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CN112512520A - 治疗中的p2rx7调节剂 - Google Patents

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CN112512520A CN201980024129.7A CN201980024129A CN112512520A CN 112512520 A CN112512520 A CN 112512520A CN 201980024129 A CN201980024129 A CN 201980024129A CN 112512520 A CN112512520 A CN 112512520A
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Universite Lille 2 Droit et Sante
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Abstract

本发明涉及式(I)的化合物、其对映体及其药学上可接受的盐以及其在治疗中的用途，特别是用于预防和/或治疗癌症或炎症性疾病。

Description

治疗中的P2RX7调节剂
技术领域
本发明涉及式(I)的化合物、其对映体及其药学上可接受的盐以及其在治疗中的用途，特别是用于预防和/或治疗癌症或炎症性疾病。
背景技术
炎症是关键的保护性应答，而将炎症与损伤修复和再生联系起来的大多数机制在进化中均得到保留(Karin,M.和Clevers,H.修复性炎症负责组织再生(Reparativeinflammation takes charge of tissue regeneration).Nature,2016.529:p.307-315)。炎症是一种微调的应答；这种应答的困扰导致许多慢性退行性疾病。流行病学研究特别强调了慢性炎症与癌症之间的联系。在这种情况下，鉴于现有疗法的长期有效性，迫切需要开发治疗炎症和由此引起的病理的新策略。
正常细胞或肿瘤细胞的死亡会产生与危险相关的分子模式(DAMP)，如ATP，其通常位于细胞内部。P2X家族的嘌呤能受体是由三种蛋白质单体形成的ATP门控性阳离子通道。在这七种受体成员中，受体P2X7(由基因P2RX7编码)是具有在富含细胞外ATP的微环境中介导大孔形成并最终导致细胞死亡的潜力的唯一一个。P2RX7由免疫细胞和非免疫细胞表达。
P2RX7建立微调炎症反应的潜力已经凸显；还显示出P2RX7拮抗剂在结肠炎相关癌症的原位小鼠模型中提高肿瘤发生率的能力(Cesaro,A.等人,响应中性粒细胞跨上皮迁移，肠上皮细胞中的P2X7R激活诱导了炎症过程的放大环(Amplification loop of theinflammatory process is induced by P2X7R activation in intestinal epithelialcells in response to neutrophil transepithelial migration),Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol,2010.299(1):p.G32-42；Hofman,P.等人,嘌呤能P2RX7受体的遗传和药理失活抑制炎症，但增加了结肠炎相关癌小鼠模型中的肿瘤发病率(Geneticand Pharmacological Inactivation of the Purinergic P2RX7 Receptor DampensInflammation but Increases Tumor Incidence in a Mouse Model of Colitis-Associated Cancer),Cancer Res,2015)。
此外，大多数针对慢性炎症或癌症的现有治疗使免疫细胞应答失调。
在过去十年中，免疫疗法(抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体或抗CTLA-4抗体)彻底改变了黑色素瘤和肺癌(NLSCC)的治疗(Sharma,P.和J.P.Allison,免疫检查点疗法的未来(Thefuture of immune checkpoint therapy),Science,2015.348(6230):p.56-61)。这些疗法可逆转免疫检查点，以放大T细胞应答并降低肿瘤微环境(TME)内的免疫抑制。然而，一些PD-L1表达水平较高的患者对治疗有抗药性(McLaughlin,J.等人,定量评估非小细胞肺癌中PD-L1表达的异质性(Quantitative Assessment of the Heterogeneity of PD-L1Expression in Non-Small-Cell Lung Cancer),JAMA Oncol,2016.2(1):p.46-54)。T淋巴细胞的抗肿瘤活性也被TME内吸引的髓样抑制细胞(MDSC)削弱(Anderson,K.G.,I.M.Stromnes和P.D.Greenberg,肿瘤微环境对T细胞活性构成的障碍：协同治疗的病例(Obstacles Posed by the Tumor Microenvironment to T cell Activity:A Case forSynergistic Therapies),Cancer Cell,2017.31(3):p.311-325)。
因此，需要开发针对所有免疫抑制因子的新免疫疗法。还需要能够重新激活肿瘤的免疫原性和/或可以恢复患者的免疫系统的有效疗法。
发明内容
本发明旨在解决这些需求：它涉及化合物，其为P2RX7调节剂，并且可用于治疗慢性炎症性疾病和癌症。
令人惊讶地，发明人发现所述化合物在细胞外ATP的存在下增强P2RX7，并且能够恢复功能性抗肿瘤T细胞应答。此外，发明人还发现：所述化合物既通过提高肿瘤免疫原性而直接作用于肿瘤细胞，又通过降低免疫抑制细胞的浸润而作用于肿瘤微环境。
有趣的是，发明人注意到：所述化合物对于降低结肠炎症的鼠模型中的炎症临床症状也是有效的。
因此，出乎意料的是，所述分子可能能够治疗炎症性疾病和癌症。
因此，本发明涉及一种化合物，选自式(I)的化合物、其对映体及其药学上可接受的盐，
Figure BDA0002711329260000031
其中，
R1代表C1-C14烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂芳基，其中，所述芳基、芳烷基或杂芳基不被或被选自以下的至少一种基团取代：
-卤素原子，
-C1-C6烷氧基，
-C1-C6烷基，和
-C1-C6卤代烷基；
并且R2代表芳基、芳烷基或环烷基，其中，所述芳基或芳烷基不被或被选自卤素原子的至少一种基团取代。
优选地，本发明的化合物不同于以下化合物：
Figure BDA0002711329260000032
优选地，本发明的化合物(式(I)或(II))使得R1和R2各自不同时代表未取代的苯基。
优选地，本发明的化合物(式(I)或(II))使得R1和R2各自不同时代表以下杂芳基：
Figure BDA0002711329260000033
所述杂芳基为色酮基。
优选地，本发明的化合物选自式(I’)的化合物、其对映体及其药学上可接受的盐，
Figure BDA0002711329260000041
其中，R1代表C1-C14烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂芳基，其中，所述芳基、芳烷基或杂芳基不被或被选自以下的至少一种基团取代：
-卤素原子，
-C1-C6烷氧基，
-C1-C6烷基，和
-C1-C6卤代烷基。
优选地，式(I)的化合物为对映体(S)，对映体(S)具有下式(II)：
Figure BDA0002711329260000042
其中，R1和R2如上定义。
更优选地，本发明的化合物具有下式(II’)：
Figure BDA0002711329260000043
其中，R1如上定义。
“药学上可接受的盐”是指使用无机酸或有机酸制备的任何盐，无机酸如盐酸、硫酸、磷酸等，而有机酸如乙酸、柠檬酸、马来酸、琥珀酸、酒石酸、乳酸、苹果酸、草酸、富马酸、甲磺酸等。
卤素原子优选选自F、Br、I和Cl，更优选为Cl。
“C1-C14烷基”是指包含1至14个碳原子的直链烃基，特别是1至12个碳原子的直链烃基，或包含3至6个碳原子的支链烃基。C1-C14烷基的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、正己基和十二烷基，并且优选为甲基、正丁基、正戊基、正己基、正十二烷基、异丙基或叔丁基。
类似地，“C1-C6烷基”是指包含1至6个碳原子的直链烃基或包含3至6个碳原子的支链烃基。C1-C6烷基的实例包括：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和正己基，并且优选为甲基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基或叔丁基。
“C1-C6烷氧基”是指-O-烷基，其中，烷基部分为C1-C6烷基。优选地，C1-C6烷氧基为甲氧基。
“C1-C6卤代烷基”是指其至少一个氢原子被一个或多个卤素原子取代的C1-C6烷基。
优选地，C1-C6卤代烷基为三氟甲基。
“环烷基”是指包含1至12个碳原子的环状饱和烃基。优选地，环烷基选自环己基甲基、金刚烷基和环己基。
“芳基”是指可任选被取代的单环或多环芳族烃基。优选地，芳基为苯基。它也可以为联苯。芳基可未被取代或被至少一个卤素原子、一个C1-C6烷氧基和/或一个C1-C6卤代烷基取代。
优选的芳基为2-氯苯基、4-氯苯基、2-溴苯基、2-碘苯基、2,4-二氯苯基、3,4-二氯苯基、2,4-二甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、3,5-双(三氟甲基)苯基或2,4,6-三甲基苯基。
“芳烷基”是指通过烷基与式(I)的其余部分连接的芳基。芳烷基可未被取代或被至少一个卤素原子、一个C1-C6烷氧基、一个C1-C6烷基或一个C1-C6卤代烷基取代。优选地，芳烷基为取代或未取代的苄基或苯乙基。
优选地，芳烷基选自苄基、2-氯苄基、2,4-二氯苄基、3,4-二氯苄基和2,4-二氯苯乙基。
“杂芳基”是指芳族环的至少一个碳原子被杂原子取代且本身可任选被取代的芳基。杂原子可以为氮、氧、磷或硫。优选地，杂原子为氮。杂芳基的实例包括：吡啶基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、咪唑基、噻唑基、噁唑基和异噁唑基。
优选地，杂芳基为吡啶基，如2-吡啶基或3-吡啶基。杂芳基可未被或被至少一个卤素原子、一个C1-C6烷氧基和/或一个C1-C6卤代烷基取代。
优选地，杂芳基为6-氯吡啶-3-基或噻吩-2-基。
更优选地，本发明的化合物选自以下化合物(即，所有对映体(S))及其药学上可接受的盐：
Figure BDA0002711329260000061
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2314)
Figure BDA0002711329260000062
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2328)
Figure BDA0002711329260000063
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2333)
Figure BDA0002711329260000071
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2336)
Figure BDA0002711329260000072
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 3090)
Figure BDA0002711329260000073
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2347)
Figure BDA0002711329260000074
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2346)
Figure BDA0002711329260000081
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2269)
Figure BDA0002711329260000082
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2298)
Figure BDA0002711329260000083
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2535)
Figure BDA0002711329260000084
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2541)
Figure BDA0002711329260000085
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2534)
Figure BDA0002711329260000091
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2542)
Figure BDA0002711329260000092
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2537)
Figure BDA0002711329260000093
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2538)
Figure BDA0002711329260000094
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2315)
Figure BDA0002711329260000095
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2329)
Figure BDA0002711329260000101
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2339)
Figure BDA0002711329260000102
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2761)
Figure BDA0002711329260000103
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2760)
Figure BDA0002711329260000104
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2759)
Figure BDA0002711329260000111
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2331)
Figure BDA0002711329260000112
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2338)
Figure BDA0002711329260000113
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2337)
Figure BDA0002711329260000114
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2278)
Figure BDA0002711329260000121
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI2817)
Figure BDA0002711329260000122
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI2820)
Figure BDA0002711329260000123
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2548)
Figure BDA0002711329260000124
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 2773)
Figure BDA0002711329260000131
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 3127)
Figure BDA0002711329260000132
(该化合物在本发明的实施例中被称为HEI 3204)
如实施例所示，本发明的化合物为P2RX7调节剂。它们在ATP的存在下增强了P2RX7的作用。
因此，本发明进一步涉及在ATP的存在下增强P2RX7作用的P2RX7调节剂(优选为P2RX7化合物)在炎症性疾病和/或癌症的预防和/或治疗中的应用。
“P2RX7调节剂”是指能够在ATP的存在下通过大孔开口诱导细胞死亡的化合物。“ATP”本身是指ATP(三磷酸腺苷)本身，但也是指其衍生物，特别是其二苯甲酮衍生物，如BzATP(3'-O-(4-苯甲酰基)苯甲酰基ATP)。优选地，P2RX7调节剂能够在短暂(如5至15分钟)刺激后提高P2RX7通道活性(即，Ca2+和/或染料如Topro3的进入)，并在较长(如1h)刺激下通过大孔开口诱导细胞死亡。图2、图14和图15以及实施例2的研究2中介绍了可用于确定给定化合物是否为P2RX7调节剂的测试。所述测试简要总结如下：
用编码mP2rx7基因的表达载体转染不表达任何P2X受体的培养细胞。用足以测量细胞死亡的探针(如来自Invitrogen的Topro3)测定大孔的开口。在每个实验中，在测试化合物的存在下，用BzATP(3'-O-(4-苯甲酰基)苯甲酰基ATP)对细胞进行处理，或不进行处理。当指示时，添加足以测量细胞死亡的探针(如Topro3)。
通过流式细胞仪测定荧光。
在BzATP的缺乏或存在下测试每种化合物。
若被测化合物与单独的BzATP和单独的被测化合物相比在BzATP的存在下它显著提高了大孔的开口(因此细胞死亡)，则该被测化合物为P2RX7调节剂。
例如，式(I)的化合物(尤其是式(I')的化合物)为P2RX7调节剂，因为它们在ATP的存在下增强P2RX7对大孔的作用，从而引起细胞死亡。优选地，它们在ATP的存在下增强P2RX7对Ca2+进入和大孔开口的作用。
人P2RX7蛋白可在Uniprot中以登录号Q99572获得。
优选地，根据本发明的式(I)的化合物为P2RX7的激动剂。P2RX7的“激动剂”是指与P2RX7结合并激活所述P2RX7以产生生物应答的化合物。激动剂的效力与其EC50值成反比。对于给定的激动剂，可以通过确定引发激动剂最大生物反应的一半所需的激动剂浓度来测量EC50。
本发明化合物的制备
本发明的式(I)(和(I’)、(II)、(II’))化合物可以通过易于执行的工艺进行制备。所述工艺如下，并且如实施例1所示：
将5-氧代吡咯烷-2-甲酰胺衍生物或5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺衍生物(并且在式(II')的情况下尤其是N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-(2S)-甲酰胺)和相应的异氰酸酯在溶剂如甲苯中的混合物在氮气气氛下回流搅拌一段时间(例如1至24小时)。
反应方案如下：
Figure BDA0002711329260000151
优选地，获得式(I’)化合物的反应方案如下：
Figure BDA0002711329260000152
更优选地，获得式(II’)化合物(即(S)对映体)的反应方案如下：
Figure BDA0002711329260000153
所得混合物然后可以例如通过在甲醇(MeOH)中直接结晶或在二氧化硅柱上进行纯化，以得到纯净化合物。
本发明化合物的治疗应用
如上所述，并如实施例所示，发明人证明了本发明的化合物可用于治疗。
因此，本发明还涉及至少一种式(I)的化合物(优选为至少一种式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体或其药学上可接受的盐作为药物的应用。
特别地，式(I)的化合物(优选式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体和/或其药学上可接受的盐可用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或癌症。
“治疗”是指分别治愈性治疗炎症性疾病或癌症。治愈性治疗被定义为分别完全治疗(治愈)或部分治疗炎症性疾病或癌症(即，诱导肿瘤生长稳定、发育迟缓或消退)的治疗。
本发明还涉及包含以下的产品：
a)至少一种选自式(I)的化合物(优选为式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体及其药学上可接受的盐的化合物，和
b)至少一种其他疗法，作为组合产品在癌症的治疗和/或预防中同时、分别或依次使用。
它还涉及至少一种式(I)的化合物(优选至少一种式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体或其药学上可接受的盐与至少一种其他疗法组合或联合在癌症的预防和/或治疗中的应用。
它进一步涉及至少一种式(I)的化合物(优选至少一种式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体或其药学上可接受的盐在经过至少一种其他疗法治疗的受试者的癌症的预防和/或治疗中的应用。术语“受试者”是指任何受试者并且通常指患者，特别是经历癌症治疗(如免疫疗法、化学疗法和/或放射疗法)的受试者。
本发明还涉及选自至少一种式(I)的化合物(优选为式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体及其药学上可接受的盐的化合物作为辅助癌症疗法的应用。辅助疗法是以最大程度地发挥其疗效的除主要疗法或初始疗法(此处称为“其他疗法”)以外的治疗癌症的疗法。
所述其他疗法b)可以是免疫疗法、化学疗法和/或放射疗法。优选地，其他疗法b)是免疫疗法和/或化学疗法。
“免疫疗法”是指能够诱导、增强或抑制免疫应答的疗法。所述免疫疗法优选选自：细胞因子、趋化因子、生长因子、生长抑制因子、激素、可溶性受体、诱饵受体，单克隆或多克隆抗体、单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体、单体(monobody)、多体(polybody)，疫苗接种，或过继特异性免疫疗法。
优选地，免疫疗法选自单克隆或多克隆抗体、单特异性抗体、双特异性抗体或多特异性抗体、单体、多体，如抗血管生成剂，像贝伐单抗(mAb，抑制VEGF-A，Genentech)，IMC-1121B(mAb，抑制VEGFR-2，ImClone Systems)，CDP-791(Pegylated DiFab，VEGFR-2，Celltech)，2C3(mAb，VEGF-A，Peregrine Pharmaceuticals)，VEGF-trap(可溶性杂合受体VEGF-A，PIGF(胎盘生长因子)Aventis/Regeneron)。
优选地，免疫疗法是单克隆抗体，优选为抗检查点抗体。
抗检查点抗体包含针对免疫检查点的抗体，其可选自PD1、PDL1、PDL2、CTLA4、BTLA、CD27、CD40、OX40、GITR(也称为“肿瘤坏死因子受体超家族成员18”或TNFRSF18)、CD137(也称为4-1BB或TNFRS9)、CD28、ICOS、IDO(吲哚胺2,3-二加氧酶)、B7H3(也称为CD276)、KIR2DL2(也称为杀伤细胞免疫球蛋白样受体2DL2)、NKG2(C型凝集素受体家族)、LAG3(也称为淋巴细胞激活基因3)和CD70。优选地，抗检查点抗体为抗PD1抗体、抗PDL1抗体、抗PDL2抗体或抗CTLA4抗体。抗PD1抗体包括纳武单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)。抗CTLA4抗体包括依匹目单抗(ipilimumab)和曲美目单抗(tremelimumab)。
优选地，本发明还涉及包含以下的产品：
a)至少一种选自式(I)的化合物(优选为式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体及其药学上可接受的盐的化合物，和
b)至少一种其他疗法，选自抗检查点抗体，优选选自抗PD1抗体，更优选选自纳武单抗和派姆单抗，作为组合产品在癌症的治疗和/或预防中同时、分别或依次使用。
“化学疗法”或“化学治疗剂”是指用于治疗癌症并且具有抑制人的肿瘤，特别是恶性(癌性)病变的发展或进展的功能特性的化合物。
化学治疗剂具有不同的作用，例如，通过影响DNA或RNA并且干扰细胞周期复制。
在DNA水平或RNA水平上起作用的化学治疗剂的实例为：
-抗代谢物，如硫唑嘌呤、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、克拉屈滨、卡培他滨6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶和羟基脲；
-烷基化剂，如美法仑、白消安、顺铂、卡铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡巴嗪(Dacarabazine)、福莫司汀(Fotemustine)、丙卡巴嗪、苯丁酸氮芥、塞替派、洛莫司汀、替莫唑胺；
-抗有丝分裂剂，如长春瑞滨、长春新碱、长春碱、多西他赛、紫杉醇；
-拓扑异构酶抑制剂，如阿霉素、安吖啶、伊立替康、柔红霉素、表阿霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、伊达比星、替尼泊苷、依托泊苷、托泊替康；
-抗生素，如放线菌素和博来霉素；
-天冬酰胺酶；
-蒽环类或紫杉烷类。
其他化学治疗剂是酪氨酸激酶抑制剂(TKI)。对于治疗各种类型的癌症，许多TKI正在晚期和早期开发中。示例性TKI包括但不限于：BAY 43-9006(Sorafenib,
Figure BDA0002711329260000181
)和SU11248(Sunitinib,
Figure BDA0002711329260000182
)、Imatinib mesylate(
Figure BDA0002711329260000183
Novartis)；Gefitinib(
Figure BDA0002711329260000184
AstraZeneca)；Erlotinib hydrochloride(
Figure BDA0002711329260000185
Genentech)；Vandetanib(
Figure BDA0002711329260000186
AstraZeneca)、Tipifarnib(
Figure BDA0002711329260000187
Janssen-Cilag)；Dasatinib(
Figure BDA0002711329260000188
Bristol Myers Squibb)；Lonafarnib(
Figure BDA0002711329260000189
Schering Plough)；Vatalanib succinate(Novartis,Schering AG)；Lapatinib(
Figure BDA00027113292600001810
GlaxoSmithKline)；Nilotinib(Novartis)；Lestaurtinib(Cephalon)；Pazopanibhydrochloride(GlaxoSmithKline)；Axitinib(Pfizer)；Canertinib dihydrochloride(Pfizer)；Pelitinib(National Cancer Institute,Wyeth)；Tandutinib(Millennium)；Bosutinib(Wyeth)；Semaxanib(Sugen,Taiho)；AZD-2171(AstraZeneca)；VX-680(Merck,Vertex)；EXEL-0999(Exelixis)；ARRY-142886(Array BioPharma,AstraZeneca)；PD-0325901(Pfizer)；AMG-706(Amgen)；BIBF-1120(Boehringer Ingelheim)；SU-6668(Taiho)；CP-547632(OSI)；(AEE-788(Novartis)；BMS-582664(Bristol-Myers Squibb)；JNK-401(Celgene)；R-788(Rigel)；AZD-1152HQPA(AstraZeneca)；NM-3(GenzymeOncology)；CP-868596(Pfizer)；BMS-599626(Bristol-Myers Squibb)；PTC-299(PTCTherapeutics)；ABT-869(Abbott)；EXEL-2880(Exelixis)；AG-024322(Pfizer)；XL-820(Exelixis)；OSI-930(OSI)；XL-184(Exelixis)；KRN-951(Kirin Brewery)；CP-724714(OSI)；E-7080(Eisai)；HKI-272(Wyeth)；CHIR-258(Chiron)；ZK-304709(Schering AG)；EXEL-7647(Exelixis)；BAY-57-9352(Bayer)；BIBW-2992(Boehringer Ingelheim)；AV-412(AVEO)；YN-968D1(Advenchen Laboratories)；Staurosporin,Midostaurin(PKC412,Novartis)；Perifosine(AEterna Zentaris,Keryx,National Cancer Institute)；AG-024322(Pfizer)；AZD-1152(AstraZeneca)；ON-01910Na(Onconova)；和AZD-0530(AstraZeneca)。
炎症性疾病优选为慢性炎症性疾病，并且可以选自类风湿性关节炎、克罗恩氏病、炎症性肠病(IBD)、骨关节炎、骨质疏松症、皮炎、牛皮癣、哮喘、呼吸窘迫综合征和慢性阻塞性肺病(COPD)。
癌症例如选自结肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、尿路上皮癌或肾上腺皮质癌，以及非实体癌，如淋巴瘤。
癌症可以是或不是转移性癌症。癌症可以是或不是易受免疫治疗。优选地，癌症是肺癌，优选为Lewis肺癌。
本文还描述了一种预防和/或治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种如上定义的式(I)的化合物(优选至少一种式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体或其药学上可接受的盐。
术语“受试者”是指任何受试者并且通常指患者，特别是经历癌症治疗(如免疫疗法、化学疗法和/或放射疗法)的受试者，或有发展成癌症风险或疑似发展成癌症风险的受试者。
本文还描述了一种预防和/或治疗炎症性疾病的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种如上定义的式(I)的化合物(优选至少一种式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体或其药学上可接受的盐。
术语“受试者”是指任何受试者并且通常指患者，特别是正在接受炎症性疾病治疗的受试者，或有发展成炎症性疾病风险或疑似发展成炎症性疾病风险的受试者。
在任何情况下，受试者优选为哺乳动物，甚至更优选为人，例如患有癌症或患有炎症性疾病的人。
本发明的化合物优选以治疗有效量或剂量给药。本文所用的“治疗有效量或剂量”是指预防、去除、减慢受试者(优选为人类)的癌症或炎症性疾病或者减轻或延迟由所述疾病引起的或与所述疾病相关的一种或多种症状或病症的本发明化合物的量。本发明化合物及其药物组合物的有效量，更一般地为给药方案，可由本领域技术人员确定和调整。有效剂量可以通过使用常规技术并通过在类似情况下观察所获得的结果来确定。本发明化合物的治疗有效剂量将根据待治疗或预防的疾病、其严重程度、给药途径、所涉及的任何联合疗法、患者的年龄、体重、一般医疗状况、病史等而变化。
通常，对人患者而言，化合物的给药量可以为约0.01至500mg/kg体重。在具体的实施方式中，本发明的药物组合物包含0.01mg/kg至300mg/kg，优选0.01mg/kg至3mg/kg，例如25至300mg/kg的本发明的化合物。
在特定的方面，本发明的化合物可以通过肠胃外途径、局部途径、口服途径或静脉内注射而施用给受试者。本发明的化合物或纳米颗粒可以在连续几天，例如连续2至10天(优选连续3至6天)的期间中每天(例如每天1、2、3、4、5、6或7次)给药受试者。所述治疗可以在1、2、3、4、5、6或7周的期间中重复，或每二或三周或每一、二或三个月内重复。可替代地，可以执行多个治疗周期，可选地，在两个治疗周期之间具有例如1、2、3、4或5周的中断时间。本发明的化合物或纳米颗粒可以例如以每周一次、每两周一次或每月一次的单次剂量进行给药。每年可重复治疗一次或多次。
剂量以技术人员可以确定的适当间隔进行给药。量的选择将取决于多种因素，包括：给药途径、给药持续时间、给药次数、所选的式(I)的化合物的或与所述化合物组合使用的各种产品的消除率、患者的年龄、体重和身体状况以及他/她的病史，以及医学上已知的任何其他信息。
给药途径可以是口服、局部或肠胃外，通常是直肠、舌下、鼻内、腹膜内(IP)、静脉内(IV)，动脉内(IA)、肌肉内(IM)、小脑内、鞘内、肿瘤内和/或真皮内。药物组合物适用于一种或多种上述途径。药物组合物优选通过注射或静脉内输注合适的无菌溶液进行给药，或者通过消化道以液体或固体剂量的形式进行给药。
本发明的另一个目的是一种组合物，其在药学上可接受的载体中包含至少一种式(I)的化合物(优选为至少一种式(I')、(II)或(II')的化合物)、其对映体或其药学上可接受的盐。
载体必须是在与制剂的其他成分相容并且对接受者无害的意义上“可接受的”。
药物组合物可能通过提供持续和/或延迟释放的剂型或装置而可被配制为在药学上相容的溶剂中的溶液，或配制为在合适的药物溶剂或载体中的凝胶、油、乳剂、悬浮液或分散体，或配制为以本领域已知的方式含有固体载体的丸剂、片剂、胶囊剂、粉剂、栓剂等。对于这种类型的制剂，有利地使用诸如纤维素、脂质、碳酸盐或淀粉等试剂。
可以在制剂(液体和/或注射和/或固体)中使用的试剂或载体是赋形剂或惰性载体，即，药学上无活性和无毒的载体。
可以提及例如与药学用途相容并且为本领域技术人员所已知的盐水、生理、等渗和/或缓冲溶液。组合物可以包含一种或多种选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的试剂或载体。
具体的实例为甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、环糊精、聚山梨酸酯80、甘露醇、明胶、乳糖、脂质体、植物油或动物、阿拉伯胶等。优选使用植物油。
适用于口服的本发明的制剂可以是离散单元的形式，如胶囊、袋剂、片剂或锭剂，每种形式均含有预定量的活性成分，可以是粉末或颗粒的形式、在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液的形式或水包油乳液或油包水乳液的形式。
适合于肠胃外给药的制剂方便地包含活性成分的无菌油性或水性制剂，其优选与接受者的血液等渗。每种这样的制剂还可以包含其他药学上相容的且无毒的辅助剂，如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、染料、乳化剂或调味剂。
附图说明
本申请中使用的附图如下，并且仅用作说明目的。
图1：在ATP的存在下HEI2314和HEI2328在表达小鼠P2RX7的异源细胞系中提高了大孔开口。
在mP2RX7 HEK细胞上通过FACS仪来分析钙通道活性(Fluo4AM探针)和大孔开口(Topro3探针)。细胞是未刺激的(NS)，或者单独地或在HEI2314、HEI2328、HEI2333或HEI2336(50μM)的存在下经BzATP(500μM)处理的。每个版面示出了代表性的点图，并且红色数字表示每个子版面中阳性细胞的百分比。
图2：需要mP2RX7和ATP介导大孔，以响应于HEI2328。
在模拟和mP2RX7 HEK细胞上通过FACS分析了钙通道活性(Fluo4AM探针)和大孔开口(Topro3探针)。细胞是未刺激的(NS)，或者单独地或在50μM的HEI2328的存在下经BzATP(500μM)处理的。每个版面示出了代表性的点图，并且红色数字表示每个子版面中阳性细胞的百分比。直方图示出了9个独立实验的结果。***，p＜0.001(曼-惠特尼检验)。
图3：HEI2328显著改善DSS诱导的体内结肠炎。
在5天(J1至J5)内用3％DSS处理而随后10天用正常自来水处理的C57BL/6J的(A)体重损失和(B)临床评分。处理组接受了HEI2328(ip,PBS中2.3mg/kg,10％DMSO)。数据代表2个独立实验(n＝20)。示出了平均值±SEM。*，p<0.05；**，p＜0.01(曼-惠特尼检验)。
图4：HEI2328显著降低了DSS处理的小鼠结肠的炎症性病变。
在结肠的纵向截面(A)和横向截面(B)中对炎症指数评分。数据代表2个独立实验(n＝20)。示出了平均值±SEM。*，p<0.05；**，p＜0.01(曼-惠特尼检验)。
图5：HEI2328降低了脾脏内炎症性单核细胞的比率。
(A-D)用HEI2328处理或未处理的20只小鼠的脾脏免疫细胞的表型分析。数据代表2个独立实验(n＝20)。示出了平均值±SEM。*，p<0.05；**，p＜0.01(曼-惠特尼检验)。
图6：在ATP的存在下HEI2328在B16F10黑色素瘤细胞系中提高了大孔开口。
通过FACS分析钙通道活性(Fluo4AM探针)和大孔开口(Topro3探针)。分析未刺激的(NS),或单独经HEI2328(50μM)或BzATP(500μM)处理的细胞。(A)代表性点图。数字凸显出阳性细胞的百分比。(B)直方图示出了3个独立实验的结果。*，p＜0.05(曼-惠特尼检验)。
图7：HEI2328降低了体内肿瘤的生长。
将5×105的B16F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右胁中。小鼠每天接受HEI2328(n＝8,ip,在10％DMSO/PBS中2.3mg/kg)或安慰剂(n＝8,10％DMSO/PBS)。A.肿瘤外观的发生率B.肿瘤尺寸(mm2)以及C.处死日(J12)的肿瘤重量。*，p＜0.05(曼-惠特尼检验)。
图8：HEI3090在BzATP的存在下提高大孔开口。
A.来自对照或p2rx7exon2 KO小鼠的脾细胞被分离并且在BzATP(500μM)的存在或缺乏下用HEI3090(50μM)处理。B.在HEI3090的存在或缺乏下通过提高BzATP在人P2RX7表达细胞中的浓度诱导的大孔开口。
图9：HEI3090在BzATP的存在下诱导B16F10细胞死亡。
A.大孔开口。代表性实验的点图。数字凸显出阳性细胞的百分比。直方图示出了3个独立实验的结果。*，P＜0.05曼-惠特尼检验。B.XTT吸光度随时间变化的代表性曲线。直方图示出了死细胞的百分比。示出了平均值±SEM。***,p<0.001；****,p<0.0001曼恩-惠特尼检验。
图10：HEI3090是一种有效的小鼠肿瘤抑制剂。
将5×105的LLC或5×105的B16F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右胁中。小鼠每天接受HEI3090(ip,在10％DMSO/PBS中2.5mg/kg)或安慰剂(10％DMSO/PBS)。A,C.肿瘤外观的发生率B,D.肿瘤尺寸(mm2)以及处死日(J12)的肿瘤重量。E.HEI处理的肿瘤更具免疫原性。点图示出了LLC(黑色)和B16F10(灰色)肿瘤对CMH1(H2Kb/Db)和PD-L1的表达。数字凸显了对H2Kb/Db and PD-L1呈阳性的肿瘤细胞的百分比。直方图示出了平均值±SEM。F.CD-45阳性浸润在LLC和B16F10肿瘤中提高。*，P<0.05；**，p＜0.001曼-惠特尼检验。
图11：HEI3090修饰的肿瘤向免疫抑制较少的环境浸润。
将5×105的LLC或5×105的B16F10细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右侧腹中。小鼠每天接受HEI3090(ip,在10％DMSO/PBS中2.5mg/kg)或安慰剂(10％DMSO/PBS)。A.免疫抑制细胞的数量降低。代表性实验的点图。数字凸显了M-MDSC和PMN-MDSC的百分比。直方图示出了8只小鼠的结果。B.效应T细胞(Tγδ，NK，CD4+)的数量提高。直方图示出了8只小鼠的结果。*，P<0.05；**，p＜0.01曼-惠特尼检验。
图12：T CD4+细胞是介导HEI3090抗肿瘤作用的部分必需物质。
将5×105的LLC细胞皮下注射到C57BL/6小鼠的右胁中。小鼠每天接受单独的或在抗CD4抗体的存在下的HEI3090(ip,在10％DMSO/PBS中2.5mg/kg)或安慰剂(10％DMSO/PBS)。A.每天跟踪3组的肿瘤生长情况。B.牺牲日(J12)的肿瘤重量。*，p<0.05；****，p＜0.0001(曼-惠特尼检验)。
图13：ADME(吸收、分布、代谢和排泄)研究。
A.HEI-2328和-3090是稳定的分子。将来自BD Gentest(ref 5345001)的小鼠肝微粒体用1μM的HEI-2314、-2328、-2333和-3090孵育0、5、10、20、30和40分钟。化合物的稳定性通过质谱进行分析。
B.直到腹膜内给药后18h，血浆中才发现HEI 3090。进行HEI-3090的腹膜内给药(在10％DMSO中0.166mg/mL)，并在0、10、20、30、0、60、120、240、360、1080和1440分钟采集血清。血浆浓度通过LC-MS/MS进行测定并且达到2.5μM的最大值。
图14：HEI-3090是小鼠P2RX7的正变构调节剂。
在用提高剂量的BzATP处理的小鼠P2RX7转染的HEK细胞刺激后15分钟，通过FACS测定钙流入(Fluo-AM阳性细胞)和大阳离子渗透(Topro3阳性细胞)。
在HEI3090存在下，EC50降低了22％。
图15：HEI-3090是人P2RX7的正变构调节剂。
在7.8μM BzATP的存在下用递增剂量的HEI3090处理的人P2RX7转染的HEK细胞刺激后15分钟，通过FACS测定钙流入(Fluo-AM阳性细胞)和大阳离子渗透(Topro3阳性细胞)。在HEI3090的存在下，Ca和大量阳离子流入均提高了3倍，这表明该分子是正变构调节剂。
图16：HEI3090通过刺激表达P2RX7的免疫细胞而非免疫原性细胞死亡(ICD)来增强其抗肿瘤作用。
a-b.用于评估HEI3090作为免疫原性细胞死亡诱导剂的体内测定。
为了诱导B16-F10死亡，将细胞暴露于3mM的ATP，并将50μM的HEI3090和1.105垂死细胞或PBS作为对照而皮下注射到右胁(n＝4)。7天后，在对侧胁皮下注射0.5.105活的B16-F10细胞(a)。曲线示出了对侧部位的肿瘤生长的平均值(b)。
(c-f)HEI3090对p2rx7缺陷小鼠(p2rx7-/-)的肿瘤生长的影响。5.105B16-F10(c)或5.105LLC(d)被皮下注射到p2rx7-/-小鼠的胁。小鼠接受从第1天到第12天用载体(PBS，10％DMSO)或HEI3090(在PBS中1.5mg/kg，10％DMSO)进行的腹膜内处理。(e,f)p2rx7-/-小鼠用来自WT C57BL/6J小鼠的5.106脾细胞进行过继转移，并用5.105LLC皮下注射至胁。然后，小鼠接受从第1天到第12天用载体(PBS，10％DMSO)或HEI3090(在PBS中1.5mg/kg，10％DMSO)进行的腹膜内处理。
图17：HEI3090刺激NK细胞和CD4+T细胞的有效功能(图12的补充结果)。
a、b.肿瘤浸润细胞的表型流式细胞仪分析。在第12天收集LLC肿瘤。PMN-MDSC在来自用载体或HEI3090处理的小鼠的LLC肿瘤内CD45+中的比率(a)。PMN-MDSC上NK、CD4+或CD8+T细胞的比率(b)。
c、d.5.105LLC被皮下注射到C57BL6/J小鼠的胁。然后小鼠接受用载体(PBS，10％DMSO)或用HEI3090(在PBS中1.5mg/kg，10％DMSO)或用HEI3090进行腹膜内处理，并且消耗NK1.1、CD4+或CD8+T细胞的抗体。每3天腹膜内注射抗体(200μg/注射)。第12天的意面图(Spaghetti plot)和肿瘤重量(d)。每条曲线代表一只小鼠。
e-g肿瘤浸润免疫细胞或脾细胞的功能流式细胞术分析。肿瘤用PMA/离子霉素刺激，并且同时分析CD45+、NK、CD4+或CD8+T细胞中IFN-γ和IL-10的产生。图示出了产生IFN-γ的细胞在CD45+细胞中的比率或荧光的几何平均值(e)。IFN-γ和IL-10染色到TIL中的代表性点图(f)。每个TIL上IL-10阳性细胞上IFN-γ的比率。用载体或HEI3090处理的来自LLC荷瘤小鼠的脾细胞的脱粒测定(g)用LLC在体外再次刺激脾细胞，并呈现出NK、CD4+和CD8+T细胞中的CD107a阳性细胞。
图18：HEI3090诱导IL-18在体内的产生。
a.LLC肿瘤内常规树突状细胞CD4+或CD8+中P2RX7的表达的流式细胞术分析。
b.通过ELISA测定用载体或HEI3090处理的LLC荷瘤小鼠的血清中IL-1β和IL-18的蛋白水平。
c.5.105LLC皮下注射到C57BL6/J小鼠的胁中。然后，小鼠接受从第1天到第12天用载体(PBS，10％DMSO)或用HEI3090(在PBS中1.5mg/kg，10％DMSO)或用HEI3090进行腹膜内注射，并且中和针对IL-1β或IL-18的抗体。每3天腹膜内注射抗体(200μg/注射)。
d.肿瘤内NK、CD4+T或CD8+T细胞的IFN-γ和IL-10产生的流式细胞仪分析。图呈现了IL10阳性细胞上IFN-γ的比率。
e.HEI3090对IL-18缺陷小鼠(IL-18-/-)肿瘤生长的影响。5.105LLC注射到IL-18-/-小鼠的胁。小鼠接受从第1天到第12天用载体(PBS，10％DMSO)或HEI3090(在PBS中1.5mg/kg，10％DMSO)进行的腹膜内处理。
f.用载体处理的C57BL6/J小鼠的4个LLC肿瘤中IL-18IHC染色和用HEI3090处理的C57BL6/J小鼠的4个LLC肿瘤中IL-18IHC染色。
图19：HEI3090和抗PD-1免疫检查点抑制剂的组合治愈LLC荷瘤小鼠(图10的补充结果)。
a.用载体或HEI3090处理的小鼠LLC肿瘤中CD45阴性细胞上MHC-1和PD-L1表达的流式细胞仪分析。
b-g HEI3090和抗PD-1检查点抑制剂对LLC肿瘤生长的影响。5.105LLC皮下注射到C57BL/6J小鼠的胁中。小鼠接受从第1天到第18天用载体(PBS，10％DMSO)或HEI3090(在PBS中1.5mg/kg，10％DMSO)进行的腹膜内处理。每只小鼠在第4、7、10、13和16天接受200μg的抗PD-1腹膜内注射。从第1天至第90天测量肿瘤尺寸。当肿瘤达到100mm2时处死小鼠。对于对侧再攻击，治愈的小鼠或幼龄匹配的C57BL/6J小鼠在相对的胁处被皮下注射2.105LLC。在第150天，处死再挑战的小鼠或C57BL/6J幼龄小鼠以分选CD8+T细胞。2.105CD8+T细胞过继转移到其他C57BL/6J幼龄小鼠中。然后小鼠被皮下注射2.105LLC(b)。载体和抗PD-1处理的小鼠或HEI3090和抗PD-1处理的小鼠的LLC肿瘤生长的意面图(c)。每条曲线代表一只小鼠。载体或HEI3090和同种型对照或载体或HEI3090和抗PD-1处理的小鼠的存活曲线(d)。在再挑战治愈的HEI3090和抗PD-1处理的小鼠或年龄匹配的C57BL/6J小鼠之后的肿瘤生长和生存曲线(e,f)。幼龄小鼠或再挑战的处理小鼠静脉注射CD8+T细胞之后的肿瘤生长(g)。
具体实施方式
实施例
实施例1：化合物HEI 2314、HEI 2328、HEI 2333、HEI 2336和HEI 3090的合成
合成本发明化合物的一般程序：
将N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-2-甲酰胺(1当量)和相应的异氰酸酯(1当量)在甲苯中的混合物在氮气氛下回流搅拌1-24小时。所得混合物通过在MeOH中直接结晶进行纯化，以得到纯化合物。
反应方案如下：
Figure BDA0002711329260000271
a)化合物HEI 2347的合成：
Figure BDA0002711329260000281
(S)-N2-(2,4-二氯苯基)-5-氧代-N1-苯基吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2347)。一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(0.90g，3.3mmol)和异氰酸苯酯(0.39g，3.3mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为81％的纯净HEI_2347(1.05g,2.7mmol)。mp 214–217℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.9；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.98-2.10(m,1H,CH2CH2CH),2.38-2.48(m,1H,CH2CH2CH),2.60-2.81(m,2H,CH2CH2CH),5.08(dd,J＝5.6,2.4Hz,1H,CH2CH2CH),7.10(t,J＝7.2Hz,1H,ArH),7.34(t,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.42(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H,ArH),7.51(d,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.68(d,J＝2.4Hz,1H,ArH),7.73(d,J＝8.8Hz,1H,ArH),10.08(br s,1H,NH),10.51(br s,1H,NH)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 21.4(CH2),31.7(CH2),58.8(CH),119.6(2CH),123.9(CH),127.3(CH),127.5(CH),127.6(CH),129.0(C),129.1(2CH),129.7(C),133.6(C),137.2(C),149.3(C),170.2(C),177.8(C)；LC-MS(APCI+)m/z:392.1(MH+),tr4.38min；IRν(cm-1):3275,2922,1723,1693,1662,1559,1473,1219,1100,819；C18H15Cl2N3O3分析计算为:C,55.12；H,3.85；N,10.71。实测为：C,54.91；H,3.89；N,10.75％。
b)化合物HEI2346的合成：
Figure BDA0002711329260000282
(S)-N2-(环己基甲基)-5-氧代-N1-苯基吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2346)。一般程序遵循使用(S)-N-环己基甲基-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(0.40g，1.8mmol)和异氰酸苯酯(0.21g，1.8mmol)。所需产物在硅胶柱(EtOAc/正庚烷4/6至5/5)上纯化，以得到收率为88％白色固体形式的纯净HEI_2346(1.05g，8.8mmol)。mp 122–127℃(EtOAc/正庚烷)；TLC Rf(EtOAc/正庚烷:1/1)0.3；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 0.85-0.97(m,2H,环己-H),1.08-1.28(m,3H,环己-H),1.45-1.46(m,1H,环己-H),1.60-1.74(m,5H,环己-H),2.15-2.25(m,1H,CH2CH2CH),2.30-2.40(m,1H,CH2CH2CH),2.55-2.62(m,1H,CH2CH2CH),3.00-3.20(m,3H,NHCH2 and CH2CH2CH),4.79(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),6.59(s,1H,NHCH2),7.11(t,J＝7.6Hz,1H,ArH),7.32(t,J＝7.6Hz,2H,ArH),7.47(d,J＝7.6Hz,2H,ArH),10.56(br s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.6(CH2),25.9(2CH2),26.4(CH2),30.8(2CH2),32.8(CH2),38.0(CH2),46.0(CH),59.4(CH),120.5(2CH),124.6(CH),129.1(2CH),137.1(C),150.6(C),170.3(C),177.8(C)；LC-MS(APCI+)m/z:344.2(MH+),tr4.16min；IRν(cm-1):3289,2922,2851,1718,1654,1552,1446,1217,747；C19H25N3O3分析计算为:C,66.45；H,7.34；N,12.24。实测为：C,66.71；H,7.42；N,11.68％。
c)化合物HEI 2269的合成：
Figure BDA0002711329260000291
(S)-N2-苄基-5-氧代-N1-苯基吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2269)。一般程序遵循使用(S)-N-苄基-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(0.35g，1.4mmol)和异氰酸苯酯(0.15g，1.4mmol)。所需产物在硅胶柱(CH2Cl2/MeOH 1/0至98/2)上纯化，以得到收率为70％白色固体形式的纯净HEI_2269(0.33g，1.0mmol)。mp 164–165℃(CH2Cl2/MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:97/3)0.2；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.90-2.10(m,2H,CH2CH2CH),2.22-2.40-2.42(m,2H,CH2CH2CH),4.27(m,3H,CH2CH2CH和NHCH2),7.25(m,3H,ArH),7.28-7.41(m,5H,ArH),7.47(t,J＝7.6Hz,2H,ArH),8.39(t,J＝5.2Hz,1H,NHCH2),8.51(br s,1H,NHAr)；13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 27.4(CH2),30.1(CH2),42.1(CH2),55.7(CH),126.7(CH),126.8(2CH),127.2(2CH),127.7(CH),128.3(2CH),128.7(2CH),132.2(C),139.5(C),155.6(C),171.0(C),173.1(C)；LC-MS(APCI+)m/z:338.2(MH+),tr 3.07min；IRν(cm-1):3367,3183,1705,1645,1416,1175,701；C19H19N3O3分析计算为:C,67.64；H,5.68；N,12.45。实测为：C,67.72；H,5.82；N,12.13％。
d)化合物HEI 2298的合成：
Figure BDA0002711329260000301
(S)-N1-金刚烷基-N2-(2-氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2298)。一般程序遵循使用(S)-N-(2-氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.43g，5.6mmol)和异氰酸金刚烷酯(1.00g，5.6mmol)。所需产物在硅胶柱(EtOAc/正庚烷4/6至6/4)上纯化，以得到收率为62％白色固体形式的纯净HEI_2298(1.50g，3.5mmol)。mp 79–80℃(EtOAc/正庚烷)；TLCRf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.6；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 1.68(s,6H,ADM-H),1.98(s,6H,ADM-H),2.09(s,3H,ADM-H),2.10-2.18(m,1H,CH2CH2CH),2.38-2.45(m,1H,CH2CH2CH),2.46-2.52(m,1H,CH2CH2CH),2.89-2.97(m,1H,CH2CH2CH),4.51(dd,J＝14.2,5.0Hz,1H,NHCH2),4.55(dd,J＝14.2,5.0Hz,1H,NHCH2),4.76(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),7.14(t,J＝5.0Hz,1H,ArH),7.21(m,2H,ArH),7.35(m,2H,ArH和NHCH2),8.39(br s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.1(CH2),29.5(2CH2),32.9(CH2),36.4(2CH2),41.6(CH2),41.7(2CH2),51.9(CH),59.0(CH),127.1(2CH),128.9(2CH),129.6(2CH),129.7(C),133.6(C),135.4(C),151.4(C),170.5(C),177.3(C)；LC-MS(APCI+)m/z:430.1(MH+),tr 4.60min；IRν(cm-1):3289,2906,2849,1715,1663,1538,1223,1033,749；C23H28ClN3O3分析计算为:C,64.25；H,6.56；N,9.77。实测为：C,64.32；H,6.89；N,9.58％。
e)化合物HEI 2535的合成：
Figure BDA0002711329260000311
(S)-N1-丁基-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2535)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.97g，6.9mmol)和异氰酸正丁酯(0.75g，7.6mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为71％的纯净HEI_2535(1.89g,4.9mmol)。mp 162–163℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)0.4；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 0.92(t,J＝7.4Hz,3H,CH3CH2),1.35(m,2H,CH3CH2),1.51(五重峰,J＝7.8Hz,2H,CH2CH2CH2),2.12(td,J＝18.0,11.3,8.7Hz,1H,CH2CH2CH),2.39(m,1H,CH2CH2CH),2.49(td,J＝17.7,9.4,2.0Hz,1H,CH2CH2CH),2.92(td,J＝17.5,11.3,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),3.27(dq,J＝7.1,1.6Hz,2H,CH2NHCO),4.47(dd,J＝6.0,2.8Hz,2H,NHCH2Ar),4.75(dd,J＝9.0,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),7.08(br t,J＝5.7Hz,1H,NHCH2Ar),7.20(dd,J＝8.2,2.3Hz,1H,ArH),7.29(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.36(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),8.43(br t,J＝5.9Hz,1H,NHCH2CH2)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 13.7(CH3),20.0(CH2),21.1(CH2),31.6(CH2),32.5(CH2),39.7(CH2),41.1(CH2),59.0(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.6(CH),133.9(C),134.0(C),134.1(C),153.1(C),170.3(C),177.2(C)；IRν(cm-1):3270,1712,1683,1649,1465,1236,1101,810,653；C17H21Cl2N3O3分析计算为:C,52.86；H,5.48；N,10.88。实测为：C,52.50；H,5.88；N,11.11％。
f)化合物HEI 2541的合成：
Figure BDA0002711329260000321
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-N1-戊基吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2541)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.73g，6.0mmol)和异氰酸正戊酯(0.75g，6.6mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为70％的纯净HEI_2541(1.67g,4.2mmol)。mp 159–160℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)0.7；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 0.96(t,J＝6.9Hz,3H,CH3CH2),1.39(m,4H,CH2(CH2)2CH2),1.59(五重峰,J＝7.3Hz,2H,CH3CH2),2.19(m,1H,CH2CH2CH),2.41(m,1H,CH2CH2CH),2.56(td,J＝17.6,9.4,1.9Hz,1H,CH2CH2CH),2.99(td,J＝17.6,11.3,9.3Hz,1H,CH2CH2CH),3.32(qd,J＝7.4,2.8Hz,2H,CH2(CH2)3),4.54(dd,J＝7.5,6.3Hz,2H,NHCH2Ar),4.82(dd,J＝9.1,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),7.18(br t,J＝6.0Hz,1H,NHCH2Ar),7.26(dd,J＝8.2,2.4Hz,1H,ArH),7.36(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.43(d,J＝2.3Hz,1H,ArH),8.51(br t,J＝5.7Hz,1H,NH(CH2)2)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 13.9(CH3),21.2(CH2),22.3(CH2),29.0(CH2),29.2(CH2),32.5(CH2),40.0(CH2),41.1(CH2),59.0(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.5(CH),133.9(C),134.1(C),153.1(C),170.4(C),177.2(2C)；IRν(cm-1):3318,1710,1664,1561,1530,1358,1259,830,630；C18H23Cl2N3O3分析计算为:C,54.01；H,5.79；N,10.50。实测为：C,53.70；H,5.95；N,10.59％。
g)化合物HEI 2534的合成：
Figure BDA0002711329260000331
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-N1-己基-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2534)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.54g，5.4mmol)和异氰酸正己酯(0.75g，5.9mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为66％的纯净HEI_2534(1.47g,3.5mmol)。mp 141–142℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)0.4；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ0.90(t,J＝6.9Hz,3H,CH3CH2),1.32(m,6H,CH2(CH2)3CH2),1.54(q,J＝6.7Hz,2H,CH3CH2),2.14(m,1H,CH2CH2CH),2.41(m,1H,CH2CH2CH),2.52(td,J＝17.5,9.3,2.0Hz,1H,CH2CH2CH),2.94(td,J＝17.9,11.4,9.6Hz,1H,CH2CH2CH),3.82(dq,J＝7.3,1.7Hz,2H,CH2(CH2)4),4.50(dd,J＝5.8,4.5Hz,2H,NHCH2Ar),4.77(dd,J＝8.6,1.4Hz,1H,CH2CH2CH),7.11(br t,J＝5.5Hz,1H,NHCH2Ar),7.22(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H,ArH),7.31(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.39(d,J＝2.1Hz,1H,ArH),8.46(br t,J＝5.7Hz,1H,NH(CH2)2)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 14.0(CH3),21.1(CH2),22.5(CH2),26.5(CH2),29.5(CH2),31.4(CH2),32.5(CH2),40.1(CH2),41.1(CH2),59.0(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.6(CH),133.9(C),134.0(C),134.1(C),153.1(C),170.3(C),177.2(C)；IRν(cm-1):3313,2926,2865,1708,1664,1355,1253,1153,829,654；C19H25Cl2N3O3分析计算为:C,55.08；H,6.08；N,10.14。实测为：C,55.02；H,6.15；N,10.27％。
h)化合物HEI 2542的合成：
Figure BDA0002711329260000341
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-N1-十二烷基-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2542)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(0.93g，3.2mmol)和异氰酸正十二烷酯(0.75g，3.5mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为49％的纯净HEI_2542(0.78g,1.6mmol)。mp 124–125℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)0.8；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 0.88(t,J＝6.6Hz,3H,CH3CH2),1.26(m,18H,CH2(CH2)9CH2),1.53(五重峰,J＝6.7Hz,2H,CH3CH2),2.13(m,1H,CH2CH2CH),2.40(m,1H,CH2CH2CH),2.51(td,J＝17.6,9.3,1.8Hz,1H,CH2CH2CH),2.93(td,J＝17.7,11.3,9.5Hz,1H,CH2CH2CH),3.29(q,J＝7.2Hz,2H,CH2(CH2)10),4.48(dd,J＝6.2Hz,2H,NHCH2Ar),4.76(dd,J＝8.9,1.2Hz,1H,CH2CH2CH),7.11(br t,J＝5.9Hz,1H,NHCH2Ar),7.21(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H,ArH),7.30(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.37(d,J＝2.1Hz,1H,ArH),8.45(br t,J＝6.0Hz,1H,NH(CH2)2)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 14.1(CH3),21.1(CH2),22.7(CH2),26.9(CH2),29.3(CH2),29.3(CH2),29.5(CH2),29.5(CH2),29.6(CH2),29.6(CH2),29.6(CH2),31.9(CH2),32.5(CH2),40.1(CH2),41.1(CH2),59.0(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.5(CH),133.9(C),133.9(C),134.1(C),153.1(C),170.3(C),177.2(C)；IRν(cm-1):3302,2918,2850,1718,1658,1541,1349,1251,832,648；C25H37Cl2N3O3分析计算为:C,60.2；H,7.48；N,8.43。实测为：C,59.8；H,7.5；N,8.5％。
i)化合物HEI 2537的合成：
Figure BDA0002711329260000351
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-N1-(丙-2-基)吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2537)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(2.30g，8.0mmol)和异氰酸丙-2-酯(0.75g，8.8mmol)。所需产物在硅胶柱(EtOAc/正庚烷1/9至1/0)上纯化，以得到收率为55％黄色固体形式的纯净HEI_2537(1.65g，4.4mmol)。mp 111–112℃(EtOAc/正庚烷)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)0.4；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 1.20(dd,J＝6.5,2.7Hz,6H,(CH3)2CH),2.12(td,J＝18.1,11.4,9.0Hz,1H,CH2CH2CH),2.38(m,1H,CH2CH2CH),2.50(td,J＝17.5,9.3,1.8Hz,1H,CH2CH2CH),2.86(td,J＝17.6,11.4,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),3.95(m,1H,(CH3)2CH),4.48(d,J＝6.2Hz,2H,NHCH2),4.76(dd,J＝8.6,1.4Hz,1H,CH2CH2CH),7.18(br t,J＝6.2Hz,1H,NHCH2),7.20(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H,ArH),7.30(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.37(d,J＝1.8Hz,1H,ArH),8.33(br t,J＝5.7Hz,1H,NHCH(CH3)2)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.1(CH2),22.6(CH3),22.7(CH3),32.6(CH2),41.1(CH2),42.4(CH),59.0(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.5(CH),133.9(C),134.1(C),152.3(C),170.4(C),177.2(2C)；IRν(cm-1):3317,1703,1643,1523,1226,817,590；C16H19Cl2N3O3分析计算为:C,51.63；H,5.14；N,11.29。实测为：C,51.46；H,5.55；N,11.70％。
j)化合物HEI 2538的合成：
Figure BDA0002711329260000361
(S)-N1-叔丁基-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2538)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.97g，6.9mmol)和异氰酸叔丁酯(0.75g，7.6mmol)。所需产物在硅胶柱(EtOAc/正庚烷3/7至1/0)上纯化，以得到收率为36％白色固体形式的纯净HEI_2538(0.95g，2.5mmol)。mp 99–101℃(EtOAc/正庚烷)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)0.7；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 1.35(s,9H,C(CH3)3),2.05-2.16(m,1H,CH2CH2CH),2.36(dd,J＝11.9,2.0Hz,1H,CH2CH2CH),2.49(ddd,J＝17.6,9.4,2.0Hz,1H,CH2CH2CH),2.93(ddd,J＝17.7,11.4,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),4.42(dd,J＝15.2,5.9Hz,1H,NHCH2),4.53(dd,J＝15.7,6.7Hz,1H,NHCH2),4.76(dd,J＝8.6,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),7.18(dd,J＝8.2,2.1Hz,1H,ArH),7.20(br s,1H,NHCH2),7.29(d,J＝8.2Hz,1H,ArH),7.36(d,J＝2.3Hz,1H,ArH),8.48(br s,1H,NHC(CH3)3)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 20.9(CH2),28.7(3CH3),32.7(CH2),41.0(CH2),51.1(C),58.8(CH),127.2(CH),129.2(CH),130.3(CH),133.8(C),133.9(C),134.0(C),151.7(C),170.6(C),177.1(C)；IRν(cm-1):3280,1717,1689,1656,1547,1267,1191,824,657；C17H21Cl2N3O3分析计算为:C,52.86；H,5.48；N,10.88。实测为：C,52.63；H,6.03；N,10.91％。
k)化合物HEI 2315的合成：
Figure BDA0002711329260000362
(S)-N1-环己基-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2315)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(2.00g，7.0mmol)和异氰酸环己酯(0.87g，7.0mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为82％的纯净HEI_2315(2.35g,5.7mmol)。mp 137–142℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.5；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 1.15-1.45(m,5H,环己-H),1.59(m,1H,环己-H),1.71(m,2H,环己-H),1.88(m,2H,环己-H),2.05-2.20(m,1H,环己-H),2.25-2.40(m,1H,CH2CH2CH),2.42-2.56(m,1H,CH2CH2CH),2.82-2.96(m,1H,CH2CH2CH),3.62-3.66(m,1H,CH2CH2CH),4.44(dd,J＝15.2,5.6Hz,1H,NHCH2),4.51(dd,J＝15.2,5.6Hz,1H,NHCH2),4.73-4.79(m,1H,CH2CH2CH),7.19(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H,ArH),7.29(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),7.30(br s,1H,NHCH2),7.37(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),8.42(d,J＝7.6Hz,1H,NHCH)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.2(CH2),24.5(CH2),25.4(CH2),32.5(CH2),32.7(CH2),32.8(CH2),41.0(CH2),49.0(CH2),58.9(2CH),127.3(CH),129.3(CH),130.5(CH),133.9(C),134.0(C),134.1(C),152.2(C),170.5(C),177.2(C)；LC-MS(APCI+)m/z:412.0(MH+),tr4.45min；IRν(cm-1):3303,2928,2853,1703,1656,1534,1224；C19H23Cl2N3O3分析计算为:C,55.35；H,5.62；N,10.19。实测为：C,55.36；H,6.14；N,10.39％。
l)化合物HEI 2329的合成：
Figure BDA0002711329260000371
(S)-N1-金刚烷基-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2329)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.50g，5.2mmol)和异氰酸金刚烷酯(0.93g，5.2mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为97％的纯净HEI_2329(2.34g,5.0mmol)。mp 85–87℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.5；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 1.64-1.70(m,6H,ADM-H),1.95-1.99(m,6H,ADM-H),2.00-2.16(m,4H,ADM-H和CH2CH2CH),2.30-2.40(m,1H,CH2CH2CH),2.42-2.54(m,1H,CH2CH2CH),2.86-2.98(m,1H,CH2CH2CH),4.45(dd,J＝15.2,6.0Hz,1H,NHCH2),4.51(dd,J＝15.2,6.0Hz,1H,NHCH2),4.76(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),7.17(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H,ArH),7.26(t,J＝6.0Hz,1H,NHCH2),7.28(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.36(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),8.39(br s,1H,NHCH)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.1(CH2),29.5(2CH2),32.9(CH2),36.4(2CH2),41.1(CH2),41.7(2CH2),51.9(CH),59.0(CH),127.4(CH),129.4(2CH),130.5(2CH),134.0(C),134.1(2C),134.2(C),151.4(C),170.7(C),177.3(C)；LC-MS(APCI+)m/z:464.2(MH+),tr 4.80min；IRν(cm-1):3289,2906,2848,1715,1661,1538,1222,1048,829；C23H27Cl2N3O3分析计算为:C,59.49；H,5.86；N,9.05。实测为：C,59.59；H,6.26；N,8.71％。
m)化合物HEI 2339的合成：
Figure BDA0002711329260000381
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-N1-苯基吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2339)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(0.40g，1.4mmol)和异氰酸苯酯(0.17g，1.4mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为76％的纯净HEI_2339(0.43g,1.1mmol)。mp216–219℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:96/4)0.8；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.85-1.95(m,1H,CH2CH2CH),2.30-2.40(m,1H,CH2CH2CH),2.58-2.79(m,2H,CH2CH2CH),4.36(m,2H,NHCH2),4.80(dd,J＝9.2,2.4Hz,1H,CH2CH2CH),7.11(t,J＝7.2Hz,1H,ArH),7.35(t,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.43-7.44(m,2H,ArH),7.51(d,J＝7.2Hz,2H,ArH),7.61-7.62(m,1H,ArH),8.85(t,J＝5.6Hz,1H,NHCH2),10.51(br s,1H,NHAr)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 21.4(CH2),31.8(CH2),40.0(CH2),58.7(CH),119.5(2CH),123.8(CH),127.3(CH),128.6(CH),129.1(2CH),130.1(CH),132.3(C),132.9(C),135.2(C),137.3(C),149.4(C),171.2(C),177.8(C)；LC-MS(APCI+)m/z:408.1(MH+),tr 4.37min；IRν(cm-1):3276,1718,1644,1543,1217,1054,748；C19H17Cl2N3O3分析计算为:C,56.17；H,4.22；N,10.34。实测为：C,56.12；H,3.96；N,10.24％。
n)化合物HEI 2761的合成：
Figure BDA0002711329260000391
(S)-N1-(联苯-4-基)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2761)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸联苯-4-酯(0.75g，3.8mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为65％的纯净HEI_2761(1.09g,2.3mmol)。mp 191–200℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)＝0.9；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.16-2.30(m,1H,CH2CH2CH),2.34-2.43(m,1H,CH2CH2CH),2.57-2.67(m,1H,CH2CH2CH),2.99-3.12(m,1H,CH2CH2CH),4.52(dd,J＝13.4,6.7Hz,2H,NCH2Ar),4.84(d,J＝8.8Hz,1H,CH2CH2CH),6.93(s,1H,NH),7.21(dd,J＝8.2,1.8Hz,1H,ArH),7.30-7.38(m,3H,ArH),7.44(t,J＝7.3Hz,2H,ArH),7.52-7.61(m,6H,ArH),10.60(s,1H,NH)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.2(CH2),29.7(CH2),32.6(CH2),41.2(CH2),59.2(CH),126.8(2CH),126.9(CH),127.4(CH),127.7(2CH),128.8(2CH),129.4(2CH),130.8(CH),133.8(C),134.1(C),134.2(C),136.2(C),137.5(C),140.5(C),150.5(C),170.2(C),177.5(C)；IRν(cm-1):3311,3083,1715,1542,1225,764,693；C25H21Cl2N3O3分析计算为:C,62.25；H,4.39；N,8.71。实测为：C,62.06；H,4.39；N,8.73％。
o)化合物HEI 2314的合成：
Figure BDA0002711329260000401
(S)-N1-(2-氯苯基)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2314)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(2.00g，7.0mmol)和异氰酸2-氯苯酯(1.07g，7.0mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为90％的纯净HEI_2314(2.75g,6.2mmol)。mp 213–219℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.5；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.18-2.36(m,2H,CH2CH2CH),2.58-2.68(m,1H,CH2CH2CH),2.95-3.06(m,1H,CH2CH2CH),4.47(dd,J＝15.6,5.6Hz,1H,NHCH2),4.54(dd,J＝15.6,5.6Hz,1H,NHCH2),4.80(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H,CH2CH2CH),7.06(t,J＝7.6Hz,1H,NHCH2),7.21(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H,ArH),7.26(t,J＝7.6Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),7.37(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),7.40(m,2H,ArH),8.15(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),11.04(br s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.7(CH2),32.3(CH2),41.1(CH2),59.2(CH),121.8(CH),124.0(C),125.0(CH),127.4(CH),127.5(CH),129.4(CH),129.5(CH),130.6(CH),133.9(C),134.0(C),134.1(C),134.4(C),150.3(C),171.0(C),177.6(C)；LC-MS(APCI+)m/z:442.0(MH+),tr 4.45min；IRν(cm-1):3271,1713,1643,1597,1545,1222,1054,749；C19H16Cl3N3O3分析计算为:C,51.78；H,3.66；N,9.53。实测为：C,51.80；H,3.73；N,9.59％。
p)化合物HEI 2760的合成：
Figure BDA0002711329260000411
(S)-N1-(2-溴苯基)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2760)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸2-溴苯酯(0.76g，3.8mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为56％的纯净HEI_2760(0.95g,2.0mmol)。mp 217–223℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.7；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.18-2.43(m,2H,CH2CH2CH),2.58-2.69(m,1H,CH2CH2CH),2.98-3.11(m,1H,CH2CH2CH),4.52(dd,J＝9.1,5.7Hz,2H,NHCH2),4.81(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H,CH2CH2CH),6.81(br s,1H,NHCH2),7.00(ddd,J＝7.9,7.9,1.6Hz,1H,ArH),7.20(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H,ArH),7.30-7.35(m,2H,ArH),7.37(d,J＝2Hz,1H,ArH),7.58(dd,J＝8.1,1.8Hz,1H,ArH),8.13(dd,J＝8.4,2.1Hz,1H,ArH),10.94(s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.3(CH2),33.4(CH2),41.3(CH2),59.2(CH),111.3(C),122.3(CH),125.5(CH),127.4(CH),128.0(CH),129.4(CH),130.8(CH),132.7(CH),133.7(C),134.1(C),134.2(C),135.7(C),150.5(C),170.1(C),177.3(C)；IRν(cm-1):3268,3202,3063,1714,1644,1541,1218,748；C19H16BrCl2N3O3分析计算为:C,47.04；H,3.32；N,8.66。实测为：C,47.03；H,3.30；N,8.66％。
q)化合物HEI 2759的合成：
Figure BDA0002711329260000421
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-N1-(2-碘苯基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2759)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸2-碘苯酯(0.94g，3.8mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为58％的纯净HEI_2759(1.07g,2.0mmol)。mp 203–207℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.7；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.18-2.31(m,1H,CH2CH2CH),2.36-2.45(m,1H,CH2CH2CH),2.59-2.68(m,1H,CH2CH2CH),3.00-3.12(m,1H,CH2CH2CH),4.52(t,J＝5.8Hz,2H,NHCH2),4.82(dd,J＝8.7,1.7Hz,1H,CH2CH2CH),6.82(s,1H,NHCH2),6.88(td,J＝7.6,1.6Hz,1H,ArH),7.21(dd,J＝8.1,2.3Hz,1H,ArH),7.30-7.39(m,3H,ArH),7.84(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H,ArH),7.96(dd,J＝8.3,1.5Hz,1H,ArH),10.68(s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.3(CH2),32.5(CH2),41.3(CH2),59.2(CH),90.4(C),123.0(CH),126.4(CH),127.4(CH),128.8(CH),129.4(CH),130.8(C),133.8(C),134.1(C),134.2(C),138.5(C),139.5(CH),150.7(C),170.1(C),177.2(C)；IRν(cm-1):3265,3207,3076,1714,1644,1533,1217,754；C19H16Cl2IN3O3分析计算为:C,42.88；H,3.03；N,7.90。实测为：C,42.82；H,2.98；N,8.04％。
r)化合物HEI 2331的合成：
Figure BDA0002711329260000431
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-N1-(2,4-二氯苯基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2331)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸2,4-二氯苯酯(0.66g，3.5mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为87％的纯净HEI_2331(1.45g,3.1mmol)。mp 203–218℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.6；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.86-1.96(m,1H,CH2CH2CH),2.29-2.43(m,1H,CH2CH2CH),2.60-2.81(m,2H,CH2CH2CH),4.36(m,2H,CH2CH2CH and NHCH2),4.81(dd,J＝9.6,2.8Hz,1H,NHCH2),7.41(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.43(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),7.47(dd,J＝9.2,2.0Hz,1H,ArH),7.62(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),7.74(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),8.24(d,J＝9.2Hz,1H,ArH),8.88(t,J＝2.0Hz,1H,NHCH2),11.11(br s,1H,NHAr)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 21.5(CH2),31.7(CH2),39.5(CH2),58.7(CH),121.9(CH),123.0(CH),127.3(CH),127.7(C),128.1(CH),128.6(CH),128.8(CH),130.1(C),132.3(C),133.0(C),133.6(C),135.2(C),149.3(C),171.0(C),178.2(C)；LC-MS(APCI+)m/z:475.9(MH+),tr4.78min；IRν(cm-1):3263,1716,1656,1582,1537,1224,823；C19H15Cl4N3O3分析计算为:C,48.03；H,3.18；N,8.84。实测为：C,48.02；H,3.17；N,8.76％。
s)化合物HEI 2333的合成：
Figure BDA0002711329260000441
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-N1-(2,4-二甲氧基苯基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2333)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸2,4-二甲氧基苯酯(0.62g，3.5mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为83％的纯净HEI_2333(1.35g,2.9mmol)。mp 203–205℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.6；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.15-2.23(m,1H,CH2CH2CH),2.35-2.43(m,1H,CH2CH2CH),2.55-2.63(m,1H,CH2CH2CH),2.92-3.05(m,1H,CH2CH2CH),3.80(s,3H,OCH3),3.88(s,3H,OCH3),4.45(dd,J＝15.2,6.0Hz,1H,NHCH2),4.54(dd,J＝15.2,6.0Hz,1H,NHCH2),4.84(dd,J＝8.8,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),6.44(dd,J＝8.8,2.8Hz,1H,ArH),6.50(d,J＝2.8Hz,1H,ArH),7.10(t,J＝6.0Hz,1H,NHCH2),7.17(dd,J＝8.0,2.0Hz,1H,ArH),7.31(d,J＝8.0Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),7.93(d,J＝8.8Hz,1H,ArH),10.71(br s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.4(CH2),32.7(CH2),41.3(CH2),55.7(CH),56.0(CH3),59.2(CH3),98.9(CH),103.9(CH),120.3(CH),121.1(CH),127.5(CH),129.5(C),130.7(CH),134.0(C),134.1(C),134.2(C),150.4(C),150.5(C),157.0(C),170.5(C),177.2(C)；LC-MS(APCI+)m/z:466.0(MH+),tr4.33min；IRν(cm-1):3294,1712,1657,1547,1299,1205,1033,818；C21H21Cl2N3O5分析计算为:C,54.09；H,4.54；N,9.01。实测为：C,53.91；H,3.81；N,8.91％。
t)化合物HEI 2338的合成：
Figure BDA0002711329260000451
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-N1-(2,4,6-三甲基苯基)吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2338)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(0.70g，2.4mmol)和异氰酸2,4,6-三甲基苯酯(0.39g，2.4mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为55％的纯净HEI_2338(0.60g,1.3mmol)。mp 156–157℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.8；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.14(s,6H,CCH3),2.18-2.24(m,1H,CH2CH2CH),2.27(s,3H,CCH3),2.38-2.45(m,1H,CH2CH2CH),2.55-2.65(m,1H,CH2CH2CH),2.98-3.10(m,1H,CH2CH2CH),4.42(dd,J＝6.0,2.0Hz,2H,NHCH2),4.83(dd,J＝8.4,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),6.89(s,2H,ArH),7.09-7.15(m,2H,NHCH2 and ArH),7.23(d,J＝8.8Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝2.4Hz,1H,ArH),9.74(br s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 18.4(2CH3),21.1(CH3),21.3(CH2),32.7(CH2),41.1(CH2),59.2(CH),127.4(CH),129.1(2CH),129.4(C),130.4(C),130.5(CH),134.0(CH),134.1(C),134.2(C),135.1(2C),137.3(C),151.7(C),170.5(C),177.8(C)；LC-MS(APCI+)m/z:448.1(MH+),tr 4.57min；IRν(cm-1):3275,1714,1658,1514,1358,1242,1219,1033,826；C22H23Cl2N3O3分析计算为:C,58.94；H,5.17；N,9.37。实测为：C,58.80；H,5.26；N,9.25％。
u)化合物HEI 2337的合成：
Figure BDA0002711329260000461
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-N1-[(3-三氟甲基)苯基]吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2337)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸3-三氟甲基苯酯(0.65g，3.5mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为73％的纯净HEI_2337(1.20g,2.5mmol)。mp 171–174℃(MeOH)；TLCRf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.6；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.90-1.98(m,1H,CH2CH2CH),2.30-2.42(m,1H,CH2CH2CH),2.60-2.80(m,2H,CH2CH2CH),4.35-4.39(m,2H,CH2CH2CH andNHCH2),4.81(dd,J＝9.6,2.8Hz,1H,NHCH2),7.38(dd,J＝8.8,2.4Hz,1H,ArH),7.45(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),7.47(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),7.59(t,J＝8.4Hz,1H,ArH),7.61(d,J＝2.4Hz,1H,ArH),7.72(d,J＝8.8Hz,1H,ArH),8.07(s,1H,ArH),8.88(t,J＝6.0Hz,1H,NHCH2),10.68(br s,1H,NHAr)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 21.8(CH2),32.2(CH2),40.6(CH2),59.2(CH),116.3(q,J＝3.8Hz,CH),127.0(m,CH),124.0(CH),124.3(q,J＝272.0Hz,CF3),127.6(CH),129.0(CH),130.0(q,J＝32Hz,C),130.2(CH),130.6(CH),132.8(C),133.4(C),135.7(C),138.6(C),150.1(C),171.5(C),178.2(C)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δppm-61.4(CF3)；LC-MS(APCI+)m/z:474.0(MH+),tr 4.58min；IRν(cm-1):3298,1727,1658,1556,1450,1333,1251,1112,831；C20H16Cl2F3N3O3分析计算为:C,50.65；H,3.40；N,8.86。实测为：C,50.34；H,3.30；N,8.74％。
v)化合物HEI 2328的合成：
Figure BDA0002711329260000471
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-N1-(3,4-二氯苯基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2328)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.50g，5.2mmol)和异氰酸3,4-二氯苯酯(0.98g，5.2mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为81％的纯净HEI_2328(2.00g,4.2mmol)。mp 220–224℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.7；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.84-1.97(m,1H,CH2CH2CH),2.25-2.40(m,1H,CH2CH2CH),2.60-2.80(m,2H,CH2CH2CH),4.36(s,2H,NHCH2),4.79(d,J＝8.5Hz,1H,CH2CH2CH),7.38-7.65(m,5H,NHCH2 and ArH),7.94(s,1H,ArH),8.86(s,1H,ArH),10.59(br s,1H,NHAr)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δppm21.5(CH2),31.7(CH2),39.5(CH2),58.7(CH),120.0(CH),121.1(CH),125.4(C),127.3(CH),128.6(CH),130.2(CH),130.8(CH),131.2(C),132.3(C),133.0(C),135.2(C),137.5(C),149.4(C),171.0(C),177.7(C)；LC-MS(APCI+)m/z:474.0(MH+),tr 4.67min；IRν(cm-1):3270,1718,1644,1598,1547,1476,1218,1134,818；C19H15Cl4N3O3分析计算为:C,48.03；H,3.18；N,8.84。实测为：C,47.75；H,3.03；N,8.71％。
w)化合物HEI 2336的合成：
Figure BDA0002711329260000481
(S)-N1-[3,5-双(三氟甲基)苯基]-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2336)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸3,5-双(三氟甲基)苯酯(0.89g，3.5mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为64％的纯净HEI_2337(1.20g,2.2mmol)。TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:98/2)0.6；mp 223–225℃(MeOH)；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.23-2.36(m,2H,CH2CH2CH),2.60-2.70(m,1H,CH2CH2CH),2.98-3.12(m,1H,CH2CH2CH),4.49(dd,J＝15.2,5.6Hz,1H,NHCH2),4.57(dd,J＝15.2,5.6Hz,1H,NHCH2),4.78(dd,J＝7.2,2.8Hz,1H,CH2CH2CH),6.66(t,J＝5.6Hz,1H,NHCH2),7.20(dd,J＝8.4,2.4Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝8.4Hz,1H,ArH),7.36(d,J＝2.4Hz,1H,ArH),7.62(s,1H,ArH),7.99(s,2H,ArH),10.91(brs,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm21.4(CH2),32.4(CH2),41.4(CH2),59.2(CH),117.7(q,J＝3.9Hz,CH),119.8(m,2CH),123.0(q,J＝272.0Hz,2CF3),127.5(CH),129.5(CH),130.9(CH),132.4(q,J＝32.0Hz,2C),133.5(C),134.2(C),134.4(C),138.6(C),150.2(C),170.0(C),177.8(C)；19F NMR(CDCl3,100MHz)δppm-63.1(CF3)；LC-MS(APCI+)m/z:543.8(MH+),tr 5.05min；IRν(cm-1):3290,3089,1725,1656,1561,1284,1172,1128,1042,890；C21H15Cl2F6N3O3分析计算为:C,46.51；H,2.79；N,7.75。实测为：C,46.49；H,2.61；N,7.69％。
x)化合物HEI 2278的合成：
Figure BDA0002711329260000491
(S)-N1-(4-氯苯基)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2278)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸4-氯苯酯(0.54g，3.5mmol)。所需产物在硅胶柱(CH2Cl2/MeOH 1/0至99/1)上纯化，以得到收率为68％白色固体形式的纯净HEI_2278(1.05g，2.4mmol)。mp 188–191℃(CH2Cl2/MeOH)；TLC Rf(EtOAc/正庚烷:4/6)0.3；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.85-1.95(m,1H,CH2CH2CH),2.30-2.40(m,1H,CH2CH2CH),2.58-2.78(m,2H,CH2CH2CH),4.35(m,2H,CH2CH2CH和NHCH2),4.79(dd,J＝9.2,6.0Hz,1H,NHCH2),7.40(d,J＝8.8Hz,2H,ArH),7.42(m,2H,ArH),7.57(d,J＝8.8Hz,2H,ArH),7.62(d,J＝1.5Hz,1H,ArH),8.85(t,J＝6.0Hz,1H,NHCH2),10.54(br s,1H,NHAr)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 21.4(CH2),31.8(CH2),38.3(CH2),58.7(CH),121.2(2CH),127.3(CH),127.5(C),128.6(CH),128.9(2CH),130.1(CH),132.3(C),132.9(C),135.2(C),136.3(C),149.4(C),171.1(C),177.8(C)；LC-MS(APCI+)m/z:439.9(MH+),tr 4.50min；IRν(cm-1):3283,2922,1712,1649,1600,1545,1388,1224,1051,828；C19H16Cl3N3O3分析计算为:C,51.78；H,3.66；N,9.53。实测为：C,52.02；H,3.92；N,9.38％。
y)化合物HEI 2817的合成：
Figure BDA0002711329260000501
(S)-N1,N2-双(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2817)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸2,4-二氯苄酯(0.77g，3.8mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为78％的纯净HEI_2817(1.31g,2.7mmol)。TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.7；mp 224–226℃(MeOH)；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.81-1.91(m,1H,CH2CH2CH),2.24-2.37(m,1H,CH2CH2CH),2.43-2.72(m,2H,CH2CH2CH),4.31(d,J＝5.7Hz,2H,NCH2),4.44(d,J＝5.7Hz,2H,NCH2),4.69(dd,J＝9.2,2.6Hz,1H,CH2CH2CH),7.24-7.43(m,4H,ArH),7.61(dd,J＝7.4,2.0Hz,2H,ArH),8.77(t,J＝6.3Hz,1H,NH),8.86(t,J＝6.3Hz,1H,NH)；13CNMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 22.0(CH2),32.1(CH2),40.6(CH2),40.9(CH2),59.0(CH),127.6(CH),127.7(CH),128.9(CH),129.0(CH),130.4(CH),130.6(CH),132.6(CH),132.8(CH),133.2(C),133.3(C),135.7(C),135.8(C),152.5(C),171.8(C),177.6(C)；IRν(cm-1):3251,3089,1709,1653,1538,1239；C20H17Cl4N3O3分析计算为:C,49.11；H,3.50；N,8.59。实测为：C,49.12；H,3.50；N,8.60％。
z)化合物HEI 2820的合成：
Figure BDA0002711329260000502
(S)-N2-(2,4-二氯苄基)-N1-(3,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2820)
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.5mmol)和异氰酸3,4-二氯苄酯(0.67g，3.3mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为32％的纯净HEI_2820(0.54g,1.1mmol)。mp 201–204℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.7；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.12-2.25(m,1H,CH2CH2CH),2.31-2.41(m,1H,CH2CH2CH),2.49-2.59(m,1H,CH2CH2CH),2.89-3.01(m,1H,CH2CH2CH),4.33-4.57(m,4H,NCONHCH2,CHCONHCH2,CH2CH2CH),4.74(d,J＝9.3Hz,1H,CHCONHCH2),6.86(s,1H,CHCONHCH2),7.11(d,J＝9.3Hz,1H,ArH),7.16-7.22(m,1H,ArH),7.27-7.34(m,1H,ArH),7.36-7.42(m,3H,ArH),8.88(s,1H,NCONHCH2)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.3(CH2),32.4(CH2),41.2(CH2),42.8(CH2),59.1(CH),126.8(CH),127.4(CH),129.3(CH),129.4(CH),130.6(CH),130.7(CH),132.8(C),133.7(C),134.1(C),134.1(C),138.2(C),153.3(C),170.2(C),177.4(C),184.0(C)；IRν(cm-1):3320,3274,3058,2943,1707,1650,1542,1243,816；C20H17Cl4N3O3分析计算为:C,49.11；H,3.50；N,8.59。实测为：C,49.14；H,3.58；N,8.53％。
a’)化合物HEI2548的合成：
Figure BDA0002711329260000511
N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-N1-(噻吩-2-基)吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2548)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(0.83g，2.9mmol)和异氰酸噻吩-2-酯(0.40g，3.2mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为26％的纯净HEI_2548(0.31g,0.8mmol)。mp 141–143℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)0.5；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.20-2.31(m,1H,CH2CH2CH),2.35-2.41(m,1H,CH2CH2CH),2.62(td,J＝18.1,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),3.06(td,J＝17.6,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),4.50-4.55(m,2H,NHCH2),4.85(dd,J＝9.0,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),6.73(dd,J＝3.9,1.5Hz,1H,ArH),6.89(dd,J＝5.5,3.5Hz,1H,ArH),6.92(dd,J＝5.5,1.5Hz,1H,ArH),6.95(br t,J＝4.6Hz,1H,NHCH2),7.21(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝8.3Hz,1H,ArH),7.37(d,J＝1.9Hz,1H,ArH),11.00(s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.6(CH2),32.2(CH2),41.2(CH2),59.1(CH),113.4(CH),118.4(CH),124.5(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.6(CH),133.6(C),134.0(C),134.1(C),137.9(C),149.6(C),170.2(C),177.5(C)；IRν(cm-1):3291,1712,1660,1556,1510,1343,1245,1218,815,689；C17H15Cl2N3O3S分析计算为:C,49.52；H,3.67；N,10.19；S,7.78。实测为：C,49.23；H,3.80；N,10.00；S,7.03％。
b’)化合物HEI 3090的合成：
Figure BDA0002711329260000521
(S)-N1-(6-氯吡啶-3-基)-N2-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_3090)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.86g，6.5mmol)和异氰酸6-氯吡啶-3-酯(1.00g，6.5mmol)。所需产物在硅胶柱(CH2Cl2/MeOH 1/0至9/1)上纯化，以得到收率为11％白色固体形式的纯净HEI_3090(0.30g，0.7mmol)。mp187–190℃(CH2Cl2/MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.8；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm2.12-2.37(m,2H,CH2CH2CH),2.59-2.68(m,1H,CH2CH2CH),2.99-3.10(m,1H,CH2CH2CH),4.49(dd,J＝15.2,6.2Hz,1H,NHCH2),4.55(dd,J＝15.2,6.2Hz,1H,NHCH2),4.77(dd,J＝8.7,2.1Hz,1H,CH2CH2CH),6.65(br t,J＝6.2Hz,1H,NHCH2),7.22(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H,ArH),7.29(d,J＝8.6Hz,1H,ArH),7.33(d,J＝8.1Hz,1H,ArH),7.38(d,J＝2.0Hz,1H,ArH),7.92(dd,J＝8.6,2.5Hz,1H,ArH),8.49(d,J＝2.5Hz,1H,ArH),10.66(s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.4(CH2),32.4(CH2),41.4(CH2),59.2(CH),124.3(CH),127.5(CH),129.5(CH),130.2(CH),130.9(CH),133.1(C),133.6(2C),134.2(C),141.3(CH),146.2(C),150.3(C),170.0(C),177.7(C)；IRν(cm-1):3271,3095,2935,1721,1655,1594,1542,1464,1217,1104。
N,N'-双(6-氯吡啶-3-基)脲(HEI_3091)
Figure BDA0002711329260000531
在柱色谱法期间将它与先前的实验分离，以得到收率为54％白色固体形式的纯净HEI_3091(0.50g，1.8mmol)。mp>260℃；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.4；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 7.45(d,J＝8.7Hz,2H,ArH),7.99(dd,J＝8.7,3.1Hz,2H,ArH),8.49(d,J＝3.1Hz,2H,ArH),9.21(s,2H,NH)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 124.0(2CH),129.2(2CH),135.6(2C),139.8(2CH),142.6(2C),152.3(C)；IRν(cm-1):3267,3180,3095,3052,1711,1531,1465,1285,1208,1107,833。
c’)化合物HEI2773的合成：
Figure BDA0002711329260000532
(S)-N1-(3,4-二氯苯基)-N2-[2-(2,4-二氯苯基)乙基]-5-氧代吡咯烷-1,2-二甲酰胺(HEI_2773)。
一般程序遵循使用(S)-N-(2,4-二氯苯基)乙基]-5-氧代-吡咯烷-2-甲酰胺(1.00g，3.3mmol)和异氰酸3,4-二氯苯酯(0.69g，3.7mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为51％的纯净HEI_2773(0.80g,1.6mmol)。mp 213–216℃(MeOH)；TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:95/5)0.7；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δppm 1.70-1.85(m,1H,CH2CH2CH),2.19-2.36(m,1H,CH2CH2CH),2.57-2.71(m,2H,CH2CH2CH),2.78-2.92(m,2H,CH2CH2Ar),3.25-3.46(m,2H,CH2CH2Ar),4.63(dd,J＝9.5,2.9Hz,1H,CH2CH2CH),7.30-7.38(m,2H,ArH),7.49(dd,J＝8.6,2.4Hz,1H,ArH),7.54-7.65(m,2H,ArH),7.94(d,J＝2.5Hz,1H,ArH),8.36(s,1H,NH),10.60(s,1H,NH)；13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δppm 22.1(CH2),32.1(CH2),32.6(CH2),38.5(CH2),59.1(CH),120.3(CH),121.4(CH),125.8(C),127.6(CH),129.0(CH),131.2(CH),131.6(C),132.2(C),133.0(CH),134.5(C),136.2(C),137.9(C),149.7(C),171.0(C),178.2(C)；IRν(cm-1):3267,3105,1716,1652,1592,1542,1220,807；C20H17Cl4N3O3分析计算为:C,49.11；H,3.50；N,8.59。实测为：C,48.99；H,3.37；N,8.50％。
d’)化合物HEI 3127的合成：
Figure BDA0002711329260000541
N1-(6-氯吡啶-3-基)-N3-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-1,3-二甲酰胺(HEI_3127)。
一般程序遵循使用N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺(0.83g，2.9mmol)和异氰酸4-氯吡啶-3-酯(0.40g，3.2mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为26％的纯净HEI_3127(0.31g,0.8mmol)。TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)＝0.5；mp(EtOH)＝141–143℃；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.20-2.31(m,1H,CH2CH2CH),2.35-2.41(m,1H,CH2CH2CH),2.62(td,J＝18.1,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),3.06(td,J＝17.6,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),4.50-4.55(m,2H,NHCH2),4.85(dd,J＝9.0,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),6.73(dd,J＝3.9,1.5Hz,1H,ArH),6.89(dd,J＝5.5,3.5Hz,1H,ArH),6.92(dd,J＝5.5,1.5Hz,1H,ArH),6.95(br t,J＝4.6Hz,1H,NHCH2),7.21(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝8.3Hz,1H,ArH),7.37(d,J＝1.9Hz,1H,ArH),11.00(s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.6(CH2),32.2(CH2),41.2(CH2),59.1(CH),113.4(CH),118.4(CH),124.5(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.6(CH),133.6(C),134.0(C),134.1(C),137.9(C),149.6(C),170.2(C),177.5(C)；IRν(cm-1):3291,1712,1660,1556,1510,1343,1245,1218,815,689；C17H15Cl2N3O3S分析计算为:C,49.52；H,3.67；N,10.19；S,7.78。实测为：C,49.23；H,3.80；N,10.00；S,7.03％。
e’)化合物HEI3204的合成：
Figure BDA0002711329260000551
N3-(2,4-二氯苄基)-N1-(3,4-二氯苯基)-5-氧代吡咯烷-1,3-二甲酰胺(HEI_3204)
一般程序遵循使用N-(2,4-二氯苄基)-5-氧代吡咯烷-3-甲酰胺(0.83g，2.9mmol)和异氰酸3,4-二氯苯酯(0.40g，3.2mmol)。所需产物在MeOH中结晶为白色粉末，将其过滤而得到收率为26％的纯净HEI_3204(0.31g,0.8mmol)。TLC Rf(CH2Cl2/MeOH:99/1)＝0.5；mp(EtOH)＝141–143℃；1H NMR(CDCl3,400MHz)δppm 2.20-2.31(m,1H,CH2CH2CH),2.35-2.41(m,1H,CH2CH2CH),2.62(td,J＝18.1,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),3.06(td,J＝17.6,9.4Hz,1H,CH2CH2CH),4.50-4.55(m,2H,NHCH2),4.85(dd,J＝9.0,1.6Hz,1H,CH2CH2CH),6.73(dd,J＝3.9,1.5Hz,1H,ArH),6.89(dd,J＝5.5,3.5Hz,1H,ArH),6.92(dd,J＝5.5,1.5Hz,1H,ArH),6.95(br t,J＝4.6Hz,1H,NHCH2),7.21(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H,ArH),7.34(d,J＝8.3Hz,1H,ArH),7.37(d,J＝1.9Hz,1H,ArH),11.00(s,1H,NHAr)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δppm 21.6(CH2),32.2(CH2),41.2(CH2),59.1(CH),113.4(CH),118.4(CH),124.5(CH),127.3(CH),129.3(CH),130.6(CH),133.6(C),134.0(C),134.1(C),137.9(C),149.6(C),170.2(C),177.5(C)；IRν(cm-1):3291,1712,1660,1556,1510,1343,1245,1218,815,689；C17H15Cl2N3O3S分析计算为:C,49.52；H,3.67；N,10.19；S,7.78。实测为：C,49.23；H,3.80；N,10.00；S,7.03％。
实施例2：本发明化合物的生物应用
统计分析
结果表示为平均值±SEM。我们使用Prism 6软件(GraphPad)进行统计分析。使用Mann-Whitney检验来评估两组之间差异的显著性(*,p<0.05；**,p<0.01；***,p<0.001；****,p<0.0001)。使用Mantel-Cox(对数秩)检验来分析发病曲线。
1)研究1-毒性：
HEI 2333和HEI 2336的毒性已经在60种肿瘤细胞系的NCI面板(NCI 60细胞面板)上进行了测试。
所有测试分子(10μM)均未示出在细胞外ATP的缺乏下的任何毒性(即，显著抑制增殖)(数据未示出)。
2)研究2-本发明化合物对表达小鼠P2RX7(mP2RX7)的异源细胞系的生物活性：
2.1.已用编码mP2rx7基因的表达载体转染不表达任何P2X受体的HEK细胞(模拟)。阳离子通道活性用Fluo4 AM(Invitrogen)探针测定，而大孔的开口用Topro3(Invitrogen)测定。在每个实验中，将2×106个细胞用50nM的Fluo4-AM孵育30分钟。在洗涤后，在50μM的本发明化合物的存在下，细胞用500μM的BzATP(3'-O-(4-苯甲酰基)苯甲酰基ATP)处理1小时，或未处理。当指示时，在1h刺激时间内添加Topro3探针(8.5nM)。通过流式细胞仪测定荧光。
在BzATP的缺乏(数据未示出)或存在下测试每种化合物。图1示出了化合物HEI2314和HEI2328仅在BzATP的存在下才提高Topro3进入。
HEI2328是最活跃的，发明人将其用于进一步的表征。当单独用于模拟和mP2RX7细胞时，HEI2328既不会诱导通道活性，也不会诱导大孔开口。如预期的那样，BzATP在模拟细胞中是无活性的。相比之下，在表达mP2RX7的细胞中，它在BzATP的存在下提高15倍的Ca2+进入和4倍的大孔开口：当与BzATP结合使用时，HEI2328增强61％的Topro3阳性细胞的大开孔率，而当仅用BzATP刺激细胞时，增强24.7％的Topro3阳性细胞的大开孔率。有趣的是，发明人在这里注意到：HEI2328不会在这种刺激条件下不影响通道活性(图2)。
总之，在ATP的存在下，HEI2328增强了大孔开口，这是导致细胞死亡的机制。由于在ATP的缺乏下未见毒性作用，因此发明人认为：HEI2328仅在炎症性微环境(100μM的ATP)中具有活性，因此降低了脱靶作用的可能性。
2.2.ADME研究也被进行，并且示出：HEI2328和HEI3090均为稳定分子。
稳定性研究是针对小鼠肝脏微粒体系统(和未显示的人类)(图13A)以及直接体内注射的HEI3090分子(图13B)。这些实验凸显了：在注射HEI3090的小鼠血浆(ip，在10％DMSO中1.5mg/kg)中，发现HEI3090的最大浓度为2.5μM。
补充分析也被进行，以证明HEI3090(HEI2328的可溶性更高的版本)在表达小鼠P2RX7(mP2RX7)(图14)或人P2RX7(hP2RX7)(图15)的两种HEK细胞上的生物活性。BzATP或ATP刺激通道活性，该事件发生在P2RX7刺激的最初几分钟。1h刺激仅触发较大的阳离子渗透(Topro 3流入，图2)，而15min刺激证明了在低剂量HEI3090(250nM)的存在下BzATP的EC50向左移动。在表达人P2RX7的细胞上观察到相同的阳性作用(图15)。
这些结果是HEI3090充当P2RX7的正变构调节剂的第一证据。
3)研究3-结肠炎小鼠模型：
·临床评分
过去已经证明P2RX7调节克罗恩病患者的结肠炎症性应答，一种结肠的慢性炎症性疾病(Cesaro A等人,响应中性粒细胞跨上皮迁移，肠上皮细胞中的P2X7R激活诱导了炎症过程的放大环(Amplification loop of the inflammatory process is induced byP2X7R activation in intestinal epithelial cells in response to neutrophiltransepithelial migration),Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2010.299(1):p.G32-42)，发明人已经测试了HEI2328对DSS诱导的结肠炎小鼠模型的作用。
所有小鼠从第1天到第5天随意接受硫酸葡聚糖钠盐(3％DSS,TbS consultancy)，并在接下来的10天中返回到正常自来水中。对照小鼠(n＝20)每天经腹膜内注射安慰剂(PBS/10％DMSO)，而处理后的小鼠接受2.3mg/kg在PBS/10％DMSO中的HEI2328。发明人使用了以下的半定量临床评分：
体重损失评分如下：0，无损失；1，损失<5％；2，损失<10％；3，损失<20％；和4，损失>20％。
粪便稠度的评分被测量为：0，正常；1，大便稀疏；2，水样腹泻；或3，严重的水样腹泻。
直肠出血被评分为：0，无血；1，存在瘀点；2，粪便有一丝血迹；或3，出血。
正如DSS诱导的结肠炎所预期的那样，临床评分在处理的前5天是稳定的(图3)。从第6天到第9天，处理组小鼠的体重损失在统计学上低于对照组。更重要的是，HEI2328处理的小鼠在15天后恢复了原来的体重。临床评分证实了：HEI2328处理的小鼠与对照小鼠相比更健康且恢复更快(图3B)。
总之，发明人在此示出：化合物HEI2328降低了结肠炎的临床体征。有趣的是，发明人注意到：在减轻小鼠DSS诱导的结肠炎的临床体征方面，化合物HEI2328与经典的P2RX7拮抗剂相比更有效(Hofman,P.等人,嘌呤能P2RX7受体的遗传和药理失活抑制炎症，但增加了结肠炎相关癌小鼠模型中的肿瘤发病率(Genetic and Pharmacological Inactivationof the Purinergic P2RX7Receptor Dampens Inflammation but Increases TumorIncidence in a Mouse Model of Colitis-Associated Cancer),Cancer Res,2015；Marques,C.C.等人,预防性全身性P2X7受体阻滞剂可预防实验性结肠炎(Prophylacticsystemic P2X7 receptor blockade prevents experimental colitis),BiochimBiophys Acta,2014.1842(1):p.65-78)。
·组织学评分
在第15天，对小鼠实施安乐死，从直肠到盲肠的结肠段被切除，测量，并在达到结肠下部1/3的横截面上和在从下部1/3到直肠的纵截面上建立组织学评分。炎症评分由训练有素的病理学家进行。简言之，炎症的严重程度(无、轻度、中度、严重)、炎症的范围(无、粘膜、粘膜和粘膜下层、透壁)、隐窝损害(无、基部至1/3、基部至2/3、隐窝损失、隐窝和上皮细胞损失)以及受炎症影响的组织的百分比(0％、25％、50％、75％和100％)进行评分。
图4A示出了：HEI2328处理的小鼠的炎症性评分证明了与对照组相比在统计学上显著的非常低的炎症性指数。
总之，化合物HEI2328是一种非常有效的结肠炎抑制剂。
·免疫模式
HEI2328有效抑制小鼠DSS诱导的结肠炎的观察结果与直觉相反。的确，通过增强BzATP来提高大孔开口，人们可以预期IL1B的产量提高，从而导致结肠炎恶化。由于P2RX7由免疫细胞表达，因此发明人还是表征了处理的小鼠与未处理小鼠的脾脏内各免疫细胞群的比率。如图5A所示，发明人观察到：对髓样浸润的髓样浸润显著降低(28％对17％)有利于HEI2328处理的小鼠中的淋巴样群(67％对76％)。在淋巴样群体中，Treg和Tγδ淋巴细胞均提高(图5B)。在髓样浸润内，HEI2328在统计学上降低了炎症性单核细胞的比率(CD11b+CD11c-Ly6c+Ly6g-CD3-NK1.1-B220-)。相比之下，使用HEI2328的处理并没有改变常规DC(cDC)和浆细胞样DC(pDC)的比率(图5C-D)。
总之，化合物HEI2328降低炎症性单核细胞的比率。这可以解释HEI2328如何抑制DSS诱导的结肠炎症。
因此，在结肠炎小鼠模型中，发明人已经示出：化合物HEI2328可减轻DSS诱导的结肠炎症。该结果为炎症性疾病的治疗开辟了非常有趣的观点。
4)研究4-同系肿瘤小鼠模型：
4.1.已经证明了HEI2328影响治疗小鼠的脾脏中M-MDSC(髓样来源的抑制细胞)的比率，发明人假设：HEI2328降低了免疫抑制作用，因此可以增强抗肿瘤应答。为了检验该假设，向具有免疫能力的C57B16J(Envigo，Gannat France)小鼠注射黑素瘤细胞系B16-F10。首先，发明人在体外证明了B16F10细胞对HEI2328治疗敏感。如图6所示，在BzATP处理的细胞上添加HEI2328提高了大孔开口6倍以上；Topro3阳性细胞数量的提高说明了这一点。令人感兴趣的是，发明人注意到在BzATP的缺乏下，单独的HEI2328没有毒性作用。
这些结果表明，HEI2328对B16F10细胞在ATP的存在下具有细胞毒性作用。因此，发明人在经典的肿瘤小鼠模型上测试了该化合物。在每天接受腹膜内注射2.3mg/kg HEI2328(在PBS/10％DMSO中)或安慰剂(PBS/10％DMSO)达12天的C57B16小鼠右腹皮下注射5×105B16F10细胞(在200μl PBS中)。如图7A所示，在处理组中肿瘤发生率被延迟并且肿瘤生长降低了20％(图7B、C)。然而，这一令人鼓舞的结果在统计上并不显著。
由于HEI2328的溶解性差，因此在芳族循环中直接用一个偶氮化合物取代了一个氯来合成新的分子，从而得到化合物HEI3090。这种新化合物HEI3090在BzATP的存在下增强大孔开口并且需要功能性P2RX7来介导其作用，因为Topro3的掺入在从转基因P2rx7 KO小鼠分离出的脾细胞中丢失(图8A)。通过使用表达人P2RX7的异源细胞系，发明人证明了：HEI3090在BzATP的存在下增强了大孔开口(图8B)。实际上，在相同的BzATP浓度下，更多的细胞对Topro3染色呈阳性。
有趣的是，大孔开口的增强与B16F10细胞死亡提高相关，如图9所示。BzATP和HEI3090处理1h的细胞与仅BzATP处理的细胞相比掺入多3倍的Topro3(图9A)。长时间孵育提高了细胞死亡，因为在3h处理后观察到高达80％的死细胞(图9B)。
4.2.通过杀死肿瘤细胞，HEI3090可能代表了一种新的抗肿瘤治疗。为了验证这一假设，向具有免疫能力的C57B16J小鼠皮下注射5×105的B16F10或5×105的LLC(Lewis肺癌)细胞，并且每天用HEI3090(ip,10％DMSO/PBS中2.5mg/kg)或安慰剂(10％DMSO/PBS)处理。如图10所示，HEI3090有效抑制肿瘤生长。首先，在接受HEI3090处理的组中，肿瘤的出现被延迟了1至4天(图10A、C)，其次，肿瘤体积和肿瘤重量大大降低(图10B、D)。在两个肿瘤小鼠模型中，处理组的肿瘤重量在B16F10模型中降低了10倍(8mg对81mg)，而在LLC模型中降低了4倍(80mg对295mg)。有趣的是，来自HEI3090处理组的肿瘤比来自安慰剂组的肿瘤更具免疫原性。确实，在存在HEI3090的情况下，肿瘤表达的主要复合物组织相容性1(MCH1)和PD-L1(图10E)多2倍，并且肿瘤富含CD45阳性细胞(图10F)。
发明人进行了专门的实验以检验HEI3090可能诱导免疫原性细胞死亡(ICD)的假设。它们清楚地证明：在图16中，HEI3090不会刺激ICD，而是通过刺激表达P2RX7的免疫细胞来促进其抗肿瘤作用。
此外，图10示出了HEI3090治疗提高了肿瘤的免疫原性。因此，发明人将HEI3090和抗PD-1处理结合，并示出了：这些联合治疗不仅治愈了荷瘤小鼠，而且还建立了记忆T细胞应答(图19)。
因为P2RX7由免疫细胞高表达，所以发明人认为确定HEI3090对免疫区室的作用并表征了肿瘤浸润免疫细胞的组成。如图11A所示，来自HEI3090处理组的肿瘤浸润液包含较少的免疫抑制细胞(B16F10肿瘤中较少的M-MDSC和LLC肿瘤中较少的PMN-MDSC)。另外，由于效应细胞(Tγδ，NK，CD4+)和总MDSC之间的比率有利于效应细胞，因此HEI3090处理可能会增强效应应答(图11B)。
已经证明HEI3090影响抗肿瘤免疫应答，发明人旨在确定哪些免疫细胞是关键参与者。首先，发明人消耗了T CD4+淋巴细胞。如图12所示，用HEI3090和抗T CD4+抗体处理的组中的肿瘤大于HEI3090组中的肿瘤，而小于安慰剂组中的肿瘤。这种中间表型意味着其他免疫细胞参与了HEI诱导的抗肿瘤应答。如图17所示，NK和CD4+细胞都需要传递HEI3090抗肿瘤作用，而T CD8+细胞则不需要。发明人还示出：这两个免疫细胞群在用HEI3090处理的小鼠的肿瘤中被激活并表达更多的IFN-γ(图17E-G)。
因为分泌IFN-γ的细胞被IL18激活，所以发明人测试了HEI3090的抗肿瘤作用是否依赖于IL18(图18)。首先，它们示出了：HEI3090提高了树突状细胞(众所周知的产生IL18的细胞)上的P2RX7表达。其次，它们示出了：血浆中和肿瘤内，IL18在接受HEI3090的小鼠中均过表达。第三，通过使用两种不同的方法(阻断IL18抗体和Il18-/-小鼠)，它们证明了：在没有IL18的情况下，HEI3090不再阻断肿瘤的生长。这些结果凸显了IL18作为HEI3090的靶标。
总之，看来：
-HEI3090是在富含ATP的微环境中增强P2RX7的第一分子；
-HEI3090在内源性P2RX7配体(ATP)的缺乏下是无毒的，其仅被发现在炎症和/或肿瘤微环境中。在hP2RX7或mP2RX7稳定转染的HEK细胞系上以及在60种人类肿瘤细胞系的NCI面板上进行了测试；
-HEI3090对P2RX7具有特异性，如在对从P2rx7-/-小鼠制备的脾细胞进行测试时没有效果所证明的；
-HEI3090是P2RX7的正构构调节剂，其降低ATP和3'-O-(4-苄基)苯甲酰基ATP(BzATP)的EC50，并提高ATP诱导的P2RX7表达细胞的死亡；
-HEI3090在同系小鼠肿瘤模型中阻断了肺癌(Lewis肺癌)和黑素瘤(B16-F10)肿瘤的生长，如在处理后的小鼠中将小鼠的总生存期从22天提高到了50天所证明的；
-HEI3090的抗肿瘤作用部分由T CD4+淋巴细胞介导；
-HEI3090触发了IL18和NK细胞介导的抗肿瘤应答，如在消耗IL18(阻断抗体和Il18-/-小鼠)和NK细胞(抗NK1.1抗体)的小鼠中化合物作用的损失所证明的；
-HEI3090提高了肿瘤的免疫原性，如MHC-1和PD-L1阳性的肿瘤细胞的数量提高所证明的；
-当与抗PD-1处理组合使用时，HEI3090治愈了LLC荷瘤小鼠；
-HEI3090诱导了记忆T细胞应答。
令人感兴趣的是，发明人无法检测到在处理后的小鼠脾脏中免疫细胞的任何修饰。结合证明HEI3090仅在ATP的存在下才有活性的这些体外结果，据信：体内HEI3090仅在已知含有高水平ATP的炎症性和肿瘤微环境中才有活性。总而言之，这些数据表明：使用HEI3090化合物没有或只有很少的脱靶作用。

Claims (16)

1.一种化合物，选自式(I)的化合物、其对映体及其药学上可接受的盐，
Figure FDA0002711329250000011
其中，
R1代表C1-C14烷基、环烷基、芳基、芳烷基或杂芳基，其中，所述芳基、芳烷基或杂芳基不被或被选自以下的至少一种基团取代：
-卤素原子，
-C1-C6烷氧基，
-C1-C6烷基，和
-C1-C6卤代烷基；
并且R2代表芳基、芳烷基或环烷基，其中，所述芳基或芳烷基不被或被选自卤素原子的至少一种基团取代，
其中，所述化合物不同于以下化合物：
Figure FDA0002711329250000012
并且其中，所述化合物使得R1和R2不同时代表以下杂芳基：
Figure FDA0002711329250000013
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述化合物为对映体S。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，所述环烷基为包含1至12个碳原子的环状饱和烃基，并且优选选自环己基甲基、金刚烷基和环己基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物，其中，所述芳基为单环或多环芳族烃基，其可任选地被至少一个卤素原子、一个C1-C6烷氧基和/或一个C1-C6卤代烷基取代，并且优选选自2-氯苯基、4-氯苯基、2-溴苯基、2-碘苯基、2,4-二氯苯基、3,4-二氯苯基、2,4-二甲氧基苯基、3-三氟甲基苯基、3,5-双(三氟甲基)苯基和2,4,6-三甲基苯基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的化合物，其中，所述芳烷基不被或被至少一个卤素原子、一个C1-C6烷氧基、一个C1-C6烷基或一个C1-C6卤代烷基取代，并且优选选自苄基、2-氯苄基、2,4-二氯苄基、3,4-二氯苄基和2,4-二氯苯乙基。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物，其中，所述杂芳基为芳环的至少一个碳原子被杂原子，优选氮，取代的芳基；优选地，所述杂芳基可不被或被至少一个卤素原子、一个C1-C6烷氧基和/或一个C1-C6卤代烷基取代；并且更优选地，所述杂芳基为6-氯吡啶-3-基或噻吩-2-基。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中，所述化合物具有下式(I’)：
Figure FDA0002711329250000021
其中，R1如权利要求1所定义。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物，其中，所述化合物选自以下化合物及其药学上可接受的盐：
Figure FDA0002711329250000031
Figure FDA0002711329250000041
Figure FDA0002711329250000051
Figure FDA0002711329250000061
Figure FDA0002711329250000071
Figure FDA0002711329250000081
Figure FDA0002711329250000091
Figure FDA0002711329250000101
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物作为药物的应用。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物在炎症性疾病和/或癌症的预防和/或治疗中的应用。
11.根据权利要求10所述的化合物的应用，其中，所述炎症性疾病为慢性炎症性疾病，优选选自类风湿性关节炎、克罗恩氏病、炎症性肠病、骨关节炎和骨质疏松症；和/或所述癌症选自结肠癌、结肠直肠癌、黑素瘤、乳腺癌、甲状腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌、神经胶质瘤、宫颈癌、子宫内膜癌、头颈癌、肝癌、肾癌、皮肤癌、胃癌、睾丸癌、尿路上皮癌或肾上腺皮质癌，以及非实体癌，如淋巴瘤。
12.一种产品，包括：
a)至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，和
b)至少一种其他疗法，
作为组合产品在癌症的治疗和/或预防中同时、分别或依次使用。
13.根据权利要求12所述的产品，其中，所述其他疗法b)选自抗检查点抗体，优选选自抗PD1抗体，更优选选自纳武单抗和派姆单抗，和/或所述癌症为肺癌，优选为Lewis肺癌。
14.根据权利要求9至13中任一项所述的化合物的应用，其中，所述化合物为P2RX7调节剂。
15.一种药物组合物，其在药学上可接受的载体中包含至少一种根据权利要求1至8中任一项所述的化合物。
16.一种P2RX7调节剂，其为一种能够在ATP的存在下通过大孔开口诱导细胞死亡的用于预防和/或治疗炎症性疾病和/或癌症的化合物。
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