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CN112041674B - 用于制备抗tnf抗体组合物的制造方法中的色谱柱鉴定 - Google Patents

用于制备抗tnf抗体组合物的制造方法中的色谱柱鉴定 Download PDF

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CN112041674B CN201980027174.8A CN201980027174A CN112041674B CN 112041674 B CN112041674 B CN 112041674B CN 201980027174 A CN201980027174 A CN 201980027174A CN 112041674 B CN112041674 B CN 112041674B
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Abstract

本公开涉及一种在用于制备抗TNF抗体(例如，抗TNFα抗体(戈利木单抗))的制造方法中操作色谱柱的方法，以及抗体的特异性药物组合物。该方法涉及在包括柱填料的色谱柱的操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线。使用模型γ累积分布曲线的参数来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，并且基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。如果在常规柱监测期间观察到HETP的不利趋势或超过控制限度，则应评价洗脱产品质量、柱工艺性能和/或杂质去除数据以确保所识别批次的产品质量。如果产品质量或柱性能中的任一者未能满足标准设定，则应在释放以供进一步使用之前执行适当的校正动作，诸如调节、再装填或替换柱，以及鉴定。

Description

用于制备抗TNF抗体组合物的制造方法中的色谱柱鉴定
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月20日提交的美国临时申请62/660,340的优先权，该申请全文以引用方式并入本文。
技术领域
本发明涉及一种用于制备抗TNF抗体(例如，抗TNFα抗体(戈利木单抗))的制造方法中的色谱柱鉴定的方法，以及抗体的特异性药物组合物。
以电子方式提交的参考序列表
本申请含有序列表，该序列表以电子方式经由EFS-Web作为ASCII格式化序列表提交，文件名为“JBI6083USNP1 Sequences”，创建日期为2019年4月12日，并且大小为7kb。经由EFS-Web提交的该序列表是本说明书的一部分并且全文以引用方式并入本文。
背景技术
柱色谱法是在用以制备治疗性蛋白质的纯化过程中使用的重要技术。从工作台顶部到制造厂并且贯穿整个柱寿命，随着过程扩大，必须保持柱的性能。随着柱直径、设备和缓冲剂消耗的增加以扩大过程，柱评价程序、装填床完整性的潜在变化以及物流可能会出现困难。
用于色谱柱鉴定的当前方法通过从峰最大值和与半高度处的峰的宽度的标准偏差估计平均值来计算理论塔板等效高度(HETP)，其为脉冲注射之后的色散量度。该方法的主要局限性是当峰形状偏离高斯分布时，它不提供准确的色散量度(即，HETP)。为了补偿灵敏度的不足，利用第二测量(不对称性)来评估峰偏度。该量度比较在最大峰高度的10％处的前伸峰宽度和拖尾峰宽度。该方法的局限性导致对柱性能变化的灵敏度不足，并且通常导致柱的再装填或调节，而柱性能实际上是可接受的。已经报道了用于柱鉴定的其他策略。这些策略包括使用高斯分布或非高斯分布来在过程转变中建模(参见例如Larson等人，“Use of Process Data to Assess Chromatographic Performance in Production-Scale Protein Purification Columns,”Biotechnol.Prog.19:485-492(2003)以及授予Belousov等人的美国专利9,047,438和授予Ganguly的美国专利8,410,928)。高斯方法具有与上述注射方法相同的灵敏度局限性，并且所报告的非高斯方法需要复杂的计算。
需要具有更大灵敏度和更合理限定的极限的改善的鉴定程序来监测在重复操作期间的色谱柱性能变化，并评价柱在其寿命内将执行的有效性。本发明涉及克服本领域中的这种缺陷。
发明内容
本发明的实施方案分别由本文所附的独立权利要求和从属权利要求限定，为了简洁起见，这些权利要求以引用方式并入本文。根据下面结合附图的详细描述，本发明的各个方面的其他实施方案、特征和优点是显而易见的。
在某些实施方案中，本发明提供一种在用于制备抗TNF抗体的制造方法中操作色谱柱的方法，以及抗体的特异性药物组合物，该抗TNF抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链(HC)和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链(LC)或它们的抗原结合片段。该方法涉及在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。该方法还涉及使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线，
或者
其中C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定曲线的形状、缩放和偏移参数。使用式II和模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
其中
μ＝kθ+Vi，
并且
L＝柱长度
基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。基于该评估，色谱柱被重复使用、调节、替换或再装填。
已开发出用于评估柱完整性的新方法，本文称为γ分布转变分析(GDTA)。该新方法使用数学模型通过在柱操作的常规过程步骤期间生成的流动相变前沿数据来拟合曲线。然后利用模型曲线参数来计算整个柱床上的分散，作为柱质量的量度。流动相变前沿由色谱纯化过程内的离散步骤产生，其中使用具有不同特性(诸如电导率、pH和/或缓冲剂组分)的工艺缓冲剂/洗涤溶液。该方法通常可应用于在正常柱处理期间生成的任何一个或多个流动相变前沿。
GDTA方法的主要优点是，与高斯HETP估计方法相比，它提供了在整个柱床上更灵敏的色散计量。通过使用GDTA，不再需要测量不对称性，因为GDTA模型从曲线拟合正确地测量色散。另外，当与先前报告的另选的非高斯方法相比时，γ分布函数的使用便于前沿转变的分析。色谱工艺中已经存在的流动相变的使用避免了对额外离线处理步骤的需要。此外，在许多情况下，历史数据允许在实施之前建立柱效率的历史范围。最后，GDTA方法可自动化，以确保一致的应用。
在某些实施方案中，本发明提供在用于制备抗TNF抗体的制造方法中操作色谱柱的方法，该抗TNF抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链(HC)和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链(LC)或它们的抗原结合片段，所述方法包括：
在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线，
或者
其中C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定曲线的形状、缩放和偏移参数；
使用式II和模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
其中
μ＝kθ+Vi
L＝柱长度；以及
基于所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的质量。
在某些实施方案中，本发明提供方法，该方法还包括：基于所述评估来调节、替换或再装填色谱柱。
在某些实施方案中，本发明提供方法，该方法还包括：在色谱柱填料的一次或多次后续使用期间，在对应的流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用在色谱柱填料的一次或多次后续使用中的每一次使用期间收集的柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和所述计算；
基于所述执行来在所述一次或多次后续使用中的每一次使用期间确定色谱柱填料的HETP值；
编译两次或更多次后续使用的色谱柱填料的所确定的HETP值的趋势；以及
基于所编译的趋势来识别色谱柱填料的质量的变化，其中所述调节、替换或再装填色谱柱基于所述识别。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中与所述柱填料的一次或多次早期使用中的色谱柱填料的HETP值相比，所述柱填料的一次或多次后续使用中的色谱柱填料的HETP值的增加识别出色谱柱填料的质量降低。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中收集在柱填料的所述第一操作期间两个或更多个不同的流动相变前沿的柱出口信号和累积流量参数，所述方法包括：
使用针对两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿独立地收集的柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和计算，以计算两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿的HETP值；
基于两个或更多个所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量，由此所述调节、替换或再装填色谱柱基于所述评估。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中色谱柱选自：蛋白质A亲和色谱柱、阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中蛋白质A亲和色谱柱包括MabSelectTM蛋白质A亲和色谱柱，阳离子交换色谱柱包括UNOsphere STM阳离子交换色谱柱，并且阴离子交换色谱柱包括Q SepharoseTMXL阴离子交换色谱柱。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中蛋白质A亲和色谱柱中的流动相变前沿从选自以下项的一个或多个前沿生成：在抗TNF抗体的洗脱期间生成的前沿、在用盐酸胍对柱进行消毒期间生成的前沿、在用0.1MpH 3.5的柠檬酸钠对柱进行消毒后淋洗期间生成的前沿。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中阳离子交换色谱柱中的流动相变前沿从选自以下项的一个或多个前沿生成：在装载包含抗TNF抗体的溶剂/洗涤剂(S/D)处理材料期间生成的前沿、在洗脱抗TNF抗体期间生成的前沿以及在柱反萃取期间生成的前沿。
在某些实施方案中，本发明提供一种方法，其中阳离子交换色谱柱中的流动相变前沿从选自以下项的一个或多个前沿生成：在用氢氧化钠清洁柱期间生成的前沿以及在柱反萃取期间生成的前沿。
附图说明
图1A-图1B示出了示例性γ分布转变分析曲线拟合的曲线图。图1A是示出拟合到流动相变数据的示例性γ分布转变分析曲线的曲线图。图1B是示出拟合到流动相变数据的示例性γ分布转变分析曲线的曲线图，其中来自该曲线的参数用于计算理论塔板等效高度(HETP)作为柱效率的量度。
图2是示出本文所述的色谱柱鉴定系统的示意图。
图3是未进行转化的蛋白质A柱平衡前沿的HETP的概率图。
图4是未进行转化的蛋白质A柱平衡前沿的平方和(SS)的概率图。
图5是未进行转化的蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的概率图。
图6是未进行转化的蛋白质A柱洗涤前沿的SS的概率图。
图7是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的HETP的概率图。
图8是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的SS的概率图。
图9是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的概率图。
图10是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的SS的概率图。
图11是蛋白质A柱平衡的平均值(Vm)的概率图。
图12是蛋白质A柱洗涤前沿的平均值(Vm)的概率图。
图13是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的HETP的控制图表。UCL＝控制上限；LCL＝控制下限。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图14是蛋白质A柱平衡前沿的HETP的时间序列图。UCL来源于图13中的转化数据。
图15是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱平衡前沿的SS的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图16是蛋白质A柱平衡前沿的SS的时间序列图。UCL来源于图15中的转化数据。
图17是蛋白质A柱平衡前沿的平均值(Vm)的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图18是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图19是蛋白质A柱洗涤前沿的HETP的时间序列图。UCL来源于图18中的转化数据。
图20是进行自然对数(λ＝0)转化的蛋白质A柱洗涤前沿的SS的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图21是蛋白质A柱洗涤前沿的SS的时间序列图。UCL来源于图20中的转化数据。
图22是蛋白质A柱洗涤前沿的平均值(Vm)的控制图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图23是按柱包装分组的直接产物捕获(DPC)蛋白质A柱平衡前沿的HETP结果的时间序列图。
图24是按柱包装分组的DPC蛋白质A柱洗涤前沿的HETP结果的时间序列图。
图25是按滑道分组的DPC蛋白质A柱平衡前沿的HETP结果的时间序列图。
图26是按滑道分组的DPC蛋白质A柱洗涤前沿的HETP结果的时间序列图。
图27是示出DPC蛋白质A柱平衡的平均流量的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图28是平衡期间柱前平均压力的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图29是DPC蛋白质A柱洗涤前沿的平均洗涤流速的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图30是DPC蛋白质A柱洗涤前沿的平均洗涤压力的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图31是示出改变洗涤流速之前和之后的HETP的图表。图表上的编号点示出了基于Shewhart规则1、2和3的HETP结果中显而易见的异常值和/或趋势，即，1表示控制限度外的1个点，2表示中心线的同一侧上的8个点，并且3表示稳定增大或减小的6个连续点。
图32是如针对45批(英夫利昔单抗)在平衡前沿上评估的两种不同蛋白质A柱包装的HETP的时间序列图。
图33是SP-琼脂糖高性能(SPHP)柱平衡前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图34是SPHP柱WFI冲洗前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图35是SPHP柱储存前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图36是Q2柱平衡前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图37是Q2柱反萃取平衡前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图38是Q2柱储存前沿的HETP的时间序列图。控制限度来源于自然对数Box-Cox转化数据。
图39示出了戈利木单抗制造过程的9个阶段的概述。
图40是示出在(戈利木单抗)的洗脱期间生成的前沿的第3阶段MabSelectTM蛋白质A亲和色谱柱的HETP结果的图表。DPC是指MabSelectTM蛋白质A柱上(戈利木单抗)的直接产物捕获。
图41是示出在用盐酸胍进行消毒期间生成的前沿的第3阶段MabSelectTM蛋白质A亲和色谱柱的HETP结果的图表。DPC是指MabSelectTM蛋白质A柱上(戈利木单抗)的直接产物捕获。
图42是示出在用0.1M pH 3.5的柠檬酸钠进行消毒后淋洗期间生成的前沿的第3阶段MabSelectTM蛋白质A亲和色谱柱的HETP结果的图表。DPC是指MabSelectTM蛋白质A柱上(戈利木单抗)的直接产物捕获。
图43是示出在装载包含(戈利木单抗)的溶剂/洗涤剂(S/D)处理材料期间生成的第6阶段UNOsphere STM阳离子交换色谱柱前沿的HETP结果的图表。PS1是指用于在UNOsphere STM柱上的(戈利木单抗)的抛光步骤1。
图44是示出在(戈利木单抗)的洗脱期间生成的第6阶段UNOsphereSTM阳离子交换色谱柱前沿的HETP结果的图表。PS1是指用于在UNOsphere STM柱上的(戈利木单抗)的抛光步骤1。
图45是示出在柱反萃取期间生成的第6阶段UNOsphere STM阳离子交换色谱柱前沿的HETP结果的图表。PS1是指用于在UNOsphere STM柱上的(戈利木单抗)的抛光步骤1。
图46是示出在用氢氧化钠清洁期间生成的第7阶段Q SepharoseTMXL阴离子交换色谱柱前沿的HETP结果的图表。PS2是指用于在Q SepharoseTMXL柱上的(戈利木单抗)的抛光步骤2。
图47是示出在柱反萃取期间生成的第7阶段Q SepharoseTMXL阴离子交换色谱柱前沿的HETP结果的图表。PS2是指用于在Q SepharoseTMXL柱上的(戈利木单抗)的抛光步骤2。
具体实施方式
本公开涉及一种用于在制备抗TNF抗体(例如，抗TNFα抗体(戈利木单抗))的制造方法中在柱的重复操作期间监测装填色谱柱床的变化的改善的鉴定程序，以及抗体的特异性药物组合物。该方法与规模无关，提供了评价柱在整个柱寿命内将执行的有效性的实际手段。
色谱柱分离效率通常使用色谱的理论塔板模型来表征。使用该方法，色谱柱被认为由多个阶段或理论塔板组成。每个塔板是样品组分在流动相和固定相之间实现平衡的距离(参见Van Deemter、Zuiderweg和Klinkenberg，“Longitudinal Diffusion andResistance to Mass Transfer as Causes of Nonideality in Chromatography,”Chem.Engng.Sci.5:271-289(1956)，该文献据此全文以引用方式并入)。柱效率通过柱中的理论塔板数Np来测量，其中柱中的塔板越多意味着平衡越多、色谱带的色散越小、峰越窄并且质量分离越好。给定柱中塔板的数量越多，塔板高度越低。因此，柱效率也可通过计算塔板高度来测量，该塔板高度被称为“理论塔板等效高度”或HETP。使用该方法，HETP值越小，柱分离效率越高。
通过将色谱柱长度L除以理论板塔数Np来计算HETP。
HETP＝L/Np
在历史上，通过使用下式检查脉冲注射后的色谱峰来确定柱具有的理论塔板的数量：
其中tR为保持时间，并且w1/2为半高度处的峰宽度。然而，当用于计算Np的峰形状偏离高斯分布时，该方法不提供柱效率的准确测量。为了补偿灵敏度的这种不足，利用第二测量(不对称性)来评估峰偏度。该量度比较在最大峰高度的10％处的前伸峰宽度和拖尾峰宽度。如上所述，该模型缺乏检测柱性能变化的灵敏度。
本文所述的方法提供了基于在常规色谱柱操作期间发生的一个或多个流动相变前沿上的γ分布的HETP的另选且更准确的测量。因此，本公开涉及操作色谱柱的方法。该方法涉及在包含柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。该方法还涉及使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线。
或者
参考式Ia和式Ib，C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定曲线的形状、缩放和偏移参数。使用式II和模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
其中
μ＝kθ+Vi
并且
L＝柱长度。
基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。基于对柱质量的评估，确定色谱柱对于后续使用是可接受的，否则必须调节、替换或再装填该色谱柱。
本文所公开的柱鉴定方法可应用于任何色谱柱。示例性色谱柱包括但不限于用于液相色谱、高效液相色谱(HPLC)、离子交换色谱、亲和色谱、分子排阻、超临界流体色谱、气相色谱、尺寸排阻色谱、反相色谱、二维色谱、快速蛋白(FPLC)色谱、逆流色谱、手性色谱、水相正相色谱(ANP)、混合模式色谱和伪亲和色谱的那些色谱柱。示例性柱填料材料包括但不限于亲和色谱填料材料(例如，蛋白质A或蛋白质G亲和色谱填料材料)、离子交换色谱填料材料(例如，阳离子交换(羧甲基树脂)、阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式交换色谱填料材料)、吸附色谱填料材料(例如，硅胶或氧化铝填料材料)、疏水相互作用色谱填料材料(例如，苯基-琼脂糖凝胶、氮杂-arenophilic树脂或间氨基苯基硼酸填料材料)、金属螯合物亲和色谱填料材料(例如，Ni(II)-和Cu(II)-亲和材料)、尺寸排阻色谱填料材料(例如，凝胶电泳或毛细管电泳填料材料)或分子排阻色谱填料材料(例如，聚苯乙烯)。
本文所述的方法可在常规色谱柱操作期间，例如在样品中的化学或生物实体的分离、纯化或识别期间应用。此类化合物可包括例如但不限于蛋白质(例如，抗体及其片段)、核酸、碳水化合物、脂质、有机小分子、无机小分子、病毒、脂质体以及任何此类化合物的杂合物或变体形式。
与先前的色谱柱鉴定方法(其需要将柱离线进行测试，例如脉冲注射方法)相比，如本文所述的方法在常规柱操作期间进行。本方法利用了涉及具有不同特性的工艺缓冲剂和溶液的流动相过程转变，这在常规柱纯化过程期间发生。
根据本发明的方法，“流动相”是柱色谱中围绕色谱柱填料的固定色谱材料并移动通过色谱柱填料的固定色谱材料的液相。在色谱柱操作期间，流动相的组成和特性通常随每个过程步骤(例如，平衡、洗涤等)而改变。可在洗脱物(即，在通过固定相后从柱洗脱的流动相)中检测和测量流动相特性的变化。如本文所用，“柱出口信号”是当洗脱物从柱上洗脱时检测到的来自流动相的洗脱物的物理或化学特性的信号。提供柱出口信号的物理或化学特性可以是可使用任何典型的色谱检测器测量的任何特性，诸如pH、电导率、光吸收、荧光、电荷、盐浓度、偏振测定、折射率、电化学响应、质荷比等。适用于测量柱出口信号的色谱检测器包括但不限于质谱仪、红外光谱仪、可见光光谱仪、紫外光光谱仪、傅里叶变换红外光谱仪、火焰离子化检测器、小角度激光散射检测器、二极管阵列检测器、荧光光度计、pH检测器、电导率检测器、电化学检测器和折射率检测器。
从洗脱物收集柱出口信号。此外，为了收集柱出口信号，还收集“累积流量”。“累积流量”是随时间推移从柱洗脱的流体的总体积。该值除以柱的体积以用柱体积为单位来表示。
转变前沿由柱出口信号在累积流量上的变化生成。转变前沿由将具有一个或多个不同特性(例如，电导率、pH等)的不同流动相顺序施加到柱而产生。根据本文所述的方法，可将转变前沿上的柱出口信号归一化为具有最大值1和最小值0。如本文所提及的，“下降转变前沿”是其中起始流动相具有高于顺序引入的流动相的柱出口信号的柱出口信号(例如，电导率)的流动相变。
如本文所用，“上升转变前沿”是其中起始流动相具有低于顺序引入的流动相的柱出口信号的柱出口信号(例如，电导率)的流动相变。
通过在色谱柱操作过程期间向包含待鉴定的柱填料的色谱柱中添加第一流动相来创建转变前沿。在添加第一流动相之后的某个时间，例如，随着第一流动相开始洗脱，将具有与第一流动相相比不同的可检测柱出口信号的第二流动相添加到包含柱填料的色谱柱。当流动相在第一流动相和第二流动相之间转变时，通过在流动相的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数来检测转变前沿。
在一个实施方案中，第一流动相和第二流动相的柱出口信号在信号上相差超过信号噪声的量。在一个实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号的差值比背景信号噪声高5％。在另一个实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号的差值比背景信号噪声高至少10％。在另一个实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号的差值比背景信号噪声高至少15％。
在一个实施方案中，在转变前沿上检测到的柱出口信号为电导率。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少1μS/cm、至少10μS/cm、至少100μS/cm、至少1mS/cm，或大于1mS/cm。
在另一个实施方案中，在转换前沿上检测到的柱出口信号为pH。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少0.05个pH单位、至少0.1个pH单位、至少1个pH单位、至少2个pH单位，或大于2个pH单位。
在另一个实施方案中，在转变前沿上检测到的柱出口信号为UV-Vis吸光度。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少0.01个吸光度单位、至少0.1个吸光度单位、至少0.5个吸光度单位、至少0.8个吸光度单位，或超过0.8个吸光度单位。
在另一个实施方案中，在转变前沿上检测到的柱出口信号是红外吸光度。在该实施方案中，第一流动相和第二流动相之间的柱出口信号优选地相差至少1％透射率、至少10％透射率、至少20％透射率、至少30％透射率或超过30％透射率。
在一个实施方案中，流动相变前沿由从包含变性剂的流动相到包含非变性剂的流动相的变化生成。在另一个实施方案中，流动相变前沿由从包含非变性剂的流动相到包含变性剂的流动相的变化生成。
在另一个实施方案中，流动相变前沿由从碱性流动相条件到中性或更酸性流动相条件的变化生成。另选地，流动相变前沿由从酸性流动相条件到中性或更碱性流动相条件的变化生成。
在另一个实施方案中，流动相变前沿由从包含有机溶剂的流动相到含水流动相的变化生成。另选地，流动相变前沿由从含水流动相到包含有机溶剂的流动相的变化生成。
在流动转变前沿的过程中以各种间隔收集柱出口信号和累积流量参数。优选地，在从最小柱出口信号到最大柱出口信号或反之亦然的整个流动转变前沿过程中收集柱出口信号和累积流量参数。在一个实施方案中，在不规则的间隔处收集柱出口信号和累积流量参数，例如当检测到柱出口信号的变化时收集。在另一个实施方案中，在整个流动转变前沿的过程中在规则的时间间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。例如，在一个实施方案中，在整个流动转变前沿的过程中在1秒间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。在另一个实施方案中，在流动转变阶段的过程中在5秒、10秒、15秒、20秒、25秒、30秒、35秒、40秒、45秒、50秒、55秒或60秒间隔处收集柱出口信号和累积流量参数。
在一个实施方案中，通过在分析周期中将最大值设定为1并且将最小值设定为0，如上所述归一化柱出口信号数据。还将流量转换成柱体积以标准化，从而比较不同柱填料之间的数据。使用该数据，γ累积分布函数(“CDF”)用于生成最佳拟合所收集的数据点的曲线。γCDF使用下式I由三个值确定：形状参数k；缩放参数θ(theta)；以及偏移参数Vi：
C＝f(V,k,θ,Vi) 式I
参考式I，C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积。从式I导出的式Ia用于确定沿着上升转变前沿的γ分布函数值。
其中
Γ是上不完全γ函数，并且
γ是下不完全γ函数。
另选地，同样从式I导出的式Ib用于确定沿着下降转变前沿的γ分布函数值。
图1A是绘出在柱转变前沿上收集的示例性归一化柱出口信号和柱体积数据的曲线图。式Ia用于生成与数据拟合的曲线。
通过操纵k、θ和Vi的值以找到产生具有与数据的最小平方和偏差的模型曲线的参数来确定最佳拟合γCDF参数。该曲线通过来自整个转变前沿的数据点来拟合，以生成最佳拟合模型。来自该曲线的k、θ和Vi参数用于计算柱中塔板的数量Np或塔板高度(即，HETP)作为柱效率的指标。
基于模型曲线的平均值μ和方差σ2来计算塔板的数量Np。平均值和方差从曲线如下导出：
平均值，μ＝kθ+Vi
方差，σ2＝kθ2
基于平均值和方差来如下计算塔板的数量：
塔板的数量，Np＝μ2/σ2
HETP如上所述基于以厘米为单位的柱长度L除以塔板数量Np来如下计算。
图1B示出与图1A所示相同的曲线图，其中定义了平均值μ和方差σ2参数。
为了评价与如本文所述计算的数据的模型拟合，还可以确定平均值(Vm)、平方和(SS)和模式。SS是模型曲线与其所导出的过程数据的偏差的直接量度。Vm值为转变的中心点的量度，以柱体积为单位。该值应接近一，因为其通常需要一个柱体积来进行缓冲剂转变。平均值通常不受前沿形状的影响。平均值用于检查自动计算的误差。例如，低值可能指示数据收集错误并且可能需要进一步调查以确认结果。该模式对应于变化率最大的体积。这将等于转变曲线对称时的平均值。通常，转变是偏斜的，并且模式低于平均值。
除了HETP之外，可由k(形状)参数计算的其他因素包括偏度(γ1)(其为与不对称性相关的量度)和峰度(γ2)(其为峰锐度的量度)。这些因素可用于识别柱性能的变化。
根据本文所述的方法，每当柱过程在柱上运行时，针对相同的流动转变阶段收集柱出口信号和累积流量参数，以从γCDF计算HETP。由用于相同过程步骤和相同规模的柱生成的历史数据也可以被检索并用于计算HETP。编译HETP数据以识别历史操作或当前操作期间对应转变的HETP值的趋势，从而识别HETP值的控制上限和下限。控制限值是定义可接受HETP值范围HETP的高值和低值，即，对应于可接受柱效率的HETP值。这些控制上限和下限可基于统计评价来设定。例如，在一个实施方案中，通过计算平均值+/-2、3或4个标准偏差来设定控制上限和下限。在一个实施方案中，如本文实施例中所述，通过计算平均值+/-3个标准偏差来设定控制上限和下限。在另一个实施方案中，可通过由历史数据计算置信区间来设定控制上限和下限。在一个实施方案中，通过由历史数据计算95％、96％、97％或98％置信区间来设定控制上限和下限。在另一个实施方案中，通过由历史数据计算99％置信区间来设定控制上限和下限。
利用控制上限和下限来识别柱效率随时间推移的变化和柱的使用。通常，超过控制上限的HETP的任何增加可指示柱效率的降低。如果在常规柱监测期间观察到HETP的不利趋势或超过控制限度，则应评价洗脱产品质量、柱工艺性能和/或杂质去除数据以确保所识别批次的产品质量。如果产品质量或柱性能中的任一者未能满足标准设定，则应在释放以供进一步使用之前执行适当的校正动作，诸如调节、再装填或替换柱，以及鉴定。调节色谱柱以使主体床重新分布的方法将根据所采用的柱而变化，但这是本领域技术人员熟知的。
在柱操作期间对柱性能的监测可基于通常包括在纯化方案中的一个或多于一个的转变阶段。优选地，监测基于HETP值，该HETP值基于纯化方案期间两个、或三个或更多个转换阶段的γCDF来计算。
如下所述，使用本文所述的GDTA方法计算HETP以确定柱性能可基于从用于相同过程步骤和相同规模的柱收集的历史数据。从过程步骤的合格的缩小规模模型生成的数据也可用于评价。这允许与鉴定数据相比评估柱的性能的质量。
诸如流速(Van Deemter效应)、潜在的缓冲剂相互作用和额外的柱体积之类的因素可影响本文所述的GDTA方法的结果，并且应当在设定GDTA的控制限度的中进行评估。GDTA中包括的转变前沿优选地满足某些标准，诸如流动相柱出口信号测量均是按规模的，流动相之间的柱出口信号测量差值高于背景信号噪声，并且流动相和树脂之间的相互作用是一致的和可再现的。
用于在使用期间释放和监测的常见柱评价标准应通过评估特定于设备和树脂类型的历史数据来确定。表1中列出了可用于评价柱鉴定结果与性能之间的关系的常规产品质量和工艺性能测量的示例。用于评价的常规质量和工艺性能测量不限于表1中所列的那些，但该列表意在作为指导原则，并且应基于所评估的项目和过程步骤的特定要求。产品质量和工艺性能的规格和接受标准是项目特定的，并且将基于工艺要求来确定。
表1：常规质量和步骤性能测量
参数 分析方法
预洗脱体积(CV)
洗脱体积(CV)
步骤收率
色谱图 目视检查
洗脱物浓度 A280
洗脱单体 DW-SE-HPLC
工艺杂质 各种测定
如本文所述的γ分布转变分析方法可以在柱操作期间实时进行。该方法涉及通过色谱柱鉴定计算装置在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；通过色谱柱鉴定计算装置，使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线。
或者
参考式Ia和式Ib，C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，并且k、θ和Vi为用于限定曲线的形状、缩放和偏移参数。该方法还涉及通过色谱柱鉴定计算装置，使用式II和模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，
其中
μ＝kθ+Vi
L＝柱长度。
该方法还涉及使用色谱柱鉴定计算装置，基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。基于该评估，色谱柱操作员可确定在下一个柱操作之前色谱柱是否可重复使用，或者是否需要替换、重装填或调节。
图2是提供如本文所述操作色谱柱并实时评估柱效率的方法和系统的概述的示意图。如图2所示和上文所述，系统10包括用于分离作为复杂混合物(即，洗脱物14)引入柱中的生物分子的色谱柱12，当洗脱物从色谱柱洗脱时检测洗脱物中的柱输出信号的检测器20，从检测器20传输信号/数据的通信接口22，柱鉴定计算装置24，以及服务器26。
色谱柱12填充有可渗透的、半渗透的或不可渗透的固相柱填料材料。合适的色谱柱和柱填料材料在上文有所描述。将含有感兴趣的生物分子的洗脱物14引入色谱柱12中。流动相16也被引入色谱柱12中。流动相16有利于通过色谱柱12的固定相分离生物分子，并通过色谱柱的输出18洗脱洗脱物中的生物分子。根据如本文所述的方法，流动相16包含顺序引入的柱缓冲剂和/或洗涤试剂，该柱缓冲剂和/或洗涤试剂在如下文所述的一种或多种物理或化学特性(例如，pH、电导率、盐浓度)上彼此不同。检测器20在洗脱物中检测到一种或多种物理或化学特性的这些差异。
检测器20耦接到色谱柱12的输出18。因此，检测器20经由色谱柱12的洗脱物监测并收集柱输出信号。上文描述了合适的检测器和洗脱物的特性，即检测到的柱输出信号。检测器耦接到通信接口单元22，该通信接口单元将由检测器20收集的数据(例如，柱输出信号和累积流量参数)传输到用于数据处理的柱鉴定计算装置24和/或用于存储的服务器26。
本文所述的系统的柱鉴定计算装置24可以是任何计算装置，例如计算机、个人计算装置、智能电话等，其包括通过总线36或其他链路耦接在一起的中央处理单元(CPU)或处理器32、存储器30、网络接口28和用户界面34。柱鉴定计算装置24可以包括其他配置中的其他类型和/或数量的部件和元件。
柱鉴定计算装置24中的处理器32执行用于以本文示例的方式描述和示出的γ分布转变分析的一个或多个方面的存储指令的程序，但可使用其他类型和/或数量的处理装置，并且处理器32可执行其他类型和/或数量的编程指令。在一个实施方案中，处理器32仅位于柱鉴定计算装置24上。在另一个实施方案中，处理器分布在检测器20与柱鉴定计算装置24之间。例如，在一个实施方案中，柱鉴定计算装置24的处理器32包括耦接到检测器的微控制器。在该实施方案中，微控制器用作机载处理器，该机载处理器能够将由检测器20收集的数据映射或转换成数字信号，该数字信号被传输到柱鉴定计算装置24。耦接到一个或多个检测器的微控制器能够执行柱鉴定计算装置24的一个或多个处理功能。
柱鉴定计算装置24中的存储器30存储用于如本文所述的GDTA的一个或多个方面的这些编程指令。多种不同类型的存储器存储装置可用于存储器30，诸如定时处理器装置中的随机存取存储器(RAM)和/或只读存储器(ROM)，或软盘、硬盘、CD ROM、DVD ROM、或者由耦接到柱鉴定计算装置24中的处理器32的磁性、光学或其他读取和写入系统读取和写入的其他计算机可读介质。
柱鉴定计算装置24的网络接口28操作性地耦接并促进柱鉴定计算装置24与检测器20之间的通信，但也可使用具有其他类型和/或数量的连接和配置的其他类型和/或数量的通信网络或系统。
柱鉴定计算装置24还可包括用户界面34，诸如图形用户界面、触摸用户界面或基于网络的用户界面。用户界面被配置为向用户显示关于色谱柱鉴定参数的信息。用户界面还被配置为从用户接收关于色谱柱参数的输入。
图2中描绘的服务器26可以是一个或多个计算装置，每个计算装置包括CPU或处理器、存储器和网络接口，它们通过总线或类似于针对柱鉴定计算装置24所述的其他链路耦接在一起。服务器26可包括其他配置中的其他类型和/或数量的部件和元件。
本文所述的系统的通信接口22可包括一个或多个局域网(LAN)和/或广域网(WAN)。仅以举例的方式，通信接口22可使用以太网上的TCP/IP和工业标准协议，包括超文本传输协议(HTTP)和/或安全HTTP(HTTPS)，但也可使用其他类型和/或数量的通信网络。
本公开的另一方面涉及一种非暂态计算机可读介质，该非暂态计算机可读介质具有存储在其上的用于使用γ分布转变分析进行色谱柱鉴定的指令。这些指令包括可执行代码，该可执行代码在由处理器执行时，致使处理器执行包括以下的步骤：在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；使用如上所述的用于上升转变前沿的式Ia或如上所述的用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线；使用如上所述的式II和如本文所述的模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值；以及基于所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的质量。
本公开的另一方面涉及色谱柱鉴定装置。该装置包括处理器和耦接到处理器的存储器。存储器被配置为执行存储在存储器中的编程指令。这些指令包括：在包括柱填料的色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；使用如上所述的用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线；使用如上所述的式II和如本文所述的模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度(HETP)值，并且基于所计算的HETP值来评估色谱柱填料的质量。
实施例
实施例1–γ分布转变分析用于 (英夫利昔单抗)制造中使用的蛋 白质A色谱柱的柱鉴定的应用
概述：
治疗抗体(英夫利昔单抗)的制造过程涉及若干阶段，其中四个阶段涉及色谱纯化。在这些柱步骤中的每一个柱步骤期间，将用于柱鉴定的γ分布转变分析(GDTA)应用于两次或三次转变。该实施例描述了将GDTA方法应用于在(英夫利昔单抗)制造期间采用的蛋白质A柱纯化步骤。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的两个转变前沿，即，平衡和中间洗涤。
在69批(英夫利昔单抗)的连续纯化的129个前沿上执行GDTA，包括60个平衡和69个洗涤前沿。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
除了实时将GDTA应用于柱操作之外，还收集并分析了在前四年的过程中处理的285个批次的历史数据，如本文所述。数据集包括253个平衡前沿和285个洗涤前沿，总共538个历史前沿。不生成32个批次的平衡前沿，其中执行使用前消毒。选择该数据集以在柱的整个寿命期间提供均匀的分布并且代表11个柱包装。
GDTA方案：
对于蛋白质A柱纯化(即洗涤和平衡)期间的每个转变前沿，记录电导率和累积流量。通过评估预柱电导率和压力的趋势来完成起始点的确定，以便识别柱内联放置的点。创建并设置电子表格以在前沿的持续时间内使用计算的10秒间隔从服务器检索流量和电导率数据。
通过将最大值设定为1并且将最小值设定为0并且按比例缩放其他点来归一化电导率数据。另外，将流量转换成柱体积。
通过使用与PI模块相同的起始k、θ、Vi参数来计算起始γCDF。从γ分布函数的x项中的每个体积值中减去Vi。为了归一化在纯化期间增加的电导率，对于小于Vi的体积将电导率值设定为0，并且将最大值设定为1。
计算每个电导率值与每个体积点的模型拟合之间的差值(误差)。另外，计算0.5CV和1.8CV之间的误差的平方和。使用Excel解算器计算最佳拟合γCDF参数，以使用下式找到产生具有平方和的最小值的模型曲线的k、θ和Vi参数
使用GRG非线性方法，在k≥0.0001和Vi≥0的约束下，将解算器运行10,000次迭代，以确保达到最接近的拟合。
由k、θ和Vi的最终值计算以下参数：
平均值(Vm)，μ＝kθ+Vi,
方差，σ2(Σ平方)＝kθ2
模式＝(k-1)θ+Vi
计算每个前沿在0.5CV至1.8CV周期内的平均流速和柱前压力。
接受标准的分析和评价：
正态性
通过创建概率图来评估HETP和SS对于平衡前沿和洗涤前沿两者的结果的正态性。在概率图(图3-图12)中，数据点(HETP或SS的结果)表示在样品中观察到的实际累积分布。这些线表示拟合累积分布以及使用从样品估计的参数基于正态分布的上置信区间和下置信区间。转化百分位数规模，使得拟合的分布形成直线。HETP和SS数据集在下端各自由0界定，然而正态分布模型表明为负值。所得概率图显示曲线形状。参见图3-图6。因此，使用对数转化，结果拟合更好。参见图7-图10的对数转化数据的概率图。
还评估了平均值(Vm)的数据的正态性。图11和图12示出数据符合正态分布，仅有几个异常值。因此，不需要转化。该参数未在方案中指定，但提供曲线拟合有效的有用保证。该参数的控制限度也将从该分析中生成。
异常值的识别和变型的原因。
为了识别异常值并评估结果的可变性，生成每个参数的控制图表。参见图13-图22。控制图表使用HETP和SS的转化数据，其中应用自然对数转化。还将数据绘制在时间序列图中，其中这些参数中的每一个参数都具有转化的控制上限。
HETP：许多异常值和趋势在平衡前沿和洗涤前沿两者的HETP结果中是显而易见的。另外，图13和图18示出了基于Shewhart规则1、2和3的数据趋势，这些规则由图中的正方形表示，并根据以下项进行编号。
与这些偏移相关联的批次不被排除在分析之外，因为它们代表了可接受的过程。
两个控制图表(图13和图18)均示出了多个Shewhart规则1违反，其也超过了控制限度。在每种情况下，通过再调节柱来识别和校正问题。
如所预期的，由于柱包装的变化，运行次数满足规则2和3的标准。为了进一步评估趋势，用按柱包装(图23-图24)和滑道(图25-图26)分组的数据制备时间序列图。这些图表显示，许多特殊原因的变化归因于柱劣化和一些孤立的偏移。对于平衡前沿，HETP增加的趋势对于每个柱随时间推移是显而易见的(图23)。观察到的洗涤前沿的偏移看起来在不同时间与一个滑道或另一个滑道隔离(图26)，表明在滑道中可能存在柱性能可变性的来源。
平方和(SS)：平方和是γ分布与过程数据的拟合程度的量度。该量度将提供检查以确保HETP结果有效。在图15和图20中分别示出了平衡和洗涤的转化数据的控制图表。该量度仅具有控制上限。图15示出超过控制上限的6个点。这些点中的四个点与较高HETP相关联。批次880572M在前沿期间具有流动中断，这导致SS高但不影响HETP。
流量和压力的评价。
评价数据集的平均流速和柱前压力以识别任何异常值。评估所识别的差值与结果之间的关系。
流速和柱前压力在图27-图30中呈现趋势。图表显示了步骤中的每一个步骤的流速的优异控制。在该评估期间改变洗涤流速。柱前压力示出与滑道和柱相关的变化，但通常在一定范围内稳定。图31示出HETP值不受洗涤流速变化的显著影响。
蛋白质A柱的控制限度
HETP：
HETP与柱性能直接相关，并且还受系统中可能增加色散的其他因素的影响。结果必须>0。HETP的控制限度最好通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来确定，如图13对于平衡和图18对于洗涤前沿所示。控制图表显示了通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差计算的转化数据的控制限度(还可参见下表2)。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。对控制上限和下限进行逆转化(ex)以确定未转化数据的控制限度。
每个前沿的HETP结果和控制限度的时间序列图在图14和图19中示出。基于该历史审查，在这些限制内的操作预期会产生可接受的色谱性能。高于控制上限的值可指示列流量问题并且应进一步评价。低于控制下限的值可指示计算误差。
平方和(SS)：
SS是γ分布模型与数据拟合程度的量度。该量度用于确保使用GDTA方法计算的HETP值表示过程数据。不存在下限，并且结果必须>0。SS的控制上限最好通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来确定，如图15对于平衡前沿和图20对于洗涤前沿所示。控制图表显示了通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差计算的转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。控制图表示出了转化数据的控制上限，这些转化数据被逆转化以分别得到平衡前沿和洗涤前沿的0.050和0.989(参见表2)。每个前沿的SS结果和控制限度的时间序列图在图16和图20中示出。限度内的结果将确保模型拟合数据以及历史结果。如果结果在该范围之外，则可能是特殊原因。
平均值：
将平均值加起来作为γ分布模型准确度的第二量度。平均值表示前沿的理论质量中心，并且应总是接近1个柱体积，除非在系统中存在导致其移位的其他因素，诸如大的额外柱体积或流动相和树脂之间的相互作用。平衡前沿和洗涤前沿的平均值大致垂直分布并且不需要转化，参见图11和图12。平衡前沿的平均值紧密分布在1.07CV附近，其中一些异常值存在于任一侧上并且在高侧上接近1.2，参见图17。洗涤前沿示出略微更大的变化并且以0.99CV为中心，其中若干低异常值接近0.8，参见图22。建议对两个前沿的平均值应用0.80至1.20CV的控制限度(参见表2)。这是适当的，因为平均值不是柱性能的量度，而是用作检查以确保分析是适当的。更严格的控制限度将导致该检查不必要的灵敏度。
表2：在 (英夫利昔单抗)制造期间用于蛋白质A柱纯化的推荐 HETP、SS和平均值控制限度
实施例2–γ分布转变分析用于 (英夫利昔单抗)制造中使用的蛋 白质A色谱柱的亚最佳性能检测的应用
治疗抗体(英夫利昔单抗)的制造过程涉及若干阶段，其中四个阶段涉及色谱纯化。在这些柱步骤中的每一个柱步骤期间，将用于柱鉴定的γ分布转变分析(GDTA)应用于两次或三次转变。该实施例描述了将GDTA方法应用于(英夫利昔单抗)制造所采用的蛋白质A柱纯化步骤。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的两个转变前沿，即，平衡和中间洗涤。
由45批(英夫利昔单抗)的连续纯化在45个平衡前沿上执行GDTA，包括在柱包装883333M001上处理的23批和在柱包装885473M001上处理的22批。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
45个批次的平衡HETP结果的趋势(参见图32)示出了柱包装之间的显著差异。用于柱评估的当前控制未识别两个柱包装之间的任何差异。批次收率的评价显示在两个柱包装上处理的批次之间的显著(P＝0.001)差异，对于具有较高HETP值的柱包装估计低4.3％。对其他潜在因素进行评价，并且其显示与收率差异无相关性。因此，由该分析得出的结论是柱性能差异导致较低的收率。基于该发现，在继续使用之前调节较低收率的塔以改善柱填料。该实施例展示了GDTA方法在评估色谱柱质量中的灵敏度。
实施例3–γ分布转变分析用于 (英夫利昔单抗)制造中使用的SP- 琼脂糖高性能色谱柱的柱鉴定的应用
概述：
如上所述，(英夫利昔单抗)的制造过程涉及若干阶段，其中四个阶段涉及色谱纯化。该实施例描述了将GDTA方法应用于(英夫利昔单抗)制造所采用的SP-琼脂糖高性能(SPHP)柱纯化步骤。SPHP柱是阳离子交换色谱柱。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的三个转变前沿，即，平衡、WFI冲洗和储存前沿。
在23批(英夫利昔单抗)的纯化的69个前沿上执行GDTA，包括23个平衡、WFI冲洗和储存前沿。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
除了实时将GDTA应用于柱操作之外，还收集并分析了在前四年的过程中处理的189个转变前沿的历史数据，如本文所述。数据集包括64个平衡前沿、63个WFI冲洗前沿和62个储存前沿。选择该数据集以在柱的整个寿命期间提供均匀的分布并且代表6个柱包装。
SPHP柱前沿的GDTA如上文实施例1所述进行。该分析产生了每个前沿的HETP、SS和平均值的测量结果。基于统计评价得出的这三个参数中的每一个参数的控制限度在下表3中列出。
SPHP柱的控制限度：
HETP：
HETP与柱性能直接相关，并且还受系统中可能增加色散的其他因素的影响。结果必须>0。HETP的控制限度通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择25的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。对控制上限和下限进行逆转化(ex)以确定未转化数据的控制限度。每个前沿的HETP结果和控制限度的时间序列图在图33(平衡前沿)、图34(WFI冲洗前沿)和图35(储存前沿)中示出。基于该历史审查，在这些限制内的操作预期会产生可接受的色谱性能。高于控制上限的值可指示列流量问题并且应进一步评价。低于控制下限的值可指示计算误差。
平方和(SS)：
SS是γ分布模型与数据拟合程度的量度。该量度将用于确保使用GDTA方法计算的HETP值表示过程数据。不存在下限，并且结果必须>0。SS的控制上限通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。将转化数据的控制上限逆转化以给出0.110的平衡前沿、0.027的WFI冲洗前沿和0.073的储存前沿(参见表3)。限度内的结果将确保模型拟合数据以及历史结果。如果结果在该范围之外，则可能是特殊原因。
平均值：
将平均值加起来作为γ分布模型准确度的第二量度。平均值表示前沿的理论质量中心，并且应总是接近1个柱体积，除非在系统中存在导致其移位的其他因素，诸如大的额外柱体积或流动相和树脂之间的相互作用。平衡、WFI冲洗和储存前沿的平均值具有不规则的分布，并且不会受益于转化。建议对前沿中的每一个前沿的平均值应用0.80CV至1.20CV的控制限度(参见表3)。这是适当的，因为平均值不是柱性能的量度，而是用作检查以确保分析是适当的。预期这些限度足以识别与预期计算结果的显著偏离。更严格的控制限度将导致该检查不必要的灵敏度，可以看出该灵敏度随每个柱包装而变化。
表3：在 (英夫利昔单抗)制造期间用于SPHP柱纯化的推荐HETP、SS 和平均值控制限度
实施例4–γ分布转变分析用于 (英夫利昔单抗)制造中使用的Q2 色谱柱的柱鉴定的应用
概述：
该实施例描述了将GDTA方法应用于(英夫利昔单抗)制造所采用的次级阴离子交换(Q2)柱纯化步骤。Q2柱为阴离子交换色谱柱。纯化过程包括适用于如本文所述的GDTA的三个转变前沿，即，平衡、反萃取和储存前沿。
在68个前沿上执行GDTA，前沿包括23个平衡和反萃取前沿、以及22个储存前沿。γ前沿分布分析与制造同时执行，并且不影响制造过程。所有制造、监测和控制都使用当前有效的程序来执行。在(英夫利昔单抗)的柱色谱纯化期间，记录电导率(即，柱出口信号)和洗脱物的流量(即，累积流量)。
除了实时将GDTA应用于柱操作之外，还收集并分析了在前四年的过程中处理的324个转变前沿的历史数据，如本文所述。数据集包括121个平衡前沿、124个反萃取前沿和79个储存前沿。选择该数据集以在柱的整个寿命期间提供均匀的分布并且代表10个柱包装。
Q2柱前沿的GDTA如上文实施例1所述进行。该分析产生了每个前沿的HETP、SS和平均值的测量结果。基于统计评价得出的这三个参数中的每一个参数的控制限度在下表4中列出。
Q2柱的控制限度：
HETP：
HETP与柱性能直接相关，并且还受系统中可能增加色散的其他因素的影响。结果必须>0。HETP的控制限度通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。对控制上限和下限进行逆转化(ex)以确定未转化数据的控制限度。
每个前沿的HETP结果和控制限度的时间序列图在图36(平衡前沿)、图37(反萃取前沿)和图38(储存前沿)中示出。基于该历史审查，在这些限制内的操作预期会产生可接受的色谱性能。高于控制上限的值可指示列流量问题并且应进一步评价。低于控制下限的值可指示计算误差。
平方和(SS)：
SS是γ分布模型与数据拟合程度的量度。该量度将用于确保使用GDTA方法计算的HETP值表示过程数据。不存在下限，并且结果必须>0。SS的控制上限通过使用自然对数Box-Cox转化(λ＝0)来最好地确定。通过Minitab使用平均值+/-3标准偏差来计算转化数据的控制限度。基于平均移动范围来确定标准偏差。选择100的移动范围以考虑柱性能随柱寿命的变化。根据储存前沿的聚集数据确定标准偏差，因为移动范围方法产生更高的标准偏差。控制限度在下表4中报告。限度内的结果将确保模型拟合数据以及历史结果。如果结果在该范围之外，则可能是特殊原因。
平均值：
将平均值加起来作为γ分布模型准确度的第二量度。平均值表示前沿的理论质量中心，并且应总是接近1个柱体积，除非在系统中存在导致其移位的其他因素，诸如大的额外柱体积或流动相和树脂之间的相互作用。平衡、反萃取和储存前沿的平均值具有不规则的分布，并且不会受益于转化。建议对前沿中的每一个前沿的平均值应用0.80CV至1.20CV的控制限度(参见表4)。这是适当的，因为平均值不是柱性能的量度，而是用作检查以确保分析是适当的。预期这些限度足以识别与预期计算结果的显著偏离。更严格的控制限度将导致该检查不必要的灵敏度，可以看出该灵敏度随每个柱包装而变化。
表4：在 (英夫利昔单抗)制造期间用于Q2柱纯化的推荐HETP、SS和 平均值控制限度
实施例5-用以制备 (戈利木单抗)的制造过程
戈利木单抗的背景
使用抗TNFα剂的疗法已成功用于治疗炎性关节炎，但早期抗TNFα剂在安全性、给药方案、成本和/或免疫原性方面具有局限性。为了解决一些局限性，开发了全人抗TNFαmAb，称为(戈利木单抗)。戈利木单抗(也称为CNTO 148和rTNV148B)是具有免疫球蛋白G1(IgG1)重链同种型(G1m[z]同种异型)和κ轻链同种型的完全人单克隆抗体。戈利木单抗具有含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链(HC)和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链(LC)。戈利木单抗的分子量在149,802道尔顿至151,064道尔顿的范围内。
戈利木单抗与具有高亲和力和特异性的人肿瘤坏死因子α(TNFα)的可溶性和跨膜生物活性形式形成高亲和力、稳定的复合物，这防止TNFα与其受体结合并中和TNFα生物活性。未观察到与其他TNFα超家族配体的结合；具体地，戈利木单抗不结合或中和人淋巴毒素。TNFα主要由活化的单核细胞、巨噬细胞和T细胞合成，作为跨膜蛋白质，其自缔合以形成生物活性的同源三聚体并通过蛋白水解从细胞表面快速释放。TNFα与p55或p75 TNF受体的结合导致受体胞质结构域的聚集并引发信号传导。肿瘤坏死因子已被鉴定为响应各种刺激而产生的关键前哨细胞因子，并且随后通过激活半胱天冬酶依赖的凋亡途径和转录因子核因子(NF)-κB和激活蛋白质-1(AP-1)促进炎症反应。肿瘤坏死因子α还通过其在生发中心的免疫细胞组织中的作用来调节免疫应答。TNFα的升高表达已经与慢性炎性疾病诸如类风湿性关节炎(RA)以及脊柱状关节病诸如银屑病关节炎(PsA)和强直性脊柱炎(AS)有关，并且是这些疾病特有的关节炎症和结构损伤的重要媒介。
用戈利木单抗进行临床试验
在强直性脊柱炎(AS)受试者皮下(SC)施用戈利木单抗的全局、随机、双盲、安慰剂对照的第3阶段研究(研究C0524T09)中，戈利木单抗被证明在改善受强直性脊柱炎(AS)影响的受试者的体征和症状、物理功能和健康相关生活质量(HRQOL)方面是有效的。此外，安全性分析显示，SC戈利木单抗通常耐受性良好，并且显示出与用其他抗TNFα剂观察到的安全性特征相似的安全性特征。
考虑到SC戈利木单抗的一致安全性和疗效，预期IV戈利木单抗还将证明其具有与风湿性疾病(诸如RA、PsA和AS)中的其他抗TNFα剂一致的可接受的安全性。已经在第3期研究(CNTO148ART3001)中明确研究了静脉注射戈利木单抗，该研究形成了批准治疗RA的基础。CNTO148ART3001研究是一项尽管同时进行甲氨蝶呤(MTX)治疗，但在具有活动性RA的受试者中在第0周、第4周和之后每8周(q8w)时IV施用戈利木单抗2mg/kg输注施用超过30分钟±10分钟时间的有效性和安全性的随机、双盲、安慰剂对照、多中心、双臂研究。尽管MTX，患有活动性RA的受试者随机分配接受安慰剂输注或在第0周、第4周和每8周时IV施用2mg/kg的戈利木单抗至第24周。从第24周开始，所有受试者在第100周时用IV戈利木单抗治疗。已证明，IV戈利木单抗在改善RA体征和症状、身体功能和健康相关的生活质量以及抑制结构损伤的进展方面提供了实质性有益效果。在RA治疗中静脉内施用的戈利木单抗(CNTO148ART3001)显示出稳健的疗效和可接受的安全性、输注反应的发生率低。
最近，设计了两个第3期研究来评价静脉注射(IV)戈利木单抗在治疗患有活动性强直性脊柱炎(AS)和活动性银屑病性关节炎(PsA)的受试者中的功效和安全性。正在评价受试者的IV施用途径，因为目前可获得的IV抗TNFα剂在免疫原性和输注反应方面具有局限性，并且与IV戈利木单抗的30分钟±10分钟输注相比，具有更长的输注时间(60分钟至120分钟)。患者也可能更喜欢IV戈利木单抗的维持剂量计划表，而不是与SC剂相比更频繁的施用。
序列
示例性抗TNFα抗体序列- (戈利木单抗)
重链CDR(HCDR)和轻链CDR(LCDR)在戈利木单抗(由Kabat定义)的重链和轻链中标有下划线。
重链(HC)-SEQ ID NO:1
轻链(LC)-SEQ ID NO:2
重组表达盒
本发明使用包含核酸的重组表达盒。核酸序列，例如编码本发明的方法中使用的抗体的cDNA或基因组序列，可用于构建可导入到至少一种所需宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常会包含与转录起始调节序列可操作地连接的多核苷酸，所述转录起始调节序列会引导所述多核苷酸在预定的宿主细胞中的转录。异源和非异源(即内源)启动子两者均可用于引导核酸的表达。
在一些实施方案中，可在非异源形式的本发明多核苷酸的适当位置(上游、下游或内含子中)引入作为启动子、增强子或其他元件的分离核酸，以便上调或下调多核苷酸的表达。例如，可通过突变、缺失和/或置换在体内或体外改变内源启动子。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包含分离的核酸分子的载体、用重组载体进行遗传工程改造的宿主细胞以及通过本领域熟知的重组技术制备至少一种抗TNFα抗体。
可将所述多核苷酸任选地与包括可选择标记的载体连接，以在宿主中增殖。一般来讲，质粒载体在沉淀物诸如磷酸钙沉淀物中，或在与带电脂质的复合物中被导入。如果载体是病毒，那么它可以使用适当的包装细胞系在体外进行包装并且然后转导进宿主细胞内。
应将DNA插入物与适当的启动子可操作地连接。表达构建体还会含有转录起始位点、终止位点以及在转录区中含有用于翻译的核糖体结合位点。该构建体表达的成熟转录物的编码部分将优选地包括在待翻译的mRNA开始处的翻译起始和在该mRNA末端适当位置的终止密码子(例如，UAA、UGA或UAG)，对于哺乳动物或真核细胞表达优选UAA和UAG。
表达载体将优选但任选地包括至少一个可选择标记。此类标记包括例如但不限于：对于真核细胞培养物，为甲氨喋呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR，美国专利4,399,216；4,634,665；4,656,134；4,956,288；5,149,636；5,179,017)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS)(美国专利5,122,464；5,770,359；5,827,739)抗性基因；以及对于大肠杆菌(E.coli)和其他细菌或原核生物培养，为四环素或氨苄青霉素抗性基因(以上专利据此全文以引用方式并入)。用于上述宿主细胞的适当的培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对于技术人员来说将是显而易见的。载体构建体导入宿主细胞可受到磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知方法的影响。此类方法是熟知的并且在本领域中充分描述。
本发明的方法中使用的至少一种抗体可以修饰形式(诸如融合蛋白质)表达，并且可不仅包括分泌信号，而且还可包括附加异源功能区。例如，可将附加氨基酸(尤其是带电氨基酸)的区域添加至抗体的N-端，以改善纯化期间或随后的处理和储存期间在宿主细胞中的稳定性和持久性。同样，可将肽部分添加至本发明的抗体以帮助纯化。此类区域可在抗体或其至少一个片段的最终制备前去除。此类方法描述于许多标准实验室手册中，并且所述方法是熟知的并且充分描述于本领域中。
本领域技术人员可认识到许多表达系统可用于表达编码本发明的方法中使用的蛋白质的核酸。另选地，核酸可在含有编码抗体的内源DNA的宿主细胞中通过开启(通过操纵)而在宿主细胞中表达。此类方法是本领域熟知的，例如，如美国专利5,580,734、5,641,670、5,733,746和5,733,761中所述。
可用于产生抗体、其特定部分或变体的细胞包括哺乳动物细胞。哺乳动物细胞系统通常将以细胞单层的形式培养，但细胞也可适于在悬浮液中生长，例如在摇瓶或生物反应器中生长。在本领域中已经开发了许多能够表达完整糖基化蛋白质的合适宿主细胞系，并且该宿主细胞系包括例如COS-1(例如，CRL1650)、COS-7(例如，CRL-1651)、HEK293、BHK21(例如，CCL-10)、BSC-1(例如，CCL-26)、中国仓鼠卵巢(CHO)、Hep G2、P3X63Ag8.653、Sp2/0-Ag14、HeLa等，它们可容易地从例如美国典型培养物保藏中心(Manassas,Va(www.atcc.org))获得。在某些实施方案中，宿主细胞包括CHO细胞和淋巴来源的细胞，诸如骨髓瘤和淋巴瘤细胞，例如CHO-K1细胞、P3X63Ag8.653细胞(CRL-1580)和Sp2/0-Ag14细胞(CRL-1581)。
这些细胞的表达载体可包括以下的表达控制序列中的一者或多者，诸如但不限于：复制起点；启动子(例如，晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利5,168,062；5,385,839)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利5,266,491)、至少一种人免疫球蛋白启动子；增强子和/或加工信息位点诸如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如SV40大T Ag聚A添加位点)和转录终止子序列。可用于产生本发明的核酸或蛋白质的其他细胞也是已知的和/或可例如从美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录(www.atcc.org)或其他已知的来源或商业来源得到。
当使用真核宿主细胞时，通常会将多腺苷酸化或转录终止序列并入载体内。终止序列的示例是来自牛生长激素基因的多腺苷酸化序列。还可包括用于准确剪接转录物的序列。剪接序列的示例是来自SV40的VP1内含子(Sprague等人，“Expression of arecombinant DNA gene coding for the vesicular stomatitis virus nucleocapsidprotein.”J.Virol.45:773-781(1983))。此外，如本领域已知，可将控制在宿主细胞中的复制的基因序列并入载体内。
CHO细胞系
尽管有若干种其他哺乳动物细胞系可用，但如今产生的大多数重组治疗蛋白质都在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中制备(Jayapal KP等人，“Recombinant protein theorapeutics from CHO cells-20years and counting.”Chem Eng Prog.2007；103:40-47；Kunert R，Reinhart D.，“Advances in recombinant antibody manufacturing.”ApplMicrobiol Biotechnol.2016；100(8):3451-61)。它们的优势包括例如作为贴壁细胞或在悬浮液中的稳健生长、对无血清和化学成分确定的培养基的适应性、高产率以及确立的对于治疗重组蛋白制备的监管批准史。它们还非常易于进行基因修饰，并且用于细胞转染、重组蛋白表达和克隆选择的方法都得到很好的表征。CHO细胞还可提供人相容的翻译后修饰。如本文所用，“CHO细胞”包括但不限于例如CHO-DG44、CHO-Kl、CHO-M、CHO-S、CHO GS敲除以及它们的修饰和衍生物。
在CHO细胞中的克隆和表达。
一种常用于在CHO细胞中表达的载体是pC4。质粒pC4是质粒pSV2-dhfr(37146)的衍生物。该质粒含有在SV40早期启动子控制下的小鼠DHFR基因。用这些质粒转染的缺乏二氢叶酸活性的中国仓鼠卵巢细胞或其他细胞，可通过使细胞在补充有化学治疗剂甲氨蝶呤的选择培养基(例如lpha minus MEM,Life Technologies,Gaithersburg,MD)中生长进行选择。DHFR基因在对甲氨蝶呤(MTX)具有抗性的细胞中的扩增已得到充分记载(参见例如，F.W.Alt等人，“Selective multiplication of dihydrofolate reductase genesin methotrexate-resistant variants of cultured murine cells.”J.Biol.Chem.253:1357-1370(1978)；以及M.J.Page和M.A.Sydenham，“High level expression ofthehumanized monoclonal antibody Campath-1H in Chinese hamster ovary cells.”Biotechnology 9:64-68(1991))。在浓度渐增的MTX中生长的细胞由于DHFR基因扩增造成超量产生靶酶DHFR而发展出对药物的抗性。如果第二基因与DHFR基因连接，那么它通常被共扩增和过表达。本领域已知的是，该方法可用于开发携带超过1,000个拷贝的扩增基因的细胞系。随后，当甲氨蝶呤被取出时，获得含有整合进宿主细胞的一个或多个染色体内的扩增基因的细胞系。
质粒pC4含有用于表达感兴趣的基因的劳斯肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)的强启动子(Cullen等人，“Functional analysis of the transcription control regionlocated within the avian retroviral long terminal repeat.”Molec.Cell.Biol.5:438-447(1985))和从人巨细胞病毒(CMV)即刻早期基因的增强子分离的片段(Boshart等人，A very strong enhancer is located upstream of an immediate early geneofhuman cytomegalovirus.”Cell41:521-530(1985))。启动子的下游是允许基因整合的BamHI、XbaI和Asp718限制性内切酶切割位点。在这些克隆位点之后，该质粒含有大鼠前胰岛素原基因的3'内含子和多腺苷酸化位点。其他高效率的启动子也可以用于表达，例如人β-肌动蛋白启动子、SV40早期或晚期启动子或来自其他逆转录病毒例如HIV和HTLVI的长末端重复序列。Clontech的Tet-Off和Tet-On基因表达系统和类似系统可以用于在哺乳动物细胞中以受调控的方式表达蛋白质(M.Gossen和H.Bujard，“Tight control ofgeneexpression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters.”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:5547-5551(1992))。对于mRNA的多腺苷酸化，也可以使用例如来自人生长激素或珠蛋白基因的其他信号。携带整合进染色体中的感兴趣的基因的稳定细胞系也可以在与选择标记诸如gpt、G418或潮霉素共转染时进行选择。有利的是在开始时使用不止一种选择标记，例如，G418加上甲氨蝶呤。
一般纯化方法
抗TNFα抗体可通过熟知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化，所述方法包括但不限于例如蛋白质A纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和色谱、羟基磷灰石色谱和凝集素色谱。高效液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。
如本文所用，术语“抗体”或“多种抗体”包括根据2009年的生物制品价格竞争和创新法案(BPCI Act)和全球类似法律法规批准的生物仿制抗体分子。根据BPCI Act，如果数据显示，抗体与参考产品“高度相似”，但是临床非活性组分具有微小差异，并且在安全性、纯度和效能方面“预期”产生与参考产品相同的临床结果，则可证实抗体是生物仿制的(R.Dolinar、F.Lavernia和S.Edelman.“A GUIDE TO FOLLOW-ON BIOLOGICS ANDBIOSIMILARS WITH A FOCUS ON INSULIN.”EndocrinePractice:February 2018,Vol.24,No.2,pp.195-204)。为这些生物仿制药抗体分子提供了简化的批准途径，从而使申请人能够依靠创新药参考产品的临床数据来确保监管批准。与基于成功临床试验被FDA批准的原始创新药参考抗体相比，生物仿制药抗体分子在本文中称为“后续生物制剂”。如本文所示，(戈利木单抗)是基于成功临床试验批准的原始创新药参考抗TNFα抗体。戈利木单抗自2009年以来已在美国销售。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体片段，诸如像，双抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、二硫键稳定Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv')、二硫键稳定双抗体(ds双抗体)、单链抗体分子(scFv)、单结构域抗体(sdab)、scFv二聚体(二价双抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体的一部分形成的多特异性抗体、骆驼化单结构域抗体、纳米抗体、结构域抗体、二价结构域抗体或结合抗原但不包含完整抗体结构的任何其它抗体片段。抗原结合片段能够结合至与亲本抗体或亲本抗体片段结合的抗原相同的抗原。根据具体实施方案，抗原结合片段包含轻链可变区、轻链恒定区和Fd链段(即包含在Fab片段中的重链部分)。根据其它具体实施方案，抗原结合片段包含Fab和F(ab')。
制造过程概述
(戈利木单抗)以9阶段过程制造，该过程包括连续灌注细胞培养物，然后纯化。图39中提供了制造过程的概述。
如本文所用，术语“培养物”、“培养”、“培养的”和“细胞培养物”是指在适于细胞群存活和/或生长的条件下悬浮在培养基中的细胞群。如本领域普通技术人员从上下文将清楚的是，如本文所用的这些术语也指包含细胞群体和细胞群悬浮于其中的培养基的组合。细胞培养物包括例如通过分批、分批补料或灌注细胞培养方法等生长的细胞。在某些实施方案中，细胞培养物是哺乳动物细胞培养物。
用于本发明的细胞系包括哺乳动物细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、人胚肾细胞(HEK细胞)、幼仓鼠肾细胞(BHK细胞)、小鼠骨髓瘤细胞(例如，NS0细胞和Sp2/0细胞)和人视网膜细胞(例如，PER.C6细胞)。
如本文所用，术语“化学成分确定的培养基”、“多个化学成分确定的培养基”、“化学成分确定的杂交瘤培养基”或“多个化学成分确定的杂交瘤培养基”是指其中所有组分的种类和浓度是已知的合成生长培养基。化学成分确定的培养基不含细菌、酵母、动物或植物提取物、动物血清或血浆，但它们可包括或可不包括单个植物或动物来源的组分(例如，蛋白质、多肽等)。化学成分确定的培养基可包含支持生长所需的无机盐，诸如磷酸盐、硫酸盐等。碳源是确定的，并且通常为糖诸如葡萄糖、乳糖、半乳糖等，或其他化合物诸如甘油、乳酸酯、乙酸酯等。虽然某些化学成分确定的培养基还使用磷酸盐作为缓冲剂，但也可使用其他缓冲剂，诸如柠檬酸盐、三乙醇胺等。可商购获得的化学成分确定的培养基的示例包括但不限于ThermoFisher的CD杂交瘤培养基和CD杂交瘤AGTTM培养基、各种Dulbecco'sModified Eagle's(DME)培养基(Sigma-Aldrich Co；SAFC Biosciences,Inc)，Ham's营养物混合物(Sigma-Aldrich Co；SAFC Biosciences,Inc)，它们的组合等。制备化学成分确定的培养基的方法是本领域已知的，例如在美国专利6,171,825和6,936,441、WO 2007/077217以及美国专利申请公布2008/0009040和2007/0212770中。
如本文所用，术语“生物反应器”是指可用于细胞培养物生长的任何容器。生物反应器可为任何尺寸，只要其可用于培养的细胞。在某些实施方案中，此类细胞是哺乳动物细胞。通常，生物反应器将为至少1升并且可为10升、100升、250升、500升、1,000升、2,500升、5,000升、8,000升、10,000升、12,000升或更大，或其间的任何体积。在培养周期期间任选地控制生物反应器的内部条件，包括但不限于pH和温度。生物反应器可由适于保持悬浮在本发明培养条件下的培养基中的哺乳动物细胞培养物的任何材料构成，包括玻璃、塑料或金属。如本文所用，术语“制备生物反应器”是指用于制备感兴趣的多肽或糖蛋白的最终生物反应器。制备生物反应器的体积通常为至少500升，并且可为1,000升、2,500升、5,000升、8,000升、10,000升、12,000升或更大，或其间的任何体积。本领域的普通技术人员将意识到并且将能够选择用于实施本发明的合适的生物反应器。
预培养、细胞扩增和细胞产生在第1阶段和第2阶段中执行。在第1阶段中，从表达戈利木单抗的HC和LC序列的转染的Sp2/0细胞的单个工作细胞库小瓶开始预培养，并且细胞在培养瓶、一次性培养袋、以及配备有内部旋转过滤器的50L灌注种子生物反应器或配备有交替切向流中空纤维过滤器(ATF)细胞保留系统的200L灌注种子生物反应器中扩增。培养细胞直至获得接种500L或1000L制备生物反应器所需的细胞密度和体积。在第2阶段中，使用ATF系统在500L或1000L制备生物反应器中连续灌注细胞培养物。从ATF系统收集细胞培养渗透物(收获物)，同时将细胞返回到生物反应器，并且用新鲜培养基补充培养物。从生物反应器中移除的生物质可与从ATF系统中取出的收获物组合，然后可澄清以产生合并的收获物以用于进一步处理。
在第3阶段至第8阶段中，通过亲和和离子交换色谱步骤以及灭活或去除潜在病毒污染的步骤(溶剂/洗涤剂处理和病毒去除过滤)的组合执行从细胞培养物收获物纯化戈利木单抗。在第3阶段中，使用蛋白质A亲和色谱来澄清和纯化收获物和/或合并的收获物。将所得的直接产物捕获(DPC)洗脱物冷冻直到进一步加工。将DPC洗脱物过滤并在解冻后的第4阶段中合并，并且随后在第5阶段中用磷酸三正丁酯(TNBP)和聚山梨酸酯80(PS 80)处理以使可能存在的任何脂质包膜病毒失活。
在第6阶段中，使用阳离子交换色谱从戈利木单抗产物中去除TNBP和PS80试剂以及杂质。在第7阶段中使用阴离子交换色谱进一步纯化戈利木单抗产物以去除DNA、可能存在的病毒和杂质。在第8阶段中，将纯化的戈利木单抗产物稀释并通过病毒保留型过滤器过滤。
戈利木单抗的最终制备在第9阶段中执行。超滤步骤浓缩戈利木单抗产物，并且渗滤步骤添加制剂赋形剂并去除过程中缓冲盐。加入PS 80，并且将本体中间体过滤到聚碳酸酯容器中，以按配制本体冷冻储存。
批次被定义为一定量的材料、中间体或最终产物，其旨在使特征和质量保持一致，并且是在限定的制造周期期间制备的。术语“批次”应用于：
·预培养物
·50L种子反应器/500L制备生物反应器
·200L种子生物反应器
·1000L制备生物反应器
·直接产物捕获
·下游处理
在制造过程的多个阶段期间，分配各种批号。下面给出了定义为批次的制造过程的阶段的总结。
制造过程中的第一阶段是从工作细胞库(WCB)小瓶引发预培养物。每个预培养物或备用预培养物被识别为批次。
当预培养物满足接种标准时，将预培养物转移到50L种子生物反应器中，并且将一个50L种子生物反应器的内容物转移到一个500L制备生物反应器中，50L和500L生物反应器的每种组合被识别为批次。从生物反应器中移除的生物质可与从ATF系统中取出的收获物组合，然后可澄清以产生合并的收获物以用于进一步处理。来源于一个500L生物反应器的所有细胞培养上清液收获物或合并的收获物接收生物反应器批号加上对应于特定收获物的扩展名(即，001、002等)。
也可将预培养物转移到200L种子生物反应器中，并将一个200L种子生物反应器的内容物转移到一个1000L制备生物反应器中。每个单独的200L和1000L生物反应器被定义为批次。来源于一个1000L生物反应器的所有细胞培养上清液收获物接收生物反应器批号加上对应于特定收获物的扩展名(即，001、002等)。
使来自多个生物反应器的细胞培养上清液收获物合并，以在直接产物捕获(DPC)蛋白质A色谱步骤中纯化。每次DPC运行识别为批次。直径为28cm、40cm、60cm或80cm的柱可用于DPC。每个批次可包含不同量的戈利木单抗原材料，并且基于戈利木单抗原材料的量来使用不同直径的柱。合并多个DPC批次以引发下游处理(DSP)批次，其可用不同量的戈利木单抗引发。
本体制造过程允许满足过程中控制接受标准的任何收获物的合并，以通过蛋白质A色谱进行进一步处理(第3阶段)。类似地，可合并满足过程中控制规范的任何DPC批次(第4阶段)以便引发下游批次。然而，有助于DPC池的细胞培养收获物的质量加权平均年龄必须介于15天和51天之间，包括端值在内。
DPC池的质量加权平均年龄定义为每次收获所贡献的戈利木单抗质量乘以收获天数的总和除以DPC池的总戈利木单抗质量：
其中，m是每次收获对池贡献的戈利木单抗质量，并且d是完成收获批量的收集时的生物反应器天数。
包括输入(即，过程参数)和输出(即，过程中控制[IPC]和过程监测测试[PMT])两者的过程变量在整个制造过程中被控制并且记录在制备批次记录中以确保过程和产物一致性。
制造过程和过程控制的详细描述
第1阶段
预培养和扩增
(戈利木单抗)制备的第一阶段是从表达戈利木单抗的HC和LC序列的转染Sp2/0细胞的工作细胞库(WCB)小瓶引发预培养，并且随后在培养瓶、一次性培养袋和50L或200L种子生物反应器中扩增细胞培养物。培养细胞直至获得接种500L或1000L制备生物反应器所需的细胞密度和体积。
制造程序
将来自WCB的冷冻小瓶解冻并用补充有6mM L谷氨酰胺、0.5mg/L霉酚酸、2.5mg/L次黄嘌呤和50mg/L黄嘌呤的化学成分确定的杂交瘤培养基(CDH-A培养基)稀释至0.2-0.4×106个活细胞(VC)/mL的接种密度。解冻时的培养物活性必须为≥50％。初始传代在潮湿的CO2温育箱中的培养瓶中保持，其中温度和CO2控制在批次记录中限定的范围内。将培养物温育2天-3天直到获得0.6×106VC/mL的最小细胞密度。
扩大通过在培养瓶和一次性培养袋中依次扩增培养物来实现。通过用CDH-A培养基稀释，以0.2-0.4×106VC/mL的细胞密度开始每次传代。传代在每个扩增步骤温育2天-3天直到获得0.6×106VC/mL的最小细胞密度。一旦在一次性培养袋中以≥0.8×106VC/mL和≥80％培养物活性实现足够的培养体积，就可将培养物接种到50L或200L种子生物反应器中。
针对活细胞密度(VCD)、培养物活性和显微镜检查对每次预培养物传代取样。在接种50L或200L种子生物反应器之前，对预培养物取样以进行生物负荷。预培养物可在解冻后保持最多30天。如果检测到微生物污染或超过最大持续时间，则终止预培养。备用预培养物可在接种种子生物反应器时保留，或者可用新的WCB小瓶解冻开始。备用预培养物如上所述扩增，并经受与原代培养物相同的过程中控制和操作参数。可根据需要维持备用预培养物并将其用于接种50L或200L种子生物反应器。
当预培养物满足接种标准时，将一次性培养袋的内容物转移到50L或200L种子生物反应器中以实现≥0.3×106VC/mL的接种密度。向50L或200L种子生物反应器进料CDH-A培养物培养基，并且在全工作体积下以灌注模式操作。控制培养物的pH、温度和溶解氧浓度以支持细胞生长。使50L或200L种子生物反应器培养物扩增直到在≥80％培养物活性下获得≥2.0×106VC/mL的细胞密度。在VCD、培养物活性和显微镜检查的整个过程中对50L或200L种子生物反应器培养物取样。在接种500L或1000L制备生物反应器之前，对50L或200L种子生物反应器取样以用于生物负荷。如果50L或200L种子生物反应器的VCD达到≥2.0×106VC/mL并且500L或1000L制备生物反应器未准备好用于接种，则可在灌注模式下继续培养直至50L种子生物反应器接种后6天和200L种子生物反应器接种后7天的最长培养持续时间。如果检测到微生物污染或超过最大持续时间，则终止50L或200L种子生物反应器操作。
第2阶段
生物反应器制备
制造过程中的第二阶段是在500L或1000L制备生物反应器中灌注细胞培养物。从制备生物反应器收集细胞培养渗透物(收获物)，同时经由交替切向流(ATF)中空纤维细胞保留装置保留细胞，并且用新鲜培养基补充培养物。
制造程序
通过将50L或200L种子生物反应器的内容物转移到包含化学成分确定的杂交瘤培养基的500L或1000L制备生物反应器中来执行500L或1000L制备生物反应器的接种，该化学成分确定的杂交瘤培养基补充有6mM L谷氨酰胺、0.5mg/L霉酚酸、2.5mg/L次黄嘌呤和50mg/L黄嘌呤(CDH-A培养基)。转移的体积必须足以产生≥0.3×106个活细胞(VC)/mL的接种密度。将培养物维持在34.0-38.0℃的温度、6.80-7.40的pH和10％-80％的溶解氧浓度下。在整个500L或1000L制备过程中对活细胞密度(VCD)、培养物活性、生物负荷和免疫球蛋白G(IgG)浓度执行取样。
在接种之后，根据预定的计划表增加对培养物的培养基进料速率直到达到最大进料速率。将最大进料速率控制在0.80反应器体积/天-1.50反应器体积/天。当达到生物反应器的全部工作体积时，使用ATF系统引发灌注以从渗透物中分离细胞。渗透物通过ATF过滤器连续退出，而细胞培养物在ATF系统和生物反应器之间循环。ATF渗透物收集在生物过程容器(BPC)中。
当VCD达到≥8.5×106VC/mL，但不晚于接种500L或1000L制备生物反应器后第15天时，将生物反应器的培养基进料从CDH-A转换为补充有6mM L谷氨酰胺、0.5mg/L霉酚酸、2.5mg/L次黄嘌呤、50mg/L黄嘌呤和10mM乙酸钠的CD杂交瘤培养基(CDH-B培养基)。借助于来自培养物的可变生物质去除流，将生物反应器中的活细胞密度控制在至少12.0×106VC/mL的目标。
从生物反应器中移除的生物质可被丢弃或与ATF渗透物组合并通过过滤澄清。
ATF渗透物被指定为收获流。将乙二胺四乙酸(EDTA)添加到收获流中至5mM-20mM的浓度。在从生物反应器断开连接后，将收获物在2-8℃环境中的生物过程容器(BPC)中保存最长21天的周期。在直接产物捕获(第3阶段)之前，对每个收获的BPC取样IgG浓度、内毒素和生物负荷。
在500L或1000L制备生物反应器中的灌注细胞培养操作在接种后持续至多60天。在500L或1000L制备生物反应器操作的最后一天，对培养物取样以进行支原体和外来病毒测试。监测生物反应器IgG浓度并仅报告信息。
第3阶段
直接产物捕获(DPC)
在第3阶段中，使用MabSelectTM(GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA,USA)蛋白质A亲和色谱柱和自动色谱滑道过滤和纯化来自一个或多个500L或1000L制备生物反应器的收获物。从收获物捕获戈利木单抗产物，并去除过程相关杂质，包括培养基组分和宿主细胞相关杂质(例如，DNA和宿主细胞蛋白)，以及可能存在的病毒。将所得的直接产物捕获(DPC)洗脱物冷冻直到进一步加工。
蛋白质A柱制备和再生
在收获物装载之前，将MabSelectTM蛋白质A柱用50mM磷酸钠、150mM氯化钠、0.1％聚山梨酸酯80(PS 80)，pH7.3(平衡缓冲剂)平衡。监测柱流出物的pH和电导率以确保柱平衡。
使用后，可通过施加6M盐酸胍，然后用0.1M pH 3.5的柠檬酸钠淋洗，然后在平衡缓冲剂中洗涤，来再生MabSelectTM蛋白质A柱。也可使用的另选再生程序包括施加平衡缓冲剂，之后施加6M盐酸胍，之后施加平衡缓冲剂，之后施加0.1M pH 3.5的柠檬酸钠，之后施加平衡缓冲剂。如果需要，将MabSelectTM树脂保存在20％乙醇中。
制造程序
使收获物通过0.45μm过滤器并以20-50g/L的装载比装载到蛋白质A柱上。在用平衡缓冲剂洗涤柱直到280nm下的紫外吸光度(A280)返回到≤100mAU/mm路径长度之后，用另外2柱体积-6柱体积(CV)的平衡缓冲剂洗涤具有结合的戈利木单抗产物的柱。然后，用4.5CV-7.0CV的0.1M pH 5.0的柠檬酸钠执行中间体洗涤。
使用0.1M pH 3.5的柠檬酸钠缓冲剂洗脱戈利木单抗产物。洗脱产物的收集从≥50mAU/mm路径长度的上升A280信号处开始，并在≥50mAU/mm路径长度的下降A280信号处停止。在装载、洗涤和洗脱期间施加的流速为150cm/h-500cm/h。
在收集后，通过添加1.0M Tris缓冲剂(未滴定)和1.0M柠檬酸(未滴定)(如果需要)将戈利木单抗DPC洗脱物中和到6.0-6.5的pH。在pH调整期间，混合DPC洗脱物以确保溶液的均匀性。在0.2μm过滤之前，对经pH调整的戈利木单抗DPC洗脱物取样进行生物负荷分析。如果在第一0.2μm过滤期间使用的0.2μm过滤器的完整性测试失败，则可执行第二0.2μm过滤。
将经过滤的DPC洗脱物等分到聚碳酸酯容器中。对过滤后的DPC洗脱物取样以分析单体含量、生物负荷、内毒素和蛋白质浓度(由此计算步骤收率，其应为≥55％)。在≤-40℃下储存之前，可将过滤后的DPC洗脱物在15-25℃下保持≤48小时，并且在2-8℃下保持≤168小时的累积时间。
第4阶段
直接产物捕获(DPC)洗脱物的解冻和合并
在第4阶段中，在溶剂/洗涤剂处理之前，将多个直接产物捕获(DPC)洗脱物解冻、过滤并合并。
制造程序
选择DPC洗脱物，使得DPC池的质量加权平均年龄为15天-51天，包括端值在内。将冷冻的DPC洗脱物在15-25℃下解冻。当洗脱物明显不含冰时，认为解冻完成。解冻不得超过120小时。在解冻、合并和混合之后，测试合并的DPC洗脱物的pH，并且如果需要，通过添加1.0M Tris(未滴定)或1.0M柠檬酸(未滴定)调整到5.9-6.5的pH。在达到最终pH后，对合并的DPC洗脱物取样用于生物负荷分析。池的蛋白质浓度基于池中蛋白质的总池体积和总克数来计算。然后将合并的DPC洗脱物0.2μm过滤到混合容器中。在第5阶段中进一步处理之前，可将经过滤和合并的DPC洗脱物在15-25℃下储存≤48小时并且在2-8℃下储存≤168小时的累积时间。
第5阶段
DPC洗脱物的溶剂/洗涤剂(S/D)处理
在第5阶段中，将合并的直接产物捕获(DPC)洗脱物与磷酸三正丁酯(TNBP)和聚山梨酸酯80(PS 80)一起温育(溶剂/洗涤剂[S/D]处理)以使可能存在的任何脂质包膜病毒失活。
制造程序
将包含2％TNBP/10％PS 80(w/w)的S/D原液转移到具有合并的DPC洗脱物的混合容器中，直到达到0.08-0.12(v/v)的比率。将溶液混合以确保溶液的均匀性，然后转移到失活容器中。转移后，通过在15-25℃的温度下温育至少90分钟来实现病毒灭活。S/D处理的戈利木单抗产物装载到阳离子交换色谱柱上(第6阶段)在添加S/D化学品(第5阶段)后≤20小时内完成。
第6阶段
阳离子交换色谱
在第6阶段中，溶剂/洗涤剂(S/D)处理的第5阶段材料使用UNOsphere STM(Bio-Rad,Hercules,California,USA)阳离子交换色谱柱和自动色谱滑道进行纯化。第6阶段被设计成从产物中去除S/D加工化学品(磷酸三正丁酯[TNBP]和聚山梨酸酯80[PS 80])和其他杂质。
色谱柱制备和再生
装载前，将装填柱用30mM磷酸钠，pH6.5缓冲剂(平衡缓冲剂)平衡。监测柱流出物的pH和电导率以确保柱平衡。
在使用后，通过用50mM Tris、1.0M NaCl，pH 7.6-8.0缓冲剂洗涤，然后使用1.0MNaOH消毒，并且如果需要，储存在溶液(0.1M NaOH)中，来再生UNOsphere STM阳离子交换柱。
制造程序
在装载期间，将S/D处理的产物用水在线稀释以进行注射，从而实现1.5mS/cm-4.5mS/cm的装载电导率。在将柱装载到35g-55g戈利木单抗/L的装载比之后，用1.6柱体积-6.7柱体积(CV)的平衡缓冲剂以及其后5.2CV-9.8CV的50mM Tris、pH 7.6-8.0缓冲剂洗涤柱。
然后用50mM Tris、50mM NaCl，pH7.6-8.0缓冲剂从阳离子交换柱洗脱材料。洗脱产物的收集从≥30mAU/mm路径长度的280nm(A280)处的上升紫外吸光度处开始，并在≥75mAU/mm路径长度的下降A280处停止。在装载、洗涤和洗脱期间施加的流速为45cm/h-150cm/h。
对洗脱的材料取样以分析生物负荷、HCP、残余蛋白质A、聚集体和蛋白质浓度。步骤收率由蛋白质浓度计算，并且必须符合≥80％。然后在第7阶段中进一步处理之前，对产物进行0.2μm过滤。
另选地，对洗脱的材料取样以进行生物负荷，并且将产物0.2μm过滤，并且取样以分析HCP、残余蛋白质A、聚集体、和蛋白质浓度。步骤收率由蛋白质浓度计算，并且必须符合≥80％。然后在第7阶段中进一步加工材料。
戈利木单抗的第6阶段至第8阶段累积处理和保持时间证明可接受的范围(PAR)小于或等于115小时，其中制造操作范围(MOR)在受控室温(15-25℃)下为70小时-90小时。累积处理和保持时间被定义为在第6阶段产物洗脱结束时开始并且在第9阶段产物浓度开始时结束，并且包括主动处理步骤以及阶段之间的中间保持时间。考虑到3个阶段的材料条件不改变，尚未确定第6阶段、第7阶段或第8阶段的单独阶段特定限制。因此，过程控制基于三个阶段的累积时间。
第7阶段
阴离子交换色谱
在第7阶段中，使用Q SepharoseTMXL(GE Healthcare Bio-Sciences,Pittsburgh,PA,USA)阴离子交换色谱柱和自动色谱滑道纯化第6阶段材料。戈利木单抗流过树脂，而DNA、其他杂质和病毒(如果存在)保留下来。
色谱柱制备和再生
装载前，用50mM Tris、50mM NaCl，pH 7.6-8.0(平衡缓冲剂)平衡阴离子交换柱。监测柱流出物的pH和电导率以确保柱平衡。
使用后，通过用50mM Tris、1.0M NaCl，pH 7.6-8.0缓冲剂洗涤，然后使用2.0MNaOH消毒并用WFI、3.0M KCl和WFI或(仅在Janssen Biologics BV[JBV]下)连续淋洗，随后使用1.0M NaOH/1.0M NaCl消毒，并用WFI淋洗，并且如果需要，将柱储存在溶液(0.1MNaOH)中，来再生Q SepharoseTMXL阴离子交换色谱柱。
制造程序
将通过阳离子交换色谱(第6阶段)纯化的材料以50cm/h-250cm/h的装载流速和50g/L-150g/L的装载比装载到阴离子交换柱上。戈利木单抗流过柱(非结合模式)，并且一旦280nm处的紫外吸光度(A280)增加至≥30mAU/mm路径长度，便收集戈利木单抗。装载后，用平衡缓冲剂以50cm/h-250cm/h的流速洗涤柱。继续收集产物流通，直到A280读数返回到≥80mAU/mm路径长度。
对流通进行取样以分析生物负荷和蛋白质浓度。步骤收率由蛋白质浓度计算，并且必须符合≥80％。然后在第8阶段中进一步处理之前，对材料进行0.2μm过滤。
另选地，对流通进行取样以分析生物负荷，然后对材料进行0.2μm过滤并针对蛋白质浓度进行取样。步骤收率由蛋白质浓度计算，并且必须符合≥80％。此后，如果第8阶段处理需要，将材料用50mM Tris、50mM NaCl，pH 7.6-8.0稀释至≤6.5g/L的蛋白质浓度，并且混合，之后在第8阶段中进一步处理。
戈利木单抗的第6阶段至第8阶段累积处理和保持时间证明可接受的范围(PAR)小于或等于115小时，其中制造操作范围(MOR)在受控室温(15-25℃)下为70小时-90小时。累积处理和保持时间被定义为在第6阶段产物洗脱结束时开始并且在第9阶段产物浓度开始时结束，并且包括主动处理步骤以及阶段之间的中间保持时间。由于过程控制基于三个阶段的累积时间，因此尚未确定第6阶段、第7阶段或第8阶段的单独阶段特定限制。
第8阶段
病毒去除过滤
在第8阶段中，通过阴离子交换色谱纯化的第7阶段材料通过NFPTM病毒保留过滤器过滤。该步骤针对可能存在的小病毒和大病毒两者的去除。
NFPTM过滤器制备
在使用前，将NFPTM过滤器安装到NFPTM过滤系统中，用注射用水(WFI)冲洗，并高压灭菌。高压灭菌后，用WFI冲洗过滤器，然后测试水渗透性。用50mM Tris、50mM NaCl，pH7.6-8.0缓冲剂平衡过滤器。监测滤液的pH和电导率以确保TMNFP过滤器平衡。
在产物过滤和缓冲剂淋洗之后，对NFPTM过滤器进行单独的完整性测试。
制造程序
如果需要，在产物过滤之前，将通过阴离子交换色谱纯化的产物(在第7阶段中)用50mM Tris、50mM NaCl，pH 7.6-8.0稀释至≤6.5g/L的蛋白质浓度。稀释后，将产物溶液混合，然后通过0.2μm过滤器过滤。
然后使用TM3.1巴的压力，使稀释的产物通过平衡的NFP≤过滤器过滤。施加≤725g/m2的膜负载。可在该过程的产物过滤开始后20分钟内记录初始产物过滤通量率。产物过滤开始后，对于9个过滤器，初始产物过滤通量可记录在≤154L内，或者对于10个过滤器，初始产物过滤通量可记录在≤171L内。监测通量衰减以确保从初始通量率(定义为0％通量衰减)的减小不超过74％。在通量衰减达到74％的极限(定义为通量衰减极限)的情况下，可隔离过滤器并且停止对该过滤器的产物装载。将隔离的过滤器放回到线上以用于装载后缓冲剂冲洗步骤。在过滤期间，如果通量衰减达到74％的极限(定义为通量衰减极限)，则可停止过滤并立即执行缓冲剂冲洗。
一旦完成过滤，使用≤3.1巴的过滤压力，用50mM Tris、50mM NaCl，pH 7.6-8.0缓冲剂冲洗包括过滤器的系统总共≤10.1L/m2。收集缓冲剂冲洗液，将其与NFPTM过滤产物的其余部分组合并混合，并且针对生物负荷和蛋白质浓度进行取样。步骤收率由蛋白质浓度计算，并且必须符合≥90％。然后将合并的NFPμ滤液通过0.2TMm过滤器过滤，之后在第9阶段中进一步处理。
正好在NFPTM过滤之前，可对来自第7阶段的稀释材料取样以分析生物负荷。一旦完成过滤，使用≤3.1巴的过滤压力，用50mM Tris、50mM NaCl，pH 7.6-8.0缓冲剂冲洗包括过滤器的系统总共≤10.1L/m2。收集缓冲剂冲洗液，将其与NFPTM过滤材料的其余部分组合并混合，并且取样以分析蛋白质浓度。步骤收率由蛋白质浓度计算，并且在第9阶段中进一步处理之前必须符合≥90％。
戈利木单抗的第6阶段至第8阶段累积处理和保持时间证明可接受的范围(PAR)小于或等于115小时，其中制造操作范围(MOR)在受控室温(15-25℃)下为70小时-90小时。累积处理和保持时间被定义为在第6阶段洗脱结束时开始并且在第9阶段浓度开始时结束，并且包括主动处理步骤以及阶段之间的中间保持时间。由于过程控制基于三个阶段的累积时间，因此尚未确定第6阶段、第7阶段或第8阶段的单独阶段特定限制。
第9阶段
用以获得配制本体(FB)的浓缩和渗滤
在第9阶段中，浓缩并渗滤第8阶段材料以添加制剂赋形剂。然后，将聚山梨酸酯80(PS 80)添加到浓缩和渗滤的戈利木单抗溶液中以获得配制本体(FB)。
超滤系统制备
在使用前，将包括膜的超滤系统用50mM Tris、50mM NaCl，pH 7.6-8.0缓冲剂进行平衡。监测滤液和保留物的pH以确保膜平衡。
使用后，通过用注射用水(WFI)和1.0M NaOH冲洗来对包括膜的超滤系统进行消毒。然后将WFI冲洗通过系统，并且执行归一化水渗透性测试。如果需要，将系统和膜储存在适当的溶液中。
制造程序
将通过病毒去除过滤(在第8阶段中)纯化的戈利木单抗产物浓缩至40g/L-90g/L，并使用8渗滤体积-12渗滤体积的10mM组氨酸、4.5％山梨醇、pH 5.3缓冲剂(渗滤缓冲剂)进行渗滤。渗滤后，测试滤液pH、电导率和渗透压，以确保缓冲剂交换完全执行。缓冲剂交换后，将溶液过浓缩至≤180g/L，然后通过清空系统进行回收。在浓缩、渗滤和过浓缩期间，进料和保留物压力可分别控制为≤2.8巴和≤2.1巴。另选地，在浓缩、渗滤和过浓缩期间，跨膜压力(TMP)可控制在≤2.5巴。监测储料罐的温度为≤35℃。
在确定过浓缩的戈利木单抗产物的蛋白质浓度后，使用≤100％计算量的稀释所需渗滤缓冲剂，用缓冲剂冲洗从系统中回收剩余产物。在确定组合的回收缓冲剂冲洗和过浓缩戈利木单抗产物的蛋白质浓度后，通过添加≤100％计算量的稀释所需渗滤缓冲剂来进一步调整产物的浓度。监测收率，并且该收率应为≥90％。
然后通过将10mM组氨酸、4.5％山梨醇、pH 5.3缓冲剂中的1％PS 80以0.013％-0.017％(w/v)的缓冲剂与产物比率添加至浓缩和渗滤的戈利木单抗产物来制备FB。在添加之后，将戈利木单抗产物混合以确保溶液的均匀性。对FB取样以分析生物负荷，并使用预过滤器过滤，然后0.2μm过滤到聚碳酸酯容器中。取出产物样品用于戈利木单抗低聚糖IPC测试和FB释放测试。通过正相阴离子交换HPLC与荧光检测来分析低聚糖组成。在最终0.2μm过滤之前和/或之后，可将FB保持在15-25℃或2-8℃下总共≤120小时，然后储存在≤-40℃下。
实施例6-γ分布转变分析(GDTA)方法用于 (戈利木单抗)制造中使用 的色谱柱的应用
该实施例描述了在抗TNF抗体(例如，抗TNFα抗体(戈利木单抗))的制造期间将GDTA方法应用于纯化中的色谱柱，例如第3阶段中的蛋白质A亲和色谱柱、第6阶段中的阳离子交换色谱柱和第7阶段中的阴离子交换色谱柱。
第3阶段-蛋白质A亲和色谱柱
对于第3阶段，使用MabSelectTM蛋白质A亲和色谱柱，分析的转变前沿包括例如洗脱前沿(图40)、在用盐酸胍消毒期间生成的前沿(图41)以及在用0.1M pH 3.5的柠檬酸钠消毒后淋洗期间生成的前沿(图42)。所示结果表示160个批次的(戈利木单抗)的分析。趋势的初步评价显示，柱性能存在一些明显漂移，并且在柱包装之间观察到一些差异。将完成对该数据的完整分析，包括与其他可用批次信息和柱性能数据的比较，以便建立用于未来实施用于实时过程监测的GDTA方法的控制限度。
第6阶段-阳离子交换色谱柱
对于第6阶段，使用UNOsphere STM阳离子交换色谱柱，分析的转变前沿包括例如在装载溶剂/洗涤剂(S/D)处理材料期间生成的前沿(图43)、在洗脱期间生成的前沿(图44)以及在反萃取期间生成的前沿(图45)。所示结果表示72个批次的(戈利木单抗)的分析。趋势的初步评价显示，柱性能存在一些明显漂移，并且在柱包装之间观察到一些差异。将完成对该数据的完整分析，包括与其他可用批次信息和柱性能数据的比较，以便建立用于未来实施用于实时过程监测的GDTA方法的控制限度。
第7阶段-阴离子交换色谱柱
对于第7阶段，使用Q SepharoseTMXL阴离子交换色谱柱，分析的转变前沿包括例如在用氢氧化钠清洁期间生成的前沿(图46)以及在反萃取期间生成的前沿(图47)。所示结果表示71个批次的(戈利木单抗)的分析。趋势的初步评价显示，柱性能存在一些明显漂移，并且在柱包装之间观察到一些差异。将完成对该数据的完整分析，包括与其他可用批次信息和柱性能数据的比较，以便建立用于未来实施用于实时过程监测的GDTA方法的控制限度。
虽然本文已经描绘和详述了优选的实施方案，但对于相关领域的技术人员将显而易见的是，可在不脱离本发明的实质的情况下进行各种修改、添加、取代等，并因此认为这些在如下权利要求中所定义的本发明的范围之内。

Claims (10)

1.一种在用于制备抗TNF抗体的制造方法中操作色谱柱的方法，所述抗TNF抗体包含含有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的重链和含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的轻链或它们的抗原结合片段，所述方法包括：
在包括柱填料的所述色谱柱的第一操作期间在至少一个流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用用于上升转变前沿的式Ia或用于下降转变前沿的式Ib，基于所述至少一个流动相变前沿的所收集的柱出口信号和累积流量参数来确定模型γ累积分布曲线，
或者
其中C为给定V的柱出口信号，V为累积流量除以柱体积，Γ是上不完全γ函数，γ是下不完全γ函数，并且k、θ和Vi分别为用于限定所述曲线的形状、缩放和偏移参数；
使用式II和所述模型γ累积分布曲线参数k、θ和Vi来计算所述至少一个流动相变前沿的理论塔板等效高度（HETP）值，
其中
L=柱长度；以及
基于所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的质量；
其中如果所计算的HETP值高于控制下限并且低于控制上限，则所述色谱柱填料的质量是可接受的，其中使用确定的HETP值的编译趋势来确定所述控制下限和控制上限；或者
所述方法还包括如果所计算的HETP值低于控制下限或者高于控制上限，则调节、替换或再装填所述色谱柱，以改进所述色谱柱填料的质量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中基于所述评估来调节、替换或再装填所述色谱柱提高制造收率或者制备所述抗TNF抗体。
3.根据权利要求2所述的方法，还包括：
在所述色谱柱填料的一次或多次后续使用期间，在对应的流动相变前沿的两个或更多个间隔处收集柱出口信号和累积流量参数；
使用在所述色谱柱填料的所述一次或多次后续使用中的每一次使用期间收集的所述柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和所述计算；
基于所述执行来在所述一次或多次后续使用中的每一次使用期间确定所述色谱柱填料的HETP值；
编译所述一次或多次后续使用的所述色谱柱填料的所确定的HETP值的趋势；以及
基于所编译的趋势来识别所述色谱柱填料的所述质量的变化，其中所述色谱柱的所述调节、替换或再装填基于所述识别。
4.根据权利要求3所述的方法，其中与所述柱填料的一次或多次早期使用中的所述色谱柱填料的HETP值相比，所述柱填料的所述一次或多次后续使用中的所述色谱柱填料的HETP值的增加识别出所述色谱柱填料的质量降低。
5.根据权利要求2所述的方法，其中收集在所述柱填料的所述第一操作期间两个或更多个不同的流动相变前沿的柱出口信号和累积流量参数，所述方法包括：
使用针对所述两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿独立地收集的所述柱出口信号和累积流量参数来执行所述确定和计算，以计算所述两个或更多个不同的流动相变前沿中的每一个流动相变前沿的HETP值；
基于两个或更多个所计算的HETP值来评估所述色谱柱填料的所述质量，由此所述色谱柱的所述调节、替换或再装填基于所述评估。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述色谱柱选自：蛋白质A亲和色谱柱、阳离子交换色谱柱和阴离子交换色谱柱。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质A亲和色谱柱包括MABSELECT®蛋白质A亲和色谱柱，所述阳离子交换色谱柱包括UNOSPHERE™ S阳离子交换色谱柱，并且所述阴离子交换色谱柱包括Q SEPHAROSE® XL阴离子交换色谱柱。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述蛋白质A亲和色谱柱中的所述流动相变前沿从选自以下项的一个或多个前沿生成：在抗TNF抗体的洗脱期间生成的前沿、在用盐酸胍对所述柱进行消毒期间生成的前沿以及在用0.1M pH 3.5的柠檬酸钠对所述柱进行消毒后淋洗期间生成的前沿。
9.根据权利要求6所述的方法，其中所述阳离子交换色谱柱中的所述流动相变前沿从选自以下项的一个或多个前沿生成：在装载包含抗TNF抗体的溶剂/洗涤剂处理材料期间生成的前沿、在洗脱所述抗TNF抗体期间生成的前沿以及在柱反萃取期间生成的前沿。
10.根据权利要求6所述的方法，其中所述阴离子交换色谱柱中的所述流动相变前沿从选自以下项的一个或多个前沿生成：在用氢氧化钠清洁所述柱期间生成的前沿以及在柱反萃取期间生成的前沿。
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