乳糖蛋白9、TIM3、CD48、2B4、CD155、CD112、CD113和TIGIT。
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