CN112574957B - 一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19181。利用该细胞株分泌获得异噁草酮单克隆抗体用于进行食品安全检测中异噁草酮残留的分析检测。本发明获得的异噁草酮单克隆抗体可用于免疫分析检测，其对异噁草酮有较好的检测灵敏度和特异性（IC50值为5.5 ng/mL）。本发明成果可用于制备异噁草酮的免疫检测试剂盒以及胶体金试纸条，为谷物、油料、蔬菜、糖料、烟草中异噁草酮残留量的检测提供有力的检测方法与手段。
Description
技术领域
本发明涉及一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。
背景技术
异噁草酮（clomazone，简称CLO），又称异噁草松，国外商品名为广灭灵，是一种选择性芽前除草剂。其施用后会被植物的根、幼芽吸收，随蒸腾作用向上传导到植物的各个部位，敏感植物叶绿素的生物合成会受抑制，虽然能萌芽出土，但无色素，白化，在短期内死亡，而大豆等耐药性植物吸收后能通过代谢作用，将其转化为无杀草能力的降解产物，使自身免受其害。因此，其广泛应用于大豆田、水稻田、甘蔗田及烟草田等来防除阔叶杂草和禾本科杂草。但其属长残留性除草剂，半衰期约为24 d，在土壤中的生物活性可持续6个月以上，易对后茬小麦、向日葵等作物及多种蔬菜造成药害残留，并且有研究表明其对哺乳动物的基因具有潜在的致突变性，会增加癌症风险，因此国标中对其最低残留量做出了明确规定，要求其最低检测线为10 ng/mL。
异噁草酮含量分析方法有：高效液相色谱法(HPLC)、液质联用 (LC-MS)等仪器方法，这些检测方法具有耗时、步骤繁琐、无法进行现场快速检测、成本高等缺点。因此建立快速简便的异噁草酮检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，适用于大量样本的现场快速检测，为异噁草酮检测提供了一种新的检测途径。
发明内容
本发明的目的是提供一株分泌抗异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，由该细胞株分泌的抗体针对异噁草酮具有较高的检测灵敏度，可以用来建立异噁草酮的免疫学检测方法。
本发明的技术方案，一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19181。
异噁草酮单克隆抗体，它由所述保藏编号为CGMCC No.19181的杂交瘤细胞株ABC06分泌产生。
所述异噁草酮单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中异噁草酮残留量的分析检测。
本发明提供的分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06的制备基本步骤为：
（1）异噁草酮半抗原的制备：将26 μL浓硝酸溶于100 μL浓硫酸，混匀，制成混合酸溶液备用；取100 mg异噁草酮溶于325 μL浓硫酸，4℃搅拌溶解，向异噁草酮溶液中逐滴滴入混合酸溶液，-10℃反应7 h；恢复至0℃，加入2 mL冰水，逐滴加入浓氨水调节pH至4.8-5.2，有浅黄色固体析出，减压抽滤，干燥，得到产物为CLO- NO2；取50 mg CLO- NO2溶于乙醇/醋酸/水（体积比2:2:1）混合溶液中，置于圆底烧瓶中，加入20 mg锌粉和3 μL浓盐酸，60℃加热回流15 min，室温搅拌40 min，由混浊变为澄清；过滤除去锌粉，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤，干燥，减压蒸干，得到半抗原CLO-NH2，半抗原合成路线见杂交瘤细胞株ABC06的制备；
（2）异噁草酮完全抗原的制备：采用碳二亚胺法将半抗原CLO-NH2分别与载体蛋白BSA及 OVA偶联制备免疫原异噁草酮-BSA和包被原异噁草酮-OVA，通过透析分离完全抗原与未偶联的半抗原CLO-NH2；
（3）小鼠的免疫：将免疫原异噁草酮-BSA与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天，最后一次用异噁草酮-BSA完全抗原（不含佐剂）冲刺免疫；通过间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测血清效价和抑制；
（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG 4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接竞争酶联免疫法（ic-ELISA）检测阳性细胞孔，并进一步利用ic-ELISA测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制效果的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株ABC06；
（5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ic-ELISA测定灵敏度和特异性。
本发明的有益效果：本发明提供的杂交瘤细胞株ABC06分泌的单克隆抗体，对异噁草酮具有较好的特异性和检测灵敏度（IC50值为5.5 ng/mL），可实现对谷物、油料、蔬菜、糖料、烟草中异噁草酮残留量的检测，为食品中异噁草酮残留的免疫学检测提供了原料，具有实际应用价值。
生物材料样品保藏: 一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期2019年11月28日，保藏编号CGMCC No.19181。
附图说明
图1 ABC06分泌的单克隆抗体对异噁草酮的抑制标准曲线。
具体实施方式
本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或规范。下面通过实施例对本发明作进一步说明。
本发明通过将异噁草酮完全抗原免疫小鼠，通过细胞融合，HAT选择性培养基培养，通过icELISA筛选细胞上清，最终得到了对异噁草酮有较高灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株ABC06。
实施例1 杂交瘤细胞株ABC06的制备
1、完全抗原的制备
（1）半抗原的合成，反应方程式如下式所示：
衍生步骤简述如下：
异噁草酮半抗原的制备：将26 μL浓硝酸溶于100 μL浓硫酸，混匀，制成混合酸溶液备用；取100 mg异噁草酮溶于325 μL浓硫酸，4℃搅拌溶解，向异噁草酮溶液中逐滴滴入混合酸溶液，-10℃反应7 h；恢复至0℃，加入2 mL冰水，逐滴加入浓氨水调节pH至4.8-5.2，有浅黄色固体析出，减压抽滤，干燥，得到产物为CLO-NO2；取50 mg CLO-NO2溶于乙醇/醋酸/水（体积比2:2:1）混合溶液中，置于圆底烧瓶中，加入20 mg锌粉和3 μL浓盐酸，60℃加热回流15 min，室温搅拌40 min，由混浊变为澄清；过滤除去锌粉，乙酸乙酯萃取，收集有机相，洗涤，干燥，减压蒸干，得到半抗原CLO-NH2；
（2）免疫原异噁草酮-BSA的制备：
称取3.4 mg 已制备的CLO-NH2，溶于200 μL DMF中，搅拌下依次加入4.6 mg N-羟基琥珀酰亚胺和7.7 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4 h，得到的混合物称为A液；然后称取10 mg牛血清蛋白BSA溶于2 mL碳酸盐缓冲液中，称为B液；将A液缓慢滴入B液中，搅拌下室温反应12 h，用0.01 mol/L 磷酸缓冲液PBS透析3 d，即得偶联物异噁草酮-BSA，-20℃冻存备用；
2、包被原的制备：
称取1.7 mg巳制备的CLO-NH2，溶于200 μL DMF中，搅拌下依次加入2.3 mg N-羟基琥珀酰亚胺和3.4 mg 1-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温反应4 h，得到的混合物称为A液；然后称取10 mg鸡卵清蛋白OVA溶于2 mL碳酸盐缓冲液中，称为B液；将A液缓慢滴入B液中，搅拌下室温反应12 h，用0.01 mol/L 磷酸缓冲液PBS透析3 d，即得偶联物异噁草酮-OVA，-20℃冻存备用。
3、小鼠的免疫：选择健康的6～8周龄的BALB/c小鼠进行免疫。取异噁草酮完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射分别免疫BALB/c小鼠。第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首次免疫与第二次加强免疫之间间隔28天，多次加强免疫之间间隔21天。首次免疫剂量为100μL/只，加强免疫剂量为50μL/只，冲刺免疫剂量为25μL/只。第三次免疫后7天采血（小鼠断尾采血5 μL + 995 μL抗体稀释液=抗血清），使用ic-ELISA测定小鼠血清效价和抑制，选择效价高抑制好的小鼠，在第五次免疫后21天冲刺免疫，腹腔注射，要求冲免剂量减半且不含任何佐剂。
4、细胞融合：在冲刺免疫三天后，按照常规PEG（聚乙二醇，分子量为4000）方法进行细胞融合，具体步骤如下：
（1）摘眼球取血，颈椎脱臼法处死小鼠后，立即放入75%酒精中消毒，浸泡5 min左右，无菌操作取出小鼠的脾脏，用注射器的胶头适度研磨并通过200目细胞筛网得到脾细胞悬液，收集，并离心（1200 rpm，8 min），用RPMI-1640培养基洗涤脾细胞三次，最后一次离心后，将脾细胞稀释到一定体积，计数，备用；
（2）收集鼠源骨髓瘤SP2/0细胞：融合前7-10天，将SP2/0瘤细胞用含10% FBS（胎牛血清）RPMI-1640培养基在5% CO2培养箱中培养。融合前要求SP2/0瘤细胞数量达到（1~ 4）×107，保证融合前SP2/0瘤细胞处于对数生长期。融合时，收集瘤细胞，悬浮于RPMI-1640基础培养液中，进行细胞计数；
（3）融合过程7 min。第1 min，将1 mL的PEG 4000由慢到快滴加到细胞中；第2min，静置。第3 min和第4 min，在1 min内滴加1 mL RPMI-1640培养基；第5 min和第6 min，在1 min内滴加2 mL RPMI-1640培养基；第7 min，每10 s滴加1 mL的RPMI-1640培养基。然后37℃温浴5 min。 离心（800 rpm，8 min），弃上清，重悬入含20%胎牛血清，2%的50×HAT的RPMI-1640筛选培养液中，按照200 μL/孔加到96孔细胞板，置于37℃、5% CO2培养箱中培养。
5、细胞筛选与细胞株建立：在细胞融合的第3天对融合细胞进行RPMI-1640筛选培养液半换液，第5天进行用含20%胎牛血清、1%的100×HT的RPMI-1640过渡培养液进行全换液，在第7天取细胞上清进行筛选。筛选分两步：第一步先用ic-ELISA筛选出阳性细胞孔，第二步选用异噁草酮为标准品，用ic-ELISA对阳性细胞进行抑制效果测定。选择对异噁草酮标准品均有较好抑制的细胞孔，采用有限稀释法进行亚克隆，用同样的方法进行检测。重复三次，获得细胞株ABC06。
6、单克隆抗体的制备与鉴定：取8-10周龄BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射无菌石蜡油1 mL；7天后每只小鼠腹腔注射1×106杂交瘤细胞，从第七天开始收集腹水，将腹水通过辛酸-硫酸铵法纯化。在偏酸条件下，正辛酸可以沉淀腹水中除IgG免疫球蛋白外的其他杂蛋白，然后离心，弃沉淀；再用等量饱和度的硫酸铵溶液沉淀IgG型的单克隆抗体，离心，弃上清，用0.01M PBS溶液（pH 7.4）溶解后，透析脱盐，最终得到纯化后的单克隆抗体，置于-20℃保存。
使用间接竞争ELISA法，测定单克隆抗体对异噁草酮的IC50为5.5 ng/mL，并验证其对噁唑菌酮等的IC50及交叉反应率，具体如表1所示。
表1 单克隆抗体ABC06对异噁草酮、噁唑菌酮、恶霉灵的IC50及交叉反应率
7、抗体应用：将杂交瘤细胞株ABC06通过体内腹水制备的单克隆抗体应用于异噁草酮的添加回收试验，具体步骤如下：
（1）包被：将包被原异噁草酮-OVA用0.05 M pH 9.6 碳酸盐缓冲液从1 µg/mL开始倍比稀释，100 μL/孔，37℃反应2 h；
（2）洗涤：将板内溶液倾去，并用洗涤液洗涤3次，每次3 min；
（3）封闭：拍干后，加入200 μL/孔封闭液，37℃反应2 h。洗涤后烘干备用；
（4）加样：将抗血清（小鼠断尾采血后，以抗体稀释液稀释相应倍数后即抗血清）从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100 μL/孔，37℃反应30 min；充分洗涤后，加入1:3000稀释的HRP-羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37℃反应30 min；
（5）显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100 μL的TMB显色液，37℃避光反应15 min；
（6）终止和测定：每孔加入50 μL终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的OD450值。
用ic-ELISA测定单克隆抗体对异噁草酮的IC50为5.5 ng/mL，说明对异噁草酮有很好的灵敏度，可用于异噁草酮免疫分析检测。
ABC06分泌的单克隆抗体对异噁草酮的抑制标准曲线如图1所示。
溶液配制：
碳酸盐缓冲液（CBS）：称取Na2CO3 1.59 g，NaHCO3 2.93 g，分别溶于少量双蒸水后混合，加双蒸水至约800 mL混匀，调pH值至9.6，加双蒸水定容至1000 mL，4℃贮存备用；
磷酸盐缓冲液（PBS）：8.0 g NaCl，0. 2g KCl，0.2g KH2PO4，2.9 g Na2HPO4•12H2O，溶于800 mL纯水中，用NaOH或HCl调pH到7.2～7.4，定容至1000 mL；
洗涤液（PBST）：1000 mL的0.01 mol/LpH7.4的PBS溶液中加入0.5 mL的Tween–20；
PBST：含0.05 % Tween–20的PBS；
抗体稀释液：含有0.1%明胶的洗涤缓冲液；
TMB显色液：A液：Na2HPO4•12H2O 18.43 g，柠檬酸9.33 g，纯水定容至1000 mL；B液：60 mg TMB溶于100 mL乙二醇中。A、B液按体积比1:5混合即为TMB显色液，现用现混。
综上所述，虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (3)
1.一株分泌异噁草酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株ABC06，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC，地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，分类命名为单克隆细胞株，保藏日期：2019年11月28日，保藏编号CGMCCNo.19181。
2.异噁草酮单克隆抗体，其特征在于：它由权利要求1所述保藏编号为CGMCC No.19181的杂交瘤细胞株ABC06分泌产生。
3.权利要求2所述异噁草酮单克隆抗体的应用，其特征在于用于食品安全检测中异噁草酮残留量的分析检测。
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