CN112626208A

CN112626208A - 数字pcr定量检测pml-rara融合基因的试剂盒及方法

Info

Publication number: CN112626208A
Application number: CN202011487473.0A
Authority: CN
Inventors: 蒋析文; 朱小亚; 王丽芳; 徐小解; 黄志文
Original assignee: Daan Gene Co Ltd of Sun Yat Sen University
Current assignee: Daan Gene Co Ltd of Sun Yat Sen University
Priority date: 2020-12-16
Filing date: 2020-12-16
Publication date: 2021-04-09

Abstract

本发明提供了数字PCR定量检测PML‑RARA融合基因的试剂盒及方法，具体地本发明开发了一种基于数字PCR平台，定量检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)中PML‑RARA融合基因长型(L型、bcr1)和短型(S型、bcr3)mRNA的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，实验结果表明本发明的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

Description

数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及利用数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法。

背景技术

急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)是一种特殊类型的急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)，占同期AML的10％-15％，发病率约0.23/10万。APL临床表现凶险，起病及诱导治疗中易发生出血和栓塞而引起死亡。近三十年来，由于全反式维甲酸(ATRA)及砷剂的规范化临床应用，APL已成为基本不用进行造血干细胞移植即可治愈的白血病。

目前，APL的病因尚不明确，但随着分子生物学、细胞遗传学等学科的快速发展，人们对APL的分子生物学发病机制有了较深的了解。98％以上的APL患者具有特异性染色体易位t(15；17)(q22；q21)，易位的结果导致15号染色体上的早幼粒细胞白血病基因(PML)和17号染色体上的视黄酸受体α(RARα)形成PML-RARA融合基因，其蛋白产物导致细胞分化阻滞和凋亡不足，是APL发生的主要分子机制。

由于PML基因的断裂点不同，产生不同长度的PML-RARA融合基因转录本，最终可产生3种不同的PML-RARA融合基因的异构体，分别为长型(L型，bcr1)，变异型(V型，bcr2)和短型(S型，bcr3)，其中长型的发生率约占55％，短型约占45％，变异型约占5％。通过检测PML-RARA融合基因是诊断APL的最特异、敏感的方法之一，也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后和复发预测最可靠的指标。

目前PML-RARA融合基因常用的检测包括荧光原位杂交(FISH)、免疫分型、实时定量PCR技术(RQ-PCR)和数字PCR等检测方法。

(1)荧光原位杂交(FISH检测)，利用携带荧光标记的核酸探针与被检样本中的靶核酸序列进行杂交，在荧光显微镜下直接分析杂交靶序列的彩色探针信号，从而获得细胞内多条染色体或多种基因状态的信息。虽然通过FISH法可根据染色体易位断裂点设计的特异性探针，特异性较好，灵敏度较高，但由于FISH检测的实验操作复杂，对操作人员要求较高，且仅能进行定性检测。

(2)免疫分型技术常采用流式细胞仪(FCM)对特异抗原进行检测，利用荧光素标记单克隆抗体(McAb)作为分子探针，多参数分析白血病细胞的胞膜和胞浆或细胞核的免疫表型，由此了解被检测白血病细胞所属细胞学系及分化程度。采用FCM检测微量残留白血病，依赖于肿瘤细胞异常的免疫表型，包括表达交叉系列抗原、抗原表达不同步、抗原表达水平改变等，虽然可对白血病进行定量监测，但因在治疗过程中，白血病细胞免疫表型会产生变化，常需采用两个免疫表型对患者微量残留白血病。FCM法需要特殊仪器，操作技术要求较高，价格昂贵，检测结果重复性不佳。

(3)实时荧光定量PCR技术(RQ-PCR)，基于Taqman探针荧光定量PCR，Taqman探针5’端标记一个荧光分子，3’端标记一个荧光淬灭分子。当探针完整时，两者发生荧光共振能量传递(FRET)。PCR扩增时，由于Taq酶5’→3’外切酶活性，将探针水解，使荧光分子和淬灭分子间距增大，荧光监视系统检测到荧光信号。该方法操作相对较为简单，但定量检测时依赖于标准曲线，定量准确性差，灵敏度不佳。

(4)数字PCR技术在不于依赖标准曲线的情况下可对核酸分子进行绝对定量，在检测PML-RARA融合基因时具有较高的灵敏度和特异性。其技术原理为在传统的PCR扩增前对样品进行分割，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微反应，其中每个微反应或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，对微反应进行检测，有荧光信号的微反应判读为1，没有荧光信号的微反应判读为0，根据泊松分布原理及阳性微反应的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度，数字PCR无需标准曲线，可对低拷贝待检靶分子进行绝对定量。数字PCR可通过对核酸精确定量，对肿瘤进行诊断、监测，以指导个体化治疗。

中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南指出(2018年版)，检测PML-RARA融合基因是诊断APL的最特异最敏感生物方法之一，对PML-RARA融合基因表达水平进行定量检测也是APL治疗方案选择、疗效分析、预后分析和复发预测最可靠的指标，从而更好的指导患者分子靶向治疗和预后判断。

综上所述，现阶段临床亟需一种灵敏度高，特异性好，同时能快速可靠地对PML-RARA融合基因mRNA的表达水平进行定量检测的方法及试剂盒。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种基于数字PCR平台，定量检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML-RARA长型融合基因(bcr1)和PML-RARA短型融合基因(bcr3)mRNA的表达水平的的方法、引物、探针及其试剂盒。具有实验过程简单、绝对定量、引探用量低等优点。

在本发明的第一方面，提供了一种用于检测PML-RARA融合基因的引物对集，所述引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物，和/或如SEQID NO.:2所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.:3所示的反向引物。

在另一优选例中，所述引物对集还包括：

第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQID NO.:5所示的反向引物。

本发明的第二方面，提供了一种检测PML-RARA融合基因的探针集，所述探针集包括：SEQ ID NO.6所示的第一探针。

在另一优选例中，所述探针集还包括：SEQ ID NO.7所示的第二探针。

在另一优选例中，所述第一探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第一探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，所述第二探针的5’端包含有荧光报告基团；和/或，所述第二探针的3’端包含有荧光淬灭基团。

在另一优选例中，所述第一探针标记的荧光报告基团不同于所述第二探针标记的荧光报告基团。

本发明的第三方面，提供了一种用于检测PML-RARA融合基因的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的引物对集。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO.:2、SEQ ID NO.:3、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、和SEQ ID NO.:7所示的多核苷酸序列。

在另一优选例中，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含ddPCR预混液；优选地，所述ddPCR预混液包含选自下组的一种或多种组分：dNTP混合物、热启动Taq酶、RNase抑制剂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。优选地，所述阴性对照为纯水。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第五容器，所述第五容器内包含随机引物。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第六容器，所述第六容器内包含RT-缓冲液；优选地，所述RT-缓冲液包含选自下组的一种或多种组分：(NH4)₂SO₄、KCl、Tris-HCl、MgCl₂。

在另一优选例中，所述试剂盒还包括第七容器，所述第七容器内包含逆转录酶。

本发明的第四方面，提供了一种检测PML-RARA融合基因的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的RNA核酸样本，并进行RNA反转录成cDNA；

(2)制备ddPCR反应体系并进行ddPCR检测：

其中，所述ddPCR反应体系包括：步骤(1)制备的cDNA样本、本发明第一方面所述的引物对集、和本发明第二方面所述的探针集。

在另一优选例中，所述方法为非诊断目的的检测方法，例如针对实验室培养的肿瘤细胞细胞株进行检测分析，以供新药研发使用。

在另一优选例中，所述ddPCR反应体系还包括阳性质控品，和/或阴性质控品。

本发明的第五方面，提供了本发明第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备ddPCR检测试剂盒，所述ddPCR检测试剂盒用于检测PML-RARA融合基因。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1：本发明检测PML-RARA融合基因阴性对照的ddPCR结果示意图。

图2：本发明检测PML-RARA融合基因阳性对照的ddPCR结果示意图。

图3：本发明检测PML-RARA融合基因样本RNA模板的ddPCR结果示意图。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，开发了一种基于数字PCR平台，定量检测急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)中PML-RARA融合基因长型(L型、bcr1)和短型(S型、bcr3)mRNA的方法、引物、探针及包括该引物探针混合液的试剂盒，实验结果表明本发明的检测体系具有极高的灵敏度和准确性。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

数字PCR(digital PCR，dPCR)

数字PCR(digital PCR，dPCR)，dPCR能实现核酸分子的绝对定量，在检测新型冠状病毒核酸时具有较高的灵敏度、特异性及准确度。其通过物理或化学分割的方式，将一个荧光PCR反应体系分配到上万个微小的反应器中，在每个微反应器中包含或不包含1个或多个拷贝的目标核酸分子，进行“单分子模板PCR扩增”。扩增结束后，通过阳性反应单元的数目和统计学方法计算原始样本中靶基因的拷贝数。该方法具有灵敏度高，抗干扰能力强，检测结果稳定，不依赖标准曲线进行绝对定量等优点。

利用数字PCR技术针对新型冠状病毒ORF1ab基因和N基因进行检测，同时以人类管家基因RNase P为内参，该方法具有较高的灵敏度，检测低浓度样本结果较为稳定，同时能直接对核酸进行定量，检测结果更为直观可靠。

利用数字PCR技术针对新型冠状病毒进行检测，具有较高的灵敏度，非常有利于疫情防控。但是，由于数字PCR的灵敏度极高，因此对检测体系中引物探针组合的特异性要求很高，引物探针组合的设计难度较大。

多重PCR

多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一PCR反应体系里加上二对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。

影响多重PCR反应的因素有很多，比如：

(1)反应体系不平衡，反应体系的不平衡导致在前期的几轮反应中某些优势引物及其模板迅速扩增，获得大量的扩增产物，而这些扩增产物同时又是DNA聚合酶的良好抑制剂。所以，随着扩增产物的大量出现，聚合酶的聚合能力被越来越强烈的抑制，因此，前期处于劣势的引物及其模板，这时就更加难以反应，最终导致扩增产物量非常之小，以至于无法检测。

(2)引物特异性，如果引物与体系中其他非目的基因片段结合力更强，那么目的基因结合引物的能力就会受到竟争，从而导致扩增效率下降。

(3)最佳退火温度不一致，将多对引物放置入一个体系中扩增，由于进行PCR反应的退火温度相同，所以要求每一对引物的最佳退火温度接近。

(4)引物二聚体，包括引物间的二聚体以及引物自身所形成的发卡结构，还有一类是第三方DNA介导的聚体，这些二聚体和非特异引物一样都会干扰引物与目标结合位点的竟争，影响扩增效率。

虽然上述提及了影响扩增效率的几个因素，但更多的因素尚不清楚。到目前为止，还没有一个可以明确预测扩增效率的有效方法。

本发明提供了一种基于微滴式数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)平台(如伯乐QX200)，定量检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML-RARA长型融合基因(bcr1)和PML-RARA短型融合基因(bcr3)mRNA的表达水平的的方法、引物、探针及其试剂盒。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了一种定量检测急性早幼粒细胞白血病(APL)中PML-RARA长型融合基因(bcr1)和PML-RARA短型融合基因(bcr3)mRNA的表达水平的方法、引物、探针：

所述检测bcr1的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述bcr3的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述bcr1和bcr3的通用下游引物核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测ABL1内控基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述检测ABL1内控基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示；

所述探针包括检测PML-RARA融合基因(bcr1、bcr3)的探针和内控基因ABL1探针；所述PML-RARA融合基因(bcr1、bcr3)的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：6，内控ABL1的探针核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

进一步地，所述SEQ ID NO：6核苷酸序列的5’端标记有FAM、3’端标记有BHQ1，所述SEQ ID NO：7核苷酸序列的5’端标记有VIC、3’端标记有BHQ1。

优选地，所述PML-RARA融合基因上游引物在反应体系中的终浓度为0.8μmol/L，所述PML-RARA融合基因下游引物在反应体系中的终浓度为0.8μmol/L，所述PML-RARA融合基因探针在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L；所述内控ABL1基因上游引物在反应体系中的终浓度为0.8μmol/L，所述内控下游引物在反应体系中的终浓度为0.8μmol/L，所述内控ABL1基因探针在反应体系中的终浓度为0.3μmol/L；

所述PML-RARA融合基因和内控的引物探针序列如下表1：

表1.检测PML-RARA融合基因的引物探针核苷酸序列信息

上述PCR引物和标有不同类型荧光的探针可用于对PML-RARA融合基因(bcr1和bcr3)和内控ABL1基因进行检测，根据结果呈现的荧光信号有无，能够准确检测PML-RARA融合基因是否发生融合，在检测融合的同时，可以直接得出PML-RARA mRNA水平。采用特异性引物探针检测PML-RARA拷贝数与内控ABL1拷贝数，通过拷贝数比例来确定PML-RARA是否发生基因融合及计算出PML-RARA转录本的mRNA表达水平，以标准拷贝数NCN(％)表示，即：NCN％＝PML-RARA融合基因拷贝数(对应类型)/ABL1内参基因拷贝数)×100％。其中，NCN(％)≥0.001％为MRD阳性；NCN(％)＜0.001％为MRD阴性。本发明结合ddPCR系统使得检测体系灵敏度可以达到0.001％。

上述特异性引物和探针所制备的试剂盒，基于ddPCR平台可检测PML-RARA融合基因的bcr1和bcr3两种融合类型，为患者是否需要进行靶向治疗提供参考，也可用于白血病患者的高灵敏度早期检测和疗效监测。

在本发明另一个优选地实施方式中，本发明还提供了一种PML-RARA融合基因检测的试剂盒，所述试剂盒包括用于配制RT反应液的试剂：oligo dT、逆转录酶、RNasin、dNTPmix、RNase-free水。所述试剂盒还包括ddPCR扩增试剂：ddPCR Supermix、对照样本和RNase-free水，其中，ddPCR引物探针混合液，如表2。

表2.ddPCR引物探针混合液

其中，所述用于检测PML-RARA融合基因和ABL1内控基因的引物与探针分别如下：

所述检测bcr1的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述检测bcr3上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，所述检测bcr1和bcr3的通用下游引物序列如SEQ IDNO：3所示，所述检测ABL1内控基因的上游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述检测ABL1内控基因的下游引物核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示；

所述探针包括检测PML-RARA融合基因bcr1和bcr3两种型别的通用探针和ABL1内控探针；所述bcr1和bcr3的通用探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：4，其5’端标记有FAM荧光报告基团，所述ABL1内控探针的核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示，其5’端标记有VIC荧光报告基团，所述所有探针的3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。

当发生bcr1和bcr3融合时，融合基因探针与上下游引物所扩增的目的片段结合，释放FAM荧光信号；所述内控引物与探针是根据人ABL1基因保守片段设计并合成的，用于检测ABL1基因；

所述RT反应液的RT-buffer包括如下成分，如表3：

表3.RT-buffer

编号	组分	组分中的主要成分
			1	RT-buffer	(NH4)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>、KCl、Tris-HCl、MgCl<sub>2</sub>

所述对照品包括如下成分，如表4：

表4.对照样本

编号	组分	组分中的主要成分
			1	阴性对照	RNase-free水
2	阳性对照	人工合成的DNA片段混合液

所述阳性对照中含有：

检测bcr1的人工合成的DNA片段1(SEQ ID NO.:22)：

CGGGATCCCGCCCGAGGAGGCAGAGAGAGTGAAGGCCCAGGTTCAGGCCCTGGGGCTGGCTGAAGCCCAGCCTATGGCTGTGGTACAGTCAGTGCCCGGGGCACACCCCGTGCCAGTGTACGCCTTCTCCATCAAAGGCCCTTCCTATGGAGAGGATGTCTCCAATACAACGACAGCCCAGAAGAGGAAGTGCAGCCAGACCCAGTGCCCCAGGAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGAGGAGGGGAAGGAGGCAAGGTTGGCTCGGAGCTCCCCGGAGCAGCCCAGGCCCAGCACCTCCAAGGCAGTCTCACCACCCCACCTGGATGGACCGCCTAGCCCCAGGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGCCCAACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACAAGTCCTCAGGCTACCACTATGGGGTCAGCGCCTGTGAGGGCTGCAAGGGCTTCTTCCGCCGCAGCATCCAGAAGAACATGGTGTACACGTGTCACCGGGACAAGAACTGCATCATCAACAAGGTGACCCGGAACCGCTGCCAGTACTGCCGACTGCAGAAGTGCTTTGAAGTGGGCATGTCCAAGGAGTCTGTGAGAAACGACCGAAACAAGAAGAAGAAGGAGGTGCCCAAGCCCGAGTGCTCTGAGAGCTACACGCTGACGCCGGAGGTGGGGGAGCTCATTGAGAAGGTGCGTAAAGCGCACCAGGAAACCTTCCCTGCCCTCTGCCAGCTGGGCAAATACACTACGAACCCCAAGCTTGGG

检测bcr3的人工合成的DNA片段2(SEQ ID NO.:23)：

CGGGATCCCGGGTTCACGCGCAGATGCACGCGGCCGTCGGCCAGCTGGGCCGCGCGCGTGCCGAGACCGAGGAGCTGATCCGCGAGCGCGTGCGCCAGGTGGTAGCTCACGTGCGGGCTCAGGAGCGCGAGCTGCTGGAGGCTGTGGACGCGCGGTACCAGCGCGACTACGAGGAGATGGCCAGTCGGCTGGGCCGCCTGGATGCTGTGCTGCAGCGCATCCGCACGGGCAGCGCGCTGGTGCAGAGGATGAAGTGCTACGCCTCGGACCAGGAGGTGCTGGACATGCACGGTTTCCTGCGCCAGGCGCTCTGCCGCCTGCGCCAGGAGGAGCCCCAGAGCCTGCAAGCTGCCGTGCGCACCGATGGCTTCGACGAGTTCAAGGTGCGCCTGCAGGACCTCAGCTCTTGCATCACCCAGGGGAAAGCCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACAAGTCCTCAGGCTACCACTATGGGGTCAGCGCCTGTGAGGGCTGCAAGGGCTTCTTCCGCCGCAGCATCCAGAAGAACATGGTGTACACGTGTCACCGGGACAAGAACTGCATCATCAACAAGGTGACCCGGAACCGCTGCCAGTACTGCCGACTGCAGAAGTGCTTTGAAGTGGGCATGTCCAAGGAGTCTGTGAGAAACGACCGAAACAAGAAGAAGAAGGAGGTGCCCAAGCCCGAGTGCTCTGAGAGCTACACGCTGACGCCGGAGGTGGGGGAGCTCATTGAGAAGGTGCGTAAAGCGCACCAGGAAACCTTCCCTGCCCTCTGCCAGCTGGGCAAATACACTACGAACCCCAAGCTTGGG

检测ABL1内参基因的人工合成的DNA片段3(SEQ ID NO.:8)：

CGGGATCCGGACCGAGCTGGGAGAGGGGCTCCGGCCCGATCGTTCGCTTGGCGCAAAATGTTGGAGATCTGCCTGAAGCTGGTGGGCTGCAAATCCAAGAAGGGGCTGTCCTCGTCCTCCAGCTGTTATCTGGAAGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGACTTTGAGCCTCAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGCCAGAGGTCCATCTCGCTGAGATACGAAGGGAGGGTGTACCATTACAGGATCAACACTGCTTCTGATGGCAAGCTCTACGTCTAAGCTTGGG。

本发明所述试剂盒适用样本为外周血或骨髓样本核酸。

本发明所述试剂盒用于判定检测有效性的标准为：每次检测均设置阴性对照组和阳性对照组，当检测结果的阳性对照组为阳性，且阴性对照组为阴性时，表明实验结果有效。本发明所述试剂盒的检测灵敏度可以达到0.001％。

在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了一种PML-RARA融合基因定量检测的方法，具体步骤包括：

1.处理待测样本并RNA模板提取；优选地，待测样本为外周血或骨髓样本提取后的核酸，并对样本核酸进行质量检测；

2.配制RT反应体系，将待测样本中的RNA反转录成cDNA，RT反应体系构成如表5；

表5.RT反应体系

3.将步骤2中反转录的cDNA模板、ddPCR引物探针混合液、ddPCR supermix及RNase-free水混合，制备得到ddPCR反应体系；dPCR反应液构成如表6，

表6.dd PCR反应体系

成分	体积
		ddPCR引物探针混合液	1μL
DdPCR Supermix	10μL
		cDNA模板	5μL
RNase-free水	补足至20μL

4.制备微滴：将20μL样品反应体系缓慢加入到DG8cartridge中间一排的8个孔内，不足8个样品时用稀释一倍的20μL ddPCR control buffer补足；接着在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空着的孔；盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢；将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般约2分钟完成；

5.ddPCR扩增：将生成于cartridge最上面一排孔内微滴小心缓慢吸取40μL缓慢打入96孔板相应位置孔内，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，2s。封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR扩增，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.0℃/s。

6.结果读取及分析：打开QuantaSoft软件之后对96孔板中样品信息进行Setup，主要对实验名称、实验类型(ABS、CNV、RED)、Target 1及Target 2通道选择等进行设置，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实修正后保存结果，即完成了一次QX200实验。通过阴性对照样本、阳性对照样本荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值。

7.根据检测结果，判定待测样本是否发生融合，进而计算PML-RARA融合基因表达量(NCN％＝PML-RARA融合基因拷贝数/ABL1内参基因拷贝数×100％)。

本申请采用ddPCR检测原理如下：ddPCR技术是把单个PCR管中的反应试剂划分成约上万个微反应，其中每个微反应中或不含待检核酸靶标分子，或含有1个至数个待检核酸靶分子，且每个微反应都作为一个独立的PCR反应单元。经PCR扩增后，对微反应进行检测，有荧光信号的微反应判读为1，没有荧光信号的微反应判读为0，根据泊松分布原理及阴阳性微反应的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。由于dPCR结果的判读仅判断有无扩增，不依赖Ct值，对PCR反应抑制剂的耐受能力大大提高，不需要参考品和标准曲线就可以精确定量。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种PML-RARA融合基因定量检测的方法、引物、探针与试剂盒。本试剂盒优化了特异性引物探针，针对两种PML-RARA融合基因类型bcr1和bcr3仅需两条不同的上游引物，共同的下游引物与一条荧光标记的探针和一套ABL1内参基因检测系统进行检测。

使用本发明提供的特异性引物与探针，只需1管即可定量检测PML-RARA的2种融合在急性早幼粒细胞白血病中的mRNA表达水平，以标准拷贝数NCN(％)表示，即：NCN＝(PML-RARA融合基因拷贝数(对应类型)/ABL1内参基因拷贝数)×100％。本发明的灵敏度可达到0.001％。

具有过程优化简单、所需样本少、性能稳定高效、高准确性等优点，能分辨出单个拷贝的差异，实现真正意义上的绝对定量，数据分析自动化，结果可实时观察。

本发明适用于对急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的PML-RARA融合基因bcr1和bcr3转录水平进行监测，是APL治疗方案选择、疗效评价、预后分析和复发预测最可靠的指标。实现治疗效果的动态追踪，从而早期识别耐药或疾病进展，从而指导干预治疗。这是探索白血病早期诊断与高效治疗的一条可行途径，值得推广应用。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：试剂盒及检测方法

本实施例提供了一种PML-RARA融合基因定量检测的试剂盒的组成成分、包装及数量(48反应/盒)，如表7：

表7.试剂盒的组成成分、包装及数量

具体检测步骤如下，

步骤一：待测样本RNA模板提取及质量检测

①抽取白血病患者不少于1.5mL外周血置于EDTA或枸橼纳抗凝剂的采血管中，做好标记确保标签信息无误后，4℃保存。②使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂，按照试剂盒说明书进行核酸提取；③采用分光光度计(如NanoDrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行RNA质量检测：核酸的纯度应满足A260/A280比值范围在1.8～2.2之间，浓度应不低于10ng/μL，模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。

步骤二：RNA反转录成cDNA

①准备RT混合液：取出试剂盒中的随机引物Random hexamers、RT-buffer、逆转录酶、RNase-free水等，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制RT反应体系，构成如表8：

表8.RT反应体系

②加样反转录：取步骤一所制备的样本RNA模板5μL及试剂盒中的各对照样本5μL，加样至配制的RT体系的八连管中，使每管RT反应液的总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于反转录反应；所述试剂盒的对照品及RT程序如表9：

表9.试剂盒的对照品

所述阳性对照是将2种含有bcr1模板、bcr3模板与ABL1内参基因模板分别按一定比例混合；其中，含有bcr1阳性模板来源于外合大片段1，含有bcr3阳性模板来源于外合大片段2，含有ABL1内参基因模板来源于外合大片段3；阴性对照样本为RNase-free水。

步骤三：ddPCR反应

①ddPCR体系配制前准备：取出试剂盒中的特异性引物和探针混合液、ddPCRSupermix、RNase-free水等，室温融化，涡旋震荡混匀后离心10秒，配制ddPCR体系；ddPCR体系构成如表10：

表10.ddPCR体系

②加样：取步骤二样本及对照品中反转录的cDNA，加样至配制好的dd PCR反应体系中，使每管ddPCR反应液的总体积为20μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于制备微滴；

③制备微滴：将20μL样品反应体系缓慢加入到DG8cartridge中间一排的8个孔内，不足8个样品时用稀释一倍的20μL dd PCR control buffer补足；接着在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70μL微滴生成油，同样不能有空着的孔；盖上胶垫(gasket)，注意两边的小孔都要钩牢；将以上holder轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，注意仪器上指示灯状态，一般约2分钟完成；

④ddPCR扩增：将生成于cartridge最上面一排孔内微滴小心缓慢吸取40μL缓慢打入96孔板相应位置孔内，用预热好的PX1热封仪对其进行封膜，推荐的运行程序为：180℃，5s。封好膜之后应该在30分钟内进行PCR反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行PCR，可在任意一台96孔PCR仪上完成，注意升降温速度≤2.0℃/s。ddPCR扩增条件见表11：

表11.ddPCR扩增条件

步骤四：结果读取及分析

打开QuantaSoft软件之后对96孔板中样品信息进行Setup，主要对实验名称、实验类型(ABS、CNV、RED)、Target 1及Target 2通道选择等进行设置，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze，人工核实修正后保存结果，即完成了一次QX200实验。通过阴性对照样本、阳性对照样本及无模板对照样本的参照及荧光信号的分布，可调节微反应信号阈值。

实施例2：试剂盒的灵敏度检测及最低检出率实验

灵敏度参考品由2种PML-RARA融合基因bcr1和bcr3模板与ABL1内参基因模板(内参基因拷贝数≥10⁶)分别按一定比例混合，混合液的NCN(％)分别为0.1％、0.01％、0.001％；其中，bcr1、bcr3和内标模板来源于人工制备的假病毒；阴性对照为RNase-free水；

取阴性对照、阳性对照及灵敏度参考品各5μL，加样至步骤二配制的RT反应体系的八连管中，使每管RT反应液总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于反转录；

取步骤二反转录的cDNA样本5μL，加样至步骤三种配制好的ddPCR反应体系中，使每管ddPCR反应液的总体积为20μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于制备微滴反应；

反转后的cDNA参照步骤三进行微滴制备及ddPCR扩增，扩增结束后参照步骤四进行结果读取及分析。

用ddPCR系统对本发明的灵敏度和最低检出率进行检测，当上述阳性对照样本混合液理论NCN(％)的值分别为0.1％、0.01％、0.001％时，实际测得的NCN(％)如表12所示：

表12.灵敏度检测结果

试剂盒的灵敏度检测结果与理论值相符，灵敏度检测良好；当PML-RARA拷贝数与ABL1拷贝数混合的阳性样本NCN(％)为0.001％时，ddPCR系统也可稳定检测出相应融合型别，且阳性符合率为100％。

实施例3：试剂盒的重复性与准确性检测

根据所测得对照样本的拷贝数，制备准确性参考品

将bcr1和bcr3两种PML-RARA融合基因与ABL1内参基因(内参基因拷贝数≥10⁶)分别按一定比例混合，制得0.1％、0.01％的混合液。

每种准确性参考品做4个重复实验，共4管；取长型PML-RARA融合基因准确性参考品5μL，短型PML-RARA融合基因准确性参考品5μL加样至步骤二所配制的RT反应体系的八连管中，使得RT反应液的总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于反转录；

取步骤二反转录的cDNA样本5μL，加样至步骤三种配制好的dd PCR反应体系中，使每管ddPCR反应液的总体积为20μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于制备微滴反应；

用ddPCR系统对本发明试剂盒的准确性进行检测，得到结果如表13:

表13.准确性检测结果

根据上表所述结果，各质控品准确性的检测结果的SD≤0.25，符合CSLI EP5-A3，符合定量检测方法的精密度要求；另外各质控品准确性的检测结果阳性率为100％，符合理论定性标准，表明本发明试剂盒的准确性检测符合要求。

实施例4：临床应用实验

抽取15例白血病患者外周血1.5mL置于EDTA或枸橼纳抗凝剂的采血管中，提供血样的15名患者已进行荧光定量PCR检测，并且明确为PML-RARA融合基因类型，或者不含2种融合类型；做好样本标记并确保标签信息无误，4℃保存。使用中山大学达安基因股份有限公司的核酸提取或纯化试剂(粤穗械备20170583号)，按照试剂盒说明书进行核酸提取；建议采用分光光度计(如NanoDrop2000超微量分光光度计或其他分光光度计仪器)对提取后的核酸进行检测，核酸的纯度应满足A260/A280比值范围在1.8-2.2之间，浓度应不低于10ng/μL，模板核酸可直接用于后续实验或置于-80℃保存备用，避免反复冻融。

取样本及试剂盒中对照样本各5μL，加样至步骤二配制的RT反应体系的八连管中，使每管反应液的总体积为25μL；盖紧八连管管盖，充分混匀，高速离心10秒，用于反转录；

检测结果为：15例样本中，5例样本呈PML-RARA融合阳性，其余样本为阴性，所检结果与荧光定量PCR检测的结果一致性为100％。

对比例1

本发明人对PML-RARA融合基因的基因序列，进行深入比对分析后，针对目标序列设计了数对引物和数条探针，期望获得能够同时检测2种融合类型的引物组和检测探针。

由于引物特异性差异、退火温度不一致、以及引物二聚体等原因，不同引物探针组合对于试剂检测灵敏度影响较大，很难获得较优的多重数字PCR扩增引物以及探针序列。本发明人通过大量的实验，对设计的引物和探针进行优化选择并验证，最终确定了可以用于同时检测2种融合类型和内控靶标的多重数字PCR扩增的引物、探针序列及其组合。

实验中发现，即使在已经基本确定针对各目标核酸的引物对和探针序列的情况下，不同引物对组合进行多重扩增的效果也存在显著差异。

例如，使用如下的对照引物对进行检测，其它检测步骤和条件同上述实施例：

表14.对照引物对1：

表15.对照引物对2：

按照实施例2的方法进行灵敏度检测，检测结果表明对照引物对1可检出融合比例为0.01％；对照引物对2可检出融合比例为0.1％；对照引物对1和对照引物对2的灵敏度均较差。按照实施例3的方法进行重复性及准确性检测，结果表明对照引物对1和对照引物对2的准确性较差，无法进行理论定性。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中山大学达安基因股份有限公司

<120> 数字PCR定量检测PML-RARA融合基因的试剂盒及方法

<130> 000079

<160> 23

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 1

cttcctgccc aacagcaac 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

accgatggct tcgacgagtt 20

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

agggctgggc actatctctt c 21

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

agtggagata acactctaag cataa 25

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

tgttgactgg cgtgatgtag t 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

aactgctgct ctgggtctca atggc 25

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ctaaaggtga aaagctccgg gtcttag 27

<210> 8

<211> 625

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

cgggatccgg accgagctgg gagaggggct ccggcccgat cgttcgcttg gcgcaaaatg 60

ttggagatct gcctgaagct ggtgggctgc aaatccaaga aggggctgtc ctcgtcctcc 120

agctgttatc tggaagaagc ccttcagcgg ccagtagcat ctgactttga gcctcagggt 180

ctgagtgaag ccgctcgttg gaactccaag gaaaaccttc tcgctggacc cagtgaaaat 240

gaccccaacc ttttcgttgc actgtatgat tttgtggcca gtggagataa cactctaagc 300

ataactaaag gtgaaaagct ccgggtctta ggctataatc acaatgggga atggtgtgaa 360

gcccaaacca aaaatggcca aggctgggtc ccaagcaact acatcacgcc agtcaacagt 420

ctggagaaac actcctggta ccatgggcct gtgtcccgca atgccgctga gtatctgctg 480

agcagcggga tcaatggcag cttcttggtg cgtgagagtg agagcagtcc tggccagagg 540

tccatctcgc tgagatacga agggagggtg taccattaca ggatcaacac tgcttctgat 600

ggcaagctct acgtctaagc ttggg 625

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

acctcagctc ttgcatcacc 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ccatagtggt agcctgagga c 21

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

tcctgacaga caaagcaagg cttgt 25

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

agcataacta aaggtgaaaa gct 23

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

ccaggagtgt ttctccagac t 21

<210> 14

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

ttgactggcg tgatgtagtt gcttg 25

<210> 15

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

tcttcctgcc caacagcaa 19

<210> 16

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

ccgatggctt cgacgagtt 19

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

gcttgtagat gcggggtaga g 21

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

agtgcccagc cctccctcgc 20

<210> 19

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

cagtggagat aacactctaa gcata 25

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 20

agtgtttctc cagactgttg act 23

<210> 21

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 21

cgtgatgtag ttgcttggga cc 22

<210> 22

<211> 880

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 22

cgggatcccg cccgaggagg cagagagagt gaaggcccag gttcaggccc tggggctggc 60

tgaagcccag cctatggctg tggtacagtc agtgcccggg gcacaccccg tgccagtgta 120

cgccttctcc atcaaaggcc cttcctatgg agaggatgtc tccaatacaa cgacagccca 180

gaagaggaag tgcagccaga cccagtgccc caggaaggtc atcaagatgg agtctgagga 240

ggggaaggag gcaaggttgg ctcggagctc cccggagcag cccaggccca gcacctccaa 300

ggcagtctca ccaccccacc tggatggacc gcctagcccc aggagccccg tcataggaag 360

tgaggtcttc ctgcccaaca gcaaccacgt ggccagtggc gccggggagg cagccattga 420

gacccagagc agcagttctg aagagatagt gcccagccct ccctcgccac cccctctacc 480

ccgcatctac aagccttgct ttgtctgtca ggacaagtcc tcaggctacc actatggggt 540

cagcgcctgt gagggctgca agggcttctt ccgccgcagc atccagaaga acatggtgta 600

cacgtgtcac cgggacaaga actgcatcat caacaaggtg acccggaacc gctgccagta 660

ctgccgactg cagaagtgct ttgaagtggg catgtccaag gagtctgtga gaaacgaccg 720

aaacaagaag aagaaggagg tgcccaagcc cgagtgctct gagagctaca cgctgacgcc 780

ggaggtgggg gagctcattg agaaggtgcg taaagcgcac caggaaacct tccctgccct 840

ctgccagctg ggcaaataca ctacgaaccc caagcttggg 880

<210> 23

<211> 893

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

cgggatcccg ggttcacgcg cagatgcacg cggccgtcgg ccagctgggc cgcgcgcgtg 60

ccgagaccga ggagctgatc cgcgagcgcg tgcgccaggt ggtagctcac gtgcgggctc 120

aggagcgcga gctgctggag gctgtggacg cgcggtacca gcgcgactac gaggagatgg 180

ccagtcggct gggccgcctg gatgctgtgc tgcagcgcat ccgcacgggc agcgcgctgg 240

tgcagaggat gaagtgctac gcctcggacc aggaggtgct ggacatgcac ggtttcctgc 300

gccaggcgct ctgccgcctg cgccaggagg agccccagag cctgcaagct gccgtgcgca 360

ccgatggctt cgacgagttc aaggtgcgcc tgcaggacct cagctcttgc atcacccagg 420

ggaaagccat tgagacccag agcagcagtt ctgaagagat agtgcccagc cctccctcgc 480

caccccctct accccgcatc tacaagcctt gctttgtctg tcaggacaag tcctcaggct 540

accactatgg ggtcagcgcc tgtgagggct gcaagggctt cttccgccgc agcatccaga 600

agaacatggt gtacacgtgt caccgggaca agaactgcat catcaacaag gtgacccgga 660

accgctgcca gtactgccga ctgcagaagt gctttgaagt gggcatgtcc aaggagtctg 720

tgagaaacga ccgaaacaag aagaagaagg aggtgcccaa gcccgagtgc tctgagagct 780

acacgctgac gccggaggtg ggggagctca ttgagaaggt gcgtaaagcg caccaggaaa 840

ccttccctgc cctctgccag ctgggcaaat acactacgaa ccccaagctt ggg 893

Claims

1.一种用于检测PML-RARA融合基因的引物对集，其特征在于，所述引物对集包括：

第一引物对，所述第一引物对包括如SEQ ID NO.:1所示的正向引物，和/或如SEQ IDNO.:2所示的正向引物；以及，如SEQ ID NO.:3所示的反向引物。

2.如权利要求1所述的引物对集，其特征在于，所述引物对集还包括：

第二引物对，所述第二引物对组包括如SEQ ID NO.:4所示的正向引物；和，如SEQ IDNO.:5所示的反向引物。

3.一种检测PML-RARA融合基因的探针集，其特征在于，所述探针集包括：SEQ ID NO.6所示的第一探针；

优选地，所述探针集还包括：SEQ ID NO.7所示的第二探针。

4.一种用于检测PML-RARA融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物对集。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括权利要求3所述的探针集。

6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第一容器，所述第一容器内包含引物探针混合液，所述引物探针混合液中包含SEQ ID NO：1、SEQ ID NO.:2、SEQ IDNO.:3、SEQ ID NO.:4、SEQ ID NO.:5、SEQ ID NO.:6、和SEQ ID NO.:7所示的多核苷酸序列。

7.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括第二容器，所述第二容器内包含ddPCR预混液。

8.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括第三容器，所述第三容器内包含阳性对照；和/或

所述试剂盒还包括第四容器，所述第四容器内包含阴性对照。

9.一种检测PML-RARA融合基因的方法，所述方法包括步骤：

(1)提供待检测对象的RNA核酸样本，并进行RNA反转录成cDNA；

(2)制备ddPCR反应体系并进行ddPCR检测：

其中，所述ddPCR反应体系包括：步骤(1)制备的cDNA样本、权利要求1的引物对集、和权利要求3所述的探针集。

10.第一方面所述的引物对集、和/或本发明第二方面所述的探针集的用途，用于制备ddPCR检测试剂盒，所述ddPCR检测试剂盒用于检测PML-RARA融合基因。