CN112516325B - 一种稳定的口蹄疫疫苗组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂，其中，该稳定剂包含：以在疫苗组合物中的终浓度计0.5～2w/V％DEAE葡聚糖，0.5～2w/V％羟丙基‑β‑环糊精。本发明的稳定剂能长时期稳定疫苗组合物中的灭活口蹄疫抗原，保证其146S的含量稳定，同时能保证疫苗组合物自身的稳定，外观一致。本发明还提供了含有该稳定剂的疫苗组合物。
Description
技术领域
本发明属于医用配制品领域，具体涉及一种稳定的口蹄疫疫苗组合物。
背景技术
灭活口蹄疫病毒抗原的不稳定性是疫苗生产中面临的巨大挑战之一。口蹄疫灭活病毒抗原主要是沉降系数为146S的完整病毒，尺寸在30nm左右，具有强的免疫原性。然而146S在生产过程和储存过程中容易发生颗粒结构的破坏，裂解成尺寸更小的颗粒12S，尺寸小于10nm，并释放出病毒核酸，而裂解后的12S几乎没有免疫原性。因此，活性抗原完整病毒146S的收率是口蹄疫疫苗生产的关键。
CN108504638A公开了一种口蹄疫灭活病毒抗原纯化或储存的方法，通过在纯化或储存过程中加入多元羟基化合物提高活性抗原的收率。由其专利说明书第五页表1的结果可知，在众多一般被作为普通蛋白质保护剂的物质中，具有多元羟基的化合物如糖类、糖醇、甘油等对146S的裂解有抑制作用，而像氨基酸类、表面活性剂类和白蛋白类等并无保护作用，甚至有的还有促进裂解的作用。
“口蹄疫疫苗保存技术研究”(李正丰等)公开了一种口蹄疫的稳定剂，其组成为海藻糖、山梨醇、PVP，其比例为4：5：1，并且公开了口蹄疫疫苗中加入稳定剂，影响疫苗的稳定性，海藻糖、山梨醇、PVP均对疫苗的稳定性有影响，其中PVP影响更大。
因此，现有技术中需要一种既不影响疫苗稳定性，又能增强口蹄疫抗原稳定性的口蹄疫疫苗组合物。
发明内容
为解决以上技术问题，本发明提供一种用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂，其中，所述稳定剂包含：以在疫苗组合物中的终浓度计0.5～2w/V％DEAE葡聚糖，0.5～2w/V％羟丙基-β-环糊精。
通过使用DEAE葡聚糖和羟丙基-β-环糊精为稳定剂，产生协同作用，合用对口蹄疫抗原的稳定性有显著的效果，并可以降低两者的使用浓度。
在疫苗组合物中的DEAE葡聚糖终浓度可选自0.5w/V％、0.6w/V％、0.7w/V％、0.8w/V％、0.9w/V％、1.0w/V％、1.1w/V％、1.2w/V％、1.3w/V％、1.4w/V％、1.5w/V％、1.6w/V％、1.7w/V％、1.8w/V％、1.9w/V％、2w/V％。
在疫苗组合物中的羟丙基-β-环糊精终浓度可选自0.5w/V％、0.6w/V％、0.7w/V％、0.8w/V％、0.9w/V％、1.0w/V％、1.1w/V％、1.2w/V％、1.3w/V％、1.4w/V％、1.5w/V％、1.6w/V％、1.7w/V％、1.8w/V％、1.9w/V％、2w/V％。作为本发明的一种实施方式，本发明所述的用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂中，所述稳定剂还包含0.1～0.4％w/V EDTA2Na。
通过加入EDTA2Na后稳定性能略有提高。
在疫苗组合物中的EDTA2Na终浓度可选自0.1％w/V、0.2％w/V、0.3％w/V、0.4w/V。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂中，所述稳定剂包含：以在疫苗组合物中的终浓度计0.5w/V％DEAE葡聚糖，0.5w/V％羟丙基-β-环糊精；或所述稳定剂包含：以在疫苗组合物中的终浓度计0.5w/V％DEAE葡聚糖，0.5w/V％羟丙基-β-环糊精，0.1w/VEDTA2Na；或所述稳定剂包含：以在疫苗组合物中的终浓度计1w/V％DEAE葡聚糖，1w/V％羟丙基-β-环糊精，0.2w/VEDTA2Na；或所述稳定剂包含：以在疫苗组合物中的终浓度计2w/V％DEAE葡聚糖，2w/V％羟丙基-β-环糊精，0.1w/VEDTA2Na；或所述稳定剂包含：以在疫苗组合物中的终浓度计2w/V％DEAE葡聚糖，2w/V％羟丙基-β-环糊精，0.4w/VEDTA2Na。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂中，所述口蹄疫抗原为灭活的口蹄疫抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂中，所述口蹄疫抗原为灭活的口蹄疫146S抗原。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂中，所述口蹄疫抗原为灭活的O型口蹄疫抗原。
作为本发明的一种更优选实施方式，本发明所述的用于稳定口蹄疫抗原的稳定剂中，所述口蹄疫抗原为灭活的MYA98/O 146S抗原。
本发明还提供了一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括所述的稳定剂和免疫量的口蹄疫灭活抗原，以及tris缓冲液。
本发明的疫苗组合物中加入稳定剂对疫苗的稳定性没有影响，并且在疫苗中也能长时期实现抗原的稳定。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述口蹄疫灭活抗原为146S。
作为本发明的一种优选实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述口蹄疫抗原为灭活的MYA98/O 146S抗原。
作为本发明的一种实施方式，本发明所述的疫苗组合物中，所述tris缓冲液为0.12％w/v的tris缓冲液，pH为7.5。
本发明还提供了所述的稳定剂在稳定疫苗组合物中灭活口蹄疫抗原的稳定性方面的应用。
本发明的有益效果
本发明的疫苗组合物具有良好的稳定性和热稳定性(和疫苗外观稳定性，可使疫苗长时期实现抗原的稳定。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
本发明实施例中所用到的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1、添加剂对口蹄疫病毒抗原稳定性的影响
取含O型(MYA98/O)口蹄疫病毒抗原浓度为27μg/mL的病毒原液，分别加入表1中不同的物质及不同的浓度的添加剂，于45℃下储存30min后测定剩余的抗原含量，测定方法按照蔗糖密度离心法，计算剩余抗原含量占0min时抗原含量的百分数，与不添加任何物质的抗原的剩余含量(空白对照)进行比较。
表1加入不同添加剂和不同浓度的添加剂的口蹄疫病毒抗原在45℃储存30min后的剩余抗原含量
| 添加剂 | 添加剂浓度(w/V) | 剩余抗原含量 |
| 空白对照 | 23％ | |
| 蔗糖 | 5 | 76％ |
| 蔗糖 | 15 | 82％ |
| DEAE葡聚糖 | 1 | 22％ |
| DEAE葡聚糖 | 5 | 26％ |
| 羟丙基-β-环糊精 | 1 | 23％ |
| 羟丙基-β-环糊精 | 5 | 47％ |
| 羟丙基-β-环糊精 | 10 | 63％ |
表1的试验结果证明，低浓度DEAE葡聚糖的加入对口蹄疫抗原稳定性提高的影响不大，羟丙基-β-环糊精、蔗糖均需较高浓度才能起稳定剂作用。
实施例2、口蹄疫抗原溶液加入稳定剂对疫苗稳定性的影响
取加入表2中不同添加剂和不同浓度后的口蹄疫抗原溶液为水相，后加入佐剂(206佐剂，seppic)按照重量比1:1在31℃乳化5分钟，乳化后在25℃进行稳定性试验，观察疫苗的外观稳定性，试验结果见表2。
表2、口蹄疫疫苗25℃的外观稳定性
| 添加剂 | 抗原中添加剂及浓度(w/V) | 25℃稳定性 |
| 空白对照 | —— | 14天没有明显变化 |
| 蔗糖 | 5 | 5天有明显分层 |
| 蔗糖 | 15 | 2天有明显分层 |
| DEAE葡聚糖 | 1 | 14天没有明显变化 |
| DEAE葡聚糖 | 5 | 14天没有明显变化 |
| 羟丙基-β-环糊精 | 1 | 14天没有明显变化 |
| 羟丙基-β-环糊精 | 5 | 14天没有明显变化 |
| 羟丙基-β-环糊精 | 10 | 7天明显分层 |
由表2试验结果可知，蔗糖对口蹄疫疫苗的稳定性(外观稳定性)有明显的影响，DEAE葡聚糖和低浓度的的羟丙基-β-环糊精对疫苗的稳定性(外观稳定性)几乎没有影响。
实施例3、制备口蹄疫疫苗并进行稳定性试验
3.1水相的制备
用口蹄疫O型抗原27μg/mL作为抗原原液，按照表3的添加剂及含量制备口蹄疫抗原水相，余量为稀释液，稀释液用0.12％(w/v)的tris碱溶液，最终pH为7.5。将水相于45℃下储存30min后测定剩余的抗原含量，测定方法按照蔗糖密度离心法，计算剩余抗原含量占0min时抗原含量的百分数。
表3抗原水相的配制以及稳定性
表3试验结果表明，用DEAE葡聚糖和羟丙基-β-环糊精为稳定剂，产生协同作用，合用对口蹄疫抗原的稳定性有显著的效果，并可以降低两者的使用浓度。而加入EDTA2Na后稳定性略有提高。
在本发明的疫苗组合物中，DEAE葡聚糖终浓度选自0.5～2％w/V，羟丙基-β-环糊精终浓度选自0.5～2％w/V，EDTA2Na终浓度选自0.1～0.4％w/V的任意组合均能保证疫苗的良好稳定性。
3.2疫苗的制备
取3.1中加入不同浓度添加剂后的抗原溶液为水相，后按照重量比1:1加入佐剂(206佐剂，seppic)后，在31℃乳化5分钟，制备疫苗。
3.3疫苗稳定性试验
3.2中制备的疫苗进行稳定性试验，分别在25℃进行稳定性外观稳定性试验，对4℃稳定性试验样品于9个月时，按照CN 102380232方法进行破乳并测定146s的含量，计算其与0天测定146S的比值，结果见表4。
表4口蹄疫疫苗25℃的外观稳定性
| 组别 | 25℃外观稳定性 | 9个月时4℃稳定性 |
| 试验例1配制疫苗 | 14天没有明显变化 | 88％ |
| 试验例2配制疫苗 | 14天没有明显变化 | 90％ |
| 试验例3配制疫苗 | 14天没有明显变化 | 89％ |
| 试验例4配制疫苗 | 14天没有明显变化 | 93％ |
| 试验例5配制疫苗 | 14天没有明显变化 | 92％ |
| 对比例1配制疫苗 | 14天没有明显变化 | 81％ |
从表4结果可知，本发明的疫苗组合物中加入稳定剂对疫苗的稳定性没有影响，并且在疫苗中也能长时期实现抗原的稳定。
以上所述仅是本发明的优选实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，虽然本发明已以优选实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案的范围内，当可利用上述揭示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (6)
1.一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物包括稳定剂和免疫量的口蹄疫灭活146S抗原，以及tris缓冲液；
所述稳定剂由以下组分组成：以在疫苗组合物中的终浓度计0.5～2w/V％DEAE葡聚糖，0.5～2w/V％羟丙基-β-环糊精。
2.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述稳定剂还包含0.1～0.4w/V％EDTA2Na。
3.根据权利要求1或2所述的疫苗组合物，其中，所述稳定剂由以下组分组成：以在疫苗组合物中的终浓度计0.5w/V％DEAE葡聚糖，0.5w/V％羟丙基-β-环糊精；或
所述稳定剂由以下组分组成：以在疫苗组合物中的终浓度计0.5w/V％DEAE葡聚糖，0.5w/V％羟丙基-β-环糊精，0.1w/V％EDTA2Na；或
所述稳定剂由以下组分组成：以在疫苗组合物中的终浓度计1w/V％DEAE葡聚糖，1w/V％羟丙基-β-环糊精，0.2w/V％EDTA2Na；或
所述稳定剂由以下组分组成：以在疫苗组合物中的终浓度计2w/V％DEAE葡聚糖，2w/V％羟丙基-β-环糊精，0.1w/V％EDTA2Na；或
所述稳定剂由以下组分组成：以在疫苗组合物中的终浓度计2w/V％DEAE葡聚糖，2w/V％羟丙基-β-环糊精，0.4w/V％EDTA2Na。
4.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述口蹄疫灭活146S抗原为灭活的O型口蹄疫146S抗原。
5.根据权利要求4所述的疫苗组合物，其中，所述口蹄疫灭活146S抗原为灭活的MYA98/O 146S抗原。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中，所述tris缓冲液为0.12％w/v的tris缓冲液，pH为7.5。
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