CN112725380A

CN112725380A - 稳定表达外源蛋白CHO细胞高效表达体系及其筛选方法和在PCV2 Cap蛋白中的应用

Info

Publication number: CN112725380A
Application number: CN202110116061.4A
Authority: CN
Inventors: 何玉龙; 杨瑞; 舒建洪; 查银河
Original assignee: Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang Hongsheng Biotechnology Co ltd; Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2021-01-28
Filing date: 2021-01-28
Publication date: 2021-04-30

Abstract

本发明公开了一种CHO细胞高效表达体系，所述的CHO细胞中含有CAG启动子基因‑人干扰素‑α2信号肽基因‑Luc基因的真核表达载体。本发明还公开了一种所述的CHO细胞高效表达体系的筛选方法，所述的方法包括以下步骤：启动子的筛选和信号肽的筛选。本发明还公开了一种所述的CHO细胞高效表达体系在PCV2Cap蛋白表达中的应用，所述的应用是将PCV2Cap蛋白基因替换所述的真核表达载体中的Luc基因。本发明所述的CHO细胞高效表达体系使用时，直接将目的蛋白基因替换Luc基因，即可实现目的蛋白在CHO细胞中稳定高效分泌表达，且使用我们的体系在PCV2Cap蛋白的表达中的应用很成功。

Description

稳定表达外源蛋白CHO细胞高效表达体系及其筛选方法和在 PCV2 Cap蛋白中的应用

技术领域

本发明涉及稳定表达外源蛋白CHO细胞高效表达体系及其筛选方法和在PCV2 Cap蛋白中的应用，生物技术领域。

背景技术

在哺乳动物细胞表达系统中应用最为普遍的是中国仓鼠卵巢细胞(Chinesehamster ovary cells,CHO)表达系统。CHO细胞被广泛用作表达外源蛋白的宿主细胞的优势如下：(1)其具有高效的翻译后修饰能力，CHO细胞产生的重组蛋白与天然蛋白分子更相似；(2)CHO 细胞已被大量研究证明是一种安全的表达外源蛋白的宿主细胞，因此它们可能更容易从FDA 之类的监管机构获得销售生产治疗蛋白质的资格和批准；(3)使用其它哺乳动物细胞生产蛋白质的主要缺点是生产力低下，但其可以被CHO细胞中的基因扩增来克服；(4)CHO细胞更易于在无血清中进行悬浮细胞培养，通过无血清悬浮培养和驯化的方式，CHO细胞可以在特定的培养基中进行高密度高水平表达外源蛋白，为工业化生产提供了便利。

为了进一步提高目的蛋白在CHO细胞中的分泌表达量，转染质粒中的启动子和信号肽是关键，因此筛选合适的适用于CHO细胞表达的启动子和信号肽是实现CHO细胞高效表达的一个关键因素，但现有技术中筛选启动子和信号肽主要还是结合目的蛋白一个一个的来实验，通量小、时间长、成本高。因此，很有必要开发一种适用的筛选方法。

猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus Type 2,PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(Porcine Circovirus Associated Disease,PCVAD)的主要传播病原体之一，每年给我国乃至全球的仔猪养殖和育种业的发展造成巨大的经济损失。目前，疫苗接种是控制和预防PCVAD的主要措施。研究表明，衣壳蛋白(Cap)是PCV2的最具免疫原性的蛋白，与PCV2的感染和免疫密切相关。因此，Cap蛋白是开发PCV2疫苗的潜在靶蛋白。

发明内容

本发明要解决的技术问题一是提供一种CHO细胞高效表达体系及其筛选方法；二是该方法在PCV2 Cap蛋白表达中的应用。

因此，一方面，本发明提供了一种CHO细胞高效表达体系，其特征在于，所述的CHO细胞中含有CAG启动子基因-人干扰素-α2信号肽基因-Luc基因的真核表达载体。

优选地，本发明所述的CAG启动子基因如SEQ ID NO.7所示；所述的人干扰素-α2信号肽基因如SEQ ID NO.4所示。

优选地，本发明所述的Luc基因如SEQ ID NO.8所示。

优选地，本发明所述的CHO细胞为CHO-K1细胞；所述的真核表达载体为pcDNA3.1。

另一方面，本发明还提供了一种所述的CHO细胞高效表达体系的筛选方法，所述的方法包括以下步骤：1)启动子的筛选：将启动子基因和Luc基因克隆到真核表达载体中，以得到含有启动子基因-Luc基因的重组真核表达载体；将所述的重组真核表达载体转染至CHO细胞中，通过培养CHO细胞，再使用化学发光仪和werstern blot检测Luc蛋白的表达情况，筛选Luc表达量高的启动子用于后续信号肽的筛选；2)信号肽的筛选：将信号肽基因克隆到1) 中筛选的最优的含有启动子基因-Luc基因的重组真核表达载体中，得到含有启动子基因-信号肽基因-Luc基因的重组真核表达载体，所述的基因在重组真核表达载体中的排列顺序为启动子基因-信号肽基因-Luc基因；通过培养CHO细胞，再使用化学发光仪和werstern blot检测 Luc蛋白的表达情况，筛选Luc表达量高的信号肽，从而得到CHO细胞高效表达体系。

优选地，本发明所述的真核表达载体为pcDNA3.1，所述的CHO细胞为CHO-K1细胞。

再一方面，本发明还提供了一种所述的CHO细胞高效表达体系在PCV2 Cap蛋白表达中的应用，所述的应用是用PCV2-Cap蛋白的基因替换Luc基因，得到的CHO细胞含有CAG启动子-人干扰素-α2信号肽-PCV2-Cap蛋白的基因的真核表达载体。

优选地，本发明所述的PCV2-Cap蛋白的基因序列如SEQ ID NO.6所示。

优选地，本发明所述的真核表达载体中的核苷酸的排列顺序为SEQ ID NO.7-SEQID NO.4-SEQ ID NO.6。

优选地，本发明所述的CHO细胞株为CHO-K1细胞株；所述的真核表达载体为pcDNA3.1。

本发明所述的CHO细胞高效表达体系使用时，直接将目的蛋白基因替换Luc基因，即可实现目的蛋白在CHO细胞中稳定高效分泌表达，且使用我们的筛选方法可以很方便的筛选合适的启动子和信号肽。

为了获得高效表达PCV2 Cap蛋白的稳转CHO细胞株，本发明应用所述的体系和方法得到了稳定高效表达PCV2 Cap蛋白的稳转CHO细胞株。首先以荧光素酶(Luciferase，Luc) 为报告基因，筛选不同的启动子和信号肽对其在CHO-K1细胞中表达的影响，在此基础上，构建可表达PCV2 Cap蛋白的真核表达载体，转染CHO-K1细胞后筛选得到稳定表达Cap蛋白的细胞株。筛选得到的细胞株在实验室贴壁培养条件下，镍柱纯化后的重组Cap蛋白浓度为0.6mg/L；摇瓶培养条件下，产量能达到1.0g/L以上。且易纯化，因此易于规模化工业化生产。纯化重组的Cap蛋白免疫BALB/c小鼠，经抗体水平和淋巴细胞增殖实验等检测证明其具有良好免疫原性，可作为制备PCV2基因工程亚单位疫苗使用。

附图说明

图1pcDNA3.1-Luc重组载体构建示意图。

图2pcDNA3.1-CAG-Luc重组载体构建示意图。

图3启动子对报告基因Luc蛋白表达量的鉴定，其中A为Luc蛋白的Western Blot检测结果，B为蛋白Luc的表达量的灰度分析统计结果，C为Luc的化学发光检测结果。

图4pcDNA3.1-CAG-SP_X-Luc重组载体构建示意图。

图5信号肽对Luc报告基因表达的影响结果，其中A为Luc的化学发光检测结果，B为Luc蛋白的Western Blot检测结果。

图6pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap重组载体构建示意图。

图7不同细胞克隆重组蛋白Cap表达的Western Blot鉴定结果，其中A为Cap蛋白表达的Western Blot鉴定，B为Cap蛋白Western Blot的灰度分析统计分析。

图8重组Cap蛋白免疫小鼠后血清特异性抗体效价测定结果。

图9重组Cap蛋白免疫小鼠脾淋巴细胞增殖指数检测结果。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明中的一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明所涉及的化学试剂均为国产试剂。所提及试剂配方如下所示：

PBS：8gNaCl，0.2g KCl，1.44gNa₂HPO₄，0.24g KH₂PO₄溶于ddH₂O定容至1L；抗原包被缓冲液：1.59g Na₂CO₃，2.93g NaHCO₃，ddH₂O定容至1L；ELISA洗涤液：0.05％Tween-20 的PBS溶液；ELISA封闭液：5％脱脂奶粉，5％BSA的PBS溶液；ELISA抗体稀释液：2％脱脂奶粉，1％BSA的PBS溶液；ELISA终止液：2M H₂SO₄。

实施例1 CHO细胞高效表达体系的建立

以载体商品化pAAV-CAG-RFP和pNFκB-TA-Luc质粒为模板，设计引物通过PCR技术分别扩增CAG启动子基因和Luc报告基因，PCR扩增引物反应体系如表1所示。

表1 PCR引物设计

用限制性内切酶BglII和XbaI将上述扩增的CAG和Luc基因酶切，利用分子生物学方法连入pcDNA3.1载体。得到pcDNA3.1-CAG-Luc和pcDNA3.1-Luc(注：原载体为CMV启动子)重组载体，载体图谱如图1和图2所示。

将上述获得的分别携带有CAG和CMV启动子的重组质粒pcDNA3.1-CAG-Luc和pcDNA3.1-Luc通过CaCl₂法转化TG1感受态细胞，筛选阳性克隆。提取质粒，通过FuGENE6(Promega公司)试剂转染培养密度约为4.5×10⁶的CHO-K1细胞中，转染72h后收集细胞进行裂解后蛋白表达鉴定。经化学发光仪检测Luc蛋白的表达水平，同时以anti-Luc(北京博奥森生物技术有限公司，货号：bsm-33318M)为一抗，通过Western Blot方法检测Luc蛋白的表达情况，以筛选表达量高的启动子供后期使用，结果证实CAG启动子的效果优于CMV 启动子(P<0.05或P<0.001)，如图3所示。

选择以下5种基因的信号肽：SP1(人血清白蛋白)；SP2(氮杂环蛋白前体蛋白)；SP3(小鼠信号肽IgGκ)；SP4(人干扰素-α2)和SP5(人白细胞介素-2)的信号肽序列。根据载体和基因的序列选择适当的酶切位点，分别通过化学合成如下两端分别携带XbaI和XhoI限制性内切酶酶切位点的信号肽序列：①XbaI-SP1-XhoI；②XbaI-SP2-XhoI；③XbaI-SP3-XhoI、④XbaI-SP4-XhoI和⑤XbaI-SP5-XhoI，五条序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。

用限制性内切酶XbaI和XhoI将上述合成的序列①、②、③、④和⑤分别双酶切，利用分子生物学方法连入pcDNA3.1-CAG-Luc载体。得到pcDNA3.1-CAG-SP_X-Luc重组载体，载体图谱如图4所示。

将上述获得的重组质粒pcDNA3.1-CAG-SP_X-Luc通过CaCl₂法转化入TG1感受态细胞中，筛选出阳性克隆。提取质粒，通过FuGENE6(Promega公司)试剂转染入密度约为4.5×10⁶的CHO-K1细胞中，转染72h后收集细胞培养上清液，同时裂解细胞收集裂解液进行蛋白表达鉴定。经化学发光仪检测Luc蛋白的表达水平，同时以anti-Luc为一抗，通过Western Blot方法检测Luc蛋白的表达情况，以筛选表达量高的信号肽供后期使用，结果证实，带有SP4信号肽的重组质粒的细胞，在细胞培养液中分泌的目的蛋白和细胞中表达的目的蛋白量较高，如图5所示。

通过对不同启动子和信号肽的筛选，证实携带有CAG启动子和SP4信号肽的重组载体目的蛋白表达量最高，建立了一种CHO细胞高效表达外源蛋白的体系。

实施例2稳定表达猪圆环病毒2型Cap蛋白CHO细胞株的建立

在NCBI数据库中查找山东株PCV2 Cap基因序列(登录号：KY656098.1)，删除核定位信号肽(1-123bp)，对剩余579bp的核酸序列进行基于CHO细胞表达系统的密码子优化。根据载体和基因的序列选择适当的酶切位点，化学合成如下融合基因：⑥XhoI-Cap-6×His-TGA-EcoRI，其中TGA为终止密码子。序列如SEQ ID NO.6所示。

用XhoI和EcoRI将序列⑥双酶切，利用分子生物学方法连入pcDNA3.1-CAG-SP4载体中。得到pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap重组载体，载体图谱如图6所示。

将上述获得的重组质粒pcDNA3.1-CAG-SP4-Cap通过CaCl₂法转化入TG1感受态细胞，筛选出阳性克隆。提取质粒，通过FuGENE6试剂转染入密度约为4.5×10⁶的CHO-K1细胞中，转染24h后用终浓度为700μg/mL G418的完全培养基换液继续培养；每日在显微镜下观察细胞状态，每48h用终浓度为700μg/mL G418的完全培养基换液。待对照组所有细胞完全死亡后，将G418浓度降低为350μg/mL继续培养，当阳性对照组在显微镜下观察到单克隆细胞时，将实验组的细胞传达至60mm培养皿中继续培养，通过有限稀释法在96孔培养板中筛选出单克隆细胞株。

将筛选出的单克隆细胞株扩大培养后收集培养上清液与细胞裂解液进行SDS-PAGE电泳和Western Blot检测重组蛋白的表达情况。通过BCA蛋白定量和Western Blot结果显示细胞裂解液中和细胞培养上清液中均有蛋白的表达，说明已筛选得到可分泌表达Cap蛋白的CHO 细胞株。经过计算，在实验室贴壁培养条件下，镍柱纯化后的重组Cap蛋白浓度为0.6mg/L；摇瓶培养条件下，产量能达到1.0g/L以上。

将通过筛选获得的8株CHO-K1细胞分别扩大培养，收集细胞以裂解后获取目的蛋白进行鉴定。以anti-Cap(北京博奥森生物技术有限公司，货号：bs-10057R)为一抗，通过Western Blot方法检测重组蛋白的表达情况，结果如图7A所示，在25-35kDa处可观察到条带，与理论大小26.1kDa相符，基于此可以判断出8种细胞株(SP4-1、SP4-2、SP4-3、SP4-5、SP4-6、 SP4-7、SP4-9、SP4-11)中SP4-1株、SP4-2株、SP4-3株、SP4-5株、SP4-9株和SP4-11株都可稳定表达Cap蛋白。

为了获得具有较强细胞增殖能力的细胞株，通过MTT实验对表达量较高的SP4-1、SP4-2、 SP4-3和SP4-54株CHO-K1细胞进行筛选。在MTT实验中，设置空白对照组(无细胞及G418，只有完全培养基)和实验组(有细胞及完全培养基，加G418)；每组设置3个复孔，连续培养96h后，进行MTT测试，结果发现SP4-1细胞株具有较强的增殖能力，如图7B所示。扩增增殖能力较强的SP4-1单克隆细胞株，收集细胞裂解液，通过镍柱纯化Cap蛋白后于-80℃冰箱保存备用。

实施例3 CHO细胞表达的重组Cap蛋白免疫原性分析

将24只6-8周龄的雌性BALB/c小鼠随机分成以下三组：①PBS阴性对照组；②Cap蛋白实验组；③PCV2疫苗(圆立优，金宇生物技术股份有限公司)阳性对照组，每组8只。采用皮下注射途径，分别在第0、14和28d进行免疫注射。其中PBS组每只小鼠注射无菌 PBS 200μL，阳性疫苗组每只小鼠免疫100μL商品化圆立优疫苗，实验组每只小鼠免疫25μg Cap蛋白。分别在第7、14、28、35和42d进行尾部取血，在第14、28、35和42d分别对每组3只小鼠进行脾淋巴细胞增殖实验分析。

具体检测步骤如下：

(1)抗体水平检测：为了评估小鼠对于抗原刺激所产生的体液免疫效应，采用间接ELISA 法，用经缓冲液稀释后浓度为1μg/mL原核表达的Cap抗原蛋白包被，ELISA封闭液封闭，分别孵育以上7、14、28、35和42d五个时间段采集的血清，再孵育二抗，加显色液显色，其中每两步间均用ELISA洗涤液洗板4次，每次1min。最后加入ELISA终止液终止显色反应，450nm波长下检测OD值。结果如图8所示，实验组小鼠针对抗原表现出显著的特异性IgG反应(P<0.001)，表明CHO细胞表达的重组Cap蛋白具有良好的免疫原性。

(2)脾淋巴细胞增殖实验：为了评估小鼠对于抗原刺激所产生的细胞免疫效应，使用小鼠淋巴细胞分离液(北京达科为生物技术有限公司)分离14、28、35和42d的各组小鼠的脾淋巴细胞，具体操作流程见产品说明书。计数分离后的各组小鼠脾淋巴细胞，96孔板每孔加入稀释至密度为4.5×10⁶cells/mL的细胞悬液100μL。待细胞贴壁后，分别在每孔加入100 μL稀释后的重组Cap抗原蛋白(终浓度为10μg/mL)、1640培养基与阳性对照(刀豆蛋白，终浓度10μg/mL)。将细胞放入CO₂培养箱培养42h后每孔加入20μg MTT(5mg/mL)，继续培养4h，弃尽细胞培养上清液，每孔加入100μLDMSO溶液，振荡器上震荡混匀5min，最后检测490nm波长下的OD值，计算刺激指数(SI＝刺激孔OD值/未刺激孔OD值)。结果发现免疫后28d开始显著高于PBS组和阳性疫苗组(P<0.05、P<0.01或P<0.001)，如图9 所示，其中NS表示无显著性差异，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。Cap 免疫实验组的小鼠相比较于PBS阴性对照组和商品化疫苗阳性对照组，对于抗原刺激表现较高的刺激指数(SI)，表明CHO细胞表达的重组Cap蛋白免疫后能引发小鼠体内产生特异性的细胞免疫效应。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>浙江洪晟生物科技股份有限公司浙江理工大学

<120>稳定表达外源蛋白CHO细胞高效表达体系及其筛选方法和在PCV2 Cap蛋白中的应用

<160>5

<170>PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>57

<212>DNA

<213>SP1序列

<400> 1

atgaagtggg tgaccttcat ctccctgctg ttcctgtttt ccagctcttc cagggcc 57

<210> 2

<211>57

<212>DNA

<213>SP2序列

<400> 2

atgaccaggc tgacagtgct ggccctgctg gctggactgc tggcctccag ccgggct 57

<210>3

<211>60

<212>DNA

<213>SP3序列

<400>3

atggagaccg acacactgct gctgtgggtg ctgctgctgt gggtgccagg ctccaccggc 60

<210>4

<211>69

<212>DNA

<213>SP4序列

<400>4

atggccctga ccttcgctct gctggtggcc ctgctggtgc tgtcttgcaa gtccagctgt 60

tccgtgggc 69

<210>5

<211>60

<212>DNA

<213>SP5序列

<400>5

atgaggcgga tgcagctgct gctgctgatc gccctgtccc tggctctggt gaccaacagc 60

<210>6

<211>579

<212>DNA

<213>Cap序列

<400>6

aacggcatct tcaatacaag actgtctcgc acatttggct ataccgtgaa gaagaccaca 60

gtgaggaccc catcctggaa ggtggacatg atgcggttca acatcaatga ttttctgcca 120

cctggaggag gctccaaccc actgagcgtg cccttcgagt actataggat caggaaggtg 180

aaggtggagt tttggccctg ctcccctatc acccagggcg acaggggagt gggctccagc 240

gccgtgatcc tggacgataa cttcgtgacc aaggccacag ctctgaccta cgatccttat 300

gtgaattact cttccagaca caccatcaca cagccattca gctatcattc tcgctacttt 360

acacctaagc cagtgctgga cagcaccatc gattatttcc agcccaacaa taagaggaac 420

cagctgtggc tgcggctgca gaccacaggc aatgtggacc acgtgggcct gggcacagct 480

tttgagaact ctatctatga tcaggagtac aatatcagag tgaccatgta cgtgcagttc 540

cgcgagttta acctgaagga cccacccctg aatcctaag 579

<210>7

<211>659

<212>DNA

<213>CAG启动子基因序列

<400>7

gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60

catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120

acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180

ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240

aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300

ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360

tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 420

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 480

tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 540

gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 600

cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcg 659

Claims

1.一种CHO细胞高效表达体系，其特征在于，所述的CHO细胞中含有CAG启动子基因-人干扰素-α2信号肽基因-Luc基因的真核表达载体。

2.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述的CAG启动子基因如SEQ ID NO.7所示；所述的人干扰素-α2信号肽基因如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述的Luc基因如SEQ ID NO.8所示。

4.根据权利要求1所述的体系，其特征在于，所述的CHO细胞为CHO-K1细胞；所述的真核表达载体为pcDNA3.1。

5.一种如权利要求1所述的CHO细胞高效表达体系的筛选方法，其特征在于，所述的方法包括以下步骤：

1)启动子的筛选：将启动子基因和Luc基因克隆到真核表达载体中，以得到含有启动子基因-Luc基因的重组真核表达载体；将所述的重组真核表达载体转染至CHO细胞中，通过培养CHO细胞，再使用化学发光仪和wersternblot检测Luc蛋白的表达情况，筛选Luc表达量高的启动子用于后续信号肽的筛选；

2)信号肽的筛选：将信号肽基因克隆到1)中筛选的最优的含有启动子基因-Luc基因的重组真核表达载体中，得到含有启动子基因-信号肽基因-Luc基因的重组真核表达载体，所述的基因在重组真核表达载体中的排列顺序为启动子基因-信号肽基因-Luc基因；通过培养CHO细胞，再使用化学发光仪和werstern blot检测Luc蛋白的表达情况，筛选Luc表达量高的信号肽，从而得到CHO细胞高效表达体系。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的真核表达载体为pcDNA3.1，所述的CHO细胞为CHO-K1细胞。

7.一种如权利要求1所述的CHO细胞高效表达体系在PCV2 Cap蛋白表达中的应用，其特征在于，用PCV2-Cap蛋白的基因替换Luc基因，得到的CHO细胞含有CAG启动子-人干扰素-α2信号肽-PCV2-Cap蛋白的基因的真核表达载体。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的PCV2-Cap蛋白的基因序列如SEQ IDNO.6所示。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的真核表达载体中的核苷酸的排列顺序为SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的CHO细胞株为CHO-K1细胞株；所述的真核表达载体为pcDNA3.1。