CN112111485B

CN112111485B - 合成dna纳米球互补链的方法、试剂盒和用途及测序方法

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Publication number: CN112111485B
Application number: CN201910533379.5A
Authority: CN
Inventors: 王卉; 徐讯; 温晴; 唐国鑫; 邢承美; 章文蔚; 徐崇钧; 陈奥; 杨晋
Original assignee: MGI Tech Co Ltd
Current assignee: MGI Tech Co Ltd
Priority date: 2019-06-19
Filing date: 2019-06-19
Publication date: 2022-03-22
Anticipated expiration: 2039-06-19
Also published as: CN112111485A

Abstract

一种合成DNA纳米球互补链的方法、试剂盒和用途及测序方法，其中合成DNA纳米球互补链的方法包括：使用一链测序引物与DNA纳米球模板链结合进行一链测序，其中一链测序引物包括修饰引物和正常引物，修饰引物的3’端包括阻断修饰使该引物无法延伸；除去阻断修饰以使改变后的修饰引物能够在聚合酶作用下在DNA纳米球模板链上延伸；将多重置换扩增引物杂交到一链测序后的DNA纳米球模板链上，进行链置换反应合成DNA纳米球模板链的互补链。该方法将特殊修饰的引物与正常一链测序引物混合，在不影响一链测序质量的情况下，使一部分杂交到DNA纳米球上的引物不能延伸，MDA之前将特殊修饰的引物上的修饰去掉，使这些引物用来合成互补链，增加DNA纳米球互补链拷贝数。

Description

合成DNA纳米球互补链的方法、试剂盒和用途及测序方法

技术领域

本发明涉及测序技术领域，具体涉及一种合成DNA纳米球互补链的方法、试剂盒和用途及测序方法。

背景技术

多重置换扩增(MDA)技术广泛用于全基因组扩增，是目前对整个基因组覆盖最广、各位点扩增偏倚最小的全基因组扩增方法。目前，该方法也被用于高通量测序领域，基于MDA原理进行DNA纳米球(DNB)互补链合成(Rongqin Ke,et.al.,US20160237488 A1)来实现对DNB双末端的测序。

在双末端测序中，完成DNB一链的测序后，需要将它的互补链产生出来，再对其互补链进行测序。因此，互补链产生得好坏对测序质量的影响很大。如图1所示，现有方法中，在进行MDA时需要同时加入标签(Barcode)引物以及插入(insert)引物，用于合成互补链。但是由于一链经过长循环(cycle)的测序后，生成的一链测序链常常会将插入(insert)引物的杂交位置占据，因此在进行MDA时，只有Barcode引物可以充分杂交到接头上，而插入(insert)引物由于一链测序链的占位导致其很难被杂交上去。扩增时常常是Barcode引物与一链测序链作为引物进行扩增。然而，由于一链测序链的置换效率偏低，影响DNB拷贝数，从而使测序信号较低。此外，一链经过长循环(cycle)测序后，一些测序酶结合在测序链上不能完全洗脱，并且带荧光阻断的dNTP切除后残留的疤痕(scar)都会影响Phi29DNA聚合酶的置换效果，从而影响DNB的拷贝数，使荧光信号偏低，同时也会影响测序质量。

发明内容

本发明提供一种合成DNA纳米球互补链的方法、试剂盒和用途及测序方法，该方法在一链测序时，将特殊修饰的引物与正常的一链测序引物混合，在不影响一链测序质量的情况下，使一部分杂交到DNA纳米球上的引物不能正常延伸，MDA之前将特殊修饰的引物上的修饰去掉，使这些引物用来合成互补链，从而增加DNA纳米球互补链拷贝数。

根据第一方面，一种实施例中提供一种合成DNA纳米球互补链的方法，该方法包括：

使用一链测序引物与DNA纳米球模板链结合进行一链测序，其中上述一链测序引物包括修饰引物和正常引物，上述修饰引物的3’端包括阻断修饰使该引物无法延伸，上述正常引物与上述模板链结合在聚合酶作用下延伸；

在上述一链测序后，除去上述阻断修饰以使改变后的修饰引物能够在聚合酶作用下在上述DNA纳米球模板链上延伸；和

将多重置换扩增引物杂交到一链测序后的DNA纳米球模板链上，在具有链置换功能的聚合酶作用下，进行链置换反应合成上述DNA纳米球模板链的互补链。

在优选实施例中，上述阻断修饰是3’末端磷酸化基团修饰。

在优选实施例中，上述除去上述阻断修饰是使用多聚核苷酸激酶去除上述3’末端磷酸化基团。

在优选实施例中，上述修饰引物的序列为5’-CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’-磷酸化修饰。

在优选实施例中，上述阻断修饰是上述修饰引物的3’端具有至少一个U碱基且该U碱基的3’端下游包括一段与上述DNA纳米球模板链错配的核苷酸序列。

在优选实施例中，上述错配的核苷酸序列的长度是3至15nt，即U碱基距离引物3’末端的长度是3至15nt，

在优选实施例中，上述错配的核苷酸序列的长度是5至10nt，即U碱基距离引物3’末端的长度是5至10nt。

在优选实施例中，上述除去上述阻断修饰是使用USER酶切除上述U碱基及其3’端下游的错配的核苷酸序列。

在优选实施例中，上述修饰引物的序列为5’-CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGAUTTACACA-3’。

在优选实施例中，上述修饰引物和正常引物的质量比是1:8～22。

在优选实施例中，上述修饰引物和正常引物的质量比是1：10～20。

在优选实施例中，在上述一链测序过程中加入带有荧光基团和/或阻断基团的碱基；上述一链测序后，切除最后一个碱基所带的荧光基团和/或阻断基团。

在优选实施例中，上述具有链置换功能的聚合酶是Phi29DNA聚合酶。

根据第二方面，一种实施例中提供一种第一方面的方法合成的DNA纳米球互补链或包含上述互补链和上述DNA纳米球的复合体。

根据第三方面，一种实施例中提供一种双末端测序方法，包括：

通过第一方面的方法合成上述DNA纳米球互补链；和

使用互补链测序引物与上述互补链杂交，进行互补链测序。

根据第四方面，一种实施例中提供一种双末端测序方法，包括：

将待测序的DNA纳米球装载到测序芯片上；和

使用第三方面的测序方法进行测序。

根据第五方面，一种实施例中提供一种合成DNA纳米球互补链的试剂盒，包括：

一链测序引物，其包括修饰引物和正常引物，其中上述修饰引物的3’端包括阻断修饰使该引物无法延伸，上述正常引物与DNA纳米球模板链结合在聚合酶作用下延伸，上述一链测序引物用于进行一链测序；

多重置换扩增引物，其包括多条引物，分别与上述DNA纳米球模板链的多个位置结合，用于杂交到一链测序后的DNA纳米球模板链上，在具有链置换功能的聚合酶作用下，进行链置换反应合成DNA纳米球模板链互补链。

在优选实施例中，上述试剂盒还包括：用于除去上述阻断修饰的试剂组分，具有链置换功能的聚合酶，以及反应缓冲液；

在优选实施例中，上述试剂组分是多聚核苷酸激酶或USER酶。

根据第六方面，一种实施例中提供第五方面的试剂盒在测序中的用途。

本发明的方法，在一链测序时，将特殊修饰的引物(例如，3’末端磷酸化基团修饰、或3’端U碱基和错配核苷酸序列)与正常的一链测序引物混合，在不影响一链测序质量的情况下，使一部分杂交到DNA纳米球上的引物不能正常延伸，在后续MDA之前将特殊修饰的引物上的修饰去掉，使这些引物用来合成互补链，增加DNA纳米球互补链拷贝数，实现增加互补链测序信号及质量的效果。

附图说明

图1为现有技术中DNB一链测序完成后通过MDA合成互补链的原理示意图；

图2为本发明实施例中DNB一链测序完成后通过MDA合成互补链的原理示意图，其中一链测序过程中包括3’末端磷酸化基团修饰的引物；

图3为本发明实施例中DNB一链测序完成后通过MDA合成互补链的原理示意图，其中一链测序过程中包括3’端包含U碱基与错配序列修饰的引物；

图4为本发明实施例1中对照组和测试组的信号值比较结果图；

图5为本发明实施例2中对照组和测试组的信号值比较结果图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。

另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。

本发明一个实施例提供一种合成DNA纳米球互补链的方法，该方法伴随DNA纳米球测序进行，在一链测序时，将特殊修饰的引物与正常的一链测序引物混合，在不影响一链测序质量的情况下，使一部分杂交到DNA纳米球上的引物不能正常延伸，在MDA之前将特殊修饰的引物上的修饰去掉，使这些引物用来合成互补链，增加DNA纳米球互补链拷贝数。

本发明实施例中，一种合成DNA纳米球互补链的方法，包括：

在本发明中，在进行一链测序时，将3’端具有阻断修饰的修饰引物掺入正常引物中，由于修饰引物3’端包括阻断修饰，该引物无法延伸，起到占位作用。在一链测序后，阻断修饰可以被去除将修饰引物的3’端释放出来成为可延伸的末端，能够在聚合酶作用下在DNA纳米球上延伸，从而形成DNA纳米球的互补链，同时多重置换扩增引物也能在DNA纳米球进行扩增反应形成DNA纳米球的互补链，因此，本发明的方法能够增加DNA纳米球互补链拷贝数。

在本发明中，有多种方式实现对修饰引物的3’端的阻断修饰。其中一种方式是3’末端磷酸化基团修饰，即修饰引物的3’末端最后一个碱基磷酸化修饰，阻止延伸反应进行。该3’末端磷酸化基团可以使用多聚核苷酸激酶(PNK)等酶去除。

如图2所示，一种合成DNA纳米球互补链的方法，包括：

使用正常的一链测序引物和3’末端磷酸化修饰的一链测序引物，与DNA纳米球模板链结合进行一链测序，其中正常的一链测序引物与模板链结合在聚合酶作用下延伸，而3’末端磷酸化修饰的一链测序引物，由于3’末端磷酸化修饰被阻断而无法延伸；

在一链测序后，使用多聚核苷酸激酶去除3’末端磷酸化修饰，改变后的修饰引物能够在聚合酶作用下在DNA纳米球模板链上延伸；和

将多重置换扩增引物(MDA引物，即图中Barcode引物)杂交到一链测序后的DNA纳米球模板链上，在具有链置换功能的聚合酶作用下，进行链置换反应合成DNA纳米球模板链的互补链。

阻断修饰的另一种方式是3’端具有至少一个U碱基且该U碱基的3’端下游包括一段与DNA纳米球错配的核苷酸序列。由于U碱基能够被USER酶等切除，因此使用USER酶切除U碱基及其3’端下游的错配的核苷酸序列以后即可将修饰引物的3’端释放出来成为可延伸的末端。在一个实施例中，错配的核苷酸序列的长度，即U碱基距离引物3’末端的长度是3至15nt，例如3nt、4nt、5nt、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt或15nt等。

如图3所示，一种合成DNA纳米球互补链的方法，包括：

使用正常的一链测序引物和修饰引物(其3’端具有一个U碱基且该U碱基的下游3’端包括一段与DNA纳米球错配的核苷酸序列)，与DNA纳米球模板链结合进行一链测序，其中正常的一链测序引物与模板链结合在聚合酶作用下延伸，而修饰引物，由于3’端包括一段与DNA纳米球错配的核苷酸序列而无法延伸；

在一链测序后，使用USER酶切除U碱基及其3’端下游的错配的核苷酸序列，改变后的修饰引物能够在聚合酶作用下在DNA纳米球模板链上延伸；和

本发明实施例中，USER酶是指尿嘧啶-特异性切除试剂，能够在尿嘧啶位置产生一个单核苷酸缺口。USER酶是尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)和DNA糖基化酶-裂解酶Endo VIII的混合物。UDG催化尿嘧啶碱基的切割，形成一个脱碱基(脱嘧啶)位点，但保持磷酸二酯骨架结构完整。Endo VIII的裂解酶活力使脱碱基位点3′和5′端的磷酸二酯键断裂，释放无碱基的脱氧核糖。可以分别从E.coli K-12菌株纯化Endo VIII和尿嘧啶DNA糖基化酶制成USER酶。该菌株的质粒上含有编码这两种酶的基因。USER酶的反应条件一般是CutSmart反应缓冲液或者TE缓冲液，一般在37℃温育。

需要说明的是，本发明中阻断修饰的方式并不限于上述两种方式，任何能够阻断引物3’端延伸并能通过一定方式去除而将引物3’端释放出来成为可延伸末端的修饰均可用于本发明中。

本发明中，所谓“修饰引物的3’端包括阻断修饰”中“3’端”，作广义的理解，即不但是指3’末端最后一个碱基，也是指靠近引物3’末端最后一个碱基的上游碱基，例如，在一些实施例中，修饰引物的阻断修饰是指3’端具有至少一个U碱基且该U碱基的3’端下游包括一段与DNA纳米球模板链错配的核苷酸序列，上述错配的核苷酸序列长度为3至15nt。此处，3’端是指U碱基距离引物3’末端(3’端最后一个碱基)为5至10nt的位置。本发明实施例中，DNA纳米球作为测序模板一般是由环状DNA通过滚环扩增得到的多拷贝串联核酸分子，可以按照本领域常用的方法制备DNA纳米球，例如可以按照Drmanac等人发明的方法合成DNA纳米球。这样的DNA纳米球通常用于一些测序平台上进行测序，例如，典型的华大基因公司的MGI、BGI测序平台等。DNA纳米球通过合适的装载方法装载在测序芯片上，即可上机测序。测序芯片以各种适合核酸固定的基底制成，这样的基底例如玻璃、陶瓷、二氧化硅、硅、金属、硅氧烷弹性体等。

本发明实施例中，“一链”也称为“第一链”，是指DNA纳米球模板链。以DNA纳米球模板链为模板、在一链测序引物的引导下，进行边合成边测序过程后得到的合成序列，被称为一链测序链。

本发明实施例中，修饰引物和正常引物可以按照任何合适的比例混合，然而在较佳的实施例中，发明人发现修饰引物和正常引物的质量比是1:8～22，例如地，上述质量比是1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:21、1:22、1:23、1:24或1:25时，能够取得较好的技术效果，即既不会影响一链测序质量，同时也能增加DNA纳米球互补链拷贝数。

需要说明的是，本发明实施例中，所谓“正常引物”是指不包括阻断修饰，能够正常地结合到DNA纳米球模板链上并在该模板链上延伸的引物。

本发明实施例中，用于多重置换扩增的具有链置换功能的聚合酶可以是任何具有这种功能的合适的酶，例如Phi29DNA聚合酶、Bst聚合酶等具有链置换能力的聚合酶。在该多重置换扩增过程中，多重置换扩增引物、去除了阻断修饰的修饰引物以及结合在DNA纳米球上的一链均作为引物引导扩增反应进行，因此，增加了DNB拷贝数，提高互补链测序信号及质量。

本发明实施例中，一链测序过程中往往引入带有荧光基团和/或阻断基团的碱基。因此，在一个优选实施例中，一链测序后，使用切除试剂切除DNA纳米球一链测序后的最后一个碱基所带的荧光基团和/或阻断基团。这些荧光基团是一链测序中的信号基团，其存在会干扰互补链测序中的荧光信号；阻断基团是阻断测序继续进行的基团，其存在使得该一链测序链在互补链合成中难以作为引导延伸的引物。使用切除试剂切除这些荧光基团和阻断基团能够避免上述问题。

在本发明的优选实施例中，在合成DNA纳米球的互补链之后，还需要用阻断试剂将互补链的末端进行阻断。

通过本发明的合成DNA纳米球互补链的方法，能够在DNA纳米球上形成可用于测序的互补链，因此，该DNA纳米球互补链或包含互补链和DNA纳米球的复合体，也在本发明的保护范围内。

本发明的另一实施例提供一种双末端测序方法，该方法包括：通过本发明的合成DNA纳米球互补链的方法来合成DNA纳米球的互补链；以及使用互补链测序引物与互补链结合，进行互补链测序。

本发明的另一实施例提供一种双末端测序方法，该方法包括：将待测序的DNA纳米球装载到测序芯片上；以及使用上述的双末端测序方法进行测序。

本发明的方法，在不影响一链测序质量的情况下，在一链测序时，将特殊修饰的引物(例如，3’末端磷酸化基团修饰、或3’端U碱基和错配核苷酸序列)与正常的一链测序引物混合，使一部分杂交到DNA纳米球上的引物不能正常延伸，在MDA之前将特殊修饰的引物上的修饰去掉，使这些引物用来合成互补链，增加DNA纳米球互补链拷贝数，实现增加互补链测序信号及质量的效果。

相应地，本发明的另一实施例提供一种合成DNA纳米球互补链的试剂盒，包括：

一链测序引物，其包括修饰引物和正常引物，其中修饰引物的3’端包括阻断修饰使该引物无法延伸，正常引物与DNA纳米球模板链结合在聚合酶作用下延伸，一链测序引物用于进行一链测序；

多重置换扩增引物，其包括多条引物，分别与DNA纳米球模板链的多个位置结合，用于杂交到一链测序后的DNA纳米球模板链上，在具有链置换功能的聚合酶作用下，进行链置换反应合成DNA纳米球模板链互补链。

在其他优选实施例中，本发明的试剂盒还包括：用于除去阻断修饰的试剂组分。例如，在修饰引物的3’末端磷酸化基团修饰的情况下，使用多聚核苷酸激酶作为用于除去阻断修饰的试剂组分；在修饰引物的3’端具有U碱基和错配核苷酸序列的情况下，使用USER酶作为用于除去阻断修饰的试剂组分。

在其他优选实施例中，本发明的试剂盒还包括：具有链置换功能的聚合酶，以及反应缓冲液。

相应地，本发明的另一实施例提供上述试剂盒在测序中的用途，特别是上述试剂盒在双末端测序中合成DNA纳米球互补链的用途。

以下通过实施例详细说明本发明的技术方案，应当理解，实施例仅是示例性的，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例中用到的引物序列如下表1所示：

表1

实施例1

本实施例，以BGISEQ500测序平台为例，使用IP-P引物作为修饰引物，展示本发明的PE100测序效果。

1)合成带修饰的一链测序引物(表1中IP-P引物)，并将其用5×SSC(柠檬酸钠缓冲液)稀释到工作液浓度1μM，如下表2所示，其中母液20×SSC需要使用H₂O进行稀释。

表2

组分	终浓度
		100μM IP-P或100μM IP1	1Μm
20×SSC	5×

2)按照IP-P:IP1＝1:20的比例混合两种引物，如下表3所示：

表3

组分	体积
		1μM IP-P	10mL
1μM IP1	200mL

3)应用DNB制备试剂盒(华大基因公司)制作DNB(DNA nano Ball，DNA纳米球)。

4)应用DNB装载试剂盒(华大基因公司)，将DNB装载到芯片表面，并将混合好的引物杂交到DNB上。

5)在BGISEQ500测序平台上先进行一链的SE100测序。

6)完成一链测序后，仍然在BGISEQ500测序平台上将最后一个循环的荧光基团和阻断基团切掉。

7)在BGISEQ500测序仪上，37℃，泵入0.1U的PNK酶混合液(如表4所示，其中，PNK酶混合液需要使用H₂O稀释为终浓度)，对3’端修饰的一链引物(IP-P)进行去磷酸化处理，时间为10min。

表4 PNK酶混合液

组分	终浓度
		10U T4PNK	0.1U
10×反应缓冲液(PH5.9)	1×

8)泵WB1清洗液(华大基因公司)清洗3次，将PNK酶洗掉。

9)杂交MDA引物(表1中MDA引物1和MDA引物2等量混合)，按照常规方法进行MDA反应。

10)对合成的互补链测序100个循环。

11)碱基调取(Basecall)分析。

结果如图4和表5所示，结果显示，IP-P与IP1混合引物按照1:20比例混合，相比对照组(无IP-P引物)，使一链信号下降约10％，但Q30及ESR没有明显差别；互补链碱基回升信号值高于对照组约20％，互补链测序Q30提升2-3％；PE100测序Q30及ESR提升2-4％。

表5

实施例2

本实施例，以BGISEQ500测序平台为例，使用IP-U引物，展示本发明的PE100测序效果。

1)合成带修饰的一链测序引物(IP-U引物)，并将其用5×SSC稀释到工作液浓度1μM，如下表6所示，其中母液20×SSC需要使用H₂O进行稀释。

表6

组分	终浓度
		100μM IP-U或100μM IP1	1μM
20×SSC	5×

2)按照IP-U:IP1＝1:20的比例混合两种引物，如下表7所示：

表7

组分	体积
		1μM IP-U	10μL
1μM IP1	200μL

3)应用DNB制备试剂盒(华大基因公司)制作DNB。

5)在BGISEQ500测序平台上先进行一链的SE100测序。

7)在BGISEQ500测序仪上，37℃，泵入0.01U的USER酶溶液(如表8所示，其中，USER酶溶液需要使用TE溶液稀释为终浓度)，对修饰的一链引物U位点进行切割，时间为20min。

表8 USER酶溶液

组分	终浓度
		10U USER(NEB公司)	0.01U

8)泵WB1清洗液(华大基因公司)清洗3次，将USER酶洗掉。

9)用0.1U PNK酶混合液(如表9所示，其中，PNK酶混合液需要使用H₂O稀释为终浓度)处理芯片10min，使USER酶处理后的引物3’端去磷酸化。

表9

组分	终浓度
		10U PNK	0.1U
10×反应缓冲液(PH5.9)	1×

10)泵WB1清洗液(华大基因公司)清洗3次，将PNK酶洗掉。

11)杂交MDA引物(表1中MDA引物1和MDA引物2等量混合)，按照常规方法进行MDA反应。

12)对合成的互补链测序100个循环。

13)碱基调取(Basecall)分析。

结果如图5和表10所示，结果显示，IP-U与IP1混合引物按照1:20比例混合，相比对照组(无IP-U引物)，使一链信号下降约10％，但Q30及ESR没有明显差别；互补链碱基回升信号值较对照组高约20％，互补链测序Q30提升约3-5％；PE100整体Q30及ESR提升约2-3％。

表10

实施例3

本实施例，以BGISEQ500测序平台为例，按照修饰引物(IP-P)与正常引物(IP1)1:10的比例，展示本发明的PE100测序效果。具体步骤参照实施例1，结果如表11所示，结果显示，按照1:10的比例进行实验，结果与1:20的比例结果接近，也能达到较好的PE100结果。

表11

实施例4

本实施例，以BGISEQ500测序平台为例，按照修饰引物(IP-P)与正常引物(IP1)1:25的比例，展示本发明的PE100测序效果。具体步骤参照实施例1，结果如表12所示，结果显示，按照1:25的比例进行实验，结果与对照组差别不大，不能达到较好的PE100结果。

表12

实施例5

本实施例，以BGISEQ500测序平台为例，按照修饰引物(IP-P)与正常引物(IP-I)1:5的比例，展示本发明的PE100测序效果。具体步骤参照实施例1，结果如表13所示，结果显示，按照1:5的比例进行实验，结果比对照组差，尤其一链质量下降较多，Q30及ESR低于对照组约5％，不能达到较好的PE100结果。

表13

以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大智造科技有限公司

<120> 合成DNA纳米球互补链的方法、试剂盒和用途及测序方法

<130> 18I27585

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac tt 42

<210> 2

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgauttaca ca 42

<210> 3

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac tt 42

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aagtcggagg ccaagcggtc ttaggaagac aa 32

<210> 5

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac tt 42

Claims

1.一种合成DNA纳米球互补链的方法，其特征在于，所述方法包括：

使用一链测序引物与DNA纳米球模板链结合进行一链测序，其中所述一链测序引物包括修饰引物和正常引物，所述修饰引物的3’端包括阻断修饰使该引物无法延伸，所述正常引物与所述模板链结合在聚合酶作用下延伸；

在所述一链测序后，除去所述阻断修饰以使改变后的修饰引物能够在聚合酶作用下在所述DNA纳米球模板链上延伸；和

将多重置换扩增引物杂交到一链测序后的DNA纳米球模板链上，在具有链置换功能的聚合酶作用下，进行链置换反应合成所述DNA纳米球模板链的互补链。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻断修饰是3’末端磷酸化基团修饰。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述除去所述阻断修饰是使用多聚核苷酸激酶去除所述3’末端磷酸化基团。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述修饰引物的序列为5’-CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’-磷酸化修饰。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述阻断修饰是所述修饰引物的3’端具有至少一个U碱基且该U碱基的3’端下游包括一段与所述DNA纳米球模板链错配的核苷酸序列。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述错配的核苷酸序列的长度是3至15nt。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述错配的核苷酸序列的长度是5至10nt。

8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述除去所述阻断修饰是使用USER酶切除所述U碱基及其3’端下游的错配的核苷酸序列。

9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述修饰引物的序列为5’-CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGAUTTACACA-3’。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述修饰引物和正常引物的质量比是1:8~22。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述修饰引物和正常引物的质量比是1:10~20。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述一链测序过程中加入带有荧光基团和/或阻断基团的碱基；所述一链测序后，切除最后一个碱基所带的荧光基团和/或阻断基团。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述具有链置换功能的聚合酶是Phi29DNA聚合酶。

14.一种双末端测序方法，其特征在于，所述方法包括：

通过权利要求1至13任一项所述的方法合成所述DNA纳米球互补链；和

使用互补链测序引物与所述互补链杂交，进行互补链测序。

15.一种双末端测序方法，其特征在于，所述方法包括：

将待测序的DNA纳米球装载到测序芯片上；和

使用权利要求14所述的测序方法进行测序。

16.一种合成DNA纳米球互补链的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：

一链测序引物，其包括修饰引物和正常引物，其中所述修饰引物的3’端包括阻断修饰使该引物无法延伸，所述正常引物与DNA纳米球模板链结合在聚合酶作用下延伸，所述一链测序引物用于进行一链测序；

多重置换扩增引物，其包括多条引物，分别与所述DNA纳米球模板链的多个位置结合，用于杂交到一链测序后的DNA纳米球模板链上，在具有链置换功能的聚合酶作用下，进行链置换反应合成DNA纳米球模板链互补链。

17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：用于除去所述阻断修饰的试剂组分，具有链置换功能的聚合酶，以及反应缓冲液。

18.根据权利要求17所述的试剂盒，其特征在于，所述用于除去所述阻断修饰的试剂组分是多聚核苷酸激酶或USER酶。

19.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述具有链置换功能的聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。

20.权利要求16至19任一项所述的试剂盒在测序中的用途。