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CN112739721B - 一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体 - Google Patents

一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体 Download PDF

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CN112739721B CN202080002988.9A CN202080002988A CN112739721B CN 112739721 B CN112739721 B CN 112739721B CN 202080002988 A CN202080002988 A CN 202080002988A CN 112739721 B CN112739721 B CN 112739721B
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Abstract

一种靶向BCMA的抗原结合蛋白，尤其涉及一种包含该抗原结合蛋白的嵌合抗原受体，及其应用。该嵌合抗原受体包含靶向BCMA的胞外域、跨膜域和胞内结构域。该嵌合抗原受体在以BCMA作为靶点的CAR‑T疗法中对肿瘤细胞具有良好的杀伤效果。

Description

一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体
技术领域
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种靶向BCMA的结合结构域，以及包含靶向BCMA的结合结构域的嵌合抗原受体。
背景技术
近年来，随着肿瘤免疫疗法和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞(ChimericAntigen Receptor-T cells，CAR-T)免疫疗法目前是最有前途的肿瘤免疫疗法之一。CAR-T疗法是一种转基因细胞疗法。通过将嵌合抗原受体(CAR)基因转入T细胞，赋予T细胞识别和杀伤靶细胞的能力。CAR是模拟TCR功能的人工受体，是CAR-T的核心部件，CAR的结构主要包括：一个抗原结合区(通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段)、铰链区、跨膜域、共刺激域和激活域。细胞外的scFv结构域在结合表达于靶细胞表面的靶蛋白以后，激活了CAR结构的共刺激域和激活域。CAR-T同时具备激活信号和共激活信号，因此可以在杀伤肿瘤的同时高效的扩增。CAR-T细胞疗法的有效性依赖于识别抗原的抗体的特异性以及抗原结合的亲和力高低等性质。
B细胞成熟抗原(B-cell maturation antigen,BCMA)，又称为CD269或TNFRSF13(tumornecrosis factor receptor superfamily member17)，是肿瘤坏死因子受体(TNF)超家族的成员，由185个氨基酸残基组成的Ⅲ型跨膜蛋白。BCMA可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)，BCMA与其配体结合后，可激活B细胞的增殖和存活。作为一种极为重要的B细胞生物标志物，主要表达于成熟B淋巴细胞和浆细胞表面。BCMA的RNA在MM细胞中普遍检测到，多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面一般可检测到BCMA蛋白。据报道，在正常细胞中，BCMA主要由浆细胞和一部分成熟B细胞表达，而在大部分B细胞以及其它器官上都不表达。因此，BCMA非常适合作为CAR-T治疗多发性骨髓瘤的靶点。以BCMA作为靶点的CAR-T疗法已经在开展临床研究，并且取得了很好的临床疗效(Noopur Raje et al.N EnglJ Med.380:1726-1737(2019)；Jie Xu et al.PNAS.116(19):9543-9551(2019))。
目前的CAR T疗法通常以来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFv段作为抗原结合区。细胞外的scFv结构域在结合表达于靶细胞表面的靶蛋白以后，可以激活CAR结构的共刺激域和激活域。但是scFv分子量比较大而且容易形成多聚体，影响CAR的功能。因此，需要包含新结构的抗原结合区的CAR。
发明内容
本申请开发了一种针对BCMA的特异性单域抗体；并且本申请利用基因工程手段设计了特异性单域抗体作为CAR的抗原结合区进行CAR修饰及CAR-T细胞疗法，提出了一种基于单域抗体的特异性嵌合抗原受体(CAR)，其包括靶点结合结构域(胞外域)、跨膜结构域、一个或多个共刺激结构域、以及胞内信号传导结构域，其中所述胞外结构域是能结合人BCMA的抗原结合片段。单域抗体虽然结构简单，但仍然可以达到与传统抗体相当甚至更高的与特异抗原结合的亲和力。相比于传统抗体，单域抗体具有分子量小、稳定性强、易于重组表达等优点。单域抗体单个重链抗体可变区(VHH)是能完整结合抗原的单个功能域抗体片段，可在无需轻链的帮助下，对抗原具有高亲和力。VHH结构简单，被称为最小的功能性抗原结合片段，因高特异性、高亲和力、免疫原性低、渗透性好，在进行肿瘤治疗时具有接触到不能被常规抗体接触的较为隐蔽靶点的可能性。本申请的BCMA单域抗体亲和力高，部分抗体的亲和力达到10-11级别。由这些高亲和力单域抗体改造构建成的CAR-T细胞对靶细胞有更强的结合能力。此外，本申请的高亲和力BCMA CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效果要优于使用scFv构建的对照CAR-T细胞。
一方面，本申请提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含靶向部分，其中所述靶向部分包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中所述CDR1包含SEQ ID NO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CDR2包含SEQ ID NO:24、27、30、33、36和39中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CDR3包含SEQ ID NO:25、28、31、34、37和40中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自下组中任意一组的序列：
a)CDR1：SEQ ID NO:23，CDR2：SEQ ID NO:24，和CDR3：SEQ ID NO:25；
b)CDR1：SEQ ID NO:26，CDR2：SEQ ID NO:27，和CDR3：SEQ ID NO:28；
c)CDR1：SEQ ID NO:29，CDR2：SEQ ID NO:30，和CDR3：SEQ ID NO:31；
d)CDR1：SEQ ID NO:32，CDR2：SEQ ID NO:33，和CDR3：SEQ ID NO:34；
e)CDR1：SEQ ID NO:35，CDR2：SEQ ID NO:36，和CDR3：SEQ ID NO:37；和，
f)CDR1：SEQ ID NO:38，CDR2：SEQ ID NO:39，和CDR3：SEQ ID NO:40。
在某些实施方式中，所述靶向部分包括VHH。
在某些实施方式中，所述靶向部分包含SEQ ID NO:1-6和41-46中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括跨膜域，所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。
在某些实施方式中，所述跨膜域包含源自CD8的跨膜域。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括胞内共刺激信号传导结构域，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
在某些实施方式中，所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包括胞内信号转导结构域，所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FcεRIγ、FcεRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
在某些实施方式中，所述胞内信号转导结构域包含源自CD3的信号传导结构域。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8 alpha、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、CD40L、TIM1、CD226、SLAM、CD30和LIGHT。
在某些实施方式中，所述铰链区包含源自CD8的铰链区。
在某些实施方式中，所述的嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:7-12和53-58中任一项所示的氨基酸序列。
另一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白，其包含互补决定区1(CDR1)、互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，其中所述CDR1包含SEQ ID NO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CDR2包含SEQ ID NO：24、27、30、33、36和39中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述CDR3包含SEQ ID NO：25、28、31、34、37和40中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，分离的抗原结合蛋白包括抗体或其抗原结合片段。
在某些实施方式中，所述抗原结合片段包括Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv,VHH和/或sdAb。
在某些实施方式中，所述抗体选自下组：单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
在某些实施方式中，所述CDR1、CDR2和CDR3包含选自下组中任意一组的序列：
a)CDR1：SEQ ID NO:23，CDR2：SEQ ID NO:24，和CDR3：SEQ ID NO:25；
b)CDR1：SEQ ID NO:26，CDR2：SEQ ID NO:27，和CDR3：SEQ ID NO:28；
c)CDR1：SEQ ID NO:29，CDR2：SEQ ID NO:30，和CDR3：SEQ ID NO:31；
d)CDR1：SEQ ID NO:32，CDR2：SEQ ID NO:33，和CDR3：SEQ ID NO:34；
e)CDR1：SEQ ID NO:35，CDR2：SEQ ID NO:36，和CDR3：SEQ ID NO:37；和，
f)CDR1：SEQ ID NO:38，CDR2：SEQ ID NO:39，和CDR3：SEQ ID NO:40。
在某些实施方式中，所述分离的抗原结合蛋白包括VHH。
在某些实施方式中，所述的抗原结合蛋白包括SEQ ID NO:1-6和41-46中任一项所示的氨基酸序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括Fc序列。
在某些实施方式中，所述的分离的抗原结合蛋白包括单域抗体。
另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码所述的嵌合抗原受体和/或所述的抗原结合蛋白。
在某些实施方式中，所述编码所述抗原结合蛋白的分离的核酸分子包含SEQ IDNO:47-52中任一项所示的核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述的编码所述嵌合抗原受体的分离的核酸分子包含SEQ IDNO:14-19和59-64中任一项所示的核苷酸序列。
另一方面，本申请提供了载体，其包含所述的分离的核酸分子。
在某些实施方式中，所述的载体为病毒载体。
在某些实施方式中，所述的载体为慢病毒载体。
另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，和/或所述的载体。
在某些实施方式中，所述的细胞包括免疫细胞。
在某些实施方式中，所述的细胞包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞(NK细胞)、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包含所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，所述的细胞和/或药学上可接受的载剂。
另一方面，本申请提供了所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。
在某些实施方式中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症包括多发性骨髓瘤。
另一方面，本申请提供了预防或治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞。
在某些实施方式中，所述与BCMA的表达相关的疾病或病症包括多发性骨髓瘤。
本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。
附图说明
本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：
图1显示的是本申请所述嵌合抗原受体的基本结构示意图，该CAR含有依次连接的信号肽、抗BCMA单域抗体、铰链区、跨膜域和胞内区。
图2显示的是BCMA-CAR-T与靶细胞U266、K562.BCMA、K562和293T共培养后检测上清中IL-2的分泌。
图3显示的是BCMA-CAR-T与靶细胞U266、K562.BCMA、K562和293T共培养后检测上清中IFN-γ的分泌。
图4显示的是抗BCMA CAR-T细胞识别肿瘤细胞后，IL-2细胞因子的分泌情况
图5显示的是抗BCMA CAR-T细胞识别肿瘤细胞后，IFN-γ细胞因子的分泌情况。
图6显示的是抗BCMA CAR-T细胞在动物体内的抗肿瘤活性。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。
术语定义
在本申请中，术语“BCMA”可与“CD269”、“BCM”“TNFRSF17”互换使用，通常是指B细胞成熟抗原。例如，人BCMA通常是由994个核苷酸长的初级mRNA转录物(NM_001192.2)编码的184个氨基酸长的蛋白质。人BCMA的氨基酸序列用UniProtKB登录号Q02223表示。在本申请中，术语“BCMA”可包括包含突变的蛋白质，例如可包括包含全长野生型BCMA的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。在本申请中，术语“BCMA”还可包括完整BCMA蛋白的一部分，只要保留相关的生物活性即可。
在本申请中，术语“抗原结合蛋白”通常是指包含结合抗原的部分的蛋白质，以及任选地允许结合抗原的部分采用促进抗原结合蛋白与抗原结合的构象的支架或骨架部分。可典型地包含抗体轻链可变区(VL)、抗体重链可变区(VH)或上述两者。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为框架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR-1、CDR1、FR-2、CDR2、FR-3、CDR3和FR-4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗原结合蛋白的实例包括但不限于抗体、抗原结合片段(Fab，Fab’，Fv片段，F(ab’)2，scFv，di-scFv和/或dAb)、免疫缀合物、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、抗体片段、抗体衍生物、抗体类似物或融合蛋白等，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单域抗体(例如，dAb)，单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本申请所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。
在本申请中，术语“单克隆抗体”通常是指一群基本同源的抗体，即包含在该群内的各个抗体除了可能的以微量存在的天然发生的突变之外是相同的。单克隆抗体可以是高度特异性的，直接针对单个抗原性位点。所述单克隆抗体可以通过杂交瘤技术制备或者通过使用重组DNA方法在细菌、真核动物或植物细胞中产生单克隆抗体也可以得自噬菌体抗体文库，使用例如Clackson etal.,Nature,352:624-628(1991)和Marks et al.,Mol.Biol.，222:581-597(1991)所述的技术进行。
在本申请中，术语“单链抗体”(scFv)通常是指包含抗体重链可变区和轻链可变区的分子。例如，所述scFv可以由抗体重链可变区和轻链可变区通过连接分子(linker)(例如，连接肽)连接而成
在本申请中，术语“嵌合抗体”通常是指这样的抗体，其中重链或轻链氨基酸序列的一部分与来自特定物种的抗体中相应氨基酸序列同源或者均属于某一类别，而该链的其他部分则与另一物种中的相应序列同源。例如，轻链和重链的可变区可以均来自一个动物物种(如小鼠、大鼠等)的抗体的可变区，而恒定部分则与来自另一物种(如人)的抗体序列同源。例如，为获得嵌合抗体，可利用非人源的B细胞或杂交瘤细胞产生可变区，而与其组合的恒定区则来自人。由于嵌合抗体的恒定区可来源于人类，因此嵌合抗体在注射时引发免疫应答的可能性会低于使用恒定区为非人来源的抗体。
在本申请中，术语“人源化抗体”通常是指一种抗体，其含有较少的来自非人免疫球蛋白的序列，从而降低异种抗体引入到人类中时的免疫原性。例如，可以使用CDR移植(Jones et al.,Nature 321:522(1986))及其变体；包括“重塑”(reshaping)，(Verhoeyen,et al.,1988Science 239:1534-1536；Riechmann,et al.,1988Nature 332:323-337；Tempest,et al.,Bio/Technol 1991 9:266-271)，“高度加成”(hyperchimerization)，(Queen,et al.,1989Proc Natl Acad Sci USA 86:10029-10033；Co,et al.,1991ProcNatl Acad Sci USA 88:2869-2873；Co,et al.,1992J Immunol 148:1149-1154)和“贴面”(veneering)，(Mark,et al.,“Derivation of therapeutically active humanized andveneered anti-CD18 antibodies.”In:Metcalf B W,Dalton B J,eds.Cellularadhesion:molecular definition to therapeutic potential.New York:Plenum Press,1994:291-312)、表面重建(美国专利US5639641)等技术手段，对非人源的结合域进行人源化。如果其他区域，例如铰链区和恒定区结构域也源自非人来源，则这些区域也可以被人源化。
在本申请中，术语“全人源抗体”通常是指全人抗体，即抗体的恒定区和可变区均来源于人。所述全人源抗体可以通过噬菌体抗体库技术、转基因小鼠制备人源性抗体、核糖体展示技术、EBV转化B细胞克隆技术、单个B细胞克隆等技术来实现。
在本申请中，术语“单域抗体(sdAb)”通常是指靶物结合活性(例如BCMA结合活性)位于单一结构域内的抗体，不同于例如抗体和单链抗体(抗体和单链抗体一般由重链可变域和轻链可变域二者贡献出抗原结合活性)。单域抗体可包括能够识别或结合抗原的VHH。单域抗体也可包括其他效应部分，例如Fc区。Fc区(fragment crystallizable region)，又称恒定区，通常是指与抗体的抗原结合区相对应的抗体区域。Fc区一般可以本身保持恒定，不负责与抗原结合，但是可以结合Fc受体和补体，发挥抗体的生物学功能。本申请的Fc区域可以是人源抗体的Fc。
在本申请中，术语“VHH”通常是指由重链抗体的可变区组成的抗体片段(Holt，L.等人，Trends in Biotechnology，21(11):484-490)，也称为纳米抗体(Nanobody)。在本申请中，所述单域抗体可以为羊驼的单域抗体。例如，所述VHH可以为由单一免疫球蛋白域形成的小型稳定且高效的抗原识别单元。
在本申请中，术语“CDR”通常是指互补决定区，CDR主要负责与抗原表位结合。重链的CDR通常被称作CDR1、CDR2和CDR3，从N-端开始顺序编号。3个CDR片段和框架区一起构成VHH区段，VHH区段和恒定区(Fc)一起构成全长的单域抗体。CDR区的定义规则在本领域中有多种，例如Chothia规则、Kabat规则等。在本申请中，所述CDR可通过IMGT定义规则进行划分。框架区(Framework region)是指抗体可变区中序列恒定的四个区域。框架区占据了抗体可变区约85％的区域。框架区的功能是作为CDR区的支架，帮助CDR区发挥特异性结合抗原的功能。本申请的框架区可以来源于人的抗体或者来源于羊驼，骆驼的单域抗体的框架区等。Fc区域(fragment crystallizable region)，又称恒定区，是指与抗体的抗原结合区相对应的抗体区域。Fc区域一般本身保持恒定，不负责与抗原结合，但是可以结合Fc受体和补体，发挥抗体的生物学功能。
在本申请中，术语“跨膜域”通常是指细胞表面蛋白中一段跨越细胞膜的序列，其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜域可以与细胞内信号转导结构域相连接，起着传递信号的作用在本申请中，跨膜域可以源自任意的I型、II型或III型跨膜蛋白。
在本申请中，术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括抗原(例如，肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域。CAR是工程化的受体，可将任意特异性受体植入到免疫效应细胞上，尤其是T细胞上。在CAR中，可以将特异识别肿瘤抗原的单克隆抗体的scFv片段或VHH片段植入T细胞或NK细胞上。可以使用例如逆转录病毒载体将编码CAR的核酸导入T细胞、NK细胞或NK T细胞中。以这种方式，可以生成大量的癌症特异性T细胞、NK细胞或NK T细胞用于过继性细胞转移。在本申请中，所述CAR可以基于抗体的抗原(例如BCMA)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。关于CAR和CAR-T细胞的描述，可参见例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi`ere I.The basicprinciples of chimeric antigenreceptor design.Cancer Discov.2013；3(4):388-398；Turtle CJ,Hudecek M,JensenMC,Riddell SR.Engineered T cells for anti-cancer therapy.Curr OpinImmunol.2012；24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S,Savoldo B,Brenner MK.Designand development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing Tcells.Immunol Rev.2014；257(1):107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。
在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。
在本申请中，术语“铰链区”通常是指胞外域(例如，BCMA靶向部分)和跨膜区之间的连接区。在本申请中，所述CAR可以在所述BCMA靶向部分和所述跨膜结构域之间包含一个或多个铰链区。
在本申请中，术语“信号传导结构域”通常是指位于细胞内部能够转导信号的结构域。在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以将信号传导至细胞内。通常，信号传导结构域为用于指导蛋白质找寻靶点的任何一段连续的氨基酸序列。在某些情形中，信号传导结构域可以源自CD3ζ。CD3ζ可以与T细胞受体亚基和CD3-gamma,-delta,和-epsilon形成T细胞受体-CD3复合体。CD3ζ含有三个ITAM基序，ITAM序列介导TCR的胞内信号激活。ζ链是一种受体激活的蛋白酪氨酸激酶底物，当TCR受体与多肽MHC复合物结合后，ζ链可以很快发生酪氨酸磷酸化，参与淋巴细胞活化信号的转导。因此CD3ζ在抗原识别和TCR信号转导中起着关键作用。
在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指不干扰活性成分的生物活性的有效性的一种或多种非毒性材料。这类制剂常规地可以含有盐、缓冲剂、防腐剂、相容的载体、以及任选地其他治疗剂。这类药学上可接受的制剂还可以含有适合于给予人的相容的固体或液体填料、稀释剂或包封物质。可以用于在此所描述的配制品中的其他设想的载体、赋形剂、和/或添加剂包括：例如，调味剂、抗微生物剂、增甜剂、抗氧化剂、抗静电剂、脂质、蛋白质赋形剂(如血清白蛋白、明胶、酪蛋白)、成盐平衡离子(如钠)等等。
在本申请中，术语“免疫细胞”通常是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括但不限于T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、肥大细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞。该术语还包括工程化的免疫细胞，如通过将DNA或RNA形式的外源遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞。
在本申请中，所述“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。载体可涵盖除转基因插入序列和主链以外的额外特征：启动子、遗传标记、抗生素抗性、报告基因、靶向序列、蛋白质纯化标签。称为表达载体(表达构建体)的载体可用于在靶细胞中表达转基因，且通常具有控制序列。本申请所述的载体可以是表达载体，可包括病毒载体(慢病毒载体和/或逆转录病毒载体)、噬菌体载体、噬菌粒、粘粒、cosmid、人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)和/或质粒。
在本申请中，术语“治疗”通常是指：(i)预防可能易患疾病、病症和/或病状、但尚未诊断出患病的患者出现该疾病、病症或病状；(ii)抑制该疾病、病症或病状，亦即遏制其发展；以及(iii)缓解该疾病、病症或病状，亦即使得该疾病、病症和/或病状和/或与该疾病、病症和/或病状相关联的症状消退。
在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。
在本申请中，术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。
除了本文提到的特定蛋白质和核苷酸之外，本申请还可包括其功能性变体、衍生物、类似物、同源物及其片段。
术语“功能性变体”指与天然存在序列具有基本上同一的氨基酸序列或由基本上同一的核苷酸序列编码并能够具有天然存在序列的一种或多种活性的多肽。在本申请的上下文中，任何给定序列的变体是指其中残基的特定序列(无论是氨基酸或核苷酸残基)已经经过修饰而使得所述多肽或多核苷酸基本上保留至少一种内源功能的序列。可以通过天然存在的蛋白质和/或多核苷酸中存在的至少一个氨基酸残基和/或核苷酸残基的添加、缺失、取代、修饰、替换和/或变异来获得变体序列，只要保持原来的功能活性即可。
在本申请中，术语“衍生物”通常是指本申请的多肽或多核苷酸而言包括自/对序列的一个(或多个)氨基酸残基的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加，只要所得的多肽或多核苷酸基本上保留其至少一种内源功能。
在本申请中，术语“类似物”通常对多肽或多核苷酸而言，包括多肽或多核苷酸的任何模拟物，即拥有该模拟物模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化学化合物。
通常，可以进行氨基酸取代，例如至少1个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或20个以上)氨基酸取代，只要经修饰的序列基本上保持需要的活性或能力。氨基酸取代可包括使用非天然存在的类似物。
用于本申请的蛋白质或多肽也可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代，所述氨基酸残基产生沉默的变化并导致功能上等同的蛋白质。可以根据残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进行有意的氨基酸取代，只要保留内源性功能即可。例如，带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；并且含具有相似亲水性值的不带电极性头基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
在本申请中，术语“同源物”通常是指与野生型氨基酸序列和野生型核苷酸序列具有一定同源性的氨基酸序列或核苷酸序列。术语“同源性”可以等同于序列“同一性”。同源序列可以包括可以与主题序列是至少80％、85％、90％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％或99.9％相同的氨基酸序列。通常，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。同源性可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)来考虑，也可以在序列同一性方面表达同源性。在本申请中，提及的氨基酸序列或核苷酸序列的SEQ ID NO中的任一项具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述百分比同一性的序列。
为了确定序列同一性，可进行序列比对，其可通过本领域技术人员了解的各种方式进行，例如，使用BLAST、BLAST-2、ALIGN、NEEDLE或Megalign(DNASTAR)软件等。本领域技术人员能够确定用于比对的适当参数，包括在所比较的全长序列中实现最优比对所需要的任何算法。
在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。
在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。
在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。
发明详述
一方面，本申请提供了以下实施方案：
1.一种嵌合抗原受体，其包含：BCMA结合结构域、跨膜域，胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域；其中所述BCMA结合结构域包含互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，所述的BCMA结合结构域选自如下a)-f)序列中的一种：
a)包含序列GFTLDYYA，序列IGGSDGST和序列ATACEGAGDGDY所示的3个CDR片段；
b)包含序列GLTFSEYT，序列ISGGGIP和序列AADARAVMTVTPNY所示的3个CDR片段；
c)包含序列GRTFNLYA，序列IGWNDDTT和序列AADENFEMPYDY所示的3个CDR片段；
d)包含序列GRTFSDYV，序列IMWPTGTP和序列AAARVGASGYEY所示的3个CDR片段；
e)包含序列GSIVSIDY，序列INSGGST和序列AARQWSSVDFAS所示的3个CDR片段；和
f)包含序列GRTFSSYA，序列ISWIGGLP和序列AAHDCSGYVCYDKEPL YEYDY所示的3个CDR片段。
2.根据实施方案1所述的嵌合抗原受体，其中所述BCMA结合结构域为单域抗体的VHH结构。
3.实施方案1或2所述的嵌合抗原受体，其中所述的BCMA结合结构域包含或具有如下所示序列中的一种：SEQ ID No：1所示的序列，SEQ ID No：2所示的序列，SEQ ID No：3所示的序列，SEQ ID No：4所示的序列，SEQ ID No：5所示的序列，和SEQ ID No：6所示的序列，或其变体。
4.前述任一项实施方案所述的嵌合抗原受体，其中在BCMA结合结构域和跨膜域之间进一步包含铰链区。
5.实施方案4所述的嵌合抗原受体，其中所述的铰链区包含以下至少一项：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD-1的铰链区。
6.前述任一项实施方案所述的嵌合抗原受体，其中跨膜域包含以下至少一项：CD8的跨膜域、CD28的跨膜域、4-1BB的跨膜域、CD4的跨膜域、CD27的跨膜域、CD7的跨膜域、PD-1的跨膜域、TRAC的跨膜域和TRBC的跨膜域。
7.前述任一项实施方案所述的嵌合抗原受体，其中胞内共刺激信号传导结构域包含以下至少一项：CD28、4-1BB、CD40L、TIM1、CD226、DR3、SLAM、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD27、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT和DAP12中的共刺激信号传导区，或及组合组成的共刺激分子。
8.前述任一项实施方案所述的嵌合抗原受体，其中的胞内信号转导结构域包含以下至少一项：CD3zeta激活区、CD3delta激活区、CD3gamma激活区、FcεRIγ激活区、FcεRIβ激活区、免疫球蛋白alpha激活区、免疫球蛋白beta激活区、牛白血病病毒gp30激活区、EB病毒LMP2A激活区、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef激活区、卡波西肉瘤疱疹病毒激活区、DAP-12激活区、至少包含一个ITAM的结构域，及以上结构域组合形成的结构域。
9.前述任一项实施方案所述的嵌合抗原受体，其包含或具有如下所示序列中的一种：SEQ ID No：7所示的序列，SEQ ID No：8所示的序列，SEQ ID No：9所示的序列，SEQ IDNo：10所示的序列，SEQ ID No：11所示的序列，和SEQ ID No：12所示的序列，或其变体。
10.一种分离的核酸分子，其编码实施方案1-8中任一项所述的嵌合抗原受体。
11.实施方案10所述的核酸分子，其包含或具有SEQ ID NO:14-19所示核酸序列中的一种序列。
12.一种载体，其包含实施方案10或11所述的核酸分子。
13.一种免疫效应细胞，其包含实施方案1-8中任一项所述的嵌合抗原受体，实施方案10或11所述的核酸分子，或实施方案11所述的载体。
14.实施方案13所述的免疫效应细胞，该免疫效应细胞是一种淋巴细胞，优选该淋巴细胞是T细胞、B细胞、单核细胞、巨噬细胞、粒细胞或NK细胞。
15.实施方案13或14所述的免疫效应细胞，该免疫效应细胞是一种T细胞。
16.一种单域抗体，其包含互补决定区1(CDR1)，互补决定区2(CDR2)和互补决定区3(CDR3)，所述的抗体选自如下a)-f)序列中的一种：
a)包含序列GFTLDYYA，序列IGGSDGST和序列ATACEGAGDGDY所示的3个CDR片段；
b)包含序列GLTFSEYT，序列ISGGGIP和序列AADARAVMTVTPNY所示的3个CDR片段；
c)包含序列GRTFNLYA，序列IGWNDDTT和序列AADENFEMPYDY所示的3个CDR片段；
d)包含序列GRTFSDYV，序列IMWPTGTP和序列AAARVGASGYEY所示的3个CDR片段；
e)包含序列GSIVSIDY，序列INSGGST和序列AARQWSSVDFAS所示的3个CDR片段；和
f)包含序列GRTFSSYA，序列ISWIGGLP和序列AAHDCSGYVCYDKEPL YEYDY所示的3个CDR片段。
17.实施方案16所述的单域抗体，其中所述的抗体包含或具有如下所示VHH序列中的一种：SEQ ID No：1所示的序列，SEQ ID No：2所示的序列，SEQ ID No：3所示的序列，SEQID No：4所示的序列，SEQ ID No：5所示的序列，和SEQ ID No：6所示的序列，或其变体。
18.实施方案17所述的单域抗体，该单域抗体是所述VHH序列和人Fc序列结合形成的。
19.一种组合物，其包含实施方案13-15任一项所述的免疫效应细胞，或包含实施方案15-17任一项所述的抗体。
20.实施方案19所述的组合物，其中的组合物是用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的组合物。
21.实施方案1-9中任一项所述的嵌合抗原受体，实施方案12-14任一项所述的免疫效应细胞，或实施方案15-17任一项所述的抗体在用于制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。
22.实施方案21所述的应用，其中与BCMA的表达相关的疾病或病症是多发性骨髓瘤。
一方面，本申请提供了一种分离的抗原结合蛋白。在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含可特异性结合BCMA的靶向部分。另一方面，本申请提供了一种包含所述分离的抗原结合蛋白(例如，所述可特异性结合BCMA的靶向部分)的嵌合抗原受体(CAR)。
本申请所述分离的抗原结合蛋白可包含互补决定区1(CDR1)。例如，所述CDR1可包含SEQ ID NO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述CDR1可包含与SEQ ID NO:23、26、29、32、35和38中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含互补决定区2(CDR2)。例如，所述互补决定区2(CDR2)可包含SEQ ID NO:24、27、30、33、36和39中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述CDR2可包含与SEQ ID NO:24、27、30、33、36和39中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含互补决定区3(CDR3)。例如，所述互补决定区3(CDR3)可包含SEQ ID NO:25、28、31、34、37和40中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述CDR2可包含与SEQ ID NO:25、28、31、34、37和40中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述分离的抗原结合蛋白可包含CDR1、CDR2和CDR3。例如，所述CDR1、CDR2和CDR3可包含选自下组中任意一组的氨基酸序列，或者所述分离的抗原结合蛋白可包含与选自下组中任意一组的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列：
a)CDR1：SEQ ID NO:23，CDR2：SEQ ID NO:24，和CDR3：SEQ ID NO:25；
b)CDR1：SEQ ID NO:26，CDR2：SEQ ID NO:27，和CDR3：SEQ ID NO:28；
c)CDR1：SEQ ID NO:29，CDR2：SEQ ID NO:30，和CDR3：SEQ ID NO:31；
d)CDR1：SEQ ID NO:32，CDR2：SEQ ID NO:33，和CDR3：SEQ ID NO:34；
e)CDR1：SEQ ID NO:35，CDR2：SEQ ID NO:36，和CDR3：SEQ ID NO:37；
f)CDR1：SEQ ID NO:38，CDR2：SEQ ID NO:39，和CDR3：SEQ ID NO:40。
在本申请中，所述抗原结合蛋白还包括框架区，所述框架区可以来源于人的抗体，或者来源于羊驼、骆驼等物种的单域抗体的框架区；在某些情形中，所述抗原结合蛋白的框架区可以来源于人。
在本申请中，所述抗原结合蛋白可以包括Fc区。在某些情形中，所述抗原结合蛋白可以包括单域抗体。
在某些情中，所述抗原结合蛋白可以包括VHH。
在某些情形中，所述CAR的靶向部分可以包含VHH。
例如，所述VHH可包含SEQ ID NO:1-6和41-46中任一项所示的氨基酸序列。例如，所述VHH可包含与SEQ ID NO:1-6和41-46中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
在本申请中，所述CAR包含胞外的BCMA靶向部分外，还可包含胞内结构域。
在某些情形中，所述CAR可包含胞内共刺激信号传导结构域，其可提供刺激信号。所述共刺激信号传导结构域可以包括但不限于下组：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88中的共刺激信号传导区及其组合组成的共刺激分子。例如，所述共刺激结构域可以是来自人4-1BB的共刺激结构域。
在某些情形中，所述CAR可包含胞内信号转导结构域，其可以包含至少有一个ITAM基序的结构域。所述胞内信号转导结构域可以将激活信号传输到细胞内部。示例性的信号传导结构域可源自选自下组的信号转导结构域，包括但不限于CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FcεRIγ、FcεRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30激活区、Epstein-Barr病毒(EBV)LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒(HSKV)、DAP10和DAP-12，及上述的变体。
术语“zeta”,“ζ”或“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”为序列Genebank:NM_198053.2提供的蛋白质或与人类近亲物种的等价残基。CD3ζ与T细胞受体亚基和CD3-gamma,-delta,和-epsilon形成T细胞受体-CD3复合体。CD3ζ含有三个ITAM基序，ITAM序列介导TCR的胞内信号激活。ζ链是一种受体激活的蛋白酪氨酸激酶底物，当TCR受体与多肽MHC复合物结合后，ζ链很快发生酪氨酸磷酸化，参与淋巴细胞活化信号的转导。因此CD3ζ在抗原识别和TCR信号转导中起着关键作用。例如，所述胞内信号转导结构域可以是来自CD3的信号转导结构域。
在某些情形中，所述CAR可包含跨膜域，所述跨膜域是细胞表面蛋白中一段跨越细胞膜的序列，其可以包含疏水性alpha螺旋。跨膜域可以源自CD28，具有良好的稳定性。跨膜域可以源自任意的I型跨膜蛋白。跨膜域可以是预测为形成疏水螺旋的合成序列。所述跨膜域可包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。例如，所述跨膜域可以是来自CD8的跨膜域。
在某些情形中，所述CAR可包含铰链区，所述铰链区可以位于所述胞外的靶向部分和所述跨膜域之间。所述铰链区可包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8 alpha、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、CD40L、TIM1、CD226、SLAM、CD30和LIGHT。
在本申请中，所述CAR可包含BCMA靶向部分(例如，所述抗原结合蛋白，又例如，所述VHH)、所述铰链区、所述跨膜域、所述共刺激信号传导区和所述信号传导结构域。在某些情形中，所述CAR在所述BCMA的N段还可包含信号肽，例如，人CD8信号肽。
例如，所述CAR可包含SEQ ID NO:7-12和53-58中任一项所示的氨基酸序列。又例如，所述CAR可包含于SEQ ID NO:7-12和53-58中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
本申请还提供了编码所述CAR的核酸分子。例如，所述编码所述CAR的核酸分子可包含SEQ ID NO:7-12和53-58中任一项所示的氨基酸序列。又例如，所述编码所述CAR的核酸分子可包含SEQ ID NO:7-12和53-58中任一项所示的氨基酸序列具有至少80％(例如，至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高)序列同源性的氨基酸序列。
本申请所述的核酸分子可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离，或所述核酸分子可以被合成生产以获得。
本申请也提供了包含所述核酸分子的载体。简单概括，通常可通过可操作地连接编码目的多肽或其部分的核酸至启动子下游，并将构建体并入表达载体，实现编码目的多肽的天然或合成核酸的表达。该载体可以是在真核细胞中适于复制和整合的。典型的载体可包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。
本申请所述核酸分子也可被连接至许多类型的载体。例如，该核酸可被连接至，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体、病毒和/或粘粒。特定的感兴趣载体可包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。病毒载体技术在本领域中是公知的，并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使插入的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。本申请所述的载体可以被引入细胞。
细胞
另一方面，本申请提供了一种细胞，其可包含所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，和/或所述的载体。所属细胞可以是原核细胞(如，细菌)或真核细胞(如，酵母、哺乳动物细胞)
所述细胞可以包括免疫细胞。在某些情形中，所述细胞可以包括免疫细胞。例如，所述细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可包括胸腺细胞、天然T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。所述T细胞可以是辅助T细胞(Th)，例如辅助T细胞1(Th1)或辅助T细胞2(Th2)细胞。所述T淋巴细胞可以是CD4+辅助T细胞(HTL；CD4+T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8+T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8+T细胞)、CD4+/CD8+T细胞、CD4-/CD8-T细胞或任何其他T淋巴细胞亚型。在某些情形中，所述经修饰的T细胞是人类T细胞。在扩增和遗传修饰本申请的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者，例如患者，获得细胞来源。T细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些情形中，可以使用本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的T细胞系。在另一些情形中，所述细胞可以源自健康供体、源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一些情形中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群体的一部分。
在某些情形中，所述细胞可包括B细胞。在某些情形中，所述B细胞可包括效应B细胞(浆细胞)、记忆B细胞。所述B细胞可包括B2细胞、B1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括巨噬细胞。所述B细胞可包括I型巨噬细胞(M1)、II型巨噬细胞(如M2a、M2B、M2c)。
在某些情形中，所述细胞可包括NK细胞。在某些情形中，所述NK细胞可包括CD56bright和CD56dim。在某些情形中，所述NK细胞可包括NK1和NK2。在某些情形中，所述NK细胞可包括A-NK和NA-NK。
在某些情形中，所述细胞可包括白细胞。白细胞通常是指一种有核的血细胞，具有活跃的移动能力，可以从血管内迁移到血管外，或从血管外组织迁移到血管内。除了在血液外，白细胞还可以存在于淋巴系统、脾，扁桃腺以及身体的其他组织。在本申请中，所述白细胞可以包括粒细胞(如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、无粒白细胞(如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、吞噬细胞、肥大细胞)。
在某些情形中，所述细胞可包括淋巴细胞，所述淋巴细胞可以包括在血液、淋巴和淋巴组织中发现的任何单核细胞、非吞噬白细胞，例如，B淋巴细胞、T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括外周血单个核细胞，其可包括在外周血中具有单个核的任何细胞。例如，在本申请中，所述外周血单个核细胞可以包括T细胞、B细胞、NK细胞、淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞。
在某些情形中，所述细胞可包括巨噬细胞。巨噬细胞是一种可以吞噬和消化细胞碎片、微生物、癌细胞和那些所有缺少正常细胞表面表达的表面标志的其他物质，这个过程叫做吞噬作用。巨噬细胞几乎存在于所有组织中，通过阿米巴运动寻找可能的病原物。它们除了在非专一的天然免疫反应中起重要作用外，还可以通过招募其他免疫细胞类型，如淋巴细胞，帮助启动获得性免疫。
药物组合物
另一方面，本申请提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包含本申请所述改造的免疫细胞，以及药学上可接受的载剂。在本申请中，术语“药学上可接受的载剂”通常是指可与本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。除非与本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。
所述药物组合物可以用来治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症，例如用于治疗骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)及其它B细胞异常增殖导致的疾病。
用途和方法
另一方面，本申请提供了所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症。
另一方面，本申请提供了预防或治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用有效量的所述的嵌合抗原受体，所述的抗原结合蛋白，所述的分离的核酸分子，所述的载体，和/或所述的细胞。
在某些情形中，本申请所述与BCMA的表达相关的疾病或病症包括骨髓瘤(例如，多发性骨髓瘤)。
另一方面，本申请提供了一种组合物，其包含本申请所述的嵌合抗原受体、抗原结合蛋白和/或细胞。所述组合物可用于治疗与BCMA的表达相关的疾病或病症，例如用于治疗多发性骨髓瘤及其它B细胞异常增殖导致的疾病。
本申请所述组合物及方法可与其他类型的癌症疗法结合使用，诸如化学疗法、手术、放射、基因疗法等。本申请中所描述的组合物及方法可用于其他依赖于免疫反应的疾病病状，诸如炎症、免疫疾病及感染性疾病。
不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的嵌合抗原受体、抗原结合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。
实施例
实施例1：BCMA单域抗体VHH基因序列获取
1.1BCMA单域抗体文库构建：
使用具有C-末端人IgGFc标签的重组人BCMA抗原(BC7-H5254,ACROBiosystems)进行羊驼免疫。总共免疫四次，免疫间隔时间约3周。第一次免疫使用0.5mg抗原与CFA(完全弗氏佐剂)1:1混匀乳化后皮下注射，计为第一天。后面三次免疫使用0.25mg抗原与IFA(不完全弗氏佐剂)1:1混匀乳化后皮下注射，期间通过取血采样评估免疫反应效果。在第七十天，取外周血通过梯度离心分离淋巴细胞，提取淋巴细胞RNA并反转录成cDNA，通过两轮聚合酶链式反应(PCR)扩增羊驼重链免疫球蛋白的可变区片段VHH序列，将扩增出来的VHH插入噬菌体展示载体，并通过电转化将携带有单域抗体基因片段的产物转入感受态大肠杆菌，从而获得单域抗体免疫文库。
1.2BCMA特异性抗体序列筛选：
利用噬菌体展示技术将单域抗体分子展示于噬菌体表面，进而筛选出抗原特异性的单域抗体，将BCMA蛋白(BCA-H82E4，ACROBiosystems)包被到96孔板中，通过Elisa实验筛选3-5轮，将BCMA特异性的噬菌体逐步得到富集。挑选大量阳性克隆进行Elisa检测并对阳性克隆筛选和测序，根据序列比对确定独特的克隆并将其序列分为框架区FR和互补决定区CDR。通过以上方法，共获得6株亲和力较高的BCMA单域抗体。这6株抗体分别命名为BCMA-sdAb-4、BCMA-sdAb-15、BCMA-sdAb-20、BCMA-sdAb-52、BCMA-sdAb-19B、BCMA-sdAb-35B。不同抗体对应的CDR区和VHH氨基酸序列见表1。
实施例2：BCMA嵌合抗原受体分子设计、构建并克隆至慢病毒载体
为了筛选出更有效的靶向BCMA的嵌合抗原受体，将6株sdAb都分别构建到慢病毒载体上，同时选择已申请专利并公开的1个CAR序列作为阳性对照(CN108004259A中的SEQID No：31)。
2.1合成含有不同sdAb的靶向BCMA的嵌合抗原受体的基因序列：
靶向BCMA的嵌合抗原受体含有人CD8信号肽、抗人BCMA的单域抗体VHH序列、人CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3信号传导结构域，它们以依次串联的方式连接(图1)。不同的嵌合抗原受体分子(CAR分子)对应的氨基酸序列见表1，对应的DNA序列见表1。靶向BCMA的嵌合抗原受体基因序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成并克隆至pUC57载体(苏州金唯智生物科技有限公司)上。在合成基因时，在基因5’端和3’端分别添加限制性内切酶BamHI(NEB:R3136S)和SalI(NEB:R3138S)酶切位点。
2.2构建表达BCMA嵌合抗原受体的慢病毒载体：
利用BamHI和SalI两个酶切位点将BCMA嵌合抗原受体的基因序列BCMA-CAR-4、BCMA-CAR-15、BCMA-CAR-20、BCMA-CAR-52、BCMA-CAR-19B、BCMA-CAR-35B、1个阳性的对照(BCMA-J22.9-CAR)分别(见表3)从pUC57载体酶切下来，酶切条带经琼脂糖凝胶电泳检测后分别进行胶回收纯化(QIAGEN：28706)得到BCMA嵌合抗原受体DNA片段。将酶切回收的BCMA嵌合抗原受体DNA片段通过T4连接酶(NEB：M0202S)克隆至慢病毒载体(Addgene；货号：12252)上，得到7个表达BCMA嵌合抗原受体的重组质粒:p-lenti-BCMA-CAR-4、p-lenti-BCMA-CAR-15、p-lenti-BCMA-CAR-20、p-lenti-BCMA-CAR-52、p-lenti-BCMA-CAR-19B、p-lenti-BCMA-CAR-35B、p-lenti-BCMA-J22.9-CAR。将7个慢病毒载体送苏州金唯智生物科技有限公司测序验证，测序引物为：
Lenti-For:TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC(SEQ ID No：21)
Lenti-Rev：CCTCATAAAGAGACAGCAACCAGG(SEQ ID No：22)
测序验证7个慢病毒载体均构建正确。
表1嵌合抗原受体分子(CAR分子)及其对应的氨基酸序列、DNA序列、BCMA结合结构域和CDR序列
Figure BDA0002799778510000221
Figure BDA0002799778510000231
实施例3：制备7个BCMA嵌合抗原受体分子的慢病毒
3.1大提质粒：
将测序验证正确的重组质粒重新转化大肠杆菌stbl3(购自北京科瑞思博公司)。从转化好的平板上挑取单克隆到3ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基的摇菌管中，37℃220rpm，摇床振荡培养8h。从活化好的菌液中吸取500μl接种到250ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃220rpm，摇床振荡培养12-16h。使用Qiagen HiSpeed Plasmid MaxiKit试剂盒(货号：12662)按照试剂盒提供的实验流程进行质粒提取。提取质粒后使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)测定质粒浓度，并通过DNA琼脂糖凝胶检测超螺旋质粒含量。
3.2培养293T细胞：
将冻存的293T细胞(购自ATCC)从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促其融化。用医用酒精擦拭管口后，移到提前已加入10ml预热的DMEM完全培养基(90％DMEM+10％FBS+1％青霉素/链霉素)的15ml离心管中，轻轻吹匀，1000rpm离心3min，吸弃上清。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹匀后接种到10cm培养皿中，在37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养。第二天当细胞密度达到80％-90％时对其细胞进行传代，吸掉培养基用10ml PBS清洗1次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入培养箱1-2min(期间需要拿出在显微镜下观察细胞是否变圆)。细胞变圆后加1ml的DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移到15ml离心管中，1000rpm离心3min，吸取并弃掉上清。根据实验需要，按照1:3或1:5的比例传代，接种到新的10cm培养皿中继续培养或者冻存；
3.3制备慢病毒：
1)第一天，接种293T细胞：按照约1.7×107个/T175瓶(30ml培养基培养)接种细胞，使其第二天细胞密度达到80-90％时可转染。
2)第二天，质粒转染：转染前培养基需换成有10％FBS但无双抗的DMEM培养基。首先分别准备质粒复合物：将以下质粒加入到1.5ml Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific；31985-070)内加入后混匀：9μg的psPAX2质粒(Addgene；货号：12260)，18μg的pMD2.G质粒(Addgene；货号：12259)，18μg的病毒载体质粒。病毒载体质粒共有7种：p-lenti-BCMA-CAR-4、p-lenti-BCMA-CAR-15、p-lenti-BCMA-CAR-20、p-lenti-BCMA-CAR-52、p-lenti-BCMA-CAR-19B、p-lenti-BCMA-CAR-35B、p-lenti-BCMA-CAR-J22.9。再准备转染试剂复合物：按照质粒与PEI质量比1:3，将67.5μl(2mg/ml)PEI(polysciences：24765)加入到1.5ml Opti-MEM内混匀，室温静置5min；再将转染试剂复合物加入到质粒复合物中，混匀后静置20min。最后将转染复合物慢慢滴入到293T细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃含5％CO2的细胞培养箱中培养。
3)第四天，收病毒：转染48h收取培养基上清，2000rpm离心10min去除细胞碎片。使用0.45μm滤膜过滤上清，滤液转移到专用离心管中配平。使用超速离心机25000rpm超速离心2h。倒掉上清后，使用X-VIVO-15培养基重悬慢病毒，并将慢病毒分装后保存在-80℃超低温冰箱中。按照该流程分别制备含有BCMA-CAR-4、BCMA-CAR-15、BCMA-CAR-20、BCMA-CAR-52、BCMA-CAR-19B、BCMA-CAR-35B、BCMA-J22.9-CAR的DNA序列(见表1)的慢病毒。
实施例4：分离和激活人原代T细胞，并使用慢病毒转染T细胞
将人外周血单个核细胞(PBMCs，购自上海妙顺生物)稀释到2×106/ml，按照细胞与磁珠1:3的比例使用抗人的CD3/CD28磁珠(Thermo Fisher Scientific)激活T细胞，同时培养基中添加300IU/ml的IL-2(PeproTech：200-02)。T细胞激活24h后，对T细胞计数后将其细胞浓度调至为1×106/ml，每孔500μl接种到24孔中，分别将含有BCMA-CAR-4、BCMA-CAR-15、BCMA-CAR-20、BCMA-CAR-52、BCMA-CAR-19B、BCMA-CAR-35B、BCMA-J22.9-CAR DNA序列的慢病毒加入到T细胞培养孔内转染T细胞，未转染的T细胞作为阴性对照(对照T)，得到不同的可表达靶向人BCMA抗原的嵌合抗原受体T细胞，命名为：BCMA-CAR-T-4、BCMA-CAR-T-15、BCMA-CAR-T-20、BCMA-CAR-T-52、BCMA-CAR-T-19B、BCMA-CAR-T-35B、BCMA-J22.9-CAR-T。转染后继续培养转染的T细胞至静息态。
实施例5：检测BCMA嵌合抗原受体在细胞内的表达
通过荧光抗体染色和流式细胞术检测实施例4制得的BCMA嵌合抗原受体分子在细胞内的表达情况，基本步骤如下：分别离心收集慢病毒感染48h的BCMA-CAR-T细胞和慢病毒未感染的T细胞(对照T)，加入生物素化人BCMA蛋白(100μg/ml)(Acrobiosystems:BCA-H82E4)，4℃避光孵育30分钟，PBS清洗1次。使用适量体积PBS重悬后加入二抗PE-Streptavidin(BD Biosciences:554061)，4℃避光孵育20分钟，PBS清洗1次后再用适量的PBS重悬，最后使用流式细胞仪检测BCMA-CAR分子在T细胞表面的表达效率。
结果：使用实施例3制备得到的慢病毒感染T细胞48h后，BCMA-CAR均可以很好的表达于T细胞表面。实验结果如表2统计：
表2 CAR-T细胞表达效率
CAR-T细胞 阳性率(阳性细胞数/总细胞数％)
对照T细胞 0.18％
BCMA-J22.9-CAR-T 42.60％
BCMA-CAR-T-4 28.80％
BCMA-CAR-T-15 27.50％
BCMA-CAR-T-20 23.50％
BCMA-CAR-T-52 33.70％
BCMA-CAR-T-19B 24.30％
BCMA-CAR-T-35B 23.30％
实施例6：BCMA嵌合抗原受体与不同的靶细胞共培养后检测IL-2和IFN-γ分泌
细胞共培养：对CAR-T细胞和对照T细胞计数后将浓度调至1×106/ml，然后按照100ul每孔接种到平底96孔板中。将已接种好的CAR-T和T细胞暂时放置于37℃孵育。将靶细胞U266(购自中国科学院细胞库)、表达BCMA蛋白的K562.BCMA、不表达BCMA蛋白的阴性细胞K562(中国科学院细胞库)和293T(ATCC)按照效靶比1:1即细胞浓度1×106/ml，100μl/孔，加入到CAR-T细胞和对照T细胞中共培养。使用带有BCMA基因(Genebank：NM_001192.3)的慢病毒转染K562细胞，制备得到表达BCMA蛋白的K562.BCMA细胞系。慢病毒制备流程参见实施例3。
将上述细胞共培养24h后的上清转移到新的96孔板，使用ELISA试剂盒(ThermoFisher Scientific；货号88-7316)检测T细胞的IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌。平板制备和上清细胞因子的检测按照试剂盒提供的标准流程操作。
结果：将制备的BCMA CAR T细胞与靶细胞共孵育24h后，ELISA方法检测上清中IL-2和IFN-γ含量。结果如图2和图3所示，从图中可以看出，BCMA-CAR-T细胞与BCMA阳性的细胞(U266和K562.BCMA)共培养后释放高水平的IL-2和IFN-γ。而BCMA-CAR-T细胞与BCMA阴性的细胞(K562和293T)共培养后几乎没有分泌细胞因子释放，而且阴性对照T细胞无论与BCMA阳性的细胞和BCMA阴性的细胞共培养不诱导细胞因子的释放，验证了共培养测定中的细胞因子释放是CAR依赖性和BCMA特异性的。
实施例7：BCMA嵌合抗原受体与不同的靶细胞共培养后检测其杀伤能力
细胞铺板：使用带有荧光素酶(GenBank:AAR29591.1)的慢病毒转染U266细胞、K562细胞、A549细胞和293T细胞，制备得到标记有荧光素酶的细胞系。慢病毒制备流程参见实施例3。将标记有荧光素酶的细胞系U266.luc、标记有荧光素酶表达BCMA的K562.BCMA.luc、标记有荧光素酶的A549.luc、标记有荧光素酶的不表达BCMA的K562.luc、标记有荧光素酶的293T.luc，按照细胞浓度1×105/ml，50μl/孔铺至96孔平底不透明白板中。设置10:1、5:1、2.5:1和1:1共4个效靶比将CAR-T细胞和T细胞与靶细胞共培养。将96孔板放置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养。
细胞共培养24h后测定靶细胞剩余的荧光素酶活性(相对光单位，RLU)，来检测每种CAR-T对不同靶细胞的杀伤能力。具体步骤为：共培养后的细胞800rpm离心5min，吸掉上清后加入100μl的D-luciferin底物(Thermo Fisher Scientific：88293)混匀避光显色5min，在酶标仪用化学发光模式检测荧光强度。由于荧光素酶仅在靶细胞中表达，孔中的剩余荧光素酶活性与孔中活靶细胞的数量直接相关。在不存在效应细胞的情况下，通过将培养基加入靶细胞来获得最大荧光素酶活性作为对照。
结果：使用实施例4制备得到的CAR-T细胞与靶细胞共培养24h后，其杀伤结果见表3至表7，其中BCMA-J22.9-CAR-T作为阳性对照。表3和表4数据证实，BCMA的CAR-T细胞都对多发性骨髓瘤细胞U266.luc和表达BCMA的稳定细胞系K562.BCMA.luc呈现不同水平的杀伤能力，并且CAR-T具有针对U266.luc和K562.BCMA.luc细胞的剂量依赖性杀伤作用，在效靶比5:1情况下其中超过60％克隆其杀伤效率超过50％以上，在效靶比2.5:1和1:1下其杀伤效率开始降低。而且比较CAR T细胞在不同效靶比下对U266.luc和K562.BCMA.luc杀伤率，发现CAR T细胞表现出针对多发性骨髓瘤细胞U266.luc强效的细胞杀伤作用。同时表5、表6和表7数据证实CAR T细胞与BCMA阴性细胞系A549.luc、K562.luc、293T.luc共培养时，在3种效靶比下都未检测到荧光素酶的活性显著降低，也就是其杀伤率并没有显著增加，说明CAR T细胞针对BCMA阴性细胞系A549.luc、K562.luc、293T.luc不具有细胞的剂量依赖性杀伤作用。以上数据证明了BCMA CAR T细胞针对肿瘤细胞的杀伤作用是BCMA特异性的。
表3 BCMA-CAR-T与靶细胞U266.luc培养后，在效靶比10:1、5:1、2.5:1和1:1时对肿瘤细胞杀伤效果
Figure BDA0002799778510000271
表4 BCMA-CAR-T与靶细胞K562.BCMA.luc培养后，在效靶比10:1、5:1、2.5:1和1:1时对肿瘤细胞杀伤效果
Figure BDA0002799778510000272
表5 BCMA-CAR-T与靶细胞K562.luc培养后，在效靶比10:1、5:1、2.5:1和1:1时对肿瘤细胞杀伤效果
Figure BDA0002799778510000273
Figure BDA0002799778510000281
表6 BCMA-CAR-T与靶细胞A549.luc培养后，在效靶比10:1、5:1、2.5:1和1:1时对肿瘤细胞杀伤效果
Figure BDA0002799778510000282
表7 BCMA-CAR-T与靶细胞293T.luc培养后，在效靶比10:1、5:1、2.5:1和1:1时对肿瘤细胞杀伤效果
Figure BDA0002799778510000283
实施例8：BCMA抗体亲和力检测
1.将筛选出的6个CAR中的VHH序列分别克隆至含有人IgG1 Fc片段(hIgG1Fc)序列的表达载体中，重组表达BCMA抗体-Fc融合蛋白。使用质粒瞬时转染HEK293悬浮细胞(来自ATCC)的方法进行表达，然后使用Protein A亲和层析柱纯化重组抗体。获得的重组抗体用于亲和力的检测。
2.使用BiacoreT200(GE Healthcare)测定每种抗体对BCMA的亲和力：
基本流程为：1)抗原稀释梯度：根据抗原的相对分子质量和对应的抗原浓度算出该抗原相应的物质的量。本实验选择从40nM开始稀释，以一比二的方式稀释六个梯度。2)抗体稀释：将待测样品用HBS溶液稀释至1μg/ml。3、参数设定：设置待测样品即抗体以10μl/min的流速单独捕获到芯片表面fc2-fc4流动池上30秒。使用Protein A chip(GE,Cat#29127556)进行抗体捕获。将梯度抗原设置为30μl/min的流速流经fc1-fc4四个流动池，结合时间180s，解离时间300s。使用该流程测得的抗体亲和力见表8。
结果：从表8中测定得到抗体的解离常数KD可以看出，筛选得到的6个抗体针对BCMA都具有很高的亲和力，亲和力数量级在10-11M和10-10M之间，其中抗体BCMA-sdAb-19B的KD值能达到10-11M，抗体BCMA-sdAb-20的KD值能达到10-10M。
表8重组蛋白亲和力检测
检测的抗体 ka(1/Ms) kd(1/s) KD(M)
BCMA-sdAb-4 1.22E+07 3.45E-03 2.83E-10
BCMA-sdAb-15 1.25E+07 7.78E-04 6.21E-11
BCMA-sdAb-20 1.63E+06 7.79E-04 4.77E-10
BCMA-sdAb-52 1.23E+07 4.27E-03 3.48E-10
BCMA-sdAb-19B 9.99E+06 3.91E-04 3.92E-11
BCMA-sdAb-35B 7.24E+06 3.42E-04 4.72E-11
实施例9：BCMA单域抗体人源化
分别使用Discovery Studio和
Figure BDA0002799778510000291
Antibody Modeling，采用同源建模方法选取5-10个最优模拟结构，Loop区域一般使用同源建模方法建模。使用PDB BLAST调取数据库中序列最接近的10个抗体晶体结构模型。对比自动建模模型，选取最优的结构模型。使用IgBLAST将抗体序列与人Germline序列比对，找出驼源位点和同源性最高的人源化设计模板。将驼源序列进行人源化突变。将设计好的人源化序列与人源Germline序列进行比对，计算出每个部分及全长抗体的人源化程度百分比。
检测人源化抗体和BCMA蛋白的亲和力：
基本流程为：1)将原始单域抗体以及设计好的人源化单域抗体进行融合蛋白表达，融合标签为人IgG1 Fc。2)使用ExpiCHO-s表达体系瞬时转染表达纯化。3)使用ELISA方法检测人源化单域抗体和BCMA蛋白的亲和力。4)选取人源化单域抗体中亲和力最高的组别获得对应抗体BCMA-sdAb-4、BCMA-sdAb-15、BCMA-sdAb-20、BCMA-sdAb-52、BCMA-sdAb-19B、BCMA-sdAb-35B的六种人源化抗体序列，分别命名为：sdAb hu-4-2(氨基酸序列SEQ ID No：41，DNA序列SEQ ID No：47)、sdAb hu-15-2(氨基酸序列SEQ ID No：42，DNA序列SEQ ID No：48)、sdAb hu-20-2(氨基酸序列SEQ ID No：43，DNA序列SEQ ID No：49)、sdAb hu-52-2(氨基酸序列SEQ ID No：44，DNA序列SEQ ID No：50)、sdAb hu-19B-2(氨基酸序列SEQ ID No：45，DNA序列SEQ ID No：51)、sdAb hu-35B-2(氨基酸序列SEQ ID No：46，DNA序列SEQ IDNo：52)。
实施例10：人源化CAR-T细胞的体外活性评价
10.1人源化CAR-T细胞的制备：
上述六种人源化单域抗体改造的CAR分别命名为：CAR-hu-4-2(氨基酸序列SEQ IDNo：53，DNA序列SEQ ID No：59)、CAR-hu-15-2(氨基酸序列SEQ ID No：54，DNA序列SEQ IDNo：60)、CAR-hu-20-2(氨基酸序列SEQ ID No：55，DNA序列SEQ ID No：61)、CAR-hu-52-2(氨基酸序列SEQ ID No：56，DNA序列SEQ ID No：62)、CAR-hu-19B-2(氨基酸序列SEQ ID No：57，DNA序列SEQ ID No：63)、CAR-hu-35B-2(氨基酸序列SEQ ID No：58，DNA序列SEQ ID No：64)。从已发表专利中获取阳性对照CAR人源化anti-BCMA-10-CAR核酸序列(US20170226216中的SEQ ID NO 30；氨基酸序列SEQ ID NO：67，DNA序列SEQ ID NO：68)，通过基因合成法和分子克隆制备包含有人源化BCMA-CAR和阳性对照CAR的慢病毒载体，并制备对应的慢病毒。参照实施例3制备人源化CAR-T，将制备好的人源化CAR-T分别命名为：CAR-T-hu-4-2、CAR-T-hu-15-2、CAR-T hu-20-2、CAR-T hu-52-2、CAR-T-hu-19B-2、CAR-T-hu-35B-2和阳性对照BCMA-10-CAR-T。无转染的T细胞命名为对照T细胞。参照实施例5，对CAR表达效率进行检测。
结果：上述制备得到的人源化BCMA CAR-T细胞在转染48h后，CAR表达情况如表9统计：人源化BCMA-CAR均可以良好地表达于T细胞表面，CAR表达效率在50％左右。
表9人源化CAR-T细胞表达效率
CAR-T 阳性率(阳性细胞/总细胞％)
对照T细胞 0.30％
BCMA-10-CAR-T 53.00％
CAR-T-hu4-2 66.10％
CAR-T-hu15-2 65.50％
CAR-T-hu20-2 40.30％
CAR-T-hu52-2 45.40％
CAR-T-hu19B-2 55.40％
CAR-T-hu35B-2 49.80％
10.2人源化BCMA嵌合抗原受体与不同的靶细胞共培养后检测IL-2和IFN-γ分泌：
参照实施例6使用ELISA法检测人源化CAR-T细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌情况。
结果：如图4和图5，从图中可以看出，人源化BCMA-CAR-T在靶细胞(MM.1S和K562-BCMA)刺激后可以大量分泌细胞因子IL-2和IFN-γ，而人源化BCMA-CAR-T与BCMA阴性的细胞(K562和293T)共培养后几乎没有分泌因子释放。除CAR-T-hu20-2外，人源化CAR-T细胞因子IL-2和IFN-γ分泌量均大于阳性对照CAR-T细胞。
10.3人源化BCMA-CAR-T与不同的靶细胞共培养后检测其杀伤能力：
参照实施例7进行细胞杀伤实验。
结果：杀伤结果见表10。结果显示，人源化CAR-T可以在体外高效杀伤靶细胞。总体上，人源化CAR-T在不同效靶比的杀伤率大于或者接近于阳性对照CAR-T细胞。
表10 BCMA-CAR-T与靶细胞MM.1S培养后，在效应细胞和靶细胞比值(效靶比)为10:1、5:1和2.5:1时对肿瘤细胞杀伤效果
Figure BDA0002799778510000311
Figure BDA0002799778510000321
实施例11：人源化CAR-T动物体内活性检测
MM.1S肿瘤细胞为带有荧光标记的人骨髓瘤细胞，在常规复苏后扩增培养，至少传代2次后收获对数生长期的细胞，以不含血清的培养基重悬至1×107个/mL。取30只雄性NPG小鼠(北京维通达生物技术有限公司)，所有动物无菌条件尾静脉接种细胞悬液0.2mL。尾静脉接种MM.1S细胞后17天，根据肿瘤信号强度筛选24只动物随机分为5组：缓冲液组、对照T细胞组、CAR-T-hu-15-2组、CAR-T-hu-19B-2组和BCMA-10-CAR-T组，每组5只小鼠。提前准备预热的1640完全培养基，转移到15mL离心管，每管5mL。将冻存管自低温保存场所中取出后迅速置37℃水浴，水浴溶解后将细胞转移到15mL离心管中，与培养基混匀。取适量细胞，使用台盼蓝计数细胞密度和活力。细胞以1800rpm条件下离心5min，用PBS调整供试品细胞密度。供试品各组动物以0.30×107个T细胞/只(约0.15×107个CAR阳性细胞)的浓度给予细胞，通过调整给药容量进行给药。
在D7、D14、D21、D28天，所有动物腹腔注射150mg/kg的D-荧光素钾(Thermo FisherScientific)。注射后10～15min于异氟烷麻醉下以Bruker小动物成像仪拍摄化学发光信号，成像时间180s。
结果：成像结果见图6。图中可以显示，在本实验条件下，CAR-T-hu15-2和CAR-T-hu-19B-2都明显可以抑制肿瘤细胞的增殖。和阳性对照BCMA-10-CAR-T相比，CAR-T-hu15-2和CAR-T-hu-19B-2可以快速的使肿瘤消退，并且很好的控制肿瘤的生长，显示出良好的抗肿瘤效果。
序列表
<110> 苏州克睿基因生物科技有限公司
<120> 一种单域抗体及包含抗体结构的嵌合抗原受体
<130> 0141-PA-011CN
<160> 68
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 128
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Gly Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ala Cys Glu Gly Ala Gly Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ile Pro Tyr Tyr Arg Thr Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Ala Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Ala Arg Ala Val Met Thr Val Thr Pro Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln
115 120 125
Asp
<210> 3
<211> 128
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 3
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Leu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Asn Asp Asp Thr Thr Tyr Tyr Thr Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Glu Asn Phe Glu Met Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
<210> 4
<211> 128
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 4
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Val Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Ser Ile Met Trp Pro Thr Gly Thr Pro Leu Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Val Gly Ala Ser Gly Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
<210> 5
<211> 127
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 5
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ile Val Ser Ile Asp
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Gln Trp Ser Ser Val Asp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
<210> 6
<211> 137
<212> PRT
<213> Vicugna pacos
<400> 6
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ile Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Ala Val Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Asp Cys Ser Gly Tyr Val Cys Tyr Asp Lys Glu Pro Leu
100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
130 135
<210> 7
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-4
<400> 7
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Ile Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Gly Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ala Cys Glu Gly Ala Gly Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
130 135 140
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
145 150 155 160
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
165 170 175
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
180 185 190
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
195 200 205
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
210 215 220
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
225 230 235 240
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
245 250 255
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
260 265 270
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
275 280 285
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
290 295 300
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
305 310 315 320
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
325 330 335
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 8
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-15
<400> 8
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Pro Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ile Pro Tyr Tyr Arg Thr Thr Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asn Ala Gln Asn Thr Val Ala Leu
65 70 75 80
Glu Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Ala Arg Ala Val Met Thr Val Thr Pro Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln
115 120 125
Asp Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile
130 135 140
Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala
145 150 155 160
Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
165 170 175
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
180 185 190
Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile
195 200 205
Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp
210 215 220
Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
225 230 235 240
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
245 250 255
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
260 265 270
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
275 280 285
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
290 295 300
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
305 310 315 320
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
325 330 335
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 9
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-20
<400> 9
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Leu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Glu Arg Glu Ile Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Asn Asp Asp Thr Thr Tyr Tyr Thr Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Glu Asn Phe Glu Met Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
130 135 140
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
145 150 155 160
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
165 170 175
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
180 185 190
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
195 200 205
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
210 215 220
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
225 230 235 240
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
245 250 255
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
260 265 270
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
275 280 285
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
290 295 300
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
305 310 315 320
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
325 330 335
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 10
<211> 351
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-52
<400> 10
Gln Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Val Met Ala Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Arg Glu Phe Val
35 40 45
Gly Ser Ile Met Trp Pro Thr Gly Thr Pro Leu Tyr Lys Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Val Gly Ala Ser Gly Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp
115 120 125
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
130 135 140
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
145 150 155 160
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
165 170 175
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
180 185 190
Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
195 200 205
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
210 215 220
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg
225 230 235 240
Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln
245 250 255
Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp
260 265 270
Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro
275 280 285
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
290 295 300
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
305 310 315 320
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
325 330 335
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 11
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-19B
<400> 11
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Ser Ile Val Ser Ile Asp
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Val Phe Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Gln Trp Ser Ser Val Asp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Gln Val Thr Val Ser Ser Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Thr
115 120 125
Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser
130 135 140
Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly
145 150 155 160
Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp
165 170 175
Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile
180 185 190
Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys
195 200 205
Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys
210 215 220
Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val
225 230 235 240
Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn
245 250 255
Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val
260 265 270
Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg
275 280 285
Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys
290 295 300
Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg
305 310 315 320
Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys
325 330 335
Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
340 345 350
<210> 12
<211> 360
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-35B
<400> 12
Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Ala Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ala Ala Ile Ser Trp Ile Gly Gly Leu Pro Tyr Tyr Ala Val Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Asp Cys Ser Gly Tyr Val Cys Tyr Asp Lys Glu Pro Leu
100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
Glu Pro Lys Thr Pro Lys Pro Gln Asp Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg
130 135 140
Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg
145 150 155 160
Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly
165 170 175
Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr
180 185 190
Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg
195 200 205
Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro
210 215 220
Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu
225 230 235 240
Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala
245 250 255
Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu
260 265 270
Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly
275 280 285
Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu
290 295 300
Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser
305 310 315 320
Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly
325 330 335
Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu
340 345 350
His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 13
<211> 357
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-J22.9
<400> 13
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln Arg Phe Met Thr Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Ser Asn
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Gln Ser Pro Lys Ala Leu Ile
35 40 45
Phe Ser Ala Ser Leu Arg Phe Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Ala Ala Ser Gly Ile Asp Phe Ser Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg
145 150 155 160
Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Asp
165 170 175
Ser Ser Thr Ile Asn Tyr Ala Pro Ser Leu Lys Asp Lys Phe Ile Ile
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Lys Val
195 200 205
Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys Ala Ser Leu Tyr Tyr Asp
210 215 220
Tyr Gly Asp Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr
245 250 255
Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala
260 265 270
Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile
275 280 285
Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser
290 295 300
Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg
305 310 315 320
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
325 330 335
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
340 345 350
Glu Gly Gly Cys Glu
355
<210> 14
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-4
<400> 14
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctcgtgga gtctggggga ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg attcactttg gattattatg ccataggctg gttccgccag 180
gccccaggga aggagcgcga gggggtctca tgtattggtg gtagtgatgg tagcacatac 240
tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaatgccaa gaacacggtg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gaaacctgag gacacggccg tttattactg tgcgacagca 360
tgtgaagggg ctggtgatgg tgactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 420
gaacccaaga caccaaaacc acaagacacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 840
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 960
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1116
<210> 15
<211> 1119
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-15
<400> 15
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctcgtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctcgctcaga 120
ctctcctgcg cagcctctgg acttaccttc agtgaatata ccatgggctg gttccgccag 180
cctccaggga aggagcgtga atttgtagcg gctattagtg gaggtggtat cccatactat 240
agaaccaccg tgaagggtcg attctccatc tccagagaca acgcccagaa cacggtcgct 300
ctggagatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc agcagatgcg 360
cgtgcggtga tgactgtgac tcccaactac tggggccagg ggacccaggt caccgtctcc 420
tcagaaccca agacaccaaa accacaagac accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 480
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 540
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg 600
cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa 660
cggggcagaa agaaactcct gtatatattc aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact 720
actcaagagg aagatggctg tagctgccga tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa 780
ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt accagcaggg ccagaaccag 840
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 900
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 960
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1020
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1080
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgc 1119
<210> 16
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-20
<400> 16
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctcgtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg acgcaccttc aatctgtatg ccatgggctg gttccgccag 180
actccaggga aggagcgtga aattgtagca gctattggct ggaatgatga caccacatac 240
tatacaggct ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaacacagtg 300
tatctgcaaa tgaacagtct gaaacctgag gacacggccg tttattactg tgcagcggat 360
gagaattttg agatgcccta tgactactgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 420
gaacccaaga caccaaaacc acaagacacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 840
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 960
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1116
<210> 17
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-52
<400> 17
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcagttgc agctcgtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg acgcaccttt agtgactatg tcatggcctg gttccgccag 180
gctcccggga aggatcgtga gtttgtagga tctattatgt ggcctaccgg taccccattg 240
tataaagact ccgtgaaggg ccgattcgcc atctccagag acaacgccaa gaagacgctg 300
tatctacaaa tgaacagtct gaaacctgag gacacggccg tgtattactg tgcggcggct 360
cgggttgggg caagtggata tgagtattgg ggccagggga cccaggtcac cgtctcctca 420
gaacccaaga caccaaaacc acaagacacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 840
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 960
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1116
<210> 18
<211> 1113
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-19B
<400> 18
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccgcaggtgc agctcgtgga gtctggggga ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga 120
ctctcctgta aagcctctgg aagcatcgtc agtatcgatt acatgggctg gtaccgccag 180
actccaggga agcagcgcga gttggtcgca ggtattaaca gtggtggtag tacatattat 240
gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa cacggtgttt 300
ctgcaaatga acagcctgaa acctgaggac acggccgttt attactgtgc tgctaggcag 360
tggagctcag ttgactttgc ttcctggggc caggggaccc aggtcaccgt ctcctcggaa 420
cccaagacac caaaaccaca agacaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 480
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 540
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 600
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 660
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 720
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 780
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat 840
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 900
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 960
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1020
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1080
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1113
<210> 19
<211> 1143
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-35B
<400> 19
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc aggtggtgga gtctggggga ggattggtgc aggctggggg ctctctgaga 120
ctctcctgtg cagcctctgg acgcaccttc agtagctatg ccatgggctg gttccgccag 180
gctccaggga aggagcgtga gtttgtagca gctattagct ggattggtgg tctgccatac 240
tatgcagtct ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaacgccaa gaacacgctg 300
tatctgcaaa tgaacagcct gaaatctgag gacacggccg tgtattactg tgcggctcac 360
gactgttcag gctatgtgtg ttatgacaag gagcccctat atgagtatga ctactggggc 420
caggggaccc aggtcaccgt ctcctcagaa cccaagacac caaaaccaca agacaccacg 480
acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg 540
cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc 600
gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca 660
ctggttatca ccctttactg caaacggggc agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa 720
ccatttatga gaccagtaca aactactcaa gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca 780
gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc 840
gcgtaccagc agggccagaa ccagctctat aacgagctca atctaggacg aagagaggag 900
tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg 960
aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac 1020
agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag 1080
ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct 1140
cgc 1143
<210> 20
<211> 1134
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-J22.9
<400> 20
atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60
cctgatatag tgatgactca aagtcaaaga tttatgacca catctgtcgg agatcgggtc 120
tctgtgacct gtaaggcatc ccagagtgtt gactccaacg tagcctggta ccagcagaaa 180
ccgcgacagt ctcccaaggc attgatattt tcagctagtc tgaggttttc aggtgtacct 240
gctcggttca ccgggtctgg tagcggaaca gacttcactt tgacaattag taatcttcaa 300
agtgaagacc ttgcggaata cttctgtcag cagtacaaca attatcccct tacctttggg 360
gcaggaacaa agcttgaatt gaagggcggc gggggttctg gtggcggcgg cagcggcggt 420
ggaggatcac aggtacagct tcagcagagc gggggaggtt tggtacaacc tggcggatct 480
ttgaaacttt cctgtgcagc ttcaggaata gacttttcac ggtactggat gagctgggtc 540
cgccgagcac ctgggaaagg tcttgaatgg attggggaga taaatccaga ttcttccaca 600
attaactatg ctcccagttt gaaggacaag ttcatcatta gccgcgataa cgctaaaaac 660
actttgtact tgcagatgag taaagtacgg agtgaggata cagcgttgta ctactgcgcg 720
agcttgtatt atgattacgg agatgccatg gattactggg gccaaggcac gtctgtgact 780
gtatcttcta ctacaactcc agcacccaga ccccctacac ctgctccaac tatcgcaagt 840
cagcccctgt cactgcgccc tgaagcctgt cgccctgctg ccgggggagc tgtgcatact 900
cggggactgg actttgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 960
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaggt tcagtgtcgt gaagagaggc 1020
cggaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cctttcatga ggcccgtgca gactacccag 1080
gaggaagatg gatgcagctg tagattccct gaagaggagg aaggaggctg tgag 1134
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lenti-For
<400> 21
tcaagcctca gacagtggtt c 21
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> Lenti-Rev
<400> 22
cctcataaag agacagcaac cagg 24
<210> 23
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-4 CDR1
<400> 23
Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala
1 5
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-4 CDR2
<400> 24
Ile Gly Gly Ser Asp Gly Ser Thr
1 5
<210> 25
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-4 CDR3
<400> 25
Ala Thr Ala Cys Glu Gly Ala Gly Asp Gly Asp Tyr
1 5 10
<210> 26
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-15 CDR1
<400> 26
Gly Leu Thr Phe Ser Glu Tyr Thr
1 5
<210> 27
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-15 CDR2
<400> 27
Ile Ser Gly Gly Gly Ile Pro
1 5
<210> 28
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-15 CDR3
<400> 28
Ala Ala Asp Ala Arg Ala Val Met Thr Val Thr Pro Asn Tyr
1 5 10
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-20 CDR1
<400> 29
Gly Arg Thr Phe Asn Leu Tyr Ala
1 5
<210> 30
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-20 CDR2
<400> 30
Ile Gly Trp Asn Asp Asp Thr Thr
1 5
<210> 31
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-20 CDR3
<400> 31
Ala Ala Asp Glu Asn Phe Glu Met Pro Tyr Asp Tyr
1 5 10
<210> 32
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-52 CDR1
<400> 32
Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr Val
1 5
<210> 33
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-52 CDR2
<400> 33
Ile Met Trp Pro Thr Gly Thr Pro
1 5
<210> 34
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-52 CDR3
<400> 34
Ala Ala Ala Arg Val Gly Ala Ser Gly Tyr Glu Tyr
1 5 10
<210> 35
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-19B CDR1
<400> 35
Gly Ser Ile Val Ser Ile Asp Tyr
1 5
<210> 36
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-19B CDR2
<400> 36
Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 37
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-19B CDR3
<400> 37
Ala Ala Arg Gln Trp Ser Ser Val Asp Phe Ala Ser
1 5 10
<210> 38
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-35B CDR1
<400> 38
Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 39
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-35B CDR2
<400> 39
Ile Ser Trp Ile Gly Gly Leu Pro
1 5
<210> 40
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-35B CDR3
<400> 40
Ala Ala His Asp Cys Ser Gly Tyr Val Cys Tyr Asp Lys Glu Pro Leu
1 5 10 15
Tyr Glu Tyr Asp Tyr
20
<210> 41
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-4-2
<400> 41
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Asp Tyr Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val
35 40 45
Ser Cys Ile Gly Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Ala Cys Glu Gly Ala Gly Asp Gly Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-15-2
<400> 42
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ile Pro Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Asp Ala Arg Ala Val Met Thr Val Thr Pro Asn Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 43
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-20-2
<400> 43
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Asn Leu Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Ile Val
35 40 45
Ala Ala Ile Gly Trp Asn Asp Asp Thr Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Asp Glu Asn Phe Glu Met Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-52-2
<400> 44
Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Phe Val
35 40 45
Gly Ser Ile Met Trp Pro Thr Gly Thr Pro Leu Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala Ala Arg Val Gly Ala Ser Gly Tyr Glu Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-19B-2
<400> 45
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser Ile Val Ser Ile Asp
20 25 30
Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gln Arg Glu Leu Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Gln Trp Ser Ser Val Asp Phe Ala Ser Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 128
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-35B-2
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Phe Val
35 40 45
Ser Ala Ile Ser Trp Ile Gly Gly Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ala His Asp Cys Ser Gly Tyr Val Cys Tyr Asp Lys Glu Pro Leu
100 105 110
Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210> 47
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-4-2
<400> 47
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgaggctg 60
agctgtgccg cctccggctt caccctggat tactatgcta tgggctggtt caggcaggct 120
cccggcaagg agcgggaggg agtgtcctgc atcggcggct ccgacggcag cacctattat 180
gccgacagcg tgaagggccg gttcaccatc tccagggata atgctaagaa caccctgtac 240
ctgcagatga attccctgag ggctgaggac accgccgtgt attactgtgc taccgcctgc 300
gagggcgccg gcgatggaga ttactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtccagc 357
<210> 48
<211> 360
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-15-2
<400> 48
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcgga ctggtgcagc ctggaggaag cctgcggctg 60
agctgtgccg cctccggact gaccttctcc gagtatacaa tgggttggtt ccggcaggcc 120
cccggcaagg agagggagtt cgtgtccgcc atcagcggcg gcggcatccc ttactacgcc 180
gactccgtga agggccggtt caccatcagc cgggacaacg ctaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaact ccctgcgggc cgaggatacc gctgtgtatt attgtgctgc tgacgctcgg 300
gctgtgatga ccgtgacccc taattattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccagc 360
<210> 49
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-20-2
<400> 49
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcgga ctggtgcagc caggaggaag cctgcggctg 60
agctgtgctg ccagcggcag gaccttcaac ctgtacgcta tgggttggtt caggcagacc 120
cccggcaagg gcctggagat cgtggccgct atcggctgga acgatgatac cacctattac 180
gccggctccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggata acgctaagaa caccctgtat 240
ctgcagatga actccctgcg ggctgaggac accgctgtgt attactgtgc cgccgacgag 300
aacttcgaga tgccttatga ctattggggc cagggcaccc tggtgaccgt gagcagc 357
<210> 50
<211> 357
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-52-2
<400> 50
gagctgcagc tggtggagag cggcggcgga ctggtgcagc caggaggaag cctgaggctg 60
agctgtgccg ccagcggcag aaccttcagc gactatgtga tggcctgggt gcggcaggct 120
cctggcaagg gactggagtt cgtgggcagc atcatgtggc ccaccggcac ccccctgtac 180
gccgattccg tgaagggccg gttcgctatc agccgggaca actccaagaa gaccctgtat 240
ctgcagatga acagcctgag ggctgaggac accgccgtgt attattgcgc tgctgcccgg 300
gtgggcgcca gcggatatga gtactggggc cagggcaccc tggtgaccgt gtccagc 357
<210> 51
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-19B-2
<400> 51
gaggtgcagc tggtggagag cggcggcgga ctggtgcagc caggaggaag cctgcggctg 60
tcctgtgctg cctccggctc catcgtgtcc atcgactata tgggctggta ccggcaggcc 120
cccggcaagc agagggagtt ggtggctggc atcaactccg gcggctccac ctattacgct 180
gatagcgtga agggccggtt caccatctcc cgggacaatg ctaagaacac cctgtacctg 240
cagatgaatt ccctgcgggc cgaggatacc gctgtgtact attgtgctgc ccggcagtgg 300
tccagcgtgg acttcgcctc ctggggccag ggcaccctgg tgacagtgtc ctcc 354
<210> 52
<211> 384
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> sdAb hu-35B-2
<400> 52
gaggtgcagc tggtggagtc cggcggcgga ctggtgcagc caggaggaag cctgaggctg 60
agctgtgccg cttccggcag gaccttcagc agctacgcta tgggttggtt caggcaggcc 120
cccggcaagg agagggagtt cgtgtccgcc atctcctgga tcggcggcct gacctactac 180
gccgactccg tgaagggcag gttcaccatc agcagggaca atgctaagaa caccctgtat 240
ctgcagatga attccctgag ggctgaggac accgctgtgt actactgtgc tgctcacgat 300
tgttccggct atgtgtgtta tgataaggag cccctgtacg agtatgacta ctggggccag 360
ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 384
<210> 53
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-4-2
<400> 53
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
35 40 45
Thr Leu Asp Tyr Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Gly Val Ser Cys Ile Gly Gly Ser Asp Gly Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Thr Ala Cys Glu Gly Ala Gly Asp Gly Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
130 135 140
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
165 170 175
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
180 185 190
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
195 200 205
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
210 215 220
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
225 230 235 240
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
245 250 255
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
260 265 270
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
275 280 285
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
290 295 300
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
305 310 315 320
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
325 330 335
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 54
<211> 364
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-15-2
<400> 54
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu
35 40 45
Thr Phe Ser Glu Tyr Thr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ser Ala Ile Ser Gly Gly Gly Ile Pro Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Ala Arg Ala Val Met Thr Val Thr Pro
115 120 125
Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr
130 135 140
Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro
145 150 155 160
Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val
165 170 175
His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro
180 185 190
Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu
195 200 205
Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro
210 215 220
Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys
225 230 235 240
Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe
245 250 255
Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu
260 265 270
Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp
275 280 285
Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys
290 295 300
Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala
305 310 315 320
Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys
325 330 335
Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr
340 345 350
Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 55
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-20-2
<400> 55
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Thr Phe Asn Leu Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Thr Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Ile Val Ala Ala Ile Gly Trp Asn Asp Asp Thr Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Gly Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Asp Glu Asn Phe Glu Met Pro Tyr Asp
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
130 135 140
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
165 170 175
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
180 185 190
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
195 200 205
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
210 215 220
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
225 230 235 240
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
245 250 255
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
260 265 270
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
275 280 285
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
290 295 300
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
305 310 315 320
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
325 330 335
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 56
<211> 363
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-52-2
<400> 56
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Leu Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Thr Phe Ser Asp Tyr Val Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Phe Val Gly Ser Ile Met Trp Pro Thr Gly Thr Pro Leu
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Ala Ile Ser Arg Asp Asn Ser
85 90 95
Lys Lys Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Ala Arg Val Gly Ala Ser Gly Tyr Glu
115 120 125
Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro
130 135 140
Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu
145 150 155 160
Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His
165 170 175
Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
180 185 190
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
195 200 205
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
210 215 220
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
225 230 235 240
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
245 250 255
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
260 265 270
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
275 280 285
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
290 295 300
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
305 310 315 320
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
325 330 335
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
340 345 350
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 57
<211> 362
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-19B-2
<400> 57
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Ser
35 40 45
Ile Val Ser Ile Asp Tyr Met Gly Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Gln Arg Glu Leu Val Ala Gly Ile Asn Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys
85 90 95
Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Arg Gln Trp Ser Ser Val Asp Phe Ala Ser
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala
130 135 140
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
145 150 155 160
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
165 170 175
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
180 185 190
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
195 200 205
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
210 215 220
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
225 230 235 240
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
245 250 255
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
260 265 270
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
275 280 285
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
290 295 300
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
305 310 315 320
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
325 330 335
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
340 345 350
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
355 360
<210> 58
<211> 372
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-35B-2
<400> 58
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu
20 25 30
Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Arg
35 40 45
Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys
50 55 60
Glu Arg Glu Phe Val Ser Ala Ile Ser Trp Ile Gly Gly Leu Thr Tyr
65 70 75 80
Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala
85 90 95
Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala His Asp Cys Ser Gly Tyr Val Cys Tyr
115 120 125
Asp Lys Glu Pro Leu Tyr Glu Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
130 135 140
Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
145 150 155 160
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
165 170 175
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
180 185 190
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
195 200 205
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
210 215 220
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
225 230 235 240
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
245 250 255
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
260 265 270
Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
275 280 285
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
290 295 300
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
305 310 315 320
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
325 330 335
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
340 345 350
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
355 360 365
Leu Pro Pro Arg
370
<210> 59
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-4-2
<400> 59
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gagcggcggc ggactggtgc agcctggagg aagcctgagg 120
ctgagctgtg ccgcctccgg cttcaccctg gattactatg ctatgggctg gttcaggcag 180
gctcccggca aggagcggga gggagtgtcc tgcatcggcg gctccgacgg cagcacctat 240
tatgccgaca gcgtgaaggg ccggttcacc atctccaggg ataatgctaa gaacaccctg 300
tacctgcaga tgaattccct gagggctgag gacaccgccg tgtattactg tgctaccgcc 360
tgcgagggcg ccggcgatgg agattactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccagc 420
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 480
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 540
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 600
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 660
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 720
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 780
gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 840
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 900
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 960
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1020
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1080
ccccctcgc 1089
<210> 60
<211> 1092
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-15-2
<400> 60
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gtccggcggc ggactggtgc agcctggagg aagcctgcgg 120
ctgagctgtg ccgcctccgg actgaccttc tccgagtata caatgggttg gttccggcag 180
gcccccggca aggagaggga gttcgtgtcc gccatcagcg gcggcggcat cccttactac 240
gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc agccgggaca acgctaagaa caccctgtac 300
ctgcagatga actccctgcg ggccgaggat accgctgtgt attattgtgc tgctgacgct 360
cgggctgtga tgaccgtgac ccctaattat tggggccagg gcaccctggt gaccgtgtcc 420
agcaccacga cgccagcgcc gcgaccacca acaccggcgc ccaccatcgc gtcgcagccc 480
ctgtccctgc gcccagaggc gtgccggcca gcggcggggg gcgcagtgca cacgaggggg 540
ctggacttcg cctgtgatat ctacatctgg gcgcccttgg ccgggacttg tggggtcctt 600
ctcctgtcac tggttatcac cctttactgc aaacggggca gaaagaaact cctgtatata 660
ttcaaacaac catttatgag accagtacaa actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc 720
cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt gaactgagag tgaagttcag caggagcgca 780
gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac cagctctata acgagctcaa tctaggacga 840
agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg accctgagat ggggggaaag 900
ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac tgcagaaaga taagatggcg 960
gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga ggggcaaggg gcacgatggc 1020
ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg acgcccttca catgcaggcc 1080
ctgccccctc gc 1092
<210> 61
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-20-2
<400> 61
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gagcggcggc ggactggtgc agccaggagg aagcctgcgg 120
ctgagctgtg ctgccagcgg caggaccttc aacctgtacg ctatgggttg gttcaggcag 180
acccccggca agggcctgga gatcgtggcc gctatcggct ggaacgatga taccacctat 240
tacgccggct ccgtgaaggg ccggttcacc atctcccggg ataacgctaa gaacaccctg 300
tatctgcaga tgaactccct gcgggctgag gacaccgctg tgtattactg tgccgccgac 360
gagaacttcg agatgcctta tgactattgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 420
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 480
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 540
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 600
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 660
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 720
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 780
gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 840
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 900
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 960
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1020
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1080
ccccctcgc 1089
<210> 62
<211> 1089
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-52-2
<400> 62
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggagctgc agctggtgga gagcggcggc ggactggtgc agccaggagg aagcctgagg 120
ctgagctgtg ccgccagcgg cagaaccttc agcgactatg tgatggcctg ggtgcggcag 180
gctcctggca agggactgga gttcgtgggc agcatcatgt ggcccaccgg cacccccctg 240
tacgccgatt ccgtgaaggg ccggttcgct atcagccggg acaactccaa gaagaccctg 300
tatctgcaga tgaacagcct gagggctgag gacaccgccg tgtattattg cgctgctgcc 360
cgggtgggcg ccagcggata tgagtactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgtccagc 420
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 480
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 540
gacttcgcct gtgatatcta catctgggcg cccttggccg ggacttgtgg ggtccttctc 600
ctgtcactgg ttatcaccct ttactgcaaa cggggcagaa agaaactcct gtatatattc 660
aaacaaccat ttatgagacc agtacaaact actcaagagg aagatggctg tagctgccga 720
tttccagaag aagaagaagg aggatgtgaa ctgagagtga agttcagcag gagcgcagac 780
gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag ctctataacg agctcaatct aggacgaaga 840
gaggagtacg atgttttgga caagagacgt ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg 900
agaaggaaga accctcagga aggcctgtac aatgaactgc agaaagataa gatggcggag 960
gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt 1020
taccagggtc tcagtacagc caccaaggac acctacgacg cccttcacat gcaggccctg 1080
ccccctcgc 1089
<210> 63
<211> 1086
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-19B-2
<400> 63
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gagcggcggc ggactggtgc agccaggagg aagcctgcgg 120
ctgtcctgtg ctgcctccgg ctccatcgtg tccatcgact atatgggctg gtaccggcag 180
gcccccggca agcagaggga gttggtggct ggcatcaact ccggcggctc cacctattac 240
gctgatagcg tgaagggccg gttcaccatc tcccgggaca atgctaagaa caccctgtac 300
ctgcagatga attccctgcg ggccgaggat accgctgtgt actattgtgc tgcccggcag 360
tggtccagcg tggacttcgc ctcctggggc cagggcaccc tggtgacagt gtcctccacc 420
acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc 480
ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac 540
ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg 600
tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa 660
caaccattta tgagaccagt acaaactact caagaggaag atggctgtag ctgccgattt 720
ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 780
cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 840
gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 900
aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 960
tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1020
cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1080
cctcgc 1086
<210> 64
<211> 1116
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> CAR-hu-35B-2
<400> 64
atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60
ccggaggtgc agctggtgga gtccggcggc ggactggtgc agccaggagg aagcctgagg 120
ctgagctgtg ccgcttccgg caggaccttc agcagctacg ctatgggttg gttcaggcag 180
gcccccggca aggagaggga gttcgtgtcc gccatctcct ggatcggcgg cctgacctac 240
tacgccgact ccgtgaaggg caggttcacc atcagcaggg acaatgctaa gaacaccctg 300
tatctgcaga tgaattccct gagggctgag gacaccgctg tgtactactg tgctgctcac 360
gattgttccg gctatgtgtg ttatgataag gagcccctgt acgagtatga ctactggggc 420
cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 480
gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 540
gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 600
ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaaacgg 660
ggcagaaaga aactcctgta tatattcaaa caaccattta tgagaccagt acaaactact 720
caagaggaag atggctgtag ctgccgattt ccagaagaag aagaaggagg atgtgaactg 780
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 840
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 900
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 960
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 1020
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 1080
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 1116
<210> 65
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-J22.9 scFv
<400> 65
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Ser Val Ile
20 25 30
Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
210 215 220
Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Leu Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 66
<211> 738
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-CAR-J22.9 scFv
<400> 66
gacatcgtgc tgacacagag ccctgccagc ctggccgtga gcctgggaga aagggccacc 60
atcaactgca gggcctccga aagcgtgagc gtgatcggcg cccacctgat ccactggtat 120
cagcagaagc ccggccagcc tcccaagctg ctgatctacc tggccagcaa cctggaaacc 180
ggcgtgcctg ccaggtttag cgggagcggc agcggcaccg atttcaccct gaccatcagc 240
agcctgcagg ccgaggacgc tgccatctac tactgcctgc agtccaggat cttccccagg 300
accttcggcc agggcaccaa gctggagatc aagggcagca ccagcggcag cggcaagccc 360
ggctccggag agggcagcac caagggccag gtgcagctgg tgcagagcgg cagcgagctg 420
aagaaacccg gcgccagcgt gaaggtgagc tgcaaggcca gcggctacac cttcaccgac 480
tacagcatca actgggtgag gcaggcccct ggacagggac tggagtggat gggctggatc 540
aacaccgaga ccagggagcc cgcctacgcc tacgacttca ggggcaggtt cgtgttcagc 600
ctggacacca gcgtgagcac cgcctacctg cagatcagca gcctgaaggc cgaggacacc 660
gccgtgtact actgcgccag ggactacagc tacgccatgg actactgggg ccagggcacc 720
ctggtgacag tgtccagc 738
<210> 67
<211> 1482
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-10-CAR DNA
<400> 67
atggccctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgccaga 60
cccgacatcg tgctgacaca gagccctgcc agcctggccg tgagcctggg agaaagggcc 120
accatcaact gcagggcctc cgaaagcgtg agcgtgatcg gcgcccacct gatccactgg 180
tatcagcaga agcccggcca gcctcccaag ctgctgatct acctggccag caacctggaa 240
accggcgtgc ctgccaggtt tagcgggagc ggcagcggca ccgatttcac cctgaccatc 300
agcagcctgc aggccgagga cgctgccatc tactactgcc tgcagtccag gatcttcccc 360
aggaccttcg gccagggcac caagctggag atcaagggca gcaccagcgg cagcggcaag 420
cccggctccg gagagggcag caccaagggc caggtgcagc tggtgcagag cggcagcgag 480
ctgaagaaac ccggcgccag cgtgaaggtg agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc 540
gactacagca tcaactgggt gaggcaggcc cctggacagg gactggagtg gatgggctgg 600
atcaacaccg agaccaggga gcccgcctac gcctacgact tcaggggcag gttcgtgttc 660
agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac 720
accgccgtgt actactgcgc cagggactac agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accctggtga cagtgtccag cgcggccgca accacaacac ctgctccaag gccccccaca 840
cccgctccaa ctatagccag ccaaccattg agcctcagac ctgaagcttg caggcccgca 900
gcaggaggcg ccgtccatac gcgaggcctg gacttcgcgt gtgatattta tatttgggcc 960
cctttggccg gaacatgtgg ggtgttgctt ctctcccttg tgatcactct gtattgtaag 1020
cgcgggagaa agaagctcct gtacatcttc aagcagcctt ttatgcgacc tgtgcaaacc 1080
actcaggaag aagatgggtg ttcatgccgc ttccccgagg aggaagaagg agggtgtgaa 1140
ctgagggtga aattttctag aagcgccgat gctcccgcat atcagcaggg tcagaatcag 1200
ctctacaatg aattgaatct cggcaggcga gaagagtacg atgttctgga caagagacgg 1260
ggcagggatc ccgagatggg gggaaagccc cggagaaaaa atcctcagga ggggttgtac 1320
aatgagctgc agaaggacaa gatggctgaa gcctatagcg agatcggaat gaaaggcgaa 1380
agacgcagag gcaaggggca tgacggtctg taccagggtc tctctacagc caccaaggac 1440
acttatgatg cgttgcatat gcaagccttg ccaccccgct aa 1482
<210> 68
<211> 493
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> BCMA-10-CAR PRT
<400> 68
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu
20 25 30
Ala Val Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Glu
35 40 45
Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys
50 55 60
Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu
65 70 75 80
Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Ala Ala Ile Tyr Tyr
100 105 110
Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly
130 135 140
Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu
145 150 155 160
Leu Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly
165 170 175
Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
180 185 190
Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro
195 200 205
Ala Tyr Ala Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr
210 215 220
Ser Val Ser Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp
225 230 235 240
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr
245 250 255
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Thr Thr
260 265 270
Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln
275 280 285
Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala
290 295 300
Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala
305 310 315 320
Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr
325 330 335
Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln
340 345 350
Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser
355 360 365
Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys
370 375 380
Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln
385 390 395 400
Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu
405 410 415
Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg
420 425 430
Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met
435 440 445
Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly
450 455 460
Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp
465 470 475 480
Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485 490

Claims (28)

1.嵌合抗原受体（CAR），其包含能够特异性结合BCMA的靶向部分、跨膜域、胞内共刺激信号传导结构域和胞内信号转导结构域，其中所述靶向部分包含VHH，所述VHH包含互补决定区1（CDR1）、互补决定区2（CDR2）和互补决定区3（CDR3），其中所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 36所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO: 37所示。
2.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分为VHH。
3.根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其中所述靶向部分包括SEQ ID NO: 5和45中任一项所示的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的跨膜域：CD8、CD28、4-1BB、CD4、CD27、CD7、PD-1、TRAC、TRBC、CD3ε、CD3ζ、CTLA-4、LAG-3、CD5、ICOS、OX40、NKG2D、2B4、CD244、FcεRIγ、BTLA、CD30、GITR、HVEM、DAP10、CD2、NKG2C、LIGHT、DAP12，CD40L、TIM1、CD226、DR3、CD45、CD80、CD86、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD134、CD137、CD154和SLAM。
5.根据权利要求4所述的嵌合抗原受体，其中所述跨膜域包含源自CD8的跨膜域。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内共刺激信号传导结构域：CD28、CD137、CD27、CD2、CD7、CD8、OX40、CD226、DR3、SLAM、CDS、ICAM-1、NKG2D、NKG2C、B7-H3、2B4、FcεRIγ、BTLA、GITR、HVEM、DAP10、DAP12、CD30、CD40、CD40L、TIM1、PD-1、LFA-1、LIGHT、JAML、CD244、CD100、ICOS、CD83的配体、CD40和MyD88。
7.根据权利要求6所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内共刺激信号传导结构域包含源自4-1BB的共刺激信号传导结构域。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号转导结构域包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的胞内信号转导结构域：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、CD3ε、CD79a、CD79b、FcεRIγ、FcεRIβ、FcγRIIa、牛白血病病毒gp30、Epstein-Barr 病毒（EBV）LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14 Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒（HSKV）、DAP10、DAP-12和至少包含一个ITAM的结构域。
9.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其中所述胞内信号转导结构域包含源自CD3的信号传导结构域。
10.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其在靶向部分和跨膜域之间包括铰链区，所述铰链区包含源自选自下组中的一种或多种蛋白的铰链区：CD28、IgG1、IgG4、IgD、4-1BB、CD4、CD27、CD7、CD8、PD-1、ICOS、OX40、NKG2D、NKG2C、FcεRIγ、BTLA、GITR、DAP10、CD40L、TIM1、CD226、SLAM、CD30和LIGHT。
11.根据权利要求10所述的嵌合抗原受体，所述铰链区包含源自CD8的铰链区。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的嵌合抗原受体，其包含SEQ ID NO: 11和57中任一项所示的氨基酸序列。
13.分离的抗原结合蛋白，其包含结合BCMA的VHH，所述VHH包含互补决定区1（CDR1）、互补决定区2（CDR2）和互补决定区3（CDR3），其中所述CDR1的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示，所述CDR2的氨基酸序列如SEQ ID NO: 36所示，所述CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示。
14.根据权利要求13所述的分离的抗原结合蛋白，其包括抗体或其抗原结合片段。
15.根据权利要求14所述的分离的抗原结合蛋白，其中所述抗体选自下组：嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体。
16.根据权利要求14所述的分离的抗原结合蛋白，其为VHH。
17.根据权利要求13-16中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，其包括SEQ ID NO: 5和45中任一项所示的氨基酸序列。
18.根据权利要求14所述的分离的抗原结合蛋白，其包括Fc序列。
19.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-12中任一项所述的嵌合抗原受体和/或权利要求13-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白。
20.根据权利要求19所述的分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO: 18、51和63中任一项所示的核苷酸序列。
21.载体，其包含权利要求19-20中任一项所述的分离的核酸分子。
22.根据权利要求21所述的载体，其为病毒载体。
23.根据权利要求21-22中任一项所述的载体，其为慢病毒载体。
24.细胞，其包含权利要求1-12中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求13-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求19-20中任一项所述的分离的核酸分子，和/或权利要求21-23中任一项所述的载体。
25.根据权利要求24所述的细胞，其包括免疫细胞。
26.根据权利要求24-25中任一项所述的细胞，其包括T细胞、B细胞、天然杀伤细胞（NK细胞）、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。
27.药物组合物，其包含权利要求1-12中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求13-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求19-20中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求21-23中任一项所述的载体，权利要求24-26中任一项所述的细胞，和/或药学上可接受的载剂。
28.权利要求1-12中任一项所述的嵌合抗原受体，权利要求13-18中任一项所述的分离的抗原结合蛋白，权利要求19-20中任一项所述的分离的核酸分子，权利要求21-23中任一项所述的载体，权利要求24-26中任一项所述的细胞，和/或权利要求27所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗多发性骨髓瘤。
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