CN112683990A - Maldi-tof ms微生物鉴定样本生物安全前处理方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及MALDI‑TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法。本发明首先提供一种具有生物安全性的样本制备床和样本制备装置，样本制备床既能够制备微量可供检测的生物安全性样品，也能够制备大体积量的生物安全性样品，制备过程无需离心，整个过程只需要1分钟即可完成。样本制备装置含有本发明的样本制备床，用于制备适用于MALDI‑TOF MS微生物鉴定的样品更加省时省力，并且通量高，极大地满足各级检测机构对具有生物安全风险样品的检测需求，确保操作者的安全、检测设备和环境的安全，降低生物安全风险。

Description

MALDI-TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法

技术领域

本发明涉及MALDI-TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法，属于生物医药类微生物检测样品提取装置领域。

背景技术

病原体的快速、准确识别是临床感染诊断、传染病预防控制、食品安全等公共卫生问题的关键因素。随着软电离技术的发展，基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）的微生物识别技术也随之问世，该技术是在完整的微生物中添加酸性基质辅助细胞裂解，激光激发细胞裂解物（小蛋白或多肽）形成肽质量指纹谱，与已构建的属、种水平的共性参考谱库进行比对分析，从而实现微生物的鉴定。目前该技术体系已经成熟，其快速、自动化高通量、准确的特性已使其在全球临床诊断、质检、传染病监测、食品安全等领域占有一席之地，并迅速发展。商业化的质谱微生物鉴定系统继布鲁克及岛津公司之后，国内质谱研发及生产厂家正蓬勃发展。为提高公共卫生病原检测能力，我国各级疾控系统均在配备质谱微生物鉴定系统，以提高未知病原快速鉴定能力。微生物鉴定用质谱使用主要包括四个流程：样本制备、点靶、上机检测、数据库检索鉴定。样本制备的优劣直接影响谱图的质量及鉴定成功率。

目前，微生物质谱鉴定样本制备的方法主要有直接涂抹法、扩展直接涂抹法、提取法、以及本发明人前期开发的沉淀涂抹法。（1）直接涂抹法，是将待检测的菌株样本直接涂抹到样本靶上，点上基质溶液后即可上机，该方法快速但鉴定效率低（是提取法的50%-75%），因只靠基质溶液覆盖，存在覆盖不完全的问题，导致病原容易暴露，无法杀死绝大多数病原，具有巨大的生物安全隐患。（2）扩展的直接涂抹法，是在覆盖基质前，先覆盖70%的甲酸溶液，用于辅助细胞破壁裂解，增加鉴定成功率，与直接涂抹法比较鉴定能力略有提高，但溶液成分不能完全杀死病原体，尤其是厚壁、荚膜及芽孢菌，生物安全隐患无法解决。（3）提取法是利用提取液提取病原菌蛋白，鉴定能力非常好，生物安全性也高于涂抹法，但对于厚壁、芽孢等微生物，提取法仍然无法杀灭病原，具有生物安全隐患，极易造成过严重的生物安全事故。（4）沉淀涂抹法更适用于微量病原的质谱鉴定，谱图质量与提取法相当，但生物安全性低于提取法。

目前全球范围内没有用于质谱微生物检测样本生物安全提取的商业化产品。现有技术报道的适用于MALDI-TOF MS方法的待测样本制备过程中，存在生物安全风险，这是由于待鉴定的微生物都是未知微生物，操作者不能根据菌株的外观形态判断该微生物是否是高致病性的，也不能提前预知待测微生物是否带有荚膜或芽孢，只能统一按照一个生物安全等级进行样本前处理，对于厚壁、芽孢等微生物，目前的提取装置无法简便快速杀灭或隔离病原，具有生物安全隐患。假如已知待检测微生物是带有芽孢或荚膜的病原微生物，在提取样品后还需要对可能存在的芽孢或菌体做过滤处理，而能完成过滤芽孢或菌体的装置只有超滤管或滤器。常用的超滤管是密理博公司的产品，价格贵，每个在30元以上，并且该超滤管所需要的样本体积至少要50-100微升，且需要是菌浓度高于10⁸CFU/ml的菌液，对于常规培养出来的单菌落因获得的滤液中蛋白成分达不到质谱的检测限而无法进行鉴定（菌量不足的菌液样品）；而常规的滤器处理的样本体积更大，至少要200微升以上。因此浓度低、体积小的微量的菌液根本无法应用现有技术的方法制得适用于MALDI-TOF MS方法的样本。

为适应和推广微生物质谱鉴定系统在全国范围内的广泛应用，本领域迫切需要一种简便、快速同时又具备生物安全性的处理微生物样品的方法和装置。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有生物安全性的、用于MALDI-TOF MS微生物鉴定样本生物安全前处理方法。

本发明首先提供的一种具有操作简便、省时省力、具有生物安全性的样本制备床，包括管体，管盖和与管体底部连接的导流柱；

所述管体的底部铺放滤膜或超滤膜，且管体底部设置有开口，所述开口连接导流柱；

所述管盖通过连接部与管体连接，管盖、管体和连接部之间一体成型；

所述管盖的底部封口，具有非镂空的管底平面，盖上管盖后，管盖底部平面能够与管体底部的滤膜或超滤膜相接触。

本发明中，设置管盖盖上后，管盖底部能够与滤膜或超滤膜相接触，是考虑到管盖盖上的过程中，依靠管盖的压力推进，使管体内的空气产生正向压力，使得加入管体的样本液体流过滤膜并截留细菌菌体或截留细胞，或截留蛋白。

每个样本制备床只放置一张滤膜。一个样本想要截留不同尺寸的物质，使用不同滤膜孔径的样品制备床。

本发明中，所述滤膜为膜孔径范围为0.01-0.2μm的滤膜，或孔径范围为5μm的滤膜，或孔径范围为0.002-0.01μm的滤膜。

本领域技术人员应当理解，用于微生物鉴定用的率膜孔径范围为至0.01到0.2μm，用于血细胞截留滤膜孔径范围为5μm，用于蛋白截留滤膜孔径范围为0.002到0.01μm。

本发明提供的样本制备床中，所述管体自上而下内径均匀一致；所述管盖其嵌入管体的部分自上而下外径均匀一致。

优选地，管体内径与管盖嵌入管体部分的外径之差d为≥0.0001μm。

进一步优选地，所述管盖底部周围箍套垫圈，起到密封作用。

为增加管盖与垫圈的嵌合力度，本发明在管盖底部外径内缩，使管盖嵌入管体部分的纵切面呈现倒“凸”字型，内缩部分的管盖底部周围箍套弹性垫圈，如橡皮质地的垫圈，以增加管盖与管体的密封性。

更优选地，为增加管盖与垫圈的嵌合力度，防止垫圈脱落，本发明在管盖嵌入管体部分上，距离管盖底部0.1-2 mm距离设置一内陷凹槽，凹槽内箍套弹性垫圈。

本发明还提供一种样本制备装置，包括上述的样本制备床和助力架，所述助力架由底座，样本管架，样本制备床架组成；底座上可拆卸地固定样本管架，样本制备床架可拆卸地固定在样本管架上。即底座上自下而上依次可拆卸地固定样本管架、样本制备床架。

所述样本管架能够放置一个或多个样本管，所述样本制备床架能够放置一个或多个样本制备床；

所述样本制备床架上的样本制备床的导流柱与所述样本管架上的样本管口对应，使样本管能够接收样本制备床导流柱内流出的液体样本。

进一步优选地，本发明的样本制备装置，还包括压力盖，所述压力盖与底座一侧边缘通过转轴连接，按压压力盖，下压样本制备床架上放置的样本制备床的管盖，使样本管架上的样本管收集到样本制备床导流柱的流出液。

本发明提供了上述样本制备床或样本制备装置在以下任一种应用：

（1）在制备具有生物安全的待检测样本中的应用；

（2）在蛋白截留纯化中的应用。

（3）通过改变滤膜孔径，用于任意使用目的为截留不同分子量的样本的制作。

本发明提供了用于MALDI-TOF MS微生物鉴定的样本生物安全前处理方法，采用本发明所述的样本制备床或所述的样本制备装置制备液体样品。

具体地，上述方法是将待检测的微生物样本加入样本制备床的管体内，加入样本提取液，盖上管盖，通过导流柱得到的流出液用于后续进行质谱鉴定；通常一个菌落加10-20 ul样本提取液，半接种环加100 ul样本提取液。

所述样本制备床的管体底部仅铺一张滤膜，且滤膜的孔径为0.01微米-5微米。

本发明提供一种具有生物安全性的血液样本前处理方法，采用所述的样本制备床或所述的样本制备装置制备液体样品，先采用滤膜孔径为5微米的样本制备床过滤得到去除血细胞的滤液，再将滤液加入滤膜孔径为0.2微米的样本制备床过滤后弃去滤液，在样本制备床截留的细菌中加入样本提取液，通过导流柱得到的流出液用于后续进行质谱鉴定。

本发明的一个实施例中，记载初始样本是血液，要得到血液中的病原菌并用于MALDI-TOF MS检测，样本的处理需要两步：首先用膜孔径为5微米的本发明的样本制备床先把血细胞截留（细菌一般小于5微米，血细胞大于5微米）；然后滤液加入到滤膜为0.2微米孔径的本发明的样本制备床的管体内，截留细菌弃掉滤液，再加入样本提取液，通过导流柱得到的流出液用于后续进行质谱鉴定。样本提取液为本领域内公知的用于MALDI-TOF MS样本前处理使用的多种试剂的组合。

在本发明的实施例中，选用的样本提取液为50%-90%的甲酸和70%-100%的乙腈按1：1的比例混合得到。

本发明提供的样本制备床能够快速方便地获得具有生物安全性的蛋白样品，用于MALDI-TOF MS检测，只需要在本发明的样本制备床中加入样品提取液，菌株用接种环悬在提取液中，压出即得到蛋白样本；或液体培养的菌株离心收集细菌，并用PBS清洗一次，然后挑取适量的菌株加入样本制备管中混匀，盖上管盖，过滤得到。本发明提供的样本制备床既能够制备微量可供检测的生物安全性样品（可处理5-200ul的样本，检测菌量可以从一个单菌落到5mg），也能够制备大体积量的生物安全性样品，制备过程无需离心，整个过程只需要1分钟即可完成，比传统方法的样本制备速度提高8-10倍，且成本低，单个样本制备床约2元人民币。本发明的样本制备床可单独用于所有实验需求的除菌、除病毒、蛋白截留、血液等体液中的细胞或微生物截留分离以及所有涉及分子量截留的组份分离。

使用本发明的样本制备装置，更加省时省力，并且通量高，一次可以进行1-96个样本的制备，能够极大地满足各级检测机构对具有生物安全风险样品的检测需求，所制备的样本稳定性至少可达半年，确保操作者的安全，降低生物安全风险。适用于目前国际及国内所有的基于MALTDI-TOF MS的微生物快速检测系统，因其快速、制备的样本具有生物安全性，可在临床、疾控、质检等各种系统大规模推广使用。

附图说明

图1为本发明提供的样本制备床，图中：1、管盖，2、连接部，3、管盖嵌入管体部分，4、弹性垫圈，5、管体，6、滤膜，7、导流柱。

图2为本发明提供的样本制备床制备样品和用于MALDI-TOF MS鉴定的流程图，图中显示样品制备床的管体内加入提取液，用接种环刮取适量菌落加入样品制备床管体中，盖上管盖，样本管中得到样本液，样本液点于样品靶上，覆盖基质饱和液，干燥后进入质谱仪检测，采集数据并进行数据库检索。

图3为本发明提供的样本制备装置的主视纵切面示意图，图中：8、样本制备床，9、样本制备床架，10、样本管，11、样本管架，12、底座。

图4为具有压力盖的样本制备装置侧视纵切面示意图，图中：9、样本制备床架，11、样本管架，12、底座，13、压力盖，14、转轴。

图5为传统提取法制样样本质谱图；菌株从上至下依次为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌。

图6为本发明试剂盒制样样本质谱图；菌株从上至下依次为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌。

图7为生物安全测试结果，A1: 常规提取法制样后样本传代培养情况；A2: 本发明样本制备床制样后样本传代培养情况；B: 炭疽芽孢杆菌常规提取法与本发明样本试剂盒制样后样本传代培养情况； 1大肠杆菌，2 金黄色葡萄球菌，3枯草芽孢杆菌 ，4 肺炎链球菌，5 炭疽芽孢杆菌（常规方法制备样本），6 炭疽芽孢杆菌 （本发明样本制备床制备）。

图8为试剂盒稳定性测试结果图，从上到下分别是采用本发明试剂盒生产出2,4,6,8,10,12 个月制备的大肠杆菌样本质谱图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。本发明中述及的样品提取液为50～90%的甲酸和70～100%的乙腈按1：1的比例混合得到的液体；基质溶解液：1～5%三氟乙酸和40～60%乙腈水溶液，基质：α-氰基-4-羟基肉桂酸(α-cyano-4-hydroxyinnamic acid, CHCA)。基质饱和液是把基质溶解在基质溶解液中制备的饱和溶液。

实施例1

如图1所示，本发明提供的样本制备床，图中1、管盖，2、连接部，3、管盖嵌入管体部分，4、弹性垫圈，5、管体，6、滤膜，7、导流柱。

（1）初始样品为血液，要采用MALDI-TOF MS质谱仪鉴定血液中的病原菌。方法为：首先用膜孔径为5微米的本发明的样本制备床先把血细胞截留（细菌一般小于5微米，血细胞大于5微米）；然后滤液加入到滤膜为0.2微米孔径的本发明的样本制备床的管体内，截留细菌弃掉滤液，再加入样本提取液，通过导流柱得到的流出液用于后续进行质谱鉴定。

（2）初始样品为固体培养基上或液体培养的未知菌落。方法为：向样品制备床的管体内加入样品提取液，再用接种环刮取培养基中培养的单个或多个菌落加入样品制备床管体中混匀；液体培养的菌株离心收集细菌，并用PBS清洗一次，然后挑取适量的菌株加入样本制备管中混匀，盖上管盖，样本制备床管盖合上过程靠压力推进，内部空气产生的正向压力，使管体内液体流过滤膜并截留菌体，滤液通过导流柱流出，即为适用于MALDI-TOF MS质谱仪鉴定用的待检测样品。

为避免气溶胶产生危害，在生物安全柜内使用本发明提供的样本制备床制备样本，使用后的样本制备床作为污染物高压处理，通过导流柱流出的流出液是完全没有生物安全隐患的蛋白样本，可在普通分子生物学实验室进行后续的点靶及质谱分析工作。

如图2所示，用样本管接收导流柱内流出的液体，得到样本液，将样本液点于样品靶上，干燥后在样本点上覆盖基质饱和液，干燥后进入质谱仪检测，采集数据并进行数据库检索。

实施例2

采用本发明提供的样本制备装置，主视纵切面图如图3所示，图中8、样本制备床，9、样本制备床架，10、样本管，11、样本管架，12、底座。

样本制备床架为八孔联排架，可同时放置八个样本制备床（实施例1记载的样本制备床）；样本管架为八孔联排架，可同时放置八个样本管。

样本管架11在底座12的正上方，样本制备床架9在样本管架11的正上方。样本制备床8放置于样本制备床架9之后，导流柱直接对着样本管架11中的六连排样本管，盖上样本处理床的管盖后，含有样本的液体在压力作用下直接通过滤膜进入到样本管中。本实施例的样本制备装置能够高通量、快速（1分钟内）制得具有生物安全性的样品液。

实施例3

采用本发明提供的含有压力盖的样本制备装置，其侧视纵切面图如图4所示，参照实施例2记载的样本处理方法，仅在样本处理床的管盖盖上管体时，向下按压压力盖，压力盖能够均匀用力下压样本制备床架上放置的样本制备床的管盖，使样本管架上的样本管收集到样本制备床导流柱的流出液。压力盖能够一次按压，实现多个样本制备床同时制得适用于MALDI-TOF MS质谱仪鉴定用的待检测样品，且生物安全性高。

实施例4 本发明样本制备床和现有技术方法制备样品的效果比对评价

（1） 选用菌株

本发明选择包括革兰氏阳性、阴性菌及带有荚膜、芽孢的细菌进行使用效果比对评价，包括：大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌。

（2） 样本制备

取样本提取液50 ul加入本发明样本制备床的管体中，接种环刮取小米粒大小菌落与管中提取液混匀，合上样品制备床的管盖，手动或使用助力架向下压并收集流出液，用加样器取1ul样本点于样品靶上，干燥后在样本点上覆盖1ul基质饱和液，干燥后进质谱检测。

传统的提取方法为：1）取适量(5-10mg)样品，加入200μL18.2兆欧超纯水，仔细混匀，再加入600μL无水乙醇，震荡，混匀；若样本量较少，按需减少溶液用量，但保证超纯水与无水乙醇的比例为1:3。2）12000rpm，高速离心2分钟，弃去上清(必要时再离心一次尽量去除乙醇)。沉淀干燥。3）加入50μL 70%甲酸，仔细混匀，再加入50μL乙腈，混匀，12000rpm，高速离心2分钟。吸出上清置于一个新的离心管中；如样本量较少，可按需减少溶液用量，但保证70%甲酸与乙腈为1:1的体积比。

从处理样本的时间上来说，要达到同等的生物安全性，即使考虑到提取后过滤，上述传统的方法所用时间一个样本至少要20分钟：提取要离心两次，过滤也要离心1次。本发明的方法无需离心，整个过程只需要1分钟即可完成。

（3）数据采集与数据库检索

采用布鲁克公司的Microflex LRF质谱系统及国产重庆中元公司的EXS 3000质谱系统进行数据采集和数据库检索。厂家商业化的数据库为数据搜索标准谱库，炭疽芽孢杆菌构建参考谱并加入到商业化数据库中。仪器校准采用大肠杆菌8739菌株。使用样本制备床进行微生物鉴定的流程见图2。

（4）谱图及鉴定效果比对

本发明方法制备的样本，相同菌量、相同采集条件下，与传统乙醇/甲酸提取法相比肽质量指纹谱没有明显差异，但信号更易采集（图5和图6）。相同数据库搜索的识别率没有差异。因炭疽芽孢杆菌的高危险性，传统方法无法完全将其杀灭，从生物安全考虑，没有采集传统乙醇/甲酸法制备的样本。

（5） 样本前处理方法汇总

将本发明样本制备床前处理待测微生物样品的方法和已有的样本制备方法进行比较，从时长、安全性、谱图质量、灭菌效果等方面进行综合评价，见表1。

实施例5 安全性评价

选择大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌，参照实施例1记载的方法，采用实施例2的样本制备装置制备上述五种菌的样品液。

将取得的样品液分别涂于新鲜培养板上，培养箱中培养并观察菌落生长情况。培养结果显示，采用本发明的样本制备装置提取的样本，均无菌落生长。而同时采用传统的乙醇/甲酸法提取后的样本培养后枯草芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌病原体均有菌落生长，见图7。可见采用本发明的样本制备装置制备的样本可在普通分子生物学实验室操作，没有生物危害性，不会污染质谱仪及感染操作人员。

实施例6 样本制备床使用期评估

将本发明的样本制备床同一时间段内，制备10批次相同微生物来源的待检测样品，制得的样品放置1年，比较1年内样本的质谱肽质量指纹谱及数据搜索结果。结果显示，在12个月的时长内，肽质量谱没有显著变化（图8）。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种样本制备床，其特征在于，包括管体，管盖和与管体底部连接的导流柱；

所述管体的底部铺放滤膜或超滤膜，且管体底部设置有开口，所述开口连接导流柱；

所述管盖通过连接部与管体连接，管盖、管体和连接部之间一体成型；

所述管盖的底部封口，具有非镂空的管底平面，盖上管盖后，管盖底部平面能够与管体底部的滤膜或超滤膜相接触。

2.根据权利要求1所述的样本制备床，其特征在于，所述滤膜为膜孔径范围为0.01-0.2μm的滤膜，或孔径范围为5μm的滤膜，或孔径范围为0.002-0.01μm的滤膜。

3.根据权利要求1或2所述的样本制备床，其特征在于，

（1）所述管体自上而下内径均匀一致；所述管盖其嵌入管体的部分自上而下外径均匀一致；管体内径与管盖嵌入管体部分的外径之差d≥0.0001μm；管盖底部周围箍套垫圈；或

（2）管盖底部外径内缩，使管盖嵌入管体部分的纵切面呈现倒“凸”字型，内缩部分的管盖底部周围箍套弹性垫圈；或

（3）管盖嵌入管体的部分上，在距离管盖底部0.1-2 mm距离的设置一内陷凹槽，凹槽内箍套弹性垫圈。

4.一种样本制备装置，其特征在于，含有权利要求1-3任一所述的样本制备床和助力架，所述助力架由底座，样本管架，样本制备床架组成；底座上可拆卸地固定样本管架，样本制备床架可拆卸地固定在样本管架上；

所述样本管架能够放置一个或多个样本管，所述样本制备床架能够放置一个或多个样本制备床；

所述样本制备床架上的样本制备床的导流柱与所述样本管架上的样本管口对应，使样本管能够接收样本制备床导流柱内流出的液体样本。

5.根据权利要求4所述的样本制备装置，其特征在于，还包括压力盖，所述压力盖与底座一侧边缘通过转轴连接，按压压力盖，下压样本制备床架上放置的样本制备床的管盖，使样本管架上的样本管收集到样本制备床导流柱的流出液。

6.权利要求1-3任一所述的样本制备床或权利要求4-5任一所述的样本制备装置在以下任一种应用：

（1）在制备具有生物安全性的待检测样本中的应用；

（2）在蛋白截留纯化中的应用；

（3）通过改变滤膜孔径，用于任意使用目的为截留不同分子量的样本的制作。

7.用于MALDI-TOF MS微生物鉴定的样本生物安全前处理方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述的样本制备床或权利要求4-5任一所述的样本制备装置制备液体样品。

8.根据权利要求7所述的样本生物安全前处理方法，其特征在于，将待检测的微生物样本加入样本制备床的管体内，加入样本提取液，盖上管盖，通过导流柱得到的流出液用于后续进行质谱鉴定；

所述样本制备床的管体底部仅铺一张滤膜，且滤膜的孔径为0.01-0.2微米。

9.一种具有生物安全性的血液样本前处理方法，其特征在于，采用权利要求1-3任一所述的样本制备床或权利要求4-5任一所述的样本制备装置制备液体样品，先采用滤膜孔径为5微米的样本制备床过滤得到去除血细胞的滤液，再将滤液加入滤膜孔径为0.2微米的样本制备床过滤后弃去滤液，在截留有细菌的样本制备床中加入样本提取液，通过导流柱得到的流出液用于后续进行质谱鉴定。

10.根据权利要求8或9所述的样本前处理方法，其特征在于，所述样品提取液为50%-90%的甲酸和70%-100%的乙腈按1：1的比例混合得到。

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