CN112080516B - Bri1在植物免疫信号验证中的应用及方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及BRI1在植物免疫信号验证中的应用及方法。本发明首次将植物发育相关调控基因BRI1应用于植物免疫信号验证中。将免疫功能受体蛋白与受体蛋白BRI1进行重组构建得重组蛋白；该重组蛋白能够特异性结合外源的PAMPs分子并激活拟南芥发育相关报告基因的表达，通过报告基因的表达量确定待测PAMPs分子的免疫激发活性。本发明方法打破了植物免疫与发育研究的界限，通过检验油菜素内酯相关信号，实现了在多个激发子存在条件下，单一免疫信号对其受体蛋白的激活能力的定量分析，能够有效验证多抗原重组免疫蛋白中不同免疫元件的有效性，为重组免疫蛋白的作用机制研究、植物学研究提供了新的技术手段。

Description

BRI1在植物免疫信号验证中的应用及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及BRI1在植物免疫信号验证中的应用及方法。

背景技术

植物并没有动物所具有的获得性免疫系统和免疫细胞，而是利用自身的先天性免疫以抵抗病原菌的入侵。植物感知到入侵体内的病原菌后，会激发两种免疫防御系统：第一种为病原物相关分子模式触发免疫(PAMP-triggered immunity，PTI)，这种免疫系统主要依靠位于细胞膜表面的分子模式识别受体(Pattern recognition receptor，PRRs)识别病原菌的相关分子模式(Pathogen associated molecμLar pattern，PAMPs)而激发的，在PTI被触发后，植物为了阻止病原菌入侵会通过胼胝质沉积来加强细胞壁；第二种为效应子触发免疫(Effector-Triggered Immunity，ETI)，少数病原菌会释放毒性因子(VirμLenceFactors)也可称为效应子(Effector MolecμLes)到植物细胞中从而抑制PTI，这些效应子在阻碍细胞正常工作的同时也会被胞内相关抗性蛋白所识别，从而激发ETI。

现已有大量研究表明PTI在植物抗病免疫系统中更为重要，病原菌的PAMPs在病原菌入侵植物过程、破坏植物的生长发育具有明显作用。参与植物PTI免疫反应最大的PRRs家族是富亮氨酸重复序列类受体蛋白家族(LRR-RLK)，该家族蛋白通过胞外的LRR区域识别PAMPs，并通过胞内的激酶域(KD)将免疫信号转导入细胞内，从而激发植物一系列免疫反应，包括R蛋白的表达、丝裂原活化蛋白激酶的活化、活性氧的爆发、胼胝质的沉积以及胞内钙离子的升高等。这种识别作用和激活免疫反应通路作用在植物体内普遍存在，所以从生物学角度来分析LRR-RLK的识别和激活原理具有重大的研究意义。

在植物免疫信号通路、植物胁迫应答及生物农药研究领域，研究设计多抗原重组蛋白已成为该领域研究热点，但同时也是一个难点。原因在于，在多抗原重组蛋白验证过程中，不同免疫元件间往往会形成干扰，难以准确判定某一免疫元件是否具有激发子活性。这极大限制了多抗原重组蛋白在植物免疫作用机制深层次的研究。

发明内容

本发明主要目的是提供一种植物免疫信号验证方法，实现在多个激发子存在条件下，单一免疫信号对其受体蛋白的激活能力的定量分析，进而能够有效验证多抗原重组免疫蛋白中不同免疫元件的有效性。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

首先，本发明提供BRI1基因在植物免疫信号验证中的应用。

优选地，编码BRI1中胞内激酶域的基因片段在植物免疫信号验证中的应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

其次，本发明提供了一种植物免疫信号验证方法，所述方法包括：构建含免疫功能受体蛋白编码基因与受体蛋白BRI1编码基因的重组表达载体，并在原生质体中表达，得到含免疫功能受体蛋白和受体蛋白BRI1的重组蛋白；该重组蛋白能够特异性结合外源的PAMPs分子并激活植物发育相关报告基因的表达，通过报告基因的表达量确定待测PAMPs分子的免疫激发活性。该系统可以在多个激发子存在条件下，实现对特定PAMP分子激活植物免疫能力的定量分析。

优选地，所述报告基因表达量的确定方法为：构建含报告基因的启动子序列和荧光素酶基因的重组表达载体，将该重组表达载体与含免疫功能受体蛋白编码基因与受体蛋白BRI1编码基因的重组表达载体共同转入原生质体细胞中，通过对荧光素酶的定量检测确定报告基因的表达量。

优选地，所述报告基因为植物发育相关的油菜素内酯信号，所述油菜素内酯信号基因包括TCH4、SAUR9、XTH3、MIOX2。进一步优选地，所述报告基因为TCH4。

优选地，以上所述植物免疫信号验证方法，具体步骤包括：

(一)目的片段的扩增

根据cDNA文库，扩增如SEQ ID NO：1所示的编码BRI1胞内激酶域的基因核苷酸序列，得到BRI1KD片段；扩增得到如SEQ ID NO：2所示的编码FLS2胞外富亮氨酸结构域和跨膜域基因的核苷酸序列，得到的基因片段命名为FLS2NT；

(二)重组载体的构建

(1)背景载体的构建：分别将BRI1KD片段和HBT-GFP载体分别进行KpnI和SpeI进行双酶切后采用T₄DNA连接酶进行连接，得到重组载体HBT-BRI1KD-GFP，该载体为进一步进行分子改造的背景载体，并制备转化子和提取重组质粒HBT-BRI1KD-GFP；

(2)重组蛋白表达载体的构建：将HBT-BRI1KD-GFP背景载体进行BamHI和KpnI双酶切，将FLS2NT片段和酶切后的HBT-BRI1KD-GFP重组载体采用infusion重组酶进行连接，得到重组载体HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP；

(3)检测报告基因载体的构建：报告基因载体是将TCH4基因(AT5G57560)的启动子序列TCH4_PRO和荧光素酶基因(Luciferase)同时构建在HBT95瞬时表达载体上，构成TCH4_PRO::Luciferase瞬时表达载体；

(三)拟南芥原生质体转化

将重组蛋白表达载体HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP和TCH4_PRO::Luciferaset通过PEG介导法瞬时转化拟南芥原生质体；

(四)用相应PAMP处理后，检测报告基因表达量

加入外源PAMP分子，PAMP分子被免疫识别受体的LRR区域捕捉时会通过BRI1KD启动下游TCH4基因启动子，从而启动荧光素酶蛋白，通过双荧光素酶报告系统对基因表达量进行验证。

本发明还提供一种重组蛋白，所述重组蛋白含有免疫功能受体蛋白的胞外富域和跨膜域，以及BRI1的胞内激酶域。

优选地，所述重组蛋白含有FLS2的胞外域和跨膜域，以及BRI1的胞内激酶域，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明还提供一种重组表达载体，将SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列片段和HBT-GFP载体分别进行KpnI和SpeI双酶切后连接得到的表达载体，以及经进一步BamHI和KpnI酶切后，和SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列片段进行Infusion无缝连接反应连接得到的重组表达载体；

优选地，所述重组表达载体的宿主细胞可为大肠杆菌细胞，植物原生质体细胞；进一步优选地，所述植物原生质体细胞为拟南芥原生质体细胞；所述大肠杆菌细胞包括大肠杆菌E.coil DH5α和BL21细胞。

本发明还提供包含以上所述重组蛋白或重组表达载体的重组细胞。

最后，本发明还提供以上所述重组蛋白、重组表达载体、重组细胞在植物免疫信号验证中的应用。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果：

本发明首次将植物发育相关调控基因BRI1应用于植物免疫信号验证中。其与编码免疫功能相关受体蛋白基因融合表达后，可通过检验发育相关的油菜素内酯信号，实现对免疫受体蛋白激活能力的验证。如重组受体FLS2NT-BRI1KD-GFP能正常定位在细胞膜上并通过绑定flg22激活BRI1下游的发育相关基因TCH4，通过检验TCH4的表达量即可有效判定FLS2NT是否具有激发活性。

本发明方法打破了植物免疫与发育研究的界限，通过检验发育相关的油菜素内酯相关信号，实现了在多抗原条件下，单一免疫信号对其受体蛋白的激活能力分析，能够有效验证多抗原重组蛋白中不同免疫元件的有效性，为重组蛋白的作用机制研究、植物学研究提供了新的技术手段。其次，本发明方法在原生质体中表达重组蛋白，该重组蛋白可以来源于不同的植物中。因此，运用该方法可以检测某些植物物种特有的免疫效应。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为BRI1KD基因的PCR扩增琼脂凝胶电泳图；

图2为HBT-BRI1KD-GFP重组载体的菌落PCR琼脂凝胶电泳图；

图3为FLS2NT基因的PCR扩增琼脂凝胶电泳图；

图4为HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP重组载体的菌落PCR琼脂凝胶电泳图；

图5为原生质体荧光观察图：A为白光观察图，B为绿色荧光观察图；

图6为TCH4基因的表达量对比图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。

实施例1分子克隆实验

1.BRI1KD的PCR扩增

以本实验室保存的拟南芥基因组DNA为模板，根据载体HBT-GFP特性，选择限制性内切酶KpnI/SpeI，设计BRI1KD克隆引物如表1所示，反应体系如表2所示。PCR扩增反应条件如表3所示，最终产物置于4℃保存。

表1 PCR反应引物信息

表2 PCR反应体系

表3 PCR扩增反应条件

PCR产物纯化，PCR产物纯化采用北京天根有限公司试剂盒进行。

2.T₄DNA连接酶连接反应

连接体系如表4，反应步骤如下：

(1)将表4内反应试剂按照表格从上到下的顺序加入到0.2ml离心管内中，其中目的片段和载体片段的物质的量比例为(3:1)，轻微震荡再离心。

(2)将离心管置于16℃金属浴中，反应60min。

(3)连接反应后的反应液用于转化大肠杆菌DH5a。

表4连接体系

3.重组质粒鉴定

挑取过夜培养的单菌落，以转入HBT-BRI1KD-GFP重组载体的大肠杆菌为模板，用载体上的正反向引物Bri1-KpnI和Bri1-SpeI(表1)进行菌落PCR反应，具体反应体系如表5所示。PCR扩增反应条件如表6所示，最终产物置于4℃保存。

表5HBT-BRI1KD-GFP菌落PCR体系

表6 PCR扩增反应条件

将阳性菌落接种到10mL SOC液体培养基中，于37℃摇床培养12h后利用质粒小提试剂盒提取质粒；将质粒送去测序分析测序结果，判断重组质粒是否构建成功。

4.限制性内切酶双酶切背景质粒HBT-BRI1KD-GFP反应

提取经测序鉴定的菌液用TRANGEN质粒小提试剂盒进行质粒提取，选择限制性内切酶KpnI/SpeI将背景质粒HBT-BRI1KD-GFP进行双酶切反应，反应体系如表7，实验步骤同上述双酶切步骤一致。

表7HBT-BRI1KD-GFP背景质粒的双酶切体系

5.FLS2NT的PCR扩增

以本实验室保存的FLS2基因为模板，根据infusion反应特征设计正反向引物FLS2IN-F和FLS2IN-R如表8所示，具体反应体系如表9所示。PCR扩增反应条件如表10所示，最终产物置于4℃保存。

表8 PCR反应引物信息

表9 PCR反应体系

表10 PCR扩增反应条件

6.Infusion无缝连接反应

将单酶切后的载体HBT-BRI1KD-GFP与受体FLS2NT基因连接，在冰水浴中条件下在200μL离心管中依次加入反应物以配制成反应体系，短暂离心使各反应物均沉入管底。反应体系如表11所示。最适的线性化载体与插入片段量可由以下公式粗略计算获得：最适克隆载体使用量＝[0.02×克隆载体碱基对数]ng(0.03pmol/L)最适插入片段使用量＝[0.04×插入片段碱基对数]ng(0.06pmol/L)。

表11 Infusion无缝连接体系

7.重组质粒鉴定

挑取过夜培养的单菌落，以转入HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP重组载体的大肠杆菌为模板，用载体上的正反向引物FLS2IN-F和FLS2IN-R(表9)进行菌落PCR反应，具体反应体系如表12所示。PCR扩增反应条件如表13所示，最终产物置于4℃保存。

表12菌落PCR体系

表13 PCR扩增反应条件

将阳性菌落接种到10mL SOC液体培养基中，于37℃摇床培养12h后利用质粒小提试剂盒提取质粒；将质粒送去测序分析测序结果，判断重组质粒是否构建成功。

实施例2原生质体转化实验

1.拟南芥叶肉细胞原生质体的制备

拟南芥叶肉细胞原生质体制备具体操作如下：

(1)配置原生质体酶解液，用2.2μm的滤头过滤后备用；

(2)以在人工气候内培养4周的col-0野生型拟南芥叶片为材料，去除叶片首尾后，将叶片切成0.5～1mm细丝；

(3)将切成的细丝的叶片迅速浸入酶解液中；

(4)在23℃培养条件下，避光酶解叶片4h；

(5)待叶片裂解完全后，向裂解液中加入等体积W5，将加入W5的酶解液用纱布过滤至50mL离心管中，80rcf/min水平离心2min；

(6)用真空泵抽走上清，向原生质体细胞中加入10mL W5重悬细胞；

(7)将重悬细胞置于冰上静置30min，沉降原生质体细胞，待细胞完全沉降后抽去上清；

(8)用MMG调整原生质体细胞浓度至2×10⁵个/mL，将调整好浓度的原生质体保存至冰上待转化质粒。

2.拟南芥叶肉细胞原生质体的转化

以PEG-Ca介导法将植物瞬时表达载体转化入制备好的拟南芥叶肉细胞原生质体中，具体操作步骤如下：

(1)将待转化质粒按体系加入2mL圆底EP管管底中，轻柔摇匀制备好的原生质体细胞后，用1000μL移液枪吸取100μL原生质体细胞加入转化体系中，轻柔摇匀后加入110μLPEG-Ca轻柔振荡摇匀后静置6min；

(2)6min后向转化体系中加入440μLW5溶液，终止转化反应；

(3)终止转化反应后，80rcf/min水平离心2min，用真空泵吸去上层转液。加入60μLW5与WI混合液(W5:WI＝15:1)；

(4)向将转化完成的原生质体细胞中分别加入flg22和本实验室保存的多抗原重组蛋白MP7

(5)放入光照培养箱在22℃，2000Lx培养12h。

3.LUC酶活定量分析

将培养12h的原生质体细胞，用Promega LUC酶活检测试剂盒检测LUC的酶活性，具体操作步骤如下：

(1)将培养12h的原生质体80rcf/min水平离心2min，真空泵吸取上层原生质体培养液后迅速放入液氮中速冻，随后可存于-80℃冰箱保存；

(2)取出-80℃保存的原生质体细胞，加入50μL原生质体裂解液，用匀浆机振荡以充分裂解原生质体细胞；

(3)取5μL原生质体裂解液加入96孔酶标板中，随后加入100μL LUC底物工作液，立即用酶标仪检测LUC的活性；

(4)取2μL原生质体裂解液加入96孔酶标版中，加入25μL MΜG工作液，37℃避光保存30min，随后加入225μL 0.2mol/L Na₂CO₃溶液终止反应，立即用酶标仪检测葡糖苷酸酶(β-glucuronidase，MΜG)的活性。

(5)TCH₄基因表达量＝LUC/GUS*1000

结果与分析

1.BRI1KD的PCR扩增

取2μL 6xLoading Buffer加入到2μLBRI1KD基因PCR扩增反应后的反应液中，轻微震荡混匀后加入到1％琼脂糖凝胶的点样孔中，电泳条件为20min130V，将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中拍照观察，可观察到结果如图1所示，左侧为2000bp MAKER，右侧为BRI1KD基因PCR扩增产物，可明显的观察到右侧在1200bp的位置上有一条高亮的DNA条带，与BRI1KD基因的条带大小1216bp基本一致，图中也不存在弥散和其他条带，因此可以认为BRI1KD基因的PCR扩增实验成功。

2.HBT-BRI1KD-GFP重组载体的构建

挑取转入重组载体后培养的菌落进行菌落PCR阳性鉴定，以琼脂糖凝胶电泳方法进行结果验证，反应步骤与上述一致，可观察到结果如图2所示，左侧为2000bp MAKER，右侧为HBT-BRI1KD-GFP重组载体菌落PCR扩增产物，可明显的观察到右侧在1200bp的位置上有一条高亮的DNA条带，与BRI1KD基因的条带大小1216bp基本一致，图中不存在其他条带，为了保证实验结果的准确性，将稀释菌液送至阅微基因科技有限公司进行基因测序，结果与菌落PCR鉴定一致，说明HBT-BRI1KD-GFP重组载体构建成功。

3.FLS2NT的PCR扩增

取2μL 6xLoading Buffer加入到2μLFLS2NT的PCR扩增反应后的反应液中，轻微震荡混匀后加入到1％琼脂糖凝胶的点样孔中，电泳条件为20min130V，将电泳后的琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪中拍照观察，可观察到结果如图3所示，左侧为5000bpMAKER，最右侧为FLS2NT基因的PCR扩增产物，可明显的观察到右侧在2400bp的位置上有一条高亮的DNA条带，与FLS2NT基因的条带大小2418bp基本一致，图中也不存在弥散和其他条带，因此可以认为FLS2NT基因的PCR扩增实验成功。

4.HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP重组载体的构建

挑取转入重组载体后培养的菌落进行菌落PCR阳性鉴定，以琼脂糖凝胶电泳方法进行结果验证，反应步骤与上述一致，可观察到结果如图4所示，左侧为5000bp MAKER，右侧为HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP重组载体菌落PCR扩增产物，可明显的观察到右侧在2400bp的位置上有一条高亮的DNA条带，与FLS2NT基因的条带大小2418bp基本一致，图中也不存在弥散和其他条带，为了保证实验结果的准确性，将稀释菌液送至阅微基因科技有限公司进行基因测序，结果与菌落PCR鉴定一致，说明HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP重组载体构建成功。

5.HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP重组质粒可在原生质体细胞中高效表达

本发明采用植物原生质体瞬时转化系统，检测经重组载体HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP处理后拟南芥叶片原生质体中抗病基因TCH4的表达情况。重组蛋白含有GFP标签，能够在激发光下发出绿色荧光，因此可以通过在荧光显微镜下观察绿色荧光信号的表达情况，检测原生质体的转化效率(图5)：由图可见，转化后的原生质细胞中产生明显的绿色荧光(图5B中出现绿色荧光)，计算多个视野中具有荧光的细胞占总的细胞数量的比例，计算出原生质体转化效率约为70％，说明本研究中原生质体瞬时转化成功，目的质粒可在原生质体细胞中高效表达。

6.多抗原重组蛋白PR164E的免疫活性鉴定

将HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP重组载体和报告基因载体TCH4::Luciferase，内参载体UBQ::GUS同时转入拟南芥原生质体中，加入flg22和本实验室保存的多抗原重组蛋白MP7，以H₂O为空白对照。通过酶标仪检测萤光素酶(Luciferase，Luc)和葡糖苷酸酶(Glucuronidase，GUS)的活性，并计算TCH4基因的表达强度(图6)。实验结果表明，重组蛋白FLS2NT-BRI1KD-GFP可针对性与flg22结合并激发BRI1下游的发育相关报告基因TCH4的表达，而不受其他的因素的干扰。同时，多抗原重组蛋白MP7同样能够经过重组受体FLS2NT-BRI1KD-GFP激活告基因TCH4的表达，中flg22免疫表位具有与寡聚肽flg22等同的激发子活性。

本发明建立了通过植物发育相关基因表达验证植物免疫激发子活性的方法。将膜受体蛋白FLS2的胞外富亮氨酸结构域(FLS2NT)与共受体蛋白BRI1的胞内激酶域和跨膜域(BRI1KD)重组连接，构建重组载体HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP并在拟南芥原生质体中瞬时表达。经flg22刺激后，以表达量差异较高的TCH4作为报告基因，验证了多抗原重组蛋白MP7(含有7个不同的免疫表位)中flg22免疫表位的激发子活性。实验结果表明，MP7中的flg22免疫表位，能够与FLS2NT-BRI1KD-GFP重组蛋白结合，并激活TCH4基因表达。该方法实现了在多抗原条件下，单一免疫信号对其受体蛋白的激活能力分析，为植物学研究提供了新的技术手段。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 四川农业大学

<120> BRI1在植物免疫信号验证中的应用及方法

<130>

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1212

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

gctggtagtg tggcgatggg attgttgttc tcttttgtgt gtatatttgg gctgatcctt 60

gttggtagag agatgaggaa gagacggaga aagaaagagg cggagttgga gatgtatgcg 120

gaaggacatg gaaactctgg cgatagaact gctaacaaca ccaattggaa gctgactggt 180

gtgaaagaag ccttgagtat caatcttgct gctttcgaga agccattgcg gaagctcacg 240

tttgcggatc ttcttcaggc taccaatggt ttccataatg atagtctgat tggttctggt 300

gggtttggag atgtttacaa agcgattttg aaagatggaa gcgcggtggc tatcaagaaa 360

ctgattcatg ttagcggtca aggtgataga gagttcatgg cggagatgga aaccattggg 420

aagatcaaac atcgaaatct tgtgcctctt cttggttatt gcaaagttgg agacgagcgg 480

cttcttgtgt atgagtttat gaagtatgga agtttagaag atgttttgca cgaccccaag 540

aaagctgggg tgaaactaaa ctggtccaca cggcggaaga ttgcgatagg atcagctaga 600

gggcttgctt tccttcacca caactgcagt ccgcatatca tccacagaga catgaaatcc 660

agtaatgtgt tgcttgatga gaatttggaa gctcgggttt cagattttgg catggcgagg 720

ctgatgagtg cgatggatac gcatttaagc gtcagtacat tagctggtac accgggttac 780

gttcctccag agtattacca aagtttcagg tgttcaacaa aaggagacgt ttatagttac 840

ggtgtggtct tactcgagct actcacgggt aaacggccaa cggattcacc ggattttgga 900

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gaccccgagc ttatgaagga agatccagca ttagagatcg aacttttaca acatttaaaa 1020

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gccatgttta aggagataca agccgggtca gggatagatt cacagtcaac gatcagatca 1140

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<211> 2418

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gggcttctta caaaccttcg gaacctttca gcgcacgaca atcttcttac cggaccaata 1200

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ctcaacacat tcgatatctc cgacaatctt ctcactggaa ccatccctgg agagctgtta 1860

gcttctttga aaaacatgca gctttacctc aacttctcaa acaacttgtt gactggaacc 1920

atcccaaagg agcttggaaa gcttgaaatg gttcaagaaa tcgacctttc aaacaatctc 1980

ttttctgggt ctattccaag atctttacag gcctgcaaaa atgtgttcac actggatttt 2040

tcgcagaaca atctctcggg tcatatacca gatgaagtct tccaaggcat ggatatgatc 2100

ataagcttga acctttcaag gaacagtttc tctggagaaa tccctcagag cttcgggaac 2160

atgacgcatt tggtctcctt ggatctctct agtaacaatc tcactggtga aattccagag 2220

agtctcgcca atctttcgac tctgaaacat ctcaaactag cttcaaacaa cctcaaaggc 2280

catgttcctg aatccggggt gttcaaaaac atcaacgcct ctgatctaat gggaaacaca 2340

gatctctgtg gtagcaagaa gcctctcaag ccatgtacga tcaagcagaa gtcgagccac 2400

ttctcgaaga gaaccaga 2418

<210> 3

<211> 4359

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

atgaagttac tctcaaagac ctttttgata ttaactctca ccttcttctt ctttggcatt 60

gcactagcga aacagagctt tgaaccagag atcgaagctt tgaaatcctt caagaatggt 120

atttccaacg accctttagg agtattatca gattggacca tcatcggttc gttacgacac 180

tgtaattgga ccggaatcac ctgcgatagt accggacatg tagtctcggt ttccttgctg 240

gagaagcaac ttgaaggtgt tctgtctcca gccatagcga atctcaccta tctccaggtt 300

cttgatctca cttcaaatag ttttaccggc aaaataccgg ctgaaatagg aaagttaacc 360

gagcttaacc agcttattct gtacctaaac tatttctctg gttcgattcc ttctggaatc 420

tgggagctta agaatatttt ctatcttgat cttagaaata atttgttgtc cggtgatgtt 480

cctgaggaaa tctgcaaaac cagttctttg gtattgattg ggtttgatta caacaactta 540

accgggaaaa taccagaatg cttaggagat ttggttcatc tccaaatgtt tgtagcagct 600

ggtaaccatt taactggttc gattccggta tcaattggta ctctggctaa tttaacggat 660

ttagacctga gtggtaacca gttaaccgga aaaataccga gagattttgg aaatctcttg 720

aacttacagt ctctcgtttt aactgaaaac ttgttggaag gagatatacc agctgagatc 780

ggaaactgct cgagcttggt ccaacttgag ctttacgata accagttaac cgggaaaata 840

ccagctgaat tagggaattt ggttcagctg caagcactcc ggatatacaa gaacaaactt 900

acttcttcaa ttccatcttc attgttccgg ttaactcagt taacccattt ggggttatca 960

gaaaaccatt tggttggacc gatatcagaa gaaatcggtt ttcttgagtc acttgaagtc 1020

ctcacacttc attccaacaa cttcacagga gagtttccac agtccatcac aaacttgagg 1080

aacttgacag tcctaacggt ggggttcaat aatatttccg gtgagctccc ggcggatcta 1140

gggcttctta caaaccttcg gaacctttca gcgcacgaca atcttcttac cggaccaata 1200

ccttccagca taagtaactg caccggtctt aaactcctgg acctgtctca caaccaaatg 1260

actggcgaga tcccgcgggg tttcggaagg atgaatctta cgttcatttc tattgggagg 1320

aatcatttca ccggtgaaat tccagatgat atcttcaact gttcaaactt ggaaactctt 1380

agtgtggcag ataacaactt aacaggaact ctcaagccat taattgggaa gcttcaaaaa 1440

ctcaggattt tgcaagtttc atataactct ctcactggac cgattcctcg agaaatcggg 1500

aatctgaaag atttgaatat cttgtacctt cactctaatg gtttcacagg gagaatcccg 1560

agagagatgt cgaatctcac tctcctccag gggctaagga tgtattcaaa tgatcttgaa 1620

ggtccaattc ctgaagaaat gtttgatatg aagctactct cagttcttga tctttccaac 1680

aacaaattct caggtcaaat tcctgccttg ttctccaagc ttgaatcgct tacctacttg 1740

agtcttcaag gaaacaaatt caacgggtct atccctgcaa gccttaagtc gctttcgctt 1800

ctcaacacat tcgatatctc cgacaatctt ctcactggaa ccatccctgg agagctgtta 1860

gcttctttga aaaacatgca gctttacctc aacttctcaa acaacttgtt gactggaacc 1920

atcccaaagg agcttggaaa gcttgaaatg gttcaagaaa tcgacctttc aaacaatctc 1980

ttttctgggt ctattccaag atctttacag gcctgcaaaa atgtgttcac actggatttt 2040

tcgcagaaca atctctcggg tcatatacca gatgaagtct tccaaggcat ggatatgatc 2100

ataagcttga acctttcaag gaacagtttc tctggagaaa tccctcagag cttcgggaac 2160

atgacgcatt tggtctcctt ggatctctct agtaacaatc tcactggtga aattccagag 2220

agtctcgcca atctttcgac tctgaaacat ctcaaactag cttcaaacaa cctcaaaggc 2280

catgttcctg aatccggggt gttcaaaaac atcaacgcct ctgatctaat gggaaacaca 2340

gatctctgtg gtagcaagaa gcctctcaag ccatgtacga tcaagcagaa gtcgagccac 2400

ttctcgaaga gaaccagagg taccgctggt agtgtggcga tgggattgtt gttctctttt 2460

gtgtgtatat ttgggctgat ccttgttggt agagagatga ggaagagacg gagaaagaaa 2520

gaggcggagt tggagatgta tgcggaagga catggaaact ctggcgatag aactgctaac 2580

aacaccaatt ggaagctgac tggtgtgaaa gaagccttga gtatcaatct tgctgctttc 2640

gagaagccat tgcggaagct cacgtttgcg gatcttcttc aggctaccaa tggtttccat 2700

aatgatagtc tgattggttc tggtgggttt ggagatgttt acaaagcgat tttgaaagat 2760

ggaagcgcgg tggctatcaa gaaactgatt catgttagcg gtcaaggtga tagagagttc 2820

atggcggaga tggaaaccat tgggaagatc aaacatcgaa atcttgtgcc tcttcttggt 2880

tattgcaaag ttggagacga gcggcttctt gtgtatgagt ttatgaagta tggaagttta 2940

gaagatgttt tgcacgaccc caagaaagct ggggtgaaac taaactggtc cacacggcgg 3000

aagattgcga taggatcagc tagagggctt gctttccttc accacaactg cagtccgcat 3060

atcatccaca gagacatgaa atccagtaat gtgttgcttg atgagaattt ggaagctcgg 3120

gtttcagatt ttggcatggc gaggctgatg agtgcgatgg atacgcattt aagcgtcagt 3180

acattagctg gtacaccggg ttacgttcct ccagagtatt accaaagttt caggtgttca 3240

acaaaaggag acgtttatag ttacggtgtg gtcttactcg agctactcac gggtaaacgg 3300

ccaacggatt caccggattt tggagataac aaccttgttg gatgggtgaa acagcacgca 3360

aaactgcgga ttagcgatgt gtttgacccc gagcttatga aggaagatcc agcattagag 3420

atcgaacttt tacaacattt aaaagttgcg gttgcgtgtt tggatgatcg ggcttggaga 3480

cgaccgacaa tggtacaagt catggccatg tttaaggaga tacaagccgg gtcagggata 3540

gattcacagt caacgatcag atcaatagag gatggagggt tcagtacaat agagatggtt 3600

gatatgagta taaaagaagt tcctgaagga aaattaacta gtatggtgag caagggcgag 3660

gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 3720

aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 3780

ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccttcacc 3840

tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 3900

tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 3960

tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 4020

aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 4080

aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 4140

aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 4200

acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 4260

gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 4320

gccgccggga tcactcacgg catggacgag ctgtacaag 4359

<210> 4

<211> 1453

<212> PRT

<213> 人工合成序列

<400> 4

Met Lys Leu Leu Ser Lys Thr Phe Leu Ile Leu Thr Leu Thr Phe Phe

1 5 10 15

Phe Phe Gly Ile Ala Leu Ala Lys Gln Ser Phe Glu Pro Glu Ile Glu

20 25 30

Ala Leu Lys Ser Phe Lys Asn Gly Ile Ser Asn Asp Pro Leu Gly Val

35 40 45

Leu Ser Asp Trp Thr Ile Ile Gly Ser Leu Arg His Cys Asn Trp Thr

50 55 60

Gly Ile Thr Cys Asp Ser Thr Gly His Val Val Ser Val Ser Leu Leu

65 70 75 80

Glu Lys Gln Leu Glu Gly Val Leu Ser Pro Ala Ile Ala Asn Leu Thr

85 90 95

Tyr Leu Gln Val Leu Asp Leu Thr Ser Asn Ser Phe Thr Gly Lys Ile

100 105 110

Pro Ala Glu Ile Gly Lys Leu Thr Glu Leu Asn Gln Leu Ile Leu Tyr

115 120 125

Leu Asn Tyr Phe Ser Gly Ser Ile Pro Ser Gly Ile Trp Glu Leu Lys

130 135 140

Asn Ile Phe Tyr Leu Asp Leu Arg Asn Asn Leu Leu Ser Gly Asp Val

145 150 155 160

Pro Glu Glu Ile Cys Lys Thr Ser Ser Leu Val Leu Ile Gly Phe Asp

165 170 175

Tyr Asn Asn Leu Thr Gly Lys Ile Pro Glu Cys Leu Gly Asp Leu Val

180 185 190

His Leu Gln Met Phe Val Ala Ala Gly Asn His Leu Thr Gly Ser Ile

195 200 205

Pro Val Ser Ile Gly Thr Leu Ala Asn Leu Thr Asp Leu Asp Leu Ser

210 215 220

Gly Asn Gln Leu Thr Gly Lys Ile Pro Arg Asp Phe Gly Asn Leu Leu

225 230 235 240

Asn Leu Gln Ser Leu Val Leu Thr Glu Asn Leu Leu Glu Gly Asp Ile

245 250 255

Pro Ala Glu Ile Gly Asn Cys Ser Ser Leu Val Gln Leu Glu Leu Tyr

260 265 270

Asp Asn Gln Leu Thr Gly Lys Ile Pro Ala Glu Leu Gly Asn Leu Val

275 280 285

Gln Leu Gln Ala Leu Arg Ile Tyr Lys Asn Lys Leu Thr Ser Ser Ile

290 295 300

Pro Ser Ser Leu Phe Arg Leu Thr Gln Leu Thr His Leu Gly Leu Ser

305 310 315 320

Glu Asn His Leu Val Gly Pro Ile Ser Glu Glu Ile Gly Phe Leu Glu

325 330 335

Ser Leu Glu Val Leu Thr Leu His Ser Asn Asn Phe Thr Gly Glu Phe

340 345 350

Pro Gln Ser Ile Thr Asn Leu Arg Asn Leu Thr Val Leu Thr Val Gly

355 360 365

Phe Asn Asn Ile Ser Gly Glu Leu Pro Ala Asp Leu Gly Leu Leu Thr

370 375 380

Asn Leu Arg Asn Leu Ser Ala His Asp Asn Leu Leu Thr Gly Pro Ile

385 390 395 400

Pro Ser Ser Ile Ser Asn Cys Thr Gly Leu Lys Leu Leu Asp Leu Ser

405 410 415

His Asn Gln Met Thr Gly Glu Ile Pro Arg Gly Phe Gly Arg Met Asn

420 425 430

Leu Thr Phe Ile Ser Ile Gly Arg Asn His Phe Thr Gly Glu Ile Pro

435 440 445

Asp Asp Ile Phe Asn Cys Ser Asn Leu Glu Thr Leu Ser Val Ala Asp

450 455 460

Asn Asn Leu Thr Gly Thr Leu Lys Pro Leu Ile Gly Lys Leu Gln Lys

465 470 475 480

Leu Arg Ile Leu Gln Val Ser Tyr Asn Ser Leu Thr Gly Pro Ile Pro

485 490 495

Arg Glu Ile Gly Asn Leu Lys Asp Leu Asn Ile Leu Tyr Leu His Ser

500 505 510

Asn Gly Phe Thr Gly Arg Ile Pro Arg Glu Met Ser Asn Leu Thr Leu

515 520 525

Leu Gln Gly Leu Arg Met Tyr Ser Asn Asp Leu Glu Gly Pro Ile Pro

530 535 540

Glu Glu Met Phe Asp Met Lys Leu Leu Ser Val Leu Asp Leu Ser Asn

545 550 555 560

Asn Lys Phe Ser Gly Gln Ile Pro Ala Leu Phe Ser Lys Leu Glu Ser

565 570 575

Leu Thr Tyr Leu Ser Leu Gln Gly Asn Lys Phe Asn Gly Ser Ile Pro

580 585 590

Ala Ser Leu Lys Ser Leu Ser Leu Leu Asn Thr Phe Asp Ile Ser Asp

595 600 605

Asn Leu Leu Thr Gly Thr Ile Pro Gly Glu Leu Leu Ala Ser Leu Lys

610 615 620

Asn Met Gln Leu Tyr Leu Asn Phe Ser Asn Asn Leu Leu Thr Gly Thr

625 630 635 640

Ile Pro Lys Glu Leu Gly Lys Leu Glu Met Val Gln Glu Ile Asp Leu

645 650 655

Ser Asn Asn Leu Phe Ser Gly Ser Ile Pro Arg Ser Leu Gln Ala Cys

660 665 670

Lys Asn Val Phe Thr Leu Asp Phe Ser Gln Asn Asn Leu Ser Gly His

675 680 685

Ile Pro Asp Glu Val Phe Gln Gly Met Asp Met Ile Ile Ser Leu Asn

690 695 700

Leu Ser Arg Asn Ser Phe Ser Gly Glu Ile Pro Gln Ser Phe Gly Asn

705 710 715 720

Met Thr His Leu Val Ser Leu Asp Leu Ser Ser Asn Asn Leu Thr Gly

725 730 735

Glu Ile Pro Glu Ser Leu Ala Asn Leu Ser Thr Leu Lys His Leu Lys

740 745 750

Leu Ala Ser Asn Asn Leu Lys Gly His Val Pro Glu Ser Gly Val Phe

755 760 765

Lys Asn Ile Asn Ala Ser Asp Leu Met Gly Asn Thr Asp Leu Cys Gly

770 775 780

Ser Lys Lys Pro Leu Lys Pro Cys Thr Ile Lys Gln Lys Ser Ser His

785 790 795 800

Phe Ser Lys Arg Thr Arg Gly Thr Ala Gly Ser Val Ala Met Gly Leu

805 810 815

Leu Phe Ser Phe Val Cys Ile Phe Gly Leu Ile Leu Val Gly Arg Glu

820 825 830

Met Arg Lys Arg Arg Arg Lys Lys Glu Ala Glu Leu Glu Met Tyr Ala

835 840 845

Glu Gly His Gly Asn Ser Gly Asp Arg Thr Ala Asn Asn Thr Asn Trp

850 855 860

Lys Leu Thr Gly Val Lys Glu Ala Leu Ser Ile Asn Leu Ala Ala Phe

865 870 875 880

Glu Lys Pro Leu Arg Lys Leu Thr Phe Ala Asp Leu Leu Gln Ala Thr

885 890 895

Asn Gly Phe His Asn Asp Ser Leu Ile Gly Ser Gly Gly Phe Gly Asp

900 905 910

Val Tyr Lys Ala Ile Leu Lys Asp Gly Ser Ala Val Ala Ile Lys Lys

915 920 925

Leu Ile His Val Ser Gly Gln Gly Asp Arg Glu Phe Met Ala Glu Met

930 935 940

Glu Thr Ile Gly Lys Ile Lys His Arg Asn Leu Val Pro Leu Leu Gly

945 950 955 960

Tyr Cys Lys Val Gly Asp Glu Arg Leu Leu Val Tyr Glu Phe Met Lys

965 970 975

Tyr Gly Ser Leu Glu Asp Val Leu His Asp Pro Lys Lys Ala Gly Val

980 985 990

Lys Leu Asn Trp Ser Thr Arg Arg Lys Ile Ala Ile Gly Ser Ala Arg

995 1000 1005

Gly Leu Ala Phe Leu His His Asn Cys Ser Pro His Ile Ile His

1010 1015 1020

Arg Asp Met Lys Ser Ser Asn Val Leu Leu Asp Glu Asn Leu Glu

1025 1030 1035

Ala Arg Val Ser Asp Phe Gly Met Ala Arg Leu Met Ser Ala Met

1040 1045 1050

Asp Thr His Leu Ser Val Ser Thr Leu Ala Gly Thr Pro Gly Tyr

1055 1060 1065

Val Pro Pro Glu Tyr Tyr Gln Ser Phe Arg Cys Ser Thr Lys Gly

1070 1075 1080

Asp Val Tyr Ser Tyr Gly Val Val Leu Leu Glu Leu Leu Thr Gly

1085 1090 1095

Lys Arg Pro Thr Asp Ser Pro Asp Phe Gly Asp Asn Asn Leu Val

1100 1105 1110

Gly Trp Val Lys Gln His Ala Lys Leu Arg Ile Ser Asp Val Phe

1115 1120 1125

Asp Pro Glu Leu Met Lys Glu Asp Pro Ala Leu Glu Ile Glu Leu

1130 1135 1140

Leu Gln His Leu Lys Val Ala Val Ala Cys Leu Asp Asp Arg Ala

1145 1150 1155

Trp Arg Arg Pro Thr Met Val Gln Val Met Ala Met Phe Lys Glu

1160 1165 1170

Ile Gln Ala Gly Ser Gly Ile Asp Ser Gln Ser Thr Ile Arg Ser

1175 1180 1185

Ile Glu Asp Gly Gly Phe Ser Thr Ile Glu Met Val Asp Met Ser

1190 1195 1200

Ile Lys Glu Val Pro Glu Gly Lys Leu Thr Ser Met Val Ser Lys

1205 1210 1215

Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu

1220 1225 1230

Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly

1235 1240 1245

Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys

1250 1255 1260

Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr

1265 1270 1275

Phe Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met

1280 1285 1290

Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val

1295 1300 1305

Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr

1310 1315 1320

Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile

1325 1330 1335

Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly

1340 1345 1350

His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met

1355 1360 1365

Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg

1370 1375 1380

His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln

1385 1390 1395

Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn

1400 1405 1410

His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu

1415 1420 1425

Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly

1430 1435 1440

Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys

1445 1450

<210> 5

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

ggggtaccgc tggtagtgtg gcgatggga 29

<210> 6

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

ccactagtta attttccttc aggaacttc 29

<210> 7

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

cctctcccct tgctccgtat gaagttactc tcaagacc 38

<210> 8

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

cacactacca gcggtacctc tggttctctt cgagaa 36

Claims (8)

1.BRI1在植物免疫信号验证中的应用，其特征在于，BRI1的胞内激酶域与FLS2的胞外域和跨膜域组成重组蛋白，将所述重组蛋白在植物中表达，用于验证多抗原重组免疫蛋白中不同免疫元件的有效性；所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

2.一种植物免疫信号验证方法，其特征在于，构建含FLS2胞外域和跨膜域编码基因与BRI1的胞内激酶域编码基因的重组表达载体，并在原生质体中表达，得到FLS2胞外域和跨膜域与BRI1的胞内激酶域组成的重组蛋白，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；该重组蛋白能够特异性结合外源的PAMPs分子并激活植物发育相关报告基因的表达，通过报告基因的表达量确定待测PAMPs分子的免疫激发活性。

3.根据权利要求2所述植物免疫信号验证方法，其特征在于，所述报告基因表达量的确定方法为：构建含报告基因的启动子序列和荧光素酶基因的重组表达载体，将重组表达载体与含FLS2胞外域和跨膜域编码基因与BRI1的胞内激酶域编码基因的重组表达载体共同转入原生质体细胞中，通过对荧光素酶的定量检测确定报告基因的表达量。

4.根据权利要求3所述植物免疫信号验证方法，其特征在于，所述报告基因为TCH4。

5.根据权利要求2-4任一项所述植物免疫信号验证方法，其特征在于，所述方法具体步骤包括：

(一)目的片段的扩增

以拟南芥基因组DNA为模板，扩增如SEQ ID NO：1所示的编码BRI1胞内激酶域的基因核苷酸序列，得到BRI1KD片段；扩增得到如SEQ ID NO：2所示的编码FLS2胞外富亮氨酸结构域和跨膜域基因的核苷酸序列，得到的基因片段命名为FLS2NT；

(二)重组载体的构建

(1)背景载体的构建：分别将BRI1KD片段和HBT-GFP载体分别进行KpnI和SpeI进行双酶切后采用T 4 DNA连接酶进行连接，得到重组载体HBT-BRI1KD-GFP，该载体为进一步进行分子改造的背景载体，并制备转化子和提取重组质粒HBT-BRI1KD-GFP；

(2)重组蛋白表达载体的构建：将HBT-BRI1KD-GFP背景载体进行BamHI 和KpnI双酶切，将FLS2NT片段和酶切后的HBT-BRI1KD-GFP重组载体采用infusion重组酶进行连接，得到重组载体HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP；

(3)检测报告基因载体的构建：报告基因载体是将TCH4基因的启动子序列TCH4 PRO 和荧光素酶基因Luciferase同时构建在HBT95瞬时表达载体上，构成TCH4 PRO ::Luciferase瞬时表达载体；

(三)拟南芥原生质体转化

将重组蛋白表达载体HBT-FLS2NT-BRI1KD-GFP和TCH4 PRO ::Luciferaset通过PEG介导法瞬时转化拟南芥原生质体；

(四)用相应PAMP处理后，检测报告基因表达量

加入外源PAMP分子，PAMP分子被免疫识别受体的LRR区域捕捉时会通过BRI1KD启动下游TCH4基因启动子，从而启动荧光素酶蛋白，通过双荧光素酶报告系统对基因表达量进行验证。

6.重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白含有FLS2的胞外域和跨膜域，以及BRI1的胞内激酶域，所述重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

7.含有权利要求6所述重组蛋白的重组细胞。

8.权利要求6所述重组蛋白和权利要求7所述重组细胞在植物免疫信号验证中的应用。

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