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CN112451457A - 一种无刺激除痘隔离霜及其制备方法 - Google Patents

一种无刺激除痘隔离霜及其制备方法 Download PDF

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CN112451457A CN202011494916.9A CN202011494916A CN112451457A CN 112451457 A CN112451457 A CN 112451457A CN 202011494916 A CN202011494916 A CN 202011494916A CN 112451457 A CN112451457 A CN 112451457A
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Abstract

本发明公开了一种无刺激除痘隔离霜及其制备方法，包括假酸浆提取物、纳米乳凝胶、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊、陈皮、淮山药、白芍、绿茶、水。将R9‑EGF重组基因插入到发根农杆菌体内，利用发根农杆菌侵染假酸浆外植体，大量表达R9‑EGF复合蛋白，解决了大分子EGF的皮肤渗透性。将纳米乳与假酸浆籽胶结合，制备纳米乳凝胶，具有聚合物网络结构，能够容纳大量水和药液；通过提高纳米乳凝胶中增稠剂含量，调整内部筛网直径，使纳米乳凝胶成为优良的药物载体。将二氧化钛纳米颗粒用蚕丝蛋白包裹制成微胶囊，可以使二氧化钛纳米颗粒具有良好的水溶性，能维持水溶液稳定，对皮肤无刺激、无过敏，保护皮肤抗紫外线辐射。

Description

一种无刺激除痘隔离霜及其制备方法
技术领域
本发明涉及化妆品技术领域，具体为一种无刺激除痘隔离霜及其制备方法。
背景技术
表皮生长因子(EGF)是一种含有53个氨基酸多化单链小分子，分子量约为6.2KD。EGF对各种细胞増殖和表皮组织生长有很强的促进作用，在医学上已用于烧伤烫伤各类创伤、溃瘍和角膜损伤等很多方面的治疗。此外EGF还能促进正常表皮细胞的新陈代谢，作为化妆品添加剂添加到美容护肤品中可W达到美白、抗皱、延缓衰老的作化因此不论是作为医疗药品还是化妆品添加剂EGF都具有巨大的潜在应用价值和广阔的市场前景。然而研究表明，EGF的透皮率很低，以0.5μg/g的剂量涂抹12h后累积透皮率也仅有化0.993％，这说明绝大部分的EGF未能透过皮肤，其透皮吸收效果十分微弱。市面上很多直接添加EGF产品却并没有解决其渗透性的问题。
隔离霜虽然有遮挡痘痕的效果，却无法从根本上改善肌肤和护理痘痕；添加的抗辐射效果良好的二氧化钛，如果清洗不到位，很容易堵塞毛孔，恶化痘痘肌肤。
因此，设计亲肤和改善痘痘肌肤的一种无刺激除痘隔离霜及其制备方法是很有必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种无刺激除痘隔离霜及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种无刺激除痘隔离霜，包括假酸浆提取物5-20份、纳米乳凝胶10-20份、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊2-8份、陈皮0.5份、淮山药0.2份、白芍0.8份、绿茶0.6份、水2-8份。
一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤一：将陈皮、淮山药、柴胡、枳壳、郁金、佛手、白芍、夏枯草、绿茶加入到纳米乳凝胶中，90℃120-200rpm搅拌3h，获得A相；
步骤二：将假酸浆提取物、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊缓慢加入到步骤一获得的A相中，30℃150-200rpm搅拌2h，获得一种无刺激除痘隔离霜。
根据上述技术方案，所述纳米乳凝胶是以纳米乳为基础，加入5-100nm假酸浆籽胶基质而得；RH-40为表面活性剂，叔丁醇为助表面活性剂。RH-40与叔丁醇有助与降低皮肤对药物传递的屏障作用，便于药物到达皮肤内部，使之更好的发挥药性。
根据上述技术方案，所述蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊是使用旋涂层层自组装技术制备：
步骤一：吸取一定量蚕丝蛋白溶液(1mg/mL水溶液)覆盖整个基底，以3000rpm30s旋涂成均匀薄膜，在其上方均匀滴加一层无水甲醇，静止20s，使无定形蚕丝蛋白大分子转变成稳定的蚕丝蛋白薄膜，再次以3000rpm30s旋转干燥，随后以超纯水旋转洗涤两次，至此已构筑一层蚕丝蛋白薄膜；该膜高度有序，稳定性高。
步骤二：重复上述步骤，建立多层蚕丝蛋白薄膜，直至达到所需薄膜厚度，重复3-10次；此方法使蚕丝蛋白薄膜厚度可控。
步骤三：在piranha溶液(30％H2O2 90mL与98％H2SO4 210mL混合溶液)预处理的盖玻片(22mm×22mm)上依次旋涂二氧化钛、和步骤二所得蚕丝蛋白薄膜，利用光刻技术与等离子干法刻蚀相结合的方法，进行光刻与等离子刻蚀，从而制得图案，并进一步在丙酮溶液中，形成自包裹“微泡”结构，实现了对二氧化钛的包裹，获得蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊。将二氧化钛纳米颗粒用蚕丝蛋白包裹，解决了二氧化钛纳米颗粒水溶性性差的问题，使其能维持水溶液稳定，对皮肤无刺激、无过敏；蚕丝蛋白二氧化钛微胶囊的亲水性也使得其易洗脱，不会残留在皮肤上堵塞毛孔，避免给皮肤带来负担。该微胶囊亲肤无毒，结构稳定。
根据上述技术方案，所述假酸浆提取物，提取自假酸浆外植体发状根中，外植体可以为根、茎、叶片、叶柄其中的一种。
根据上述技术方案，所述外植体发状根，用发根农杆菌对假酸浆外植体进行侵染；取茎为外植体，外植体龄为10D，超声波处理时间5s，预培养和共培养48-72h，侵染时间为5-10min。使用茎为外植体更易获得发状根。
根据上述技术方案，所述共培养培养基pH值为5-6.5，蔗糖浓度为5-8％，添加0.3mg/mL的NAA。添加NAA可以促进发状根生长。
根据上述技术方案，所述发根农杆菌菌株为A4，其Ri质粒含有R9-EGF重组基因，通过PCR扩增R9-EGF重组基因，经双酶切后，重组到Ri质粒上。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根进行PCR检测：根据设计的一对R9-EGF基因引物(186bp)，电泳检测出现了186bp的条带，而未转化的假酸浆外植体则没有扩增出条带，证明重组基因己经整合进发状根的基因组中。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根转接到液体培养基中扩大增殖培养：用MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L，添加1mg/L KT-1、0.5mg/L 6-BA、2mg/L IAA、活性炭5g，培养25-35D。
表皮生长因子(EGF)EGF能刺激肉芽组织的形成和促进肉芽组织的上皮化，还可调节胶原降解及更新，使胶原纤维以线性方式排列，防止结缔组织异常增生，故而有缩短创伤愈合时间以及减少疤痕形成的作用，对防止和护理痤疮有很好的效果。
穿膜肽也被称为蛋白质转导结构域，其具有通过细胞膜移位的能力并且有效地转导具有生物活性的小分子、药物穿过细胞膜。小分子细胞穿膜肽的发现在增强药物吸收、药物体内运输、临床药效评价及肿瘤靶向治疗与诊断等研宄均具有极其良好的应用前景。多聚精氨酸穿膜短肽(R9)具有广泛的组织相容性、低毒性、低免疫原性和稳定性、特异性及递送功能等优点，可以有效的将EGF蛋白带入细胞内部。
将R9-EGF重组基因插入到发根农杆菌体内，利用发根农杆菌侵染假酸浆外植体，将R9-EGF重组基因转入假酸浆外植体体内，生成发状根大量表达R9-EGF重组蛋白，R9可以携带EGF透过细胞膜，直达细胞内部，解决了大分子EGF的皮肤渗透性，使其真正发挥修复痤疮损伤的作用。
假酸浆毛状根中的总黄酮、总多糖含量均高于假酸浆籽和自然根，毛状根中总黄酮粗提取液对丙酸杆菌有很好的抑菌效果，可以有效抑制皮肤丙酸杆菌的滋生。假酸浆毛状根中的总黄酮、总多糖也有较强的清除DPPH自由基活性，进一步保护肌肤免受损伤。
纳米乳凝胶是以纳米乳为基础，加入凝胶基质而得，其主要优点凝胶基质的“筛网”直径(5-100nm)可由增稠剂含量进行调节，以适应不同药物递送需求，对pH值、温度和重力等极端条件有良好的稳定性。凝胶基质的加入将极大改变纳米乳中药物的药理学活性，作为局部给药系统发挥良好治疗作用。纳米乳凝胶中的表面活性剂和助表面活性剂成分，有助降低皮肤对药物传递的屏障作用；纳米乳凝胶可同时容纳多种药物。
假酸浆籽胶内部凝胶的纤维结构间隙较大，能够容纳大量水和药液，具有聚合物网络结构，同时其内部筛网结构密布，且直径在5-100nm，基于此，将纳米乳与假酸浆籽胶结合，制备纳米乳凝胶，以改变纳米乳的药物传递性能，通过提高纳米乳凝胶中增稠剂含量，调整内部筛网直径，使纳米乳凝胶成为优良的药物载体。
假酸浆可入药，有清热解毒、对治疗热淋、痈肿疮疖有功效与作用。陈皮、淮山药、白芍、绿茶温和性中药可以排除肌肤毒素，使肌肤保存健康状态，告别痘痘困扰。
使用光刻与等离子干法刻蚀技术，将二氧化钛-蚕丝蛋白多层薄膜制成尺寸在微米范围内的图案，在铺设二氧化钛纳米颗粒的过程中，由于机械作用力，自发形成“微泡”结构，实现了对二氧化钛的包裹。将二氧化钛纳米颗粒用蚕丝蛋白包裹制成微胶囊，可以使二氧化钛纳米颗粒具有良好的水溶性，能维持水溶液稳定，对皮肤无刺激、无过敏，保护皮肤抗紫外线辐射。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明，
(1)多聚精氨酸穿膜短肽(R9)具有广泛的组织相容性、低毒性、低免疫原性和稳定性、特异性及递送功能等优点。将多聚精氨酸穿膜短肽-表皮生长因子(R9-EGF)重组基因插入到发根农杆菌体内，利用发根农杆菌侵染假酸浆外植体，将R9-EGF重组基因转入假酸浆外植体体内，生成发状根，大量表达R9-EGF复合蛋白，R9可以携带EGF透过细胞膜，直达细胞内部，解决了大分子EGF的皮肤渗透性，使其能真正发挥修复痤疮损伤的作用；假酸浆毛状根中的总黄酮、总多糖含量均高于假酸浆籽和自然根，毛状根中总黄酮粗提取液对丙酸杆菌有很好的抑菌效果，可以有效抑制皮肤丙酸杆菌的滋生。假酸浆毛状根中的总黄酮、总多糖也有较强的清除DPPH自由基活性，进一步保护肌肤免受损伤；
(2)将纳米乳与假酸浆籽胶结合，制备纳米乳凝胶，以提升纳米乳的药物传递性能；纳米乳凝胶中的表面活性剂和助表面活性剂成分，有助降低皮肤对药物传递的屏障作用；假酸浆籽胶内部凝胶的纤维结构间隙较大，具有聚合物网络结构，同时其内部筛网结构密布，能够容纳大量水和药液；通过提高纳米乳凝胶中增稠剂含量，调整内部筛网直径，使纳米乳凝胶成为优良的药物载体。用纳米乳凝胶携带假酸浆提取物、陈皮、淮山药、白芍、绿茶，其药性温和，可以排除肌肤毒素，使肌肤保存健康状态，告别痘痘困扰。
(3)使用旋涂层层自组装技术，先铺设蚕丝蛋白多层薄膜，后铺设二氧化钛纳米颗粒，利用光刻与等离子干法刻蚀技术，形成“微泡”结构，实现了蚕丝蛋白对二氧化钛的包裹。将二氧化钛纳米颗粒用蚕丝蛋白包裹制成微胶囊，解决了二氧化钛纳米颗粒水溶性性差的问题，使其能维持水溶液稳定，对皮肤无刺激、无过敏；蚕丝蛋白二氧化钛微胶囊的亲水性也使得其易洗脱，不会残留在皮肤上堵塞毛孔，避免给皮肤带来负担。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供技术方案：一种无刺激除痘隔离霜，包括假酸浆提取物5-20份、纳米乳凝胶10-20份、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊2-8份、陈皮0.5份、淮山药0.2份、白芍0.8份、绿茶0.6份、水2-8份。
一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤一：将陈皮、淮山药、柴胡、枳壳、郁金、佛手、白芍、夏枯草、绿茶加入到纳米乳凝胶中，90℃120-200rpm搅拌3h，获得A相；
步骤二：将假酸浆提取物、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊缓慢加入到步骤一获得的A相中，30℃150-200rpm搅拌2h，获得一种无刺激除痘隔离霜。
根据上述技术方案，所述纳米乳凝胶是以纳米乳为基础，加入5-100nm假酸浆籽胶基质而得；RH-40为表面活性剂，叔丁醇为助表面活性剂。
根据上述技术方案，所述蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊是使用旋涂层层自组装技术制备：
步骤一：吸取一定量蚕丝蛋白溶液(1mg/mL水溶液)覆盖整个基底，以3000rpm30s旋涂成均匀薄膜，在其上方均匀滴加一层无水甲醇，静止20s，使无定形蚕丝蛋白大分子转变成稳定的蚕丝蛋白薄膜，再次以3000rpm30s旋转干燥，随后以超纯水旋转洗涤两次，至此已构筑一层蚕丝蛋白薄膜；
步骤二：重复上述步骤，建立多层蚕丝蛋白薄膜，直至达到所需薄膜厚度，重复3-10次；
步骤三：在piranha溶液(30％H2O2 90mL与98％H2SO4 210mL混合溶液)预处理的盖玻片(22mm×22mm)上依次旋涂二氧化钛、和步骤二所得蚕丝蛋白β-sheet薄膜，利用光刻技术与等离子干法刻蚀相结合的方法，进行光刻与等离子刻蚀，从而制得图案，并进一步在丙酮溶液中，形成自包裹“微泡”结构，实现了对二氧化钛的包裹，获得蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊。
根据上述技术方案，所述假酸浆提取物，提取自假酸浆外植体发状根中，外植体可以为根、茎、叶片、叶柄其中的一种。
根据上述技术方案，所述外植体发状根，用发根农杆菌对假酸浆外植体进行侵染；取茎为外植体，外植体龄为10D，超声波处理时间5s，预培养和共培养48-72h，侵染时间为5-10min。
根据上述技术方案，所述共培养培养基pH值为5-6.5，蔗糖浓度为5-8％，添加0.3mg/mL的NAA。
根据上述技术方案，所述发根农杆菌菌株为A4，其Ri质粒含有R9-EGF重组基因，通过PCR扩增R9-EGF重组基因，经双酶切后，重组到Ri质粒上。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根进行PCR检测：根据设计的一对R9-EGF基因引物(186bp)，电泳检测出现了186bp的条带，而未转化的假酸浆外植体则没有扩增出条带，证明重组基因己经整合进发状根的基因组中。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根转接到液体培养基中扩大增殖培养：用MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L，添加1mg/L KT-1、0.5mg/L 6-BA、2mg/L IAA、活性炭5g，培养25-35D。
实施例1
一种无刺激除痘隔离霜，包括假酸浆提取物12份、纳米乳凝胶10份、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊4份、陈皮0.5份、淮山药0.2份、白芍0.8份、绿茶0.6份、水3份。
一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤一：将陈皮、淮山药、柴胡、枳壳、郁金、佛手、白芍、夏枯草、绿茶加入到纳米乳凝胶中，90℃150rpm搅拌3h，获得A相；
步骤二：将假酸浆提取物、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊缓慢加入到步骤一获得的A相中，30℃180rpm搅拌2h，获得一种无刺激除痘隔离霜。
根据上述技术方案，所述纳米乳凝胶是以纳米乳为基础，加入5-100nm假酸浆籽胶基质而得；RH-40为表面活性剂，叔丁醇为助表面活性剂。
根据上述技术方案，所述蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊是使用旋涂层层自组装技术制备：
步骤一：吸取一定量蚕丝蛋白溶液(1mg/mL水溶液)覆盖整个基底，以3000rpm30s旋涂成均匀薄膜，在其上方均匀滴加一层无水甲醇，静止20s，使无定形蚕丝蛋白大分子转变成稳定的蚕丝蛋白薄膜，再次以3000rpm30s旋转干燥，随后以超纯水旋转洗涤两次，至此已构筑一层蚕丝蛋白薄膜；
步骤二：重复上述步骤，建立多层蚕丝蛋白薄膜，直至达到所需薄膜厚度，重复3次；
步骤三：在piranha溶液(30％H2O2 90mL与98％H2SO4 210mL混合溶液)预处理的盖玻片(22mm×22mm)上依次旋涂二氧化钛、和步骤二所得蚕丝蛋白β-sheet薄膜，利用光刻技术与等离子干法刻蚀相结合的方法，进行光刻与等离子刻蚀，从而制得图案，并进一步在丙酮溶液中，形成自包裹“微泡”结构，实现了对二氧化钛的包裹，获得蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊。
根据上述技术方案，所述外植体发状根，用发根农杆菌对假酸浆外植体进行侵染；取茎为外植体，外植体龄为10D，超声波处理时间5s，预培养和共培养48-72h，侵染时间为5-10min。
根据上述技术方案，所述共培养培养基pH值为5.5，蔗糖浓度为6％，添加0.3mg/mL的NAA。
根据上述技术方案，所述发根农杆菌菌株为A4，其Ri质粒含有R9-EGF重组基因，通过PCR扩增R9-EGF重组基因，经双酶切后，重组到Ri质粒上。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根进行PCR检测：根据设计的一对R9-EGF基因引物(186bp)，电泳检测出现了186bp的条带，而未转化的假酸浆外植体则没有扩增出条带，证明重组基因己经整合进发状根的基因组中。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根转接到液体培养基中扩大增殖培养：用MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L，添加1mg/L KT-1、0.5mg/L 6-BA、2mg/L IAA、活性炭5g，培养25-35D。
实施例2
一种无刺激除痘隔离霜，包括假酸浆提取物15份、纳米乳凝胶12份、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊3份、陈皮0.5份、淮山药0.2份、白芍0.8份、绿茶0.6份、水3份。
一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤一：将陈皮、淮山药、柴胡、枳壳、郁金、佛手、白芍、夏枯草、绿茶加入到纳米乳凝胶中，90℃150rpm搅拌3h，获得A相；
步骤二：将假酸浆提取物、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊缓慢加入到步骤一获得的A相中，30℃200rpm搅拌2h，获得一种无刺激除痘隔离霜。
根据上述技术方案，所述纳米乳凝胶是以纳米乳为基础，加入5-100nm假酸浆籽胶基质而得；RH-40为表面活性剂，叔丁醇为助表面活性剂。
根据上述技术方案，所述蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊是使用旋涂层层自组装技术制备：
步骤一：吸取一定量蚕丝蛋白溶液(1mg/mL水溶液)覆盖整个基底，以3000rpm30s旋涂成均匀薄膜，在其上方均匀滴加一层无水甲醇，静止20s，使无定形蚕丝蛋白大分子转变成稳定的蚕丝蛋白薄膜，再次以3000rpm30s旋转干燥，随后以超纯水旋转洗涤两次，至此已构筑一层蚕丝蛋白薄膜；
步骤二：重复上述步骤，建立多层蚕丝蛋白薄膜，直至达到所需薄膜厚度，重复5次；
步骤三：在piranha溶液(30％H2O2 90mL与98％H2SO4 210mL混合溶液)预处理的盖玻片(22mm×22mm)上依次旋涂二氧化钛、和步骤二所得蚕丝蛋白β-sheet薄膜，利用光刻技术与等离子干法刻蚀相结合的方法，进行光刻与等离子刻蚀，从而制得图案，并进一步在丙酮溶液中，形成自包裹“微泡”结构，实现了对二氧化钛的包裹，获得蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊。
根据上述技术方案，所述外植体发状根，用发根农杆菌对假酸浆外植体进行侵染；取茎为外植体，外植体龄为10D，超声波处理时间5s，预培养和共培养48-72h，侵染时间为10min。
根据上述技术方案，所述共培养培养基pH值为6，蔗糖浓度为5％，添加0.3mg/mL的NAA。
根据上述技术方案，所述发根农杆菌菌株为A4，其Ri质粒含有R9-EGF重组基因，通过PCR扩增R9-EGF重组基因，经双酶切后，重组到Ri质粒上。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根进行PCR检测：根据设计的一对R9-EGF基因引物(186bp)，电泳检测出现了186bp的条带，而未转化的假酸浆外植体则没有扩增出条带，证明重组基因己经整合进发状根的基因组中。
根据上述技术方案，所述假酸浆发状根转接到液体培养基中扩大增殖培养：用MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L，添加1mg/L KT-1、0.5mg/L 6-BA、2mg/L IAA、活性炭5g，培养25-35D。
试验1体外透皮实验
取处理好的大鼠皮肤，角质层向上，固定在透皮仪的Franz扩散池上，在角质层一面均匀涂上假酸浆提取物2g(注意排除气泡)，有效扩散面积为2.48cm2，在接受池中加入含20％PEG400生理盐水7ml做接受液。将扩散池置(37±1)℃恒温水浴中，搅拌速度300r/min，分别在1、2、4、6、8、10、12取样1ml，并补充等温度同体积含20％PEG400生理盐水。所取样品用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液20μl进样，测定含量，并按下式计算出一定时间单位面积的累计透过量：
Qs＝{Cn*Vo+V}/S
其中，Qs：第n次取样时单位面积累积渗透量；Cn：第n次取样时接受液中的浓度；Vo：扩散池体积；V：取样体积；S：扩散面积。
单位面积累积渗透量 1h 2h 4h 6h 8h 10h 12h
Qs(μg/cm<sup>2</sup>) 2.36 3.59 4.85 5.47 6.35 7.03 7.29
表1单位面积累积渗透量
由直观分析法试验结果进行分析，假酸浆提取物的经皮渗透性良好。穿膜肽在EGF经皮渗透过程中起到促渗作用。
试验2假酸浆毛状根、自然根和干燥种籽黄酮含量测试
将液体培养基中的假酸浆毛状根和无菌苗中植物的根取出，用蒸流水反复冲洗次，之后放于30℃烘箱中烘干，分别精密称取烘干后的假酸浆毛状根、自然根和干燥种籽2.5g，分别用研钵磨成粉末，用滤纸包扎好，放于加有石油醚(60-90℃)的索氏器回流10h进行脱脂。将脱脂后的粉末分别放冷，弃去石油醚液，将粉末中石油醚挥干，之后粉末加75％乙醇50mL超声提取三次，每次30min，过滤后合并滤液，将滤液倒入蒸发皿中放于水浴锅(50℃)中减压挥发提取液，浓缩，待样品浓缩干燥后称取其重量，将称好后的样品加入75％乙醇溶液定容于的容量瓶中，得到假酸浆总黄酮，备用。
分别精确吸取假酸浆毛状根、自然根和假酸浆籽的黄酮供试品溶液1.0mL，共5份，分别置于10mL容量瓶中，加5％的NaNO20.4mL，摇匀，放置6min，加10％Al(NO3)30.4mL，摇匀，放置6min，加4％NaOH4mL，用75％乙醇定容，摇匀放置15min，以乙醇溶剂为空白，用紫外分光光度器在510nm波长处测定吸光度A值。
黄酮％＝(C×V×N/W)
C为从标准曲线上算出的黄酮浓度(mg/mL)；
N为稀释倍数；
V为加样体积(mL)；
W为发根干重(mg)。
由以上公式计算出毛状根中总黄酮的含量为9.28％，自然根中总黄酮的含量为5.89％，假酸浆籽中总黄酮的含量4.73％。
由此试验可以看出，毛状根中总黄酮的含量高于自然根和假酸浆籽中总黄酮的含量。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种无刺激除痘隔离霜，包括：假酸浆提取物5-20份、纳米乳凝胶10-20份、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊2-8份、陈皮0.5份、淮山药0.2份、白芍0.8份、绿茶0.6份、水2-8份。
2.一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，包括以下具体步骤：
步骤一：将陈皮、淮山药、柴胡、枳壳、郁金、佛手、白芍、夏枯草、绿茶加入到纳米乳凝胶中，90℃120-200rpm搅拌3h，获得A相；
步骤二：将假酸浆提取物、蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊缓慢加入到步骤一获得的A相中，30℃150-200rpm搅拌2h，获得一种无刺激除痘隔离霜。
3.根据权利要求2所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述纳米乳凝胶是以纳米乳为基础，加入5-100nm假酸浆籽胶基质而得；RH-40为表面活性剂，叔丁醇为助表面活性剂。
4.根据权利要求2所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊是使用旋涂层层自组装技术制备：
步骤一：吸取一定量蚕丝蛋白溶液(1mg/mL水溶液)覆盖整个基底，以3000rpm30s旋涂成均匀薄膜，在其上方均匀滴加一层无水甲醇，静止20s，使无定形蚕丝蛋白大分子转变成稳定的蚕丝蛋白薄膜，再次以3000rpm30s旋转干燥，随后以超纯水旋转洗涤两次，至此已构筑一层蚕丝蛋白薄膜；
步骤二：重复上述步骤，建立多层蚕丝蛋白薄膜，直至达到所需薄膜厚度，重复3-10次；
步骤三：在piranha溶液(30％H2O290mL与98％H2SO4210mL混合溶液)预处理的盖玻片(22mm×22mm)上依次旋涂二氧化钛、和步骤二所得蚕丝蛋白薄膜，利用光刻技术与等离子干法刻蚀相结合的方法，进行光刻与等离子刻蚀，从而制得图案，并进一步在丙酮溶液中，形成自包裹“微泡”结构，实现了对二氧化钛的包裹，获得蚕丝蛋白二氧化钛纳米颗粒微胶囊。
5.根据权利要求2所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述假酸浆提取物，提取自假酸浆外植体发状根中，外植体可以为根、茎、叶片、叶柄其中的一种。
6.根据权利要求5所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述外植体发状根，用发根农杆菌对假酸浆外植体进行侵染；取茎为外植体，外植体龄为10D，超声波处理时间5s，预培养和共培养48-72h，侵染时间为5-10min。
7.根据权利要求6所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述共培养培养基pH值为5-6.5，蔗糖浓度为5-8％，添加0.3mg/mL的NAA。
8.根据权利要求7所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述发根农杆菌菌株为A4，其Ri质粒含有R9-EGF重组基因，通过PCR扩增R9-EGF重组基因，经双酶切后，重组到Ri质粒上。
9.根据权利要求8所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述假酸浆发状根进行PCR检测：根据设计的一对R9-EGF基因引物(186bp)，电泳检测出现了186bp的条带，而未转化的假酸浆外植体则没有扩增出条带，证明重组基因己经整合进发状根的基因组中。
10.根据权利要求9所述的一种无刺激除痘隔离霜的制备方法，其特征在于：所述假酸浆发状根转接到液体培养基中扩大增殖培养：用MS液体培养基，蔗糖浓度为30g/L，添加1mg/L KT-1、0.5mg/L 6-BA、2mg/L IAA、活性炭5g，培养25-35D。
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