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CN112129949A - 一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒、其制备方法和使用方法 - Google Patents

一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒、其制备方法和使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒、其制备方法和使用方法,所述试剂盒包括R1试剂和R2试剂,其中,R1试剂包括磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、EDTA‑2Na和纯化水,R2试剂包括磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清、EDTA‑2Na和纯化水。本发明提供的试剂盒成分简单、灵敏高,重复性和准确性好,适用于各类自动生化分析仪。

Description

一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒、其制备方法和使用方法
技术领域
本发明涉及生物制剂领域,具体涉及一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒、其制备方法和使用方法。
背景技术
人视黄醇结合蛋白(Retinol–binding Protein,RBP)分子量约21,000,半衰期3-12h,等电点PH4.4-4.8,由肝细胞合成,分布在人的血清、脑脊液、尿液等。在血液中,RBP与视黄醇(VitA)、甲状腺素转运蛋白按1:1:1结合,以复合物形式存在,能携带90%视黄醇,从肝脏向周围组织运送,当视黄醇与靶细胞受体结合后,视黄醇即进入细胞内,RBP便于甲状腺素转运蛋白分离。游离RBP经肾小球滤出,被近端肾小管上皮细胞重吸收分解,少量由尿液排出,因此肝脏和肾脏疾病均可影响RBP在血清中浓度。近年来研究表明,视黄醇结合蛋白测定,是一项评价肾脏疾病特别是肾小管损伤疾病的良好指标。
目前测定视黄醇结合蛋白的方法较多,有放射免疫扩散、免疫透射比浊法、免疫电泳、酶联免疫法、放射免疫分析等,其中,免疫比浊法利用全自动生化分析仪来检测,没有放射源、较环保,而且稳定性、精密度和准确性性能良好,在临床常规检测中有广泛的应用。然而,现有的免疫比浊法所用的检测试剂盒成分比较复杂,不利于工业生产。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的视黄醇结合蛋白检测试剂盒成分复杂,不利于工业生产的缺陷,从而提供一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒。
本发明还提供一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制备方法和使用方法。
为此,本发明提供一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,R1试剂包括磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、EDTA-2Na和纯化水,R2试剂包括磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清、EDTA-2Na和纯化水。
进一步地,R1试剂中磷酸盐缓冲液的含量为40-60mmol/L,聚乙二醇6000的含量为80-90mmol/L,EDTA-2Na的含量为5-15mmol/L,R2试剂中磷酸盐缓冲液的含量为40-60mmol/L,羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清的含量为4-8ml/L,EDTA-2Na的含量为5-15mmol/L。
进一步地,R1试剂中磷酸盐缓冲液的含量为50mmol/L,聚乙二醇6000的含量为83mmol/L,EDTA-2Na的含量为10mmol/L,R2试剂中磷酸盐缓冲液的含量为50mmol/L,羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清的含量为6ml/L,EDTA-2Na的含量为10mmol/L。
进一步地,磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.6。
本发明还提供一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制备方法,包括以下步骤:
在水中加入磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R1;
在水中加入磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R2;
将试剂R1和试剂R2按照体积比为2:1组成试剂盒。
本发明还提供一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒的使用方法,包括:
将血清样本加入到试剂R1,37℃下孵育2-5分钟,然后再加入试剂R2,立即读取吸光度A1,5分钟后读取吸光度A2,得出吸光度△A样本,△A样本=A2-A1;用同样的方法测定标准液的吸光度△A标准,再通过公式(1)计算血清样本中的视黄醇结合蛋白含量:
血清中视黄醇结合蛋白含量=△A样本/△A标准×标准液浓度(1)。
本发明技术方案,具有如下优点:
1、本发明利用抗人视黄醇结合蛋白多或单克隆抗体与样本血清中视黄醇结合蛋白通过抗原抗体反应特异性结合,形成免疫复合物微粒,导致浊度增加,在一定条件下,浊度的增加与免疫复合物微粒数即视黄醇结合蛋白数相关,得以定量样品中视黄醇结合蛋白的浓度的原理。本发明提供的试剂盒成分简单、灵敏高,重复性和准确性好,适用于各类自动生化分析仪。
2、本试剂盒使用的原料主要是普通化学试剂,没有易燃、易爆、有毒、有害物品,并且没有污染,对人体及周围环境没有任何危害,其中的生物制品均经过纯化和灭活处理,不含有任何传染性和致病性成分,加之本产品不直接用于人体,因此在产品运输、使用过程中对使用者和环境没有安全隐患。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例中6种不同浓度的血清样本的线性分析图。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明,并不局限于所述最佳实施方式,不对本发明的内容和保护范围构成限制,任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品,均落在本发明的保护范围之内。
实施例中未注明具体实验步骤或条件者,按照本领域内的文献所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,
R1试剂包含:
磷酸盐缓冲液pH为7.2 40mmol/L;
聚乙二醇6000 80mmol/L;
EDTA-2Na 5mmol/L;
其溶剂为纯化水。
按上述配比准备原料,在水中加入磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R1。
R1试剂包含:
磷酸盐缓冲液pH为7.2 40mmol/L;
羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清 4ml/L;
EDTA-2Na 5mmol/L;
其溶剂为纯化水。
按上述配比准备原料,在水中加入磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R2。
分别取R1试剂和R2试剂按照体积比为2:1组成试剂盒,R1试剂和R2试剂独立放置,试剂盒规格为R1试剂为40ml/瓶,R2试剂为10ml/瓶,每个试剂盒很有R1试剂1瓶,R2试剂2瓶。
实施例2
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,
R1试剂包含:
磷酸盐缓冲液pH为7.2 50mmol/L;
聚乙二醇6000 83mmol/L;
EDTA-2Na 10mmol/L;
其溶剂为纯化水。
按上述配比准备原料,在水中加入磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R1。
R1试剂包含:
磷酸盐缓冲液pH为7.2 50mmol/L;
羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清 6ml/L;
EDTA-2Na 10mmol/L;
其溶剂为纯化水。
按上述配比准备原料,在水中加入磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R2。
分别取R1试剂和R2试剂按照体积比为2:1组成试剂盒,R1试剂和R2试剂独立放置,试剂盒规格为R1试剂为40ml/瓶,R2试剂为10ml/瓶,每个试剂盒很有R1试剂1瓶,R2试剂2瓶。
实施例3
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒,包括R1试剂和R2试剂,其中,
R1试剂包含:
磷酸盐缓冲液pH为7.2 60mmol/L;
聚乙二醇6000 90mmol/L;
EDTA-2Na 15mmol/L;
其溶剂为纯化水。
按上述配比准备原料,在水中加入磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R1。
R1试剂包含:
磷酸盐缓冲液pH为7.2 60mmol/L;
羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清 8ml/L;
EDTA-2Na 15mmol/L;
其溶剂为纯化水。
按上述配比准备原料,在水中加入磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R2。
分别取R1试剂和R2试剂按照体积比为2:1组成试剂盒,R1试剂和R2试剂独立放置,试剂盒规格为R1试剂为40ml/瓶,R2试剂为10ml/瓶,每个试剂盒很有R1试剂1瓶,R2试剂2瓶。
实施例4
一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒的使用方法。
使用迈瑞BS-800全自动生化分析仪,利用两点终点法进行测定,检测主波长为340nm。
取R1试剂200μl加入到样品管中,然后加入血清样本3μl,在37℃下孵育5分钟后加入R2试剂50μl,开始读取吸光度A1,5分钟后读取吸光度A2,根据公式△A样本=A2-A1得到△A样本的数值。
使用同样的方法测定标准液的吸光值,并得到△A标准,然后根据公式:
血清中视黄醇结合蛋白含量(mg/L)=△A样本/△A标准×标准液浓度,计算血清样品中视黄醇结合蛋白含量。
实验例
以实施例2的试剂做以下测试:
试剂空白吸光度:以生理盐水为检测样本,在340nm波长下检测其吸光度,重复两次,空白吸光度均值为1.2。
线性测试:
取视黄醇结合蛋白的含量为120mg/L的样本,用生理盐水进行系列稀释,配制6个不同浓度的样本,浓度依次为120mg/L、100mg/L、80mg/L、60mg/L、30mg/L、10mg/L,每个浓度的样本分别测定三次,取平均值,检测结果如图1和表1所示。
表1
Figure BDA0002638675650000081
Figure BDA0002638675650000091
经计算,相关系数r为0.999,Y=0.998x-0.015。
准确度测试:
对视黄醇结合蛋白的含量为30mg/L的样本进行测定,重复测定三次,测定结果分别为:29.12mg/L、28.53mg/L和30.02mg/L,均值为:29.22mg/L,相对偏差为-2.6%。
灵敏度测试:
对视黄醇结合蛋白的含量为50mg/L的样本进行测定,重复测定三次,吸光度△A分别为0.14、0.16和0.14,均大于0.05,灵敏度较高。
批内精密度测试:
用同一批次的试剂盒分别测定低值样本(视黄醇结合蛋白的含量为40mg/L)和高值样本(视黄醇结合蛋白的含量为100mg/L),重复进行10次测定,对所得的结果进行标准差SD和变异系数CV计算,结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002638675650000092
批间精密度:
用三个批号的试剂盒检测同一样本(视黄醇结合蛋白的含量为100mg/L),重复进行10次测定,对所得的结果进行标准差SD和变异系数CV计算,结果如表3所示。
表3
Figure BDA0002638675650000101
经计算,均值为100.09mg/L,标准差SD为0.44,变异系数CV为0.44%。
稳定性:
长期稳定性:将连续三批次的试剂盒在2-8℃的条件下放置14个月,分别在0个月、3个月、6个月、9个月、12个月和14个月时对同一样本进行测试(视黄醇结合蛋白的含量为50mg/L),每个样本测试5次,取平均值,测试结果如表4所示。
表4
Figure BDA0002638675650000102
开瓶稳定性:将连续三批次的试剂盒开瓶后在2-8℃的条件下放置35天,然后对同一样本进行测试(视黄醇结合蛋白的含量为50mg/L),每个样本测试5次,取平均值,测试结果分别为:50.21mg/L、49.89mg/L和50.12mg/L。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (6)

1.一种视黄醇结合蛋白检测试剂盒,其特征在于,包括R1试剂和R2试剂,其中,R1试剂包括磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000、EDTA-2Na和纯化水,R2试剂包括磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清、EDTA-2Na和纯化水。
2.根据权利要求1所述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒,其特征在于,R1试剂中磷酸盐缓冲液的含量为40-60mmol/L,聚乙二醇6000的含量为80-90mmol/L,EDTA-2Na的含量为5-15mmol/L,R2试剂中磷酸盐缓冲液的含量为40-60mmol/L,羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清的含量为4-8ml/L,EDTA-2Na的含量为5-15mmol/L。
3.根据权利要求1或2所述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒,其特征在于,R1试剂中磷酸盐缓冲液的含量为50mmol/L,聚乙二醇6000的含量为83mmol/L,EDTA-2Na的含量为10mmol/L,R2试剂中磷酸盐缓冲液的含量为50mmol/L,羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清的含量为6ml/L,EDTA-2Na的含量为10mmol/L。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒,其特征在于,磷酸盐缓冲液的pH为7.2-7.6。
5.权利要求1-4中任一项所述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
在水中加入磷酸盐缓冲液、聚乙二醇6000和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R1;
在水中加入磷酸盐缓冲液、羊抗人视黄醇结合蛋白抗血清和EDTA-2Na,搅拌均匀后通过0.22微米混合纤维素膜过滤,得到试剂R2;
将试剂R1和试剂R2按照体积比为2:1组成试剂盒。
6.权利要求1-4中任一项所述的视黄醇结合蛋白检测试剂盒或权利要求5所述的制备方法制备的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括:
将血清样本加入到试剂R1,37℃下孵育2-5分钟,然后再加入试剂R2,立即读取吸光度A1,5分钟后读取吸光度A2,得出吸光度△A样本,△A样本=A2-A1;用同样的方法测定标准液的吸光度△A标准,再通过公式(1)计算血清样本中的视黄醇结合蛋白含量:
血清中视黄醇结合蛋白含量=△A样本/△A标准×标准液浓度 (1)。
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