CN112513265A - 用于人类癌症检测的修饰核酸的靶向富集和测序 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测受试者的癌症或癌前病况的方法。它使用基于rhPCR的核酸靶向富集，以提高测序和分析的灵敏度和特异性。所述方法提供了来自受试者血浆、血清或其他体液的cfDNA的用途。

Description

用于人类癌症检测的修饰核酸的靶向富集和测序

发明领域

本发明涉及富集从人血浆中提取的核酸的方法及其测序方法。本发明尤其涉及对无细胞游离DNA(cfDNA)的修饰核酸进行富集和测序的方法，所述方法可用于各种临床诊断测试中，特别是用于人类癌症的检测。

发明背景

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，与基因组表达的调节密切相关。DNA四个碱基中的两个(胞嘧啶和腺嘌呤)可以被甲基化。某些遗传区域中甲基化的存在与否，具有产前诊断和预后的应用。癌细胞中DNA甲基化的异常模式，可用于将其与正常组织细胞区分开。癌细胞含有改变的甲基化模式，导致关键基因的异常表达。在癌症中，启动子CpG岛的超甲基化比突变引起的基因表达缺失发生的频率高约10倍。

Mendel和Metals于1948年报道了人血浆中存在循环无细胞游离DNA(cfDNA-也称为循环肿瘤DNA和循环核酸)。最近，循环无细胞游离DNA(cfDNA)已被认为是癌症进展、治疗应答和耐药性的潜在生物标志物。从癌症患者血浆或血清中提取的cfDNA具有典型的肿瘤DNA特征，可作为癌症检测和治疗的非侵入性生物标志物(WO2013123030A2/RYAN WAYNEL)。来源于血液或其他体液的无细胞游离DNA代表了一种更易获得的材料，可以从中获得DNA用于PCR和/或NGS测试和分析。

异常的DNA甲基化发生在癌症的早期，并且可以在循环无细胞游离DNA(ccfDNA)中检测到，从而构成了有价值的生物标志物，并能够进行非侵入性的癌症检测。当大多数具有相同序列的DNA未被甲基化时，需要高度灵敏的方法对非常低水平的甲基化DNA多重检测。例如，对从血清中分离出的无细胞游离DNA中多个甲基化DNA序列的检测，可以使癌症的早期检测成为可能。

现有用于癌症检测的方法的缺点是未甲基化的DNA与甲基化的DNA一起扩增，其进一步导致错误的测序和分析。仍然需要可以仅识别甲基化序列并进行准确检测的更灵敏和特异的筛选工具。认识到这一局限性，我们开发了用于检测人类癌症的高度灵敏的诊断工具，该工具利用了rhPCR(Integrated DNA Technologies，Inc.)和NGS技术。

发明概述

本发明旨在通过提供从人血浆中富集核酸的方法及测序所述核酸的方法来满足这些需求。

本发明的目的是提供一种用于检测甲基化核酸以鉴定受试者的癌症或癌前病况的方法，所述方法包括以下步骤：a.从受试者的体液中获得核酸；b.任选地，对核酸进行亚硫酸氢盐转化；c.使用rhPCR富集核酸；d.使用NGS对富集的核酸进行测序；以及e.基于测序鉴定受试者的癌症或癌前病况；其中rhPCR通过选择性扩增甲基化核酸并消除引物二聚体的形成，在基于NGS的测序分析中提高了对甲基化核酸的灵敏度和特异性。

根据本发明的另一个目的，本发明提供了一种用于检测甲基化核酸以鉴定受试者的癌症或癌前病况的方法，所述方法包括以下步骤：a.从受试者的体液中获得核酸；b.任选地，对核酸进行亚硫酸氢盐转化；c.使用rhPCR富集核酸；d.使用qPCR或RT-PCR(实时PCR)对富集的核酸进行测序；以及e.基于测序鉴定受试者的癌症或癌前病况；其中rhPCR通过选择性扩增甲基化核酸并消除引物二聚体的形成，在基于qPCR或RT-PCR(实时PCR)的测序分析中提高了对甲基化核酸的灵敏度和特异性。

根据本发明的另一个目的，进行从体液中提取的核酸的亚硫酸氢盐转化以区分甲基化的胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶。

根据本发明又一个目的，所述rhPCR富集方法可以提高利用下一代测序(NGS)进行甲基化DNA检测的灵敏度。

根据本发明又一个目的，所述rhPCR富集方法可以提高用qPCR或RT-PCR(实时PCR)进行甲基化DNA检测的灵敏度。

根据本发明又一个目的，所述rhPCR方法使用独特设计的rhPCR引物(rhPrimers)和热稳定的RNase H2酶，它们消除或减少了非特异性相互作用，如引物二聚体或错误引发的PCR产物。而且，rhPCR引物选择性地扩增甲基化等位基因，因此显著提高了测定的灵敏度和特异性。

根据本发明又一个目的，所述癌症或癌前病况可以是

结肠癌、肝癌、脑癌、子宫癌、膀胱癌、血液癌、肺腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、卵巢癌、胃癌、恶性间皮瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、结直肠癌、Spitzoid黑色素瘤、唾液腺癌、食道癌、腺样囊性癌、多形细胞瘤、胃癌、肾癌、尿道癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、肥大细胞增多症、乳房外佩吉特病、急性髓系白血病、胆管癌或肉瘤。

根据本发明又一个目的，所述体液可以是血液、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、滑液、羊水、精液、脑脊髓液、卵泡液和其他体液中的一种。

根据本发明又一个目的，所述核酸是修饰的核酸。

根据本发明又一个目的，所述核酸是甲基化的核酸。

根据本发明又一个目的，所述核酸选自：DNA、RNA、cDNA、mRNA、cfDNA、ccfDNA和ctDNA。

根据本发明又一个目的，所述核酸是甲基化的DNA。

根据本发明又一个目的，所述测序技术可以选自但不限于：qPCR、RT-PCR(实时PCR)、下一代测序(NGS)；所述NGS测序包括

Illumina的MiSeq测序，Illumina的HiSeq测序，Illumina的基因组分析仪IIX测序，Roche的454焦磷酸测序，Ion Torrent半导体测序，Life Technologies的SOLiD4测序，Life Technologies的Ion Proton测序，Helicos Biosciences的Heliscope测序，以及Pacific Biosciences的SMRT测序。

通过以下优选实施方案的详细描述和附图，本公开的各种目的、特征、方面和优点将变得更加明显。

附图说明

在附图中阐释了示例性实施方案。旨在将本文公开的实施方案和附图视为说明性而非限制性的。

图1显示了用于富集靶核酸的rhPCR工作流程。

图2显示了通过基于多重rhPCR的扩增子测序进行甲基化检测的下一代测序(NGS)分析工作流程。

发明详述

结合系统、组成和方法来描述和说明以下实施方案及其方面，其旨在作示例性和说明性的而非限制其范围。。

术语和首字母缩写词的词汇表

如本文所用，术语“包含/含有”是用于指对实施方案有用的组合物，方法和其各自的组分，但对包含未指明的成分是开放的，无论其是否有用。本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语通常旨在作为“开放”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于”，术语“具有”应该被解释为“至少具有”，术语“包括(includes)”应被解释为“包括但不限于”，等等)。

除非另有说明，在描述本申请特定实施方案的上下文中使用的术语“一个/种(a/an)”和“该/所述(the)”以及类似的指称(尤其是在权利要求的上下文中)，可以被解释为涵盖单数和复数形式。本文中数值范围的列举仅旨在用作分别指代该范围内每个单独数值的简写方法。除非本文另外指出，每个单独的值都被并入说明书中，就如其在本文中被单独引用一样。除非本文另外指出，或与上下文明显矛盾，本文描述的所有方法可以按任何合适的顺序执行。针对本文某些实施方案提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如/如”)的使用，仅旨在更好地阐释本申请，并且不对以其他方式要求保护的本申请的范围构成限制。缩写“e.g.”衍生自拉丁文例如(exempli gratia)，并且在本文中用于表示非限制性实例。因此，缩写“e.g.”与“例如”一词同义。说明书中的任何语言都不应解释为表示对应用实践必不可少的任何未要求保护的要素。

术语“cfDNA”是指循环无细胞游离DNA，即它不包含在细胞中，并且由于其在某些生物液体中自由循环而可以源自血液。

术语“rhPCR”是指新颖的核酸扩增技术，其提供了比常规PCR更高的准确性。

术语“rhPCR引物(rhPrimers)”是指包含RNA碱基和3'封闭部分的独特引物，并与热稳定的RNase H2酶结合使用以进行rhPCR。

术语“靶向富集”是指靶DNA的扩增。例如，富集过程可以使甲基化的靶DNA比未甲基化的DNA增加数倍。

术语“DNA甲基化”是指将甲基添加至DNA分子的过程。

术语“甲基化靶标”是指具有添加到DNA分子中的甲基的甲基化DNA。

术语“未甲基化的靶标”是指未甲基化的DNA是除甲基化的DNA以外的DNA。

术语“亚硫酸氢盐转化”是指涉及将胞嘧啶转化为尿嘧啶同时保留5-甲基胞嘧啶(5-mC)完整的技术。

术语“受试者”是指患有或处于患疾病风险中的个体，例如受试者是患有癌症的人。

术语“文库制备”是指产生具有相似大小的DNA片段的集合，其中已知的接头序列被添加到5'和3'末端以进行测序。

DNA甲基化模式的改变是癌症的标志。在不同类型的癌症中，启动子区域中的DNA甲基化导致某些肿瘤抑制基因沉默和失活。研究表明，甲基化的DNA标志物为科学家提供了一条将肿瘤细胞与正常细胞区分开的可行途径，从而大大改善了癌症的诊断。

多年来，DNA亚硫酸氢盐转化已用作各种不同分子方法的平台。亚硫酸氢盐转化方法是基于将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶(不影响甲基化的胞嘧啶)，使得在特定DNA区域的DNA甲基化模式可确定。使用基因特异性PCR引物，通过PCR扩增亚硫酸氢盐化的DNA，为其后续测定赋予序列特异性和高灵敏度(Yannick Delpu.et al.,DNA Methylation andCancer Diagnosis,2013,14,15029-15058)。甲基化灵敏度限制酶(MSRE)与聚合酶链反应(PCR)以及基因特异性引物结合使用，使得可以鉴定基因组DNA上甲基化位点(例如，甲基化的胞嘧啶)的准确位置(Anatoliy A.Melnikov et al.,MSRE-PCR for analysis of gene-specific DNA methylation,2005；33(10):e93)。

尽管PCR技术用于检测目的在研究领域和诊断领域众所周知，然而，它可能具有形成引物二聚体和/或引起同源序列错误扩增的缺点。为了克服该限制，用RNase H2酶进行PCR，其中该酶用于激活与靶序列杂交的RNase H2特异性的封闭的引物。RNase H2特异性引物包含单个核糖核苷酸残基，该残基成为所述酶激活所述引物的切割位点。这消除了引物-二聚体的形成，并且还减少了相关序列的错误扩增。切割区域的错配减少了酶切割的机会，从而进一步增加了反应的特异性(Joseph R Dobosy et al.,RNase H-dependent PCR(rhPCR):improved specificity and single nucleotide polymorphism detectionusing blocked cleavable primers,2011,11:80)。

PCR产物的进一步测序可以提供DNA甲基化模式的明确的和定量的信息。诸如下一代测序、定量PCR(实时PCR)之类的方法，可能足以量化DNA特定区域的甲基化水平。这些方法可产生高分辨率的DNA甲基化谱图结果，使得能够确定靶DNA的绝对数量，并提供扩增DNA片段的实时可视化。

在一个实施方案中，本发明涉及一种用于检测甲基化核酸以鉴定受试者的癌症或癌前病况的方法，所述方法包括以下步骤：

步骤a)从受试者的体液中获得核酸；

步骤b)任选地，对核酸进行亚硫酸氢盐转化；

步骤c)使用rhPCR富集核酸；

步骤d)使用NGS对富集的核酸进行测序；以及

步骤e)基于测序鉴定受试者的癌症或癌前病况；其中rhPCR通过选择性扩增甲基化核酸并消除引物二聚体的形成，在基于NGS的测序分析中提高了对甲基化核酸的灵敏度和特异性。

本发明提供的方法的步骤a)包括从体液中获得核酸，其中所述体液可以选自但不限于：活检中使用的血液、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、滑液、羊水、精液、脑脊髓液、卵泡液和其他体液。在一个实例中，所述核酸是从人血浆中提取的。所述核酸的提取可以使用本领域已知的任何方法和试剂盒进行，但不限于：用有机溶剂提取，苯酚-氯仿提取，基于SDS的离心分离提取，QIAamp循环核酸试剂盒(QIAgen试剂盒)，MagMAX无细胞游离DNA分离试剂盒(Thermo Fisher Scientific)，Quick-cfDNA^TM血清和血浆试剂盒(ZYMO)，Chamagic cfDNA5k试剂盒(Chemagen)和NucleoSpin血浆XS(TaKaRa)等。

本发明中的核酸可以选自但不限于：DNA、RNA、cDNA、mRNA、无细胞游离DNA(cfDNA)、循环无细胞DNA(ccfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和无细胞游离胎儿DNA(cffDNA)。在本发明的一个实例中，所述修饰的核酸是甲基化的。在另一个实例中，所述修饰的核酸是甲基化的cfDNA。本发明提供了从体液中提取的修饰核酸用于各种诊断测试的用途。在一个实例中，所述修饰的核酸用于人类癌症检测。所述癌症可以是但不限于：乳腺癌、前列腺癌、基底细胞黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、脑癌、膀胱癌、白血病、淋巴瘤或与身体任何部位有关的癌。在一个实例中，所述癌症是结直肠癌。

本发明提供的方法的步骤b)包括任选地对核酸进行亚硫酸氢盐转化。所述转化包括用亚硫酸氢盐或亚硫酸氢钠处理核酸，所述亚硫酸氢盐或亚硫酸氢钠通过使未甲基化的胞嘧啶脱氨基而将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而完整保留5-甲基胞嘧啶(5-mC)。此转换过程使PCR扩增过程能够将尿嘧啶识别为胸腺嘧啶，将5-mC或5-hmC识别为胞嘧啶，使得能够将5mC与未甲基化的胞嘧啶区分开。

本发明提供的方法的步骤c)包括使用rhPCR富集核酸，如图1所示。rhPCR使用独特设计的rhPCR引物和热稳定的RNase H2酶。富集步骤包括设计独特的rhPCR引物，其中这些rhPCR引物包含单个核糖核苷酸残基和3'封闭部分。所述引物是封闭的引物，当被RNase H2酶在G/C匹配处切割时被激活，随后是核酸的扩增步骤。所述引物仅在它们与完全匹配的核酸靶序列杂交后才能被切割。因此，rhPCR通过消除或减少非特异性相互作用(如引物二聚体)，显著提高了特异性和多重性。在rhPCR方法之前通过亚硫酸氢盐转化，促进了靶DNA样品的富集，以进一步用于各种诊断目的。

本发明提供的方法包括制备富集的核酸的文库。该文库制备涉及产生核酸片段的集合以用于测序。在一个实例中，将通用索引PCR(24个循环)用于NGS DNA文库制备。

本发明提供的方法的步骤d)包括使用NGS对富集的核酸进行测序。对富集的核酸的测序可实现针对多种应用的靶DNA分析和剖解，包括但不限于：诊断复杂疾病，全基因组测序，表观遗传修饰(如DNA甲基化)分析，靶向RNA序列的基因表达分析和线粒体测序转录组测序。

对从测序文库获得的富集核酸的测序，通过下一代测序(NGS)方法实现。根据本发明的实施方案，可以使用由不同公司开发的各种NGS方法，但不限于：Illumina(MiSeq、HiSeq、基因组分析仪IIX测序)，Roche(454焦磷酸测序)，Ion Torrent半导体，LifeTechnologies(SOLiD4、Ion Proton测序)，Helicos Biosciences(Heliscope测序)，以及Pacific Biosciences(SMRT测序)。在一个实例中，所述NGS是基于Illumina MiSeq的测序方法，其中Illumina Miseq包括把簇生成、扩增、测序和数据分析整合到单个仪器中。

在本发明另一个实施方案中，对从测序文库获得的富集核酸的测序，是通过定量聚合酶链反应(qPCR)或实时PCR(RT-PCR)方法实现的。

本发明提供的方法的步骤e)包括基于测序鉴定受试者的癌症或癌前病况。进一步分析测序的核酸，用于各种诊断测试。在一个实例中，分析测序的核酸以基于靶区域中CpG位点计数总的C和T，其指示受试者中的人类癌症检测。所述癌症可以是但不限于：结肠癌、肝癌、脑癌、子宫癌、膀胱癌、血液癌、肺腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、卵巢癌、胃癌、恶性间皮瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、结直肠癌、Spitzoid黑色素瘤、唾液腺癌、食道癌、腺样囊性癌、多形细胞瘤、胃癌、肾癌、尿道癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、肥大细胞增多症、乳房外佩吉特病、急性髓系白血病、胆管癌或肉瘤或与身体其他任何部位有关的癌。在一个实例中，所述癌症是结直肠癌。在另一个实例中，所述癌症选自：胃肠癌、肺癌和乳腺癌。

在另一个实施方案中，本发明涉及一种使用基于NGS的测序分析和rhPCR来提高甲基化DNA检测的灵敏度和特异性的方法，其中rhPCR用于富集甲基化DNA。

在又一个实施方案中，本发明涉及使用基于qPCR或RT-PCR(实时PCR)的测序分析和rhPCR来提高甲基化DNA检测的灵敏度和特异性的方法，其中rhPCR用于富集甲基化DNA。

根据先前实施方案的方法，在rhPCR之前进行亚硫酸氢盐转化，其中亚硫酸氢盐转化使rhPCR能够区分甲基化和未甲基化的胞嘧啶。

rhPCR引物选择性地扩增甲基化等位基因，同时消除了引物二聚体的形成，因此显著提高了测定的灵敏度和特异性。

甲基化DNA检测还用于鉴定受试者的癌症或癌前病况，其中甲基化DNA选自但不限于：cDNA、无细胞游离DNA(cfDNA)、循环无细胞游离DNA(ccfDNA)、循环肿瘤DNA(ctDNA)和无细胞胎儿DNA(cffDNA)。在一个实例中，鉴定的癌症或癌前病况是结直肠癌。

rhPCR使用独特设计的rhPCR引物和热稳定的RNase H2酶，如图1所示。设计独特的rhPCR引物包含单个核糖核苷酸残基和3'封闭部分。所述引物是封闭的引物，仅在被RNaseH2酶切割后才被激活。从引物中除去封闭的区段后，添加DNA聚合酶以延伸未封闭的引物，从而得到富集的PCR产物。因此，rhPCR显著增加了该过程的特异性和多重性。在rhPCR方法之前进行亚硫酸氢盐转化，有助于进一步富集靶DNA样品，以用于各种诊断目的。

在rhPCR之前将从受试者体液中提取的核酸进行亚硫酸氢盐转化。此转换过程使PCR扩增过程能够将5mC(甲基化胞嘧啶)与未甲基化的胞嘧啶区分开。与常规方法相比，本发明的方法可缩短4-5小时。

在本发明的又一个实施方案中，可以在使用rhPCR方法富集核酸之后并入纯化步骤。纯化方法包括但不限于：SPRI、DNA IQ、羧化珠等。在一个实例中，使用SPRI(固相可逆固定化)方法纯化核酸。

在本发明的又一个实施方案中，可以在富集核酸的文库制备之后并入纯化步骤。纯化方法包括但不限于：SPRI、DNA IQ、羧化珠等。在一个实例中，使用SPRI(固相可逆固定化)方法纯化文库制备后的核酸。

在本发明的另一个实施方案中，可以在制备核酸文库之前和/或之后使用SPRI方法纯化富集的核酸。

在本发明的另一个实施方案中，在纯化方法(例如SPRI)之后进行定量PCR(qPCR)以测量核酸的量。在一个实例中，在纯化核酸文库之后进行qPCR。

在又一个实施方案中，本发明提供了一种通过基于多重rhPCR的扩增子测序进行甲基化检测的方法，如图2所示。所述方法包括：从体液样品中提取靶核酸，其中所述体液样品可以选自但不限于：血液、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、滑液、羊水、精液、脑脊髓液、卵泡液等；对靶核酸进行亚硫酸氢盐转化，以区分甲基化的胞嘧啶和未甲基化的胞嘧啶；在亚硫酸氢盐转化的核酸上进行基于多重rhPCR的富集；纯化富集核酸的rhPCR扩增产物；使用富集核酸制备NGS文库；纯化核酸文库，并对富集的核酸进行测序，然后进行数据分析。分析的数据可以用于检测受试者的任何癌症或癌前病况。

在本发明的另一个实施方案中，可以进行通用索引PCR以制备核酸文库。

在又一个实施方案中，本发明还涉及用于基于rhPCR的核酸富集以增加测序分析的灵敏度和特异性的方法。在一个实例中，通过下一代测序(NGS)进行富集核酸的序列分析。在本发明的另一个实例中，通过qPCR方法进行所述序列分析。

实施例

以下实施例并非旨在将权利要求的范围限制于本发明，而是旨在作为某些实施方案的示例。本领域技术人员想到的所述示例性方法中的任何变化都将落入本发明的范围内。

实施例1：使用合成模板进行rhPCR富集有效性测试

在加内参(spiked)的合成模板中进行测试，以先进行富集测定，然后进行检测测定(模板5000份)，以检查其富集和检测性能。富集步骤增加了Septin 9的甲基化靶标4.13～4.82Cts，未甲基化靶标-0.95～-1.36Cts。所述富集可将Septin 9靶DNA增加10倍以上。

表1：无富集时通过PCR检测Septin 9

表2：有富集时通过PCR检测Septin 9(12个循环)

实施例2：用来自癌细胞系的DNA进行rhPCR富集有效性测试

在分离的Jurkat gDNA(9ng)和HeLa gDNA(9ng)上进行测试，以在进行Septin 9的检测测定前检查富集测定。甲基化靶标(HeLa为ΔCt 9.76)比未甲基化靶标(Jurkat为ΔCt1.96)的富集效果更好。结果表明，富集可以使Septin 9靶DNA在肿瘤gDNA中增加10倍以上(富集20个循环)

表3：从癌细胞系DNA中富集并通过PCR检测Septin 9

表4：从癌细胞系DNA中富集并通过PCR检测Septin 9

实施例3：用结肠癌组织的DNA进行rhPCR富集有效性测试

在人结肠肿瘤gDNA(9ng)上进行测试，以检查富集测定，然后进行Septin 9的检测测定。富集可使肿瘤gDNA中Septin 9靶DNA增加10倍以上(甲基化靶标为ΔCt 8.9，非甲基化靶标为ΔCt 4.64)(富集20个循环)

表5：从癌细胞系DNA中富集并通过PCR检测Septin 9

实施例4：靶向富集和NGS检测

将四个样品，Jurkat(25ng DNA)、HeLa(25ng DNA)，掺入1％HeLa的Jurkat(25ngDNA)和掺入10％HeLa的Jurkat(25ng DNA)用于研究。首先，所有DNA样品均经过亚硫酸氢盐转化。然后进行了rhPCR靶向富集(14个循环)。富集产物通过SPRI方法纯化。对所有4个样品设重复以进行通用索引PCR(24个循环)，用于NGS DNA库制备。使用SPRI方法再次纯化这8个DNA文库。进行定量PCR以测量DNA文库的数量。然后将所有8个DNA文库等量混合。将混合的样品上样至Illumina MiSeq Reagent Nano试剂盒v2(300个循环，1M簇PF)，并在MiSeq系统上测序。分析NGS数据。最终读出的数据显示了插入比对率(mapped rate)，以及基于目标基因(Septin 9)靶区域中CpG位点计算的总C和T。

最终结果表明，未甲基化的靶标(Jurkat比对率为0.0％，0.0％)无富集。甲基化的靶标被特异性扩增(HeLa比对率28.9％，39.1％)。HeLa样品几乎完全被甲基化(T/C比率2.31％，2.48％)。较低量的甲基化靶标在富集过程中扩增，并经过了测序。序列数据还表明靶标的完全甲基化(1％HeLa比对率25.0％，25.9％；T/C比率0.30％，0.17％)。

表6：具有癌细胞系DNA富集的Septin 9NGS检测

本文所有出版物的引用程度均如同具体和单独地指出各单独出版物或专利申请经引用并入。以下描述包括理解本发明可能有用的信息。并非承认本文提供的任何信息是现有技术或与当前要求保护的发明有关，或明示或暗示引用的任何出版物为现有技术。

Claims (20)

1.用于检测甲基化核酸以鉴定受试者的癌症或癌前病况的方法，所述方法包括以下步骤：

a.从受试者的体液中获得核酸；

b.任选地，对核酸进行亚硫酸氢盐转化；

c.使用rhPCR富集核酸；

d.使用NGS对富集的核酸进行测序；以及

e.基于测序鉴定受试者的癌症或癌前病况；

其中rhPCR通过选择性扩增甲基化核酸并消除引物二聚体的形成，在基于NGS的测序分析中提高了对甲基化核酸的灵敏度和特异性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述体液选自：血液、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、滑液、羊水、精液、脑脊髓液、卵泡液和其他体液。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述甲基化的核酸选自：DNA、RNA、cDNA、mRNA、cfDNA、ccfDNA和ctDNA。

4.根据权利要求1所述的方法，其中NGS测序选自：Illumina的MiSeq测序、Illumina的HiSeq测序、Illumina的基因组分析仪IIX测序、Roche的454焦磷酸测序、Ion Torrent半导体测序、Life Technologies的SOLiD4测序、Life Technologies的Ion Proton测序、Helicos Biosciences的Heliscope测序、以及Pacific Biosciences的SMRT测序。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述癌症或癌前病况是结肠癌、肝癌、脑癌、子宫癌、膀胱癌、血液癌、肺腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、卵巢癌、胃癌、恶性间皮瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、结直肠癌、Spitzoid黑色素瘤、涎腺腺样囊性癌、多形细胞瘤、胃癌、肾癌、尿道癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、肥大细胞增多症、乳房外佩吉特病、急性髓系白血病、胆管癌或肉瘤。

6.用于检测甲基化核酸以鉴定受试者的癌症或癌前病况的方法，所述方法包括以下步骤：

a.从受试者的体液中获得核酸；

b.任选地，对核酸进行亚硫酸氢盐转化；

c.使用rhPCR富集核酸；

d.使用qPCR或RT-PCR(实时PCR)对富集的核酸进行测序；以及

e.基于测序鉴定受试者的癌症或癌前病况；

其中rhPCR通过选择性扩增甲基化核酸并消除引物二聚体的形成，在基于qPCR或RT-PCR(实时PCR)的测序分析中提高了对甲基化核酸的灵敏度和特异性。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述体液选自：血液、血浆、血清、尿液、唾液、腹水、滑液、羊水、精液、脑脊髓液、卵泡液和其他体液。

8.根据权利要求6所述的方法，其中所述甲基化的核酸选自：DNA、RNA、cDNA、mRNA、cfDNA、ccfDNA和ctDNA。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述癌症或癌前病况是结肠癌、肝癌、脑癌、子宫癌、膀胱癌、血液癌、肺腺癌、乳腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、乳头状甲状腺癌、卵巢癌、胃癌、恶性间皮瘤、前列腺癌、成神经细胞瘤、结直肠癌、Spitzoid黑色素瘤、唾液腺癌、食道癌、腺样囊性癌、多形细胞瘤、胃癌、肾癌、尿道癌、胶质母细胞瘤、口腔鳞状细胞癌、肥大细胞增多症、乳房外佩吉特病、急性髓系白血病、胆管癌或肉瘤。

10.使用基于NGS的测序分析和rhPCR提高甲基化DNA检测的灵敏度和特异性的方法，其中rhPCR用于富集甲基化DNA。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述甲基化DNA选自：cDNA、cfDNA、ccfDNA和ctDNA。

12.根据权利要求10所述的方法，其中所述甲基化DNA检测还用于鉴定受试者的癌症或癌前病况。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述癌症或癌前病况是结直肠癌。

14.根据权利要求10至12中任一项所述的方法，

其中NGS测序选自：Illumina的MiSeq测序、Illumina的HiSeq测序、Illumina的基因组分析仪IIX测序、Roche的454焦磷酸测序、Ion Torrent半导体测序、Life Technologies的SOLiD4测序、Life Technologies的Ion Proton测序、Helicos Biosciences的Heliscope测序、以及Pacific Biosciences的SMRT测序。

15.权利要求10的方法，其中在rhPCR之前进行亚硫酸氢盐转化。

16.使用基于qPCR或RT-PCR(实时PCR)的测序分析和rhPCR提高甲基化DNA检测的灵敏度和特异性的方法，其中rhPCR用于富集甲基化DNA。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述甲基化DNA选自：cDNA、cfDNA、ccfDNA和ctDNA。

18.根据权利要求16所述的方法，其中所述甲基化DNA检测还用于鉴定受试者的癌症或癌前病况。

19.根据权利要求16所述的方法，其中所述癌症或癌前病况是结直肠癌。

20.根据权利要求16所述的方法，其中在rhPCR之前进行亚硫酸氢盐转化。

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