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CN112041436A - 雷帕霉素抗性细胞 - Google Patents

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CN112041436A
CN112041436A CN201980028787.3A CN201980028787A CN112041436A CN 112041436 A CN112041436 A CN 112041436A CN 201980028787 A CN201980028787 A CN 201980028787A CN 112041436 A CN112041436 A CN 112041436A
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CN
China
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cell
domain
nucleic acid
rapamycin
sequence
Prior art date
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Application number
CN201980028787.3A
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安德鲁·M·沙尔博格
戴维德·J·罗林斯
凯伦·索默
塞缪尔·韦斯特
玉池·蒋·霍纳克
竹内亮
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Seattle Childrens Hospital
Original Assignee
Seattle Childrens Hospital
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Abstract

本申请尤其涉及包含用于在宿主细胞中表达以使其对雷帕霉素具有抗性的蛋白质的组合物。本申请进一步涉及使用本文公开的蛋白质、细胞和组合物来调节细胞信号传导和用于细胞的选择性扩增的方法。

Description

雷帕霉素抗性细胞
相关申请的交叉引用
本申请要求2018年4月27日提交的名称为“RAPAMYCIN RESISTANT CELLS”的美国临时专利申请第62/663,562号的优先权的权益，以引用的方式在此将上述申请以其整体明确地并入本文。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。将序列表作为2019年4月25日创建的标题为SCRI186WOSEQLISTING的文件提供，其大小为约120Kb。序列表的电子格式内的信息以引用的方式整体并入本文。
技术领域
本文提供了化学诱导的信号传导复合物，其中，在雷帕霉素或相关化合物的存在下使两个组分连接在一起以产生活化的信号传导复合物，所述复合物与细胞内表达的裸露的FKBP-雷帕霉素结合蛋白结合使用来赋予宿主细胞雷帕霉素抗性。
背景技术
雷帕霉素(也称为西罗莫司)是分离自细菌吸水链霉菌(Streptomyceshygroscopicus)的复杂的大环内酯类天然产物，所述细菌于1975年在复活节岛(又称RapaNui)的土壤样品中发现(Huang,S.等，(2003).Cancer Biol.Ther.,2(3):222-232；Abraham,R.T.等，(1996).Ann.Rev.Immunol.,14:483-510；Pollock,R.等，(2002).Curr.Opin.Biotechnol.,13(5):459-467；Bayle,J.H.等，(2006).Chem.Biol.,13(1):99-107)。雷帕霉素介导蛋白FKBP12(FK506结合蛋白12)和FRB(FKBP12雷帕霉素结合结构域)的异二聚化(Huang,S.等，(2003).Cancer Biol.Ther.,2(3):222-232)。由于雷帕霉素的出色的生理特性(包括良好的药代动力学参数，例如穿过血脑屏障的膜通透性和溶解度的良好水平以及口服生物利用度(Abraham,R.T.等，(1996).Ann.Rev.Immunol.,14:483-510))，它已在哺乳动物细胞和生物体中的广泛的应用中被用作小分子二聚化剂(例如，Pollock,R.等，(2002).Curr.Opin.Biotechnol.,13(5):459-467)。
CISC(化学诱导的信号传导复合物)是多组分合成蛋白复合物，其被配置用于作为两种嵌合蛋白在宿主细胞中共表达，如国际专利申请号PCT/US2017/065746中所述，以引用的方式将其公开内容整体并入本文。CISC的每个嵌合蛋白组分都具有雷帕霉素结合复合物的一半作为细胞外结构域，融合至细胞内信号传导复合物的一半。将编码CISC的核酸递送至宿主细胞允许可通过雷帕霉素或雷帕霉素相关化合物的存在进行控制的细胞中的细胞内信号传导。
然而，尽管雷帕霉素驱动的CISC二聚化可以触发细胞内信号传导，但是雷帕霉素的存在还可以抑制宿主细胞的生长和活力，从而限制了它们用于治疗以及研究工作中的效用。因此，需要新的组合物和方法，所述组合物和方法允许使用雷帕霉素介导的CISC细胞内信号传导，但矫正了雷帕霉素或雷帕霉素相关化合物对宿主细胞的生长和活力的负面影响。
发明内容
本文尤其提供了用于使细胞对雷帕霉素具有抗性的组合物和方法。
在一个方面，本文描述了一种系统，所述系统包括：(i)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码该DNA核酸内切酶的核酸；(ii)向导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸，该向导RNA包含与细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及(iii)包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，其中，DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过DNA核酸内切酶与gRNA的关联而形成的复合物能够促进供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。在一些实施方式中，DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。在一些实施方式中，将编码DNA核酸内切酶的核酸进行密码子优化以用于在经遗传修饰的细胞中表达；将编码gRNA的核酸进行密码子优化以用于在经遗传修饰的细胞中表达；和/或将供体盒中的一个或多个编码序列进行密码子优化以用于在经遗传修饰的细胞中表达。在一些实施方式中，供体模板被配置以使得供体盒能够通过同源介导修复(HDR)整合入靶基因组基因座中。在一些实施方式中，供体模板被配置以使得供体盒能够通过非同源末端连接(NHEJ)整合入靶基因组基因座中。在一些实施方式中，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，脂质体或脂质纳米颗粒进一步包含gRNA或编码gRNA的核酸。在一些实施方式中，该系统进一步包括与核糖核蛋白(RNP)复合物中的gRNA关联的DNA核酸内切酶。
在一些实施方式中，提供了裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。在一些实施方式中，裸露的FRB多肽包括SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
在一些实施方式中，供体盒进一步包括编码二聚化可激活化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分的一个或多个核酸序列，其中，CISC的多肽组分包括：(i)第一CISC组分，包括第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；以及(ii)第二CISC组分，包括第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；其中，第一CISC组分和第二CISC组分被配置以使得当在细胞中表达时，它们能够在雷帕霉素或雷帕霉素类似物(rapalog)的存在下二聚化，以产生具有信号传导能力的CISC。
在一些实施方式中，第一或第二细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FRB结构域或其功能衍生物。在一些实施方式中，第一CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域，和/或所述第二CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域。在一些实施方式中，第一或第二CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体γ亚基(IL2Rγ)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体β亚基(IL2Rβ)结构域或其功能衍生物。在一些实施方式中，IL2Rβ结构域多肽被截短。在一些实施方式中，编码IL2Rβ结构域的核酸包括SEQ ID NO：4的核苷酸序列。在一些实施方式中，IL2Rβ结构域包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
在一些实施方式中，其中，雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903和AP23573以及它们的代谢物和衍生物。
在一些实施方式中，编码裸露的FRB结构域的核酸在编码CISC的多肽组分的一个或多个核酸序列的下游。在一些实施方式中，供体盒进一步包含编码如下之间的自切割多肽的核酸序列：(i)编码CISC的多肽组分的一个或多个核酸序列中的每一个；和/或(ii)编码裸露的FRB结构域的核酸和编码CISC的多肽组分的相邻核酸序列。
在一些实施方式中，在供体盒中编码的自切割多肽的每一个独立地选自于由P2A、T2A、E2A和F2A所组成的组。在一些实施方式中，供体盒进一步包括可操作地连接至所述供体盒中的一个或多个编码序列的启动子。在一些实施方式中，启动子是诱导型启动子或组成型启动子。在一些实施方式中，启动子是MND启动子。在一些实施方式中，供体盒进一步包括编码可检测标志物的核酸。在一些实施方式中，可检测标志物是绿色荧光蛋白(GFP)多肽、mCherry多肽或低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)。在一些实施方式中，编码裸露的FRB结构域多肽的核酸缺少编码内质网定位信号多肽的核酸。在一些实施方式中，供体盒包括来自SEQ ID NO：3的核苷酸序列的核酸序列。
在一些实施方式中，供体模板是病毒载体。在一些实施方式中，病毒载体是慢病毒、腺病毒或腺相关病毒(AAV)载体。
在一个方面，本文描述了编辑细胞基因组的方法，该方法包括向细胞提供：(i)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码该DNA核酸内切酶的核酸；(ii)向导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸，所述向导RNA包含与该细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及(iii)包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，其中，DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过DNA核酸内切酶与gRNA的关联而形成的复合物能够促进所述供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。
在一个方面，本文提供了根据如本文所述的编辑细胞基因组的方法制备的经遗传修饰的细胞，该方法包括向细胞提供：(i)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码该DNA核酸内切酶的核酸；(ii)向导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸，所述向导RNA包含与该细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及(iii)包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，其中，DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过DNA核酸内切酶与gRNA的关联而形成的复合物能够促进所述供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。在一些实施方式中，供体盒被配置以使得裸露的FRB结构域多肽在细胞内表达。在一些实施方式中，细胞是真核细胞。在一些实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞是造血干细胞。在一些实施方式中，细胞是淋巴细胞。在一些实施方式中，细胞是前体T细胞或调节性T(Treg)细胞。在一些实施方式中，细胞是CD34+、CD8+或CD4+细胞。在一些实施方式中，细胞是选自于由如下所组成的组中的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和本体CD8+T细胞。在一些实施方式中，细胞是选自于由如下所组成的组中的CD4+T辅助淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和本体CD4+T细胞。在一些实施方式中，与供体盒缺少编码裸露的FRB结构域多肽的核酸的相应细胞相比，在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的情况下，该细胞更大程度地增殖。在一些实施方式中，雷帕霉素或雷帕霉素类似物以从0.1nM或从约0.1nM至100nM或至约100nM的浓度存在。
在另一方面，本文描述了激活本文公开的经遗传修饰的细胞的方法，该方法包括使细胞与雷帕霉素或雷帕霉素类似物接触。在一些实施方式中，雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573，或它们中任一种的代谢物、衍生物和/或组合。在一些实施方式中，与细胞接触的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的浓度为从0.1nM或从约0.1nM至100nM或至约100nM。在一些实施方式中，其中在与雷帕霉素或雷帕霉素类似物接触后，选择性地扩增表达CISC组分的细胞。
在又一方面，本文描述了选择性地扩增包含在混合细胞群中的本文所述的经遗传修饰的细胞的群的方法，该方法包括使混合细胞群与雷帕霉素或雷帕霉素类似物接触，其中，表达CISC组分和裸露的FRB结构域的经遗传修饰的细胞被激活并在体外或在体内以比混合细胞群中的其它细胞更高的程度扩增。在一些实施方式中，雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573，或它们中任一种的代谢物、衍生物和/或组合。在一些实施方式中，与所述混合细胞群接触的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的浓度为从0.1nM或从约0.1nM至100nM或至约100nM。
除非从实施方式或方面的上下文中明确地或清楚地排除，否则本文所述的各个方面和实施方式均能够一起使用。
在本申请文件中，引用了各种专利、专利申请和其它类型的出版物(例如，期刊文章、电子数据库条目等)。本文引用的所有专利、专利申请和其它出版物的公开内容出于所有目的以引用的方式将其整体并入本文。
附图说明
图1是用于表达细胞内裸露的“诱饵(decoy)”FRB(FKBP12雷帕霉素结合结构域)的慢病毒构建体的示意图。表达与CISC一起的额外的FRB*结构域的构建体称为“诱饵-CISC”或“DISC”。图中的星号表示该序列具有点突变，使其能够与雷帕霉素类似物AP21967以及雷帕霉素相互作用(相对于mTOR氨基酸序列为T2098L；Bayle,J.H.等，(2006).Chem.Biol.,13(1):99-107)。
图2是示出了假定的裸露的FRB在T细胞中的作用机理的概念图。
图3描绘了对在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物AP21967的情况下培养的细胞中表达CISC构建体与DISC构建体的T细胞的扩增进行比较的图。与在所测试的所有剂量的雷帕霉素下仅用CISC构建体转导的细胞相比，DISC构建体推动了改善的T细胞的扩增。
图4是示出在所测试的CISC构建体的各种迭代中引入的显著的氨基酸变化的概念图。产生了额外的四对FRB-IL2Rβ/FKBP-IL2Rγ受体蛋白(V4-V7)，所述蛋白包含一个或多个PAAL间隔区氨基酸序列和/或GGS或GGSP接头氨基酸序列。额外的间隔区和接头氨基酸序列位于细胞外FRB/FKBP和IL2Rβ/IL2Rγ结构域之间的交界面处或位于IL2Rβ结构域内。
图5是示出在具有右侧图例所示的所指出的培养基添加剂的培养物中数周内的慢病毒转导的T细胞的数量扩增的图。
图6描绘了示出如下的两个图，在具有雷帕霉素(顶部)或雷帕霉素类似物AP21967(底部)的培养物中的随时间的经慢病毒转导的T细胞的富集(以mCherry+细胞的百分比读出)。
图7是示出用于直接对具有DISC和μDISC构建体的经雷帕霉素诱导的T细胞扩增进行比较的慢病毒构建体的概念图(包括原始CISC构建体作为参照)。
图8是示出在具有指出浓度的雷帕霉素的培养物中数天内的经慢病毒转导的T细胞(mCherry+)的数量的图。
图9是示出在具有不同剂量的雷帕霉素的培养物中9天后经慢病毒转导的T细胞(以mCherry+细胞的百分比读出)的富集的图。
图10是示出在具有不同剂量的雷帕霉素的培养物中21天后经慢病毒转导的(mCherry+)T细胞的成倍数量扩增的图。将成倍增加计算为第21天的mCherry+细胞的数量除以第0天的mCherry+细胞的数量。x轴上从左向右所示的为用1nM雷帕霉素处理的细胞(前三个条形)、用5nM雷帕霉素(条形4-6)处理的细胞和用10nM雷帕霉素处理的细胞(条形7-9)。
图11是概述用于基因编辑实验中以将DISC构建体插入内源FOXP3基因中的实验方案的图。示出了AAV6供体模板(顶部)和使用CRISPR/CAS9 RNP和AAV6递送供体模板的基因编辑程序(底部)，用于在内源FOXP3的上游引入驱动DISC表达的异位启动子。gRNA＝向导RNA；5′和3′HA＝人FOXP3同源臂。
图12示出了说明用于基因编辑实验中以将DISC构建体插入T调节性T细胞中的内源FOXP3基因中的实验设计的示意图。MND启动子在加HA标签的内源FOXP3上游驱动DISC/μDISC表达。处于两端的5′和3'同源臂为人FOXP3同源物。
图13A是示出在两阶段扩增方案中使用的AAV构建体的结构的图，所述两阶段扩增方案被设计用于改善使用DISC(edTreg)成功编辑的CD4+T细胞的扩增，其中，MND启动子驱动微-DISC的细胞表面表达和加HA标签的FOXP3的细胞内表达。图13B总结了本文所述的两阶段扩增实验的结果，其中，沿X轴指出了扩增阶段1的细胞条件。还指出了扩增阶段2的条件。
图14A-图14B以图形方式总结了编辑后十天和十五天的培养物中相对于细胞总数的μDISC edTreg的数量。沿X轴指出了扩增阶段0的培养条件。培养物中的总细胞数以白色指出，而成功编辑(HA+/μDISC+和FOXP3+)的数量以黑色指出。基于这些发现，选择μDISCedTreg生产的最佳条件作为从左侧起第二个条件，这对应于扩增阶段0的过程中使用5ng/mL IL-2。
图15A-图15B总结了流式细胞术实验的结果，进行所述流式细胞术实验以说明转移至NSG后7天，在经雷帕霉素处理相比于媒介中的μDISC GFP edTreg的扩增。图表为75μL外周血样品中的GFP+％(图15A)或GFP+细胞数量(图15B)的平均值±s.d.。IR＝辐照；Rapa＝雷帕霉素，在整个实验中每两天0.1mg/kg i.p.。P值使用学生T检验获得。在每个图中，两个左侧条形代表辐照的样品，而两个右侧条形代表无辐照的样品。
图16A-图16B总结了实验的结果，进行所述实验以说明转移至NSG后14天，在经雷帕霉素处理相比于媒介中的μDISC GFP edTreg的扩增。对于来自各群组的代表性小鼠，图16A中的流式细胞术图示出人CD45或GFP相对于活性染料(活/死)或前向细胞散射(FCS)。图16A右侧的图表总结了各群组的结果。图16B示出了75μL外周血样本中的GFP+细胞的数量的平均值±s.d.。IR＝辐照；Rapa＝雷帕霉素，在整个实验中每两天0.1mg/kg i.p.。P值使用学生T检验获得。
图17总结了用或未用雷帕霉素处理的动物中的随时间的受体小鼠体内外周血中存在的μDISC GFP edTreg细胞的百分比(％)和数量。图表总结了流式细胞术数据；每个符号代表单独的小鼠，并且平均值±s.d.通过条形显示。在顶部绘制了CD45+CD4+门控中的GFP％；在底部绘制了外周血样本中GFP+细胞的数量。
图18示出了体内免疫抑制模型的Kaplan-Meier存活曲线。Teff＝仅T效应子组。在这些实验中，所有组均接受T效应细胞。
具体实施方式
本文尤其描述了旨在与化学诱导的信号传导复合物(CISC)多肽一起使用的组合物和方法，用于在经工程化的宿主细胞中通过CISC产生雷帕霉素介导的细胞内信号传导，但没有与雷帕霉素对宿主细胞的影响(例如，通过使经工程化的宿主细胞对雷帕霉素或雷帕霉素相关的化合物、如雷帕霉素类似物的生长抑制具有抗性)相关的伴随的细胞毒性。在一些实施方式中，本文公开的组合物和方法旨在与CISC多肽一起使用，所述CISC多肽是被配置用于在宿主细胞中作为两种嵌合蛋白共表达的多组分合成蛋白复合物。可以对国际专利申请号PCT/US2017/065746(以引用的方式并入本文)中描述的CISC信号传导系统进行工程化，以诱导响应于雷帕霉素(其为用于多种治疗和研究应用的大环内酯化合物)的细胞内信号传导。CISC的每个嵌合蛋白组分都可以具有雷帕霉素结合复合物的一半(分别为FK506结合蛋白(FKPB)结构域或FKBP雷帕霉素结合(FRB)结构域)作为细胞外结构域，所述细胞外结构域融合至细胞内信号传导复合物的一半。雷帕霉素与CISC的胞外结构域的结合诱导CISC异二聚体的形成和随后的通过嵌合多肽的胞内信号传导复合物部分进行的胞内信号传导。
尽管有用，但已经观察到暴露于雷帕霉素的CISC表达细胞与使用雷帕霉素类似物AP21967获得的增殖量相比经历较少的增殖。雷帕霉素的哺乳动物靶标(mTOR)(也称为FK506结合蛋白12雷帕霉素相关蛋白1(FRAP1))是在人中由MTOR基因编码的激酶。mTOR是蛋白激酶的磷脂酰肌醇3-激酶相关激酶家族的成员。该蛋白是借由磷酸化底物刺激细胞生长的生长调节剂，其控制合成代谢过程(如脂质合成和mRNA翻译)以及阻止分解代谢过程(如自噬)。
申请人已经设计构建体和方法来克服抑制增殖的问题。如图2所示，含有FKBP结构域的蛋白质在细胞的胞质中天然表达，而mTOR包含FRB结构域。不受理论的束缚，据信雷帕霉素/FKBP复合物与mTOR的FRB结构域的结合阻断或减少mTOR介导的胞内信号传导，从而引起mRNA翻译和细胞生长减少。因此，再次不受理论的束缚，本申请的发明人假定裸露的FRB蛋白结构域(不受mTOR栓系)的细胞内表达可用于结合细胞内雷帕霉素/FKBP复合物，从而减弱雷帕霉素对表达CISC的细胞的生长的负面影响。先前的报道表明，mTOR的裸露的FRB结构域的细胞内表达对哺乳动物细胞而言是有毒的，因此不是在人细胞中细胞内缓冲雷帕霉素-FKBP与mTOR的FRB结构域相互作用的合适手段(参见Vilella-Bach,M.等，(1999).J.Biol.Chem.,274(7):4266-4272)。此外，FRB结构域中的T2098L突变(相对于mTOR氨基酸序列的序列编号)使其相对于野生型蛋白不稳定，使其在细胞中更快降解。然而，突变蛋白通过结合至雷帕霉素而稳定化(Stankunas,K.等，(2003).Mol.Cell.,12(6):1615-1624)。
与这些先前的报道相反，并且如将在本文中进一步描述的，本申请的发明人出乎预料地发现，在表达CISC的宿主细胞中细胞内表达裸露的“诱饵”FRB(FRB*)结构域可以有效地减弱雷帕霉素的生长抑制作用。将与CISC一起表达额外的FRB*结构域的构建体称为“诱饵-CISC”或“DISC”。由裸露的细胞内表达的FRB结构域赋予的雷帕霉素抗性因此增加了响应于雷帕霉素表达CISC的细胞用于治疗应用以及研究细胞内信号传导途径二者的实用性。
定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员的通常理解相同的含义。除非另有说明，否则本文引用的所有专利、申请、公开的申请和其它出版物均明确地通过引用整体并入本文。如果本文中术语有多个定义，除非另有说明，否则以本节中的定义为准。
除非上下文另有明确规定，否则单数形式的“一个/一种(a/a)”和“该(the)”包括复数指代物。
当根据说明书阅读时，“约”具有其平常和普通的含义，并且可以在例如提及可测量的值时使用，并且可以意在包括与指定值相差±20％、或±10％、或±5％、或±1％、或±0.1％的变化。
如本文中所用，“蛋白质序列”是指作为蛋白质的一级结构的氨基酸的多肽序列。如本文中所用，“上游”是指多核苷酸上的定位的5′位置，以及朝向多肽上的定位的N-末端的位置。如本文中所用，“下游”是指核苷酸上的定位的3′位置，以及朝向多肽上的定位的C-末端的位置。因此，术语“N-末端”是指多核苷酸上的元件或定位的朝向多肽上的定位的N-末端的位置。
“核酸”或“核酸分子”是指多核苷酸，诸如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)产生的片段，以及通过连接、断裂、核酸内切酶作用和外切核酸酶作用产生的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸(诸如DNA和RNA)的单体或天然存在的核苷酸的类似物(例如，天然存在的核苷酸的对映体形式)或两者的组合组成。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，其包含与聚酰胺骨架连接的天然存在的或经修饰的核酸碱基。核酸可以是单链或双链的。在一些实施方式中，提供了编码融合蛋白的核酸序列。在一些实施方式中，核酸是RNA或DNA。
本文中使用“编码(Coding for)”或“编码(encoding)”，其是指多核苷酸中特定核苷酸序列(诸如基因、cDNA或mRNA)用作合成其它大分子诸如确定的氨基酸序列的模板的性质。因此，如果对应于基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则该基因编码蛋白质。
“编码多肽的核酸序列”包括为彼此的简并形式且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。在一些实施方式中，提供了核酸，其中所述核酸编码融合蛋白。
“载体”、“表达载体”或“构建体”是用于将异源核酸引入细胞的核酸，其具有调控元件以在细胞中提供异源核酸的表达。载体包括但不限于质粒、微环、酵母和病毒基因组。在一些实施方式中，载体是质粒、微环、酵母或病毒基因组。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在一些实施方式中，表达载体是慢病毒。在一些实施方式中，载体是腺相关病毒(AAV)载体(例如但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10或AAV11)。在一些实施方式中，载体用于在细菌系统(诸如大肠杆菌(E.coli))中表达蛋白质。
如本文中所用，术语“表达”或“蛋白质表达”是指转录的RNA分子翻译成蛋白质分子。蛋白质表达的特征可在于其时间、空间、发育或形态学特征以及定量或定性指征。在一些实施方式中，表达一种或多种蛋白质，使得所述蛋白质被配置(例如被定位)用于在配体存在的情况下进行二聚化。
如本文中所用，“融合蛋白”或“嵌合蛋白”是通过连接两个或更多个基因产生的蛋白质，所述基因最初编码单独的蛋白质或蛋白质的部分。融合蛋白也可以由来自两种或更多种单独的蛋白质的特定蛋白质结构域组成。该融合基因的翻译可产生具有源自每种原始蛋白质的功能特性的单个或多个多肽。重组融合蛋白可通过重组DNA技术人工产生，用于生物研究或治疗。此类用于产生融合蛋白的方法是本领域技术人员已知的。一些融合蛋白组合整个肽，因而可包含原始蛋白质的所有结构域，尤其是功能结构域。然而，其它融合蛋白、尤其是非天然存在的那些融合蛋白仅组合编码序列的部分，因而不保持形成它们的亲本基因的原始功能。
如本文中所用，术语“调控元件”是指具有基因调控活性的DNA分子，例如，具有影响可操作地连接的可转录DNA分子的转录和/或翻译的能力的DNA分子。调控元件诸如启动子(例如MND启动子，诸如但不限于包含SEQ ID NO：33的核酸序列的MND启动子)、前导序列、内含子和转录终止区是具有基因调控活性并在活细胞中在基因的总体表达中起着不可或缺的作用的DNA分子。因此，在植物中起作用的分离的调控元件(诸如启动子)可用于通过基因工程化方法修饰植物表型。
如本文中所用，术语“可操作地连接的”是指与第二分子连接的第一分子，其中使分子排列成使得所述第一分子影响所述第二分子的功能。所述两个分子可以是单个连续分子的一部分并且可以是相邻的。例如，如果启动子调节细胞中可转录的目标DNA分子的转录，则启动子与可转录的DNA分子可操作地连接。
本文所用的“二聚化的化学诱导的信号传导复合物”、“二聚化的CISC”、或“二聚体”是指CISC的两个组分，其可以是或不是连接在一起的融合蛋白复合物。“二聚化”是指例如响应于实体与配体(例如雷帕霉素)的结合而将两个单独的实体连接成单个实体的过程。在一些实施方式中，配体或试剂刺激二聚化。在一些实施方式中，二聚化是指同二聚化，或两个相同实体诸如两个相同的CISC组分的连接。在一些实施方式中，二聚化是指异二聚化，或两个不同实体诸如两个不同的独特CISC组分的连接。在一些实施方式中，CISC组分的二聚化产生细胞信号传导途径。在一些实施方式中，CISC组分的二聚化允许细胞或细胞群的选择性扩增。其它CISC系统可包括CISC赤霉素CISC二聚化系统或SLF-TMP CISC二聚化系统。可使用其它可化学上诱导的二聚化(CID)系统和组成部分。
如本文中所用，“化学诱导的信号传导复合物”或“CISC”是指工程化的复合物，其作为配体诱导的二聚化的直接结果，启动信号进入细胞内部。CISC可以是同二聚体(两个相同组分的二聚化)或异二聚体(两个不同组分的二聚化)。因此，如本文中所用，术语“同二聚体”是指本文所述的具有相同氨基酸序列的两个蛋白质组分的二聚体。术语“异二聚体”是指本文所述的具有不同氨基酸序列的两个蛋白质组分的二聚体。
CISC可以是如本文中更详细描述的合成复合物。如本文中所用，“合成的”是指如本文所述的复合物、蛋白质、二聚体或组合物，其不是天然的，或未发现于自然界中。在一些实施方式中，IL2R-CISC是指涉及白细胞介素-2受体组分的信号传导复合物。在一些实施方式中，IL2/15-CISC是指涉及由白细胞介素-2(IL2)和白细胞介素-15(IL15)共有的受体信号传导亚基的信号传导复合物。在一些实施方式中，IL7-CISC是指涉及白细胞介素-7受体组分的信号传导复合物。因此，可以根据构成给定CISC的组分的组成部分来命名CISC。本领域技术人员将认识到，化学诱导的信号传导复合物的组成部分可由可用于掺入CISC的天然或合成组分组成。因此，本文提供的实施例并不旨在限制。
如本文中所用，“细胞因子受体”是指识别细胞因子并与其结合的受体分子。在一些实施方式中，细胞因子受体包括经修饰的细胞因子受体分子(例如，“变体细胞因子受体”)，其包括对所述细胞因子受体氨基酸和/或核酸序列具有取代、缺失和/或添加的那些细胞因子受体分子。因此，其旨在该术语包括野生型以及重组的细胞因子受体、合成产生的细胞因子受体和变体细胞因子受体。在一些实施方式中，细胞因子受体是融合蛋白，其包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方式中，受体的组分(即受体的结构域)是天然的或合成的。在一些实施方式中，结构域是人源结构域。
如本文中所用，“FKBP”是FK506结合蛋白结构域。FKBP是指具有脯氨酰异构酶活性并且在功能方面(尽管不在氨基酸序列方面)与亲环素类相关的蛋白质家族。已在从酵母至人的许多真核生物中鉴定了FKBP，并且其作为含有脯氨酸残基的蛋白质的蛋白质折叠伴侣蛋白起作用。与亲环素一起，FKBP属于亲免蛋白家族。术语FKBP包括例如FKBP12以及由基因AIP、AIPL1、FKBP1A、FKBP1B、FKBP2、FKBP3、FKBP5、FKBP6、FKBP7、FKBP8、FKBP9、FKBP9L、FKBP10、FKBP11、FKBP14、FKBP15、FKBP52和/或LOC541473编码的蛋白质；包括其同源物和其功能性蛋白质片段。
如本文中所用，“FRB”为FKBP雷帕霉素结合结构域。FRB结构域是被配置为与FKBP蛋白和雷帕霉素或其雷帕霉素类似物形成三联复合物的多肽区域(蛋白质“结构域”)。FRB结构域存在于许多天然存在的蛋白质中，包括来自人和其它物种的mTOR蛋白(在文献中也称为FRAP、RAPT1或RAFT)；包含Tor1和/或Tor2的酵母蛋白质；以及念珠菌属(Candida)FRAP同系物。FKBP和FRB均为雷帕霉素信号传导的哺乳动物靶标(mTOR)中的主要成分。
“裸露的FKBP雷帕霉素结合结构域多肽”或“裸露的FRB结构域多肽”(也可以称为“FKBP雷帕霉素结合结构域多肽”或“FRB结构域多肽”)是指由FRB结构域的氨基酸组成的多肽，或指如下蛋白：其中约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的蛋白的氨基酸是FRB结构域的氨基酸。通常，此类蛋白具有与雷帕霉素类似物AP21967以及雷帕霉素结合相互作用的能力。FRB结构域可以表达为12kDa的可溶性蛋白(Chen,J.等，(1995).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,92(11):4947-4951)。FRB结构域形成四个螺旋束，其为球状蛋白中常见的结构基序。它的整体尺寸为
Figure BDA0002746221120000151
乘以
Figure BDA0002746221120000152
乘以
Figure BDA0002746221120000153
并且所有四个螺旋都具有类似于细胞色素b562折叠的短的暗中(underhand)连接(Choi,J.等，(1996).Science,273(5272):239-242)。在一些实施方式中，裸露的FRB结构域包括SEQID NO：1(MEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLTQAWDLYYHVFRRISK)或SEQ ID NO：2(MEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMXSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISK)的氨基酸。
如本文中所用，术语“细胞外结合结构域”是位于细胞外并且被配置为与特定原子或分子结合的复合物的结构域。在一些实施方式中，CISC的细胞外结合结构域为FKBP结构域或其功能衍生物。在一些实施方式中，细胞外结合结构域为FRB结构域或其功能衍生物。在一些实施方式中，细胞外结合结构域被配置为结合配体或试剂，从而刺激两个CISC组分的二聚化。在一些实施方式中，细胞外结合结构域被配置为与细胞因子受体调节剂结合。
如本文中所用，术语“细胞因子受体调节剂”是指调节细胞因子受体的下游靶标的磷酸化、与细胞因子受体相关的信号转导途径的激活和/或特定蛋白质诸如细胞因子的表达的试剂。此类试剂可以直接或间接调节细胞因子受体的下游靶标的磷酸化、与细胞因子受体相关的信号转导途径的激活和/或特定蛋白质诸如细胞因子的表达。因此，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于与细胞因子受体或其片段免疫特异性结合的细胞因子、细胞因子的片段、融合蛋白和/或抗体或其结合部分。另外，细胞因子受体调节剂的实例包括但不限于与细胞因子或其片段免疫特异性结合的肽、多肽(例如，可溶性细胞因子受体)、融合蛋白和/或抗体或其结合部分。
如本文中所用，术语“激活(activate)”是指目标蛋白质的至少一种生物活性的增强。类似地，术语“激活(activation)”是指处于增强的活性状态的目标蛋白质的状态。术语“可激活的”是指目标蛋白质在信号、试剂、配体、化合物或刺激物存在的情况下被激活的能力。在一些实施方式中，如本文所述的二聚体在信号、试剂、配体、化合物或刺激物的存在的情况下被激活，并变成具有信号传导能力的二聚体。如本文中所用，术语“具有信号传导能力”是指二聚体使得能够启动或维持下游信号传导途径的能力或构型。
如本文中所用，术语“铰链结构域”是指将细胞外结合结构域与跨膜结构域连接，并且可赋予细胞外结合结构域柔性的结构域。在一些实施方式中，铰链结构域将细胞外结构域定位在靠近质膜的位置，以最小化被抗体或其结合片段识别的可能性。在一些实施方式中，细胞外结合结构域位于铰链结构域的N末端。在一些实施方式中，铰链结构域可以是天然的或合成的。
如本文中所用，术语“跨膜结构域”或“TM结构域”是指在膜中(诸如在细胞膜中)稳定的结构域。本文中还使用术语“跨膜跨度”、“整合蛋白”和“整合结构域”。在一些实施方式中，铰链结构域和细胞外结构域位于跨膜结构域的N末端。在一些实施方式中，跨膜结构域可以是天然的或合成的。在一些实施方式中，跨膜结构域是IL-2跨膜结构域。
如本文中所用，术语“信号传导结构域”是指参与细胞诸如哺乳动物细胞内的信号传导级联的融合蛋白或CISC组分的结构域。信号传导结构域是指向细胞(诸如T细胞)提供信号的信号传导部分，除了由例如TCR/CD3复合物的CD3ζ链提供的初级信号以外，所述信号还介导细胞应答(诸如T细胞应答，包括但不限于激活、增殖、分化和/或细胞因子分泌)。在一些实施方式中，信号传导结构域为跨膜结构域、铰链结构域和细胞外结构域的N末端。在一些实施方式中，信号传导结构域可以是合成结构域或天然结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是串联细胞质信号传导结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是细胞因子信号传导结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是抗原信号传导结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是白细胞介素-2受体γ亚基(IL2Rγ或IL2Rg)结构域。在一些实施方式中，信号传导结构域是白细胞介素-2受体β亚基(IL2Rβ或IL2Rb)结构域或截短的IL2Rβ结构域(例如包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的截短的IL2Rβ结构域)。在一些实施方式中，作为CISC组分的二聚化的结果，试剂或配体与细胞外结合结构域的结合由信号传导途径的激活引起通过信号传导结构域的信号转导。如本文中所用，术语“信号转导”是指通过与细胞外结构域结合的试剂或配体激活信号传导途径。信号的激活是细胞外结构域与配体或试剂结合(引起CISC二聚化)的结果。
如本文中所用，术语“IL2Rb”或“IL2Rβ”是指白细胞介素-2受体β亚基。类似地，术语“IL2Rg”或“IL2Rγ”是指白细胞介素-2受体γ亚基，且术语“IL2Ra”或“IL2Rα”是指白细胞介素-2受体α亚基。Il-2受体具有三种形式或链，α、β和γ，它们也是其它细胞因子的受体的亚基。IL2Rβ和IL2Rγ是I型细胞因子受体家族的成员。如本文中所用，“IL2R”是指白细胞介素-2受体，其参与T细胞介导的免疫应答。IL2R参与来自白细胞介素2的受体介导的内吞作用和促有丝分裂信号的转导。类似地，术语“IL-2/15R”是指由IL-2和IL-15共有的受体信号传导亚基，可包括α亚基(IL2/15Ra或IL2/15Rα)、β亚基(IL2/15Rb或IL2/15Rβ)或γ亚基(IL2/15Rg或IL2/15Rγ)。
在一些实施方式中，化学诱导的信号传导复合物是包含两个组分的异二聚化激活的信号传导复合物。在一些实施方式中，第一组分包含作为异二聚化对的一部分的细胞外结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域和一个或多个串联细胞质信号传导结构域。在一些实施方式中，第二组分包含作为异二聚化对的另一部分的细胞外结合结构域、任选的铰链结构域、跨膜结构域和一个或多个串联细胞质信号传导结构域。因此，在一些实施方式中，存在两个不同的修改事件。在一些实施方式中，两个CISC组分在细胞诸如哺乳动物细胞中表达。在一些实施方式中，使细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群(诸如哺乳动物细胞群)与引起异二聚化的配体或试剂接触，从而启动信号。在一些实施方式中，同源二聚化对二聚化，由此单个CISC组分在细胞(诸如哺乳动物细胞)中表达，并且CISC组分同二聚化以启动信号。
如本文中所用，术语“配体”或“试剂”是指具有期望的生物效应的分子。在一些实施方式中，配体被细胞外结合结构域识别并结合，形成包含配体和两个结合CISC组分的三联复合物。配体包括但不限于蛋白质性质的分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白质、翻译后修饰的蛋白质、抗体、其结合部分；小分子(小于1000道尔顿)、无机或有机化合物；以及核酸分子，包括但不限于双链或单链DNA、或双链或单链RNA(例如，反义，RNAi等)、适体以及三螺旋核酸分子。配体可源自或获得自任何已知的生物体(包括但不限于动物(例如，哺乳动物(人和非人类哺乳动物))、植物、细菌、真菌和原生生物、或病毒)或来自合成分子的文库。在一些实施方式中，配体是蛋白质、抗体或其功能衍生物、小分子或药物。在一些实施方式中，配体是雷帕霉素或雷帕霉素的类似物(雷帕霉素类似物)。在一些实施方式中，雷帕霉素类似物包括相对于雷帕霉素具有一个或多个以下修饰的雷帕霉素的变体：C7、C42和/或C29处的甲氧基的去甲基化、消除或替代；C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生或替代；C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生；五元脯氨酰环对六元哌啶甲酸酯环的替代；以及环己基环上的可选取代或取代的环戊基环对环己基环的替代。因此，在一些实施方式中，雷帕霉素类似物是依维莫司、merilimus、novolimus、吡美莫司、ridaforolimus、他克莫司、替西罗莫司、umirolimus、佐他莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP23573或AP1903，或它们的任一种的代谢物、衍生物和/或组合。在一些实施方式中，配体是IMID类药物(例如沙利度胺、泊马度胺、来那度胺或相关类似物)。
如本文中所用，术语“同时结合”是指配体通过两个或更多个CISC组分同时结合，或者在一些情况下，基本上同时结合，以形成包含CISC组分和配体组分的多组分复合物，并引起随后的信号激活。同时结合需要CISC组分在空间上被配置为结合单个配体，并且两个CISC组分也均被配置为与相同配体结合，包括与相同配体上的不同部分结合。
如本文中所用，术语“选择性扩增”是指期望的细胞(例如哺乳动物细胞)或期望的细胞群(诸如哺乳动物细胞群)扩增的能力。在一些实施方式中，选择性扩增是指已经历两次遗传修饰事件的纯细胞群(诸如哺乳动物细胞)的产生或扩增。二聚化CISC的一个组分是一个修饰的部分，并且另一个组分是另一个修饰。因此，异二聚化CISC的一个组分与每个遗传修饰相关联。将细胞暴露于配体只允许具有两种期望的修饰的细胞(诸如哺乳动物细胞)的选择性扩增。因此，在一些实施方式中，能够响应与配体接触的唯一细胞(诸如哺乳动物细胞)是表达异二聚化CISC的两个组分的那些细胞。
如本文中所用，“宿主细胞”包括易于用核酸构建体或载体转化、转染或转导的任何细胞类型，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方式中，宿主细胞(诸如哺乳动物细胞)是T细胞或调节性T细胞(Treg)。本文所使用的“T细胞”或“T淋巴细胞”可以来自任何哺乳动物(例如灵长类)物种，包括猴、狗和人。在一些实施方式中，T细胞与受体受试者同种异体(来自相同物种，但不同的供体)；在一些实施方式中，T细胞是自体的(供体和受体相同)；在一些实施方式中，T细胞是同基因的(供体和受体不同，但是为同卵双胞胎)。在一些实施方式中，宿主细胞(诸如哺乳动物细胞)是造血干细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是CD34+、CD8+或CD4+细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是选自于由以下组成的组中的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和本体CD8+T细胞。在一些实施方式中，宿主细胞是选自于由以下组成的组中的CD4+T辅助淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和本体CD4+T细胞。如本文中所用，术语“细胞群”是指包含多于一个细胞的一组细胞，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方式中，制备细胞、诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含如本文所述的蛋白质序列或编码如本文所述的蛋白质序列的表达载体。
如本文中所用，“细胞毒性T淋巴细胞”(CTL)是指在其表面上表达CD8的T淋巴细胞(例如，CD8+T细胞)。在一些实施方式中，此类细胞例如为抗原处理过的“记忆”T细胞(TM细胞)。在一些实施方式中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是细胞毒性T淋巴细胞。如本文中所用，“中央记忆”T细胞(或“TCM”)是指抗原处理过的CTL，与幼稚细胞相比，该细胞在其表面上表达CD62L、CCR-7和/或CD45RO，并且不表达CD45RA或具有降低的CD45RA表达。在一些实施方式中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞。在一些实施方式中，细胞是中央记忆T细胞(TCM)。在一些实施方式中，与幼稚细胞相比，中央记忆细胞对CD62L、CCR7、CD28、CD127、CD45RO和/或CD95的表达而言阳性，并且可具有降低的CD54RA表达。如本文中所用，“效应记忆”T细胞(或“TEM”)是指抗原处理过的T细胞，与中央记忆细胞相比，该细胞在其表面上不表达CD62L或具有降低的CD62L表达，并且与幼稚细胞相比，不表达CD45RA或具有降低的CD45RA表达。在一些实施方式中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞。在一些实施方式中，所述细胞是效应记忆T细胞。在一些实施方式中，与幼稚细胞或中央记忆细胞相比，效应记忆细胞对CD62L和/或CCR7的表达而言阴性，并且可具有CD28和/或CD45RA的可变表达。
如本文中所用，“幼稚T细胞”是指与中央记忆细胞或效应记忆细胞相比，表达CD62L和/或CD45RA但不表达CD45RO-的未经抗原处理过的T淋巴细胞。在一些实施方式中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞(诸如哺乳动物细胞)是幼稚T细胞。在一些实施方式中，幼稚CD8+T淋巴细胞的特征在于包含CD62L、CCR7、CD28、CD127和/或CD45RA的幼稚T细胞的表型标志物的表达。
如本文中所用，“效应”T细胞是指抗原处理过的细胞毒性T淋巴细胞，与中央记忆T细胞或幼稚T细胞相比，其不表达CD62L、CCR7和/或CD28或具有降低的CD62L、CCR7和/或CD28表达，并且对粒酶B和/或穿孔素而言阳性。在一些实施方式中，提供了用于融合蛋白分泌的细胞，诸如哺乳动物细胞。在一些实施方式中，细胞(诸如哺乳动物细胞)是效应T细胞。在一些实施方式中，与中央记忆T细胞或幼稚T细胞相比，细胞(诸如哺乳动物细胞)不表达CD62L、CCR7和/或CD28或具有降低的CD62L、CCR7和/或CD28表达，并且对粒酶B和/或穿孔素而言阳性。
如本文中所用，术语“转化的”或“转染的”是指其中已引入了外源多核苷酸分子诸如构建体的细胞(诸如哺乳动物细胞)、组织、器官或生物体。引入的多核苷酸分子可被整合到受体细胞(诸如哺乳动物细胞)、组织、器官或生物体的基因组DNA中，使得引入的多核苷酸分子由后续后代遗传。“转基因”或“转染的”细胞(诸如哺乳动物细胞)或生物体还包括所述细胞或生物体的后代和由育种程序(其采用此种转基因生物体作为杂交亲本并表现出由于外源多核苷酸分子的存在而引起的改变的表型)产生的后代。术语“转基因”是指含有一种或多种异源核酸分子的细菌、真菌或植物。
如本文中所用，“转导”是指病毒介导的(例如慢病毒或腺相关病毒)基因向细胞(诸如哺乳动物细胞)中的转移。
如本文中所用，“受试者”或“个体”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。“动物”包括冷血和温血脊椎动物和无脊椎动物诸如鱼类、贝类、爬行动物，特别是哺乳动物。“哺乳动物”包括但不限于小鼠、大鼠、兔、豚鼠、狗、猫、绵羊、山羊、牛、马、灵长类动物(诸如猴、黑猩猩和猿，特别是人)。在一些实施方式中，受试者是人。
如本文中所述，“标志物序列”编码用于选择或追踪蛋白质或具有目标蛋白质的细胞(诸如哺乳动物细胞)的蛋白质。在本文所述的实施方式中，所提供的融合蛋白可包含可在实验(诸如流式细胞术)中选择的标志物序列。
关于本文鉴定的CISC序列或其它多肽序列(例如裸露的FRB结构域多肽序列)的“氨基酸序列同一性百分比(％)”被定义为在比对序列以及必要时引入空位(以实现最大百分比序列同一性)并且不将任何保守取代考虑作为序列同一性的一部分之后，对于细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域中的每一种，候选序列中与参照序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的比对可以以在本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公众可获得的计算机软件，例如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，使用WU-BLAST-2计算机程序(Altschul,S.F.等，(1996).Methods in Enzymol.,266:460-480)产生的氨基酸序列同一性％值使用几个搜索参数，其中大多数被设置为默认值。未设置为默认值的那些参数(例如，可调参数)用以下值进行设置：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字符阈值(word threshold)(T)＝11并且评分矩阵＝BLOSUM62。在CISC的一些实施方式中，CISC包含细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域，其中每个结构域包含天然结构域的天然形式、合成形式或突变形式或截短形式。在一些实施方式中，任何给定结构域的突变或截短形式包含与本文提供的序列中所示的序列具有100％、95％、90％、85％序列同一性或在由上述百分比中的任意两个限定的范围内的序列同一性百分比的氨基酸序列。
如本文中所用，“CISC变体多肽序列”或“CISC变体氨基酸序列”是指如下定义的蛋白质序列，其与本文提供的蛋白质序列或其特定衍生的片段(诸如细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域的蛋白质序列)具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％氨基酸序列同一性(或由上述百分比中的任意两个限定的范围内的氨基酸序列同一性百分比)。通常，CISC变体多肽或其片段将与所述氨基酸序列或其衍生片段具有至少或至少约80％的氨基酸序列同一性、至少或至少约81％的氨基酸序列同一性、至少或至少约82％的氨基酸序列同一性、至少或至少约83％的氨基酸序列同一性、至少或至少约84％的氨基酸序列同一性、至少或至少约85％的氨基酸序列同一性、至少或至少约86％的氨基酸序列同一性、至少或至少约87％的氨基酸序列同一性、至少或至少约88％的氨基酸序列同一性、至少或至少约89％的氨基酸序列同一性、至少或至少约90％的氨基酸序列同一性、至少或至少约91％的氨基酸序列同一性、至少或至少约92％的氨基酸序列同一性、至少或至少约93％的氨基酸序列同一性、至少或至少约94％的氨基酸序列同一性、至少或至少约95％的氨基酸序列同一性、至少或至少约96％的氨基酸序列同一性、至少或至少约97％的氨基酸序列同一性、至少或至少约98％的氨基酸序列同一性、以及至少或至少约99％的氨基酸序列同一性。变体不涵盖天然蛋白质序列。
如本文所使用的“裸露的FRB结构域变体多肽序列”或“裸露的FRB结构域变体氨基酸序列”是指如下定义的蛋白质序列，其与本文提供的蛋白质序列(例如，SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2)或其特定衍生的片段(诸如细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域的蛋白质序列)具有至少或至少约80％、约85％、约90％、约95％、约98％或约99％的氨基酸序列同一性(或由上述百分比中的任意两个限定的范围内的氨基酸序列同一性百分比)。通常，裸露的FRB结构域变体多肽或其片段将与所述氨基酸序列或其衍生片段具有至少或至少约80％的氨基酸序列同一性、至少或至少约81％的氨基酸序列同一性、至少或至少约82％的氨基酸序列同一性、至少或至少约83％的氨基酸序列同一性、至少或至少约84％的氨基酸序列同一性、至少或至少约85％的氨基酸序列同一性、至少或至少约86％的氨基酸序列同一性、至少或至少约87％的氨基酸序列同一性、至少或至少约88％的氨基酸序列同一性、至少或至少约89％的氨基酸序列同一性、至少或至少约90％的氨基酸序列同一性、至少或至少约91％的氨基酸序列同一性、至少或至少约92％的氨基酸序列同一性、至少或至少约93％的氨基酸序列同一性、至少或至少约94％的氨基酸序列同一性、至少或至少约95％的氨基酸序列同一性、至少或至少约96％的氨基酸序列同一性、至少或至少约97％的氨基酸序列同一性、至少或至少约98％的氨基酸序列同一性以及还有至少或至少约99％的氨基酸序列同一性。变体不涵盖天然蛋白质序列。
如在本说明书中所用，无论是在过渡性措辞中还是在权利要求的主体中，术语“包含/包括(comprise(s))”和“包含/包括(comprising)”将被解释为具有开放式含义。也就是说，所述术语与所述短语“至少具有”或“至少包含”将被同义地解释。当在方法的上下文中使用时，术语“包含/包括(comprising)”意指该方法至少包括所述步骤，但可包括另外的步骤。当在化合物、组合物或装置的上下文中使用时，术语“包含/包括(comprising)”意指所述化合物、组合物或装置至少包含所述特征或组分，但也可包括另外的特征或组分。
CISC
一种或多种蛋白质序列可具有第一和第二序列。在一些实施方式中，第一序列编码第一CISC组分，其可包含第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其功能衍生物。在一些实施方式中，第二序列编码第二CISC组分，其可包含第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分。在一些实施方式中，第一CISC组分和第二CISC组分可被定位以使得当表达时，它们在配体存在的情况下二聚化。在一些实施方式中，第一CISC组分和第二CISC组分可被定位以使得当表达时，它们在配体存在的情况下同时二聚化。
在一些实施方式中，提供了异二聚双组分CISC的一种或多种蛋白质序列。在一些实施方式中，第一CISC组分是IL2Rγ-CISC复合物。在一些实施方式中，IL2Rγ-CISC包含如SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：9的蛋白质序列的核酸序列。在一些实施方式中，IL2Rγ-CISC包含如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：10的蛋白质序列的核酸序列。在一些实施方式中，IL2Rγ-CISC包含如SEQ ID NO：11所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：11的蛋白质序列的核酸序列。在一些实施方式中，IL2Rγ-CISC包含如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：12的蛋白质序列的核酸序列。
在一些实施方式中，第一CISC组分的蛋白质序列包括编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域的蛋白质序列。实施方式还包含编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域的核酸序列。在一些实施方式中，包含第一细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号结构域的第一CISC组分的蛋白质序列包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:12所示的序列的100％、99％、98％、95％、90％、85％或80％序列同一性，包括落入这些百分比内的所有值或范围。
在一些实施方式中，第二CISC组分是IL2Rβ复合物。在一些实施方式中，IL2Rβ-CISC包含如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：13的蛋白质序列的核酸序列。在一些实施方式中，IL2Rβ-CISC包含如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：14的蛋白质序列的核酸序列。在一些实施方式中，IL2Rβ-CISC包含如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：15的蛋白质序列的核酸序列。在一些实施方式中，IL2Rβ-CISC包含如SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：24的蛋白质序列的核酸序列。在一些实施方式中，第二CISC组分是IL7Rα复合物。在一些实施方式中，IL7Rα-CISC包含如SEQ ID NO：16、SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：26所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：26的蛋白质序列的核酸序列。
在其它实施方式中，IL2Rβ-CISC包括截短的细胞内IL2Rβ结构域或编码截短的细胞内IL2Rβ结构域的核酸序列。截短的IL2Rβ结构域保留与IL2Rγ-CISC蛋白序列异二聚化后激活下游IL2信号传导的能力。在一些实施方式中，截短的IL2Rβ包括SEQ ID NO：5(PAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSPFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLSLNTDAYLSLQELQ；SEQ ID NO：5)所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，SEQ ID NO：5的截短的IL2Rβ结构域缺少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个N末端氨基酸中的任一者。在其它实施方式中，具有截短的细胞内IL2Rβ结构域的FRB-CISC包括如SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列(MALPVTALLLPLALLLHAARPILWHEMWHEGLEEASRLYFGERNVKGMFEVLEPLHAMMERGPQTLKETSFNQAYGRDLMEAQEWCRKYMKSGNVKDLLQAWDLYYHVFRRISKPAALGKDTIPWLGHLLVGLSGAFGFIILVYLLINCRNTGPWLKKVLKCNTPDPSKFFSQLSSEHGGDVQKWLSSP*WORFPSSSFSPGGLAPEISPLEVLERDKVTQLLLQQDKVPEPASLNTDAYLSLQELQ；SEQ ID NO：7)。
在一些实施方式中，第二CISC组分的蛋白质序列包括编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域的蛋白质序列。实施方式还包括编码第二CISC组分的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域的核酸序列。在一些实施方式中，包括第二细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域(在一些实施方式中包括截短的IL2Rβ信号结构域中)的第二CISC组分的蛋白质序列包括如下氨基酸序列，该氨基酸序列包括与SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17所示的序列的100％、99％、98％、95％、90％、85％或80％的序列同一性，包括落入这些百分比内的所有值和范围。
在一些实施方式中，蛋白质序列可包括接头。在一些实施方式中，接头包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸(诸如甘氨酸)，或在由上述数目中的任意两个限定的范围内的许多氨基酸(诸如甘氨酸)。在一些实施方式中，甘氨酸间隔区包含至少3个甘氨酸。在一些实施方式中，甘氨酸间隔区包含SEQ ID NO:18(GGGS；SEQ ID NO:18)、SEQ ID NO:19(GGGSGGG；SEQ ID NO:19)、SEQ ID NO:20(GGG；SEQ ID NO:20)、SEQ ID NO:21(GGS；SEQ ID NO:21)、SEQ ID NO:22(GGSP；SEQ ID NO:22)或SEQ ID NO:31(PAAL；SEQID NO:31)所示的序列。实施方式还包含编码SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:31的核酸序列。在一些实施方式中，跨膜结构域位于信号传导结构域的N末端，铰链结构域位于跨膜结构域的N末端，接头位于铰链结构域的N末端，并且细胞外结合结构域位于接头的N末端。
在一些实施方式中，提供了同二聚双组分CISC的一种或多种蛋白质序列。在一些实施方式中，第一CISC组分是IL2Rγ-CISC复合物。在一些实施方式中，IL2Rγ-CISC包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO:23的蛋白质序列的核酸序列。
在一些实施方式中，第一CISC组分的蛋白质序列包括编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域的蛋白质序列。实施方式还包括编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域的核酸序列。在一些实施方式中，包括第一细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域的第一CISC组分的蛋白质序列包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:23所示的序列的100％、99％、98％、95％、90％、85％或80％的序列同一性，包括落入这些百分比内的所有值或范围。
在一些实施方式中，第二CISC组分是IL2Rβ复合物或IL2Rα复合物。在一些实施方式中，IL2Rβ-CISC包含如SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ IDNO:24的蛋白质序列的核酸序列。
在一些实施方式中，IL2Rα-CISC包含如SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO:25的蛋白质序列的核酸序列。
在一些实施方式中，第二CISC组分的蛋白质序列包括编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域的蛋白质序列。实施方式还包括编码第二CISC组分的细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域的核酸序列。在一些实施方式中，包括第二细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域的第二CISC组分的蛋白质序列包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:24或SEQID NO:25所示的序列的100％、99％、98％、95％、90％、85％或80％的序列同一性，包括落入这些百分比内的所有值或范围。
在一些实施方式中，蛋白质序列可包括接头。在一些实施方式中，接头包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸(诸如甘氨酸)，或在由上述数目中的任意两个限定的范围内的许多氨基酸(诸如甘氨酸)。在一些实施方式中，甘氨酸间隔区包含至少3个甘氨酸。在一些实施方式中，甘氨酸间隔区包含SEQ ID NO:18(GGGS；SEQ ID NO:18)、SEQ ID NO:19(GGGSGGG；SEQ ID NO:19)、SEQ ID NO:20(GGG；SEQ ID NO:20)、SEQ ID NO:21(GGS；SEQ ID NO:21)、SEQ ID NO:22(GGSP；SEQ ID NO:22)或SEQ ID NO:31(PAAL；SEQID NO:31)所示的序列。实施方式还包含编码SEQ ID NO:18-SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:31的核酸序列。在一些实施方式中，跨膜结构域位于信号传导结构域的N末端，铰链结构域位于跨膜结构域的N末端，接头位于铰链结构域的N末端，并且细胞外结合结构域位于接头的N末端。
在一些实施方式中，同二聚化双组分CISC的序列将FKBP F36V结构域与配体AP1903合并以用于同二聚化。
在一些实施方式中，提供了单组分同二聚化CISC的一种或多种蛋白质序列。在一些实施方式中，单组分CISC是IL7Rα-CISC复合物。在一些实施方式中，IL7Rα-CISC包含如SEQ ID NO:26所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO:26的蛋白质序列的核酸序列。
在一些实施方式中，单组分CISC是MPL-CISC复合物。在一些实施方式中，MPL-CISC包含如SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列。实施方式还包括编码SEQ ID NO:27的蛋白质序列的核酸序列。
在一些实施方式中，单组分CISC的蛋白质序列包括编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域的蛋白质序列。实施方式还包括编码细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域或信号传导结构域的核酸序列。在一些实施方式中，包括第一细胞外结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域和/或信号传导结构域的第一CISC组分的蛋白质序列包含氨基酸序列，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:27所示的序列的100％、99％、98％、95％、90％、85％或80％的序列同一性，或具有在由上述百分比中的任意两个限定的范围内的序列同一性。
在一些实施方式中，同二聚化单组分CISC的序列将FKBP F36V结构域与配体AP1903合并以用于同二聚化。
载体
可以构建多种载体组合以提供有效的转导和转基因表达。在一些实施方式中，载体是病毒载体。在其它实施方式中，载体可包括病毒载体与质粒载体的组合。其它病毒载体包括泡沫病毒、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体和/或慢病毒载体。在一些实施方式中，载体是慢病毒载体。在一些实施方式中，载体是泡沫病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体或慢病毒载体。在一些实施方式中，载体用于在细菌系统(诸如大肠杆菌，E.coli)中表达蛋白质。在其它实施方式中，第一载体可编码第一CISC组分，其包含第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或功能衍生物，而第二载体可编码第二CISC组分，其包含第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域和信号传导结构域或其部分。
载体可以具有用于驱动载体中的DNA序列的表达(例如，编码裸露的FRB结构域或CISC的组分的DNA序列)的一个或多个启动子。“启动子”是启动特定基因的转录的DNA区域。启动子可位于基因的转录起始位点附近、在同一条链上和DNA的上游(有义链的5′区)。启动子可以是条件型、诱导型或组成型启动子。启动子可对细菌、哺乳动物或昆虫细胞的蛋白质表达而言是特异性的。在一些实施方式中，提供编码融合蛋白的核酸的情况下，该核酸还包含启动子序列。在一些实施方式中，启动子对细菌、哺乳动物或昆虫细胞的蛋白质表达而言是特异性的。在一些实施方式中，启动子是条件型、诱导型或组成型启动子。在一些实施方式中，启动子是MND启动子(合成的启动子，其包含具有骨髓增生性肉瘤病毒增强子的经修饰的MoMuLV LTR的U3区)。在一些实施方式中，MND启动子包括SEQ ID NO：33的核酸序列。
如本文中所用，“条件型”或“诱导型”是指如下的核酸构建体，其包含在诱导物存在的情况下提供基因表达并且在诱导物不存在的情况下基本上不提供基因表达的启动子。
如本文中所用，“组成型”是指如下的核酸构建体，其包含组成型的启动子，并因此提供持续产生的多肽的表达。
在一些实施方式中，诱导型启动子具有低水平的基础活性。在一些实施方式中，使用慢病毒载体的情况下，与当细胞被诱导以表达基因时相比，未诱导的细胞中的基础活性的水平为20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或更低(但不为零)或在由上述值中的任意两个限定的范围内。可通过使用流式细胞术测量在诱导物(例如药物)不存在的情况下转基因(例如，标志物基因)的表达量来确定基础活性的水平。在本文所述的一些实施方式中，将标志物蛋白(诸如mCherry)用于确定表达。
在一些实施方式中，与未诱导的或基础活性相比，诱导型启动子提供高水平的诱导活性。在一些实施方式中，诱导状态下的活性水平为未诱导状态下的活性水平的2倍、4倍、6倍、8倍、9倍或10倍或更多倍，或者在由上述值中的任意两个限定的范围内。在一些实施方式中，在反式激活因子不存在的情况下，在诱导型启动子控制下的转基因表达在不到10天、8天、6天、4天、2天或1天(不包括0天)或者在由上述时间段中的任意两个限定的范围内关闭。
在一些实施方式中，诱导型启动子被设计和/或修改为提供低水平的基础活性、高水平的诱导性和/或短时间的可逆性。
在一些实施方式中，表达载体包含编码SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：17中的一个或多个的蛋白质序列的核酸。在一些实施方式中，表达载体包含如SEQ ID NO：28所示的核酸序列。SEQ ID NO：28编码如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16所示的蛋白质序列。
在一些实施方式中，表达载体是如SEQ ID NO：29所示的SEQ ID NO：28的变体。SEQID NO：29编码如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14所示的蛋白质序列。
在一些实施方式中，表达载体是如SEQ ID NO：30所示的SEQ ID NO：28的变体。SEQID NO：30编码如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15所示的蛋白质序列。
在一些实施方式中，表达载体包括与本文提供的核苷酸序列或其特定衍生片段具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％核酸序列同一性(或在由上述百分比中的任意两个限定的范围内的核酸序列同一性百分比)的核酸。在一些实施方式中，表达载体包含启动子。在一些实施方式中，表达载体包含编码融合蛋白的核酸。在一些实施方式中，载体是RNA或DNA。
裸露的FRB结构域
本文提供了用于细胞内表达的裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽。在一些非限制性实施方式中，本文更完全地描述的是，裸露的FRB结构域多肽与第一CISC组分和第二CISC组分的一个或多个蛋白序列共表达。裸露的FRB结构域多肽可包含与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的序列共有100％、99％、98％、95％、90％、85％或80％的序列同一性的氨基酸序列，包括落入这些百分比内的所有值和范围。
基因组编辑系统
本文提供了用于在细胞中进行基因组编辑的系统，以表达本文所述的裸露的FRB结构域多肽，以及任选地进一步表达如本文所述的CISC，例如通过将编码裸露的FRB结构域多肽、并且任选地进一步编码CISC的核酸靶向整合到细胞的基因组中。本公开内容还尤其提供了用于选择性激活和/或扩增经遗传修饰的细胞群的系统，例如用于制备选择性富集了经遗传修饰的细胞的细胞群的系统。
在一些实施方式中，本文提供的系统包括：i)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码该DNA核酸内切酶的核酸；ii)向导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸，所述向导RNA包含与细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及iii)包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，其中，DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过DNA核酸内切酶和gRNA的关联而形成的复合物能够促进供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何系统，gRNA包括与细胞中的FOXP3基因座、AAVS1基因座或TCRa(TRAC)基因座内的序列互补的间隔区序列。在一些实施方式中，gRNA包括来自SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：57中的任一个的间隔区序列，或它们的与SEQ IDNO：40-SEQ ID NO：57中的任一个相比具有不超过3个错配的变体。
本文所使用的“Cas核酸内切酶”或“Cas核酸酶”包括但不限于例如与CRISPR(成簇的规律间隔的短回文重复序列)获得性免疫系统相关的RNA引导的DNA核酸内切酶。在本文中，“Cas核酸内切酶”是指天然存在的Cas核酸内切酶和重组的Cas核酸内切酶。在一些实施方式中，根据本文所述的任何系统，Cas DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。在一些实施方式中，Cas9核酸内切酶来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(spCas9)。在一些实施方式中，Cas9来自路邓葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis)(SluCas9)。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何系统，该系统包括编码DNA核酸内切酶的核酸。在一些实施方式中，将编码DNA核酸内切酶的核酸进行密码子优化以用于在宿主细胞中表达。在一些实施方式中，编码DNA核酸内切酶的核酸经密码子优化以用于在人细胞中表达。在一些实施方式中，编码DNA核酸内切酶的核酸是DNA，例如DNA质粒。在一些实施方式中，编码DNA核酸内切酶的核酸是RNA，例如mRNA。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何系统，供体模板被配置以使得供体盒能够通过同源介导修复(HDR)整合到系统中的gRNA所靶向的基因组基因座中。在一些实施方式中，供体盒在两侧侧接有对应于靶基因组基因座中的序列的同源臂。在一些实施方式中，同源臂的长度至少为或约为0.2kb(例如至少为或约为0.3kb、0.4kb、0.5kb、0.6kb、0.7kb、0.8kb、0.9kb、1kb或更大中的任一种)。在一些实施方式中，同源臂的长度至少为或约为0.4kb，例如0.45kb、0.6kb或0.8kb。示例性同源臂进一步包括来自具有SEQ ID NO：32的序列的供体模板的同源臂。示例性供体模板包括具有SEQ ID NO：3-SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：37-SEQ ID NO：39的序列的供体模板。在一些实施方式中，供体模板在腺相关病毒(AAV)载体中编码。在一些实施方式中，AAV载体是AAV2、AAV5或AAV6载体。在一些实施方式中，AAV载体是AAV6载体。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何系统，供体模板被配置以使得供体盒能够通过非同源末端连接(NHEJ)整合入系统中的gRNA所靶向的基因组基因座中。在一些实施方式中，供体盒在一侧或两侧侧接有gRNA靶位点。在一些实施方式中，供体盒在两侧侧接有gRNA靶位点。在一些实施方式中，gRNA靶位点是系统中的gRNA的靶位点。在一些实施方式中，供体模板的gRNA靶位点是系统中的gRNA的细胞基因组gRNA靶位点的反向互补。在一些实施方式中，供体模板在腺相关病毒(AAV)载体中编码。在一些实施方式中，AAV载体是AAV2、AAV5或AAV6载体。在一些实施方式中，AAV载体是AAV6载体。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何系统，将DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，脂质体或脂质纳米颗粒还包括gRNA。在一些实施方式中，脂质体或脂质纳米颗粒是脂质纳米颗粒。在一些实施方式中，系统包括脂质纳米颗粒，所述脂质纳米颗粒包含编码DNA核酸内切酶和gRNA的核酸。在一些实施方式中，编码DNA核酸内切酶的核酸是编码DNA核酸内切酶的mRNA。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何系统，DNA核酸内切酶与核糖核蛋白(RNP)复合物中的gRNA关联。
基因组编辑
本文提供了通过基因编辑对宿主细胞或生物体进行遗传修饰以表达本文公开的任何裸露的FRB结构域多肽和任选的本文公开的化学诱导的信号传导复合多肽的方法。在一些方面，使用CRISPR/Cas系统进行基因编辑。
CRISPR核酸内切酶系统
在许多原核生物(例如细菌和古细菌)的基因组中可以找到CRISPR(成簇的规律的间隔短回文重复序列)基因组基因座。在原核生物中，CRISPR基因座编码作为一类免疫系统起作用以帮助原核生物防御外来入侵者(诸如病毒和噬菌体)的产物。CRISPR基因座功能存在三个阶段：将新序列整合到CRISPR基因座中，CRISPR RNA(crRNA)的表达，以及外来入侵者核酸的沉默。已经鉴别出五种类型的CRISPR系统(例如，I型、II型、III型、U型和V型)。
CRISPR基因座包含许多短的重复的序列，称为“重复序列(repeats)”。重复序列在表达时可以形成二级发夹结构(例如，发夹)和/或具有非结构化单链的序列。重复序列通常成簇出现，并且经常在物种之间出现差异。将重复序列用称为“间隔区”的独特的间插序列有规律地间隔，产生重复序列-间隔区-重复序列基因座结构。间隔区与已知的外来入侵者序列相同或具有高度同源性。间隔区-重复序列单元编码crisprRNA(crRNA)，所述crRNA被加工成间隔区-重复序列单元的成熟形式。crRNA具有参与靶向靶核酸的“种子”或间隔区序列(在原核生物中的天然存在的形式中，间隔区序列靶向外来入侵者核酸)。间隔区序列位于crRNA的5′或3′端。
CRISPR基因座也具有编码CRISPR相关(Cas)基因的多核苷酸序列。Cas基因编码参与原核生物中的crRNA功能的生物发生和干扰阶段(interference stages)的核酸内切酶。一些Cas基因具有同源的二级和/或三级结构。
靶向基因组的核酸与定点多肽(例如，核酸引导的核酸酶，如Cas9)相互作用，从而形成复合物。靶向基因组的核酸(例如gRNA)将定点多肽引导至靶核酸。
如前所述，在一些实施方式中，可以各自分开地向细胞或受试者给予定点多肽和靶向基因组的核酸。另一方面，在一些其它实施方式中，定点多肽可以与一个或多个向导RNA、或同tracrRNA一起的一个或多个crRNA进行预复合。然后可以向细胞或受试者给予预复合的材料。此类预复合材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
II型CRISPR系统
II型CRISPR系统中的crRNA生物发生本质上需要反式激活的CRISPR RNA(tracrRNA)。tracrRNA被内源性RNase III修饰，然后杂交至pre-crRNA阵列中的crRNA重复序列。募集内源性RNase III以切割pre-crRNA。使经切割的crRNA经受外切核酸酶修整以产生成熟的crRNA形式(例如5′修整)。tracrRNA保持杂交至crRNA，并且tracrRNA和crRNA与定点多肽(例如Cas9)相关联。crRNA-tracrRNA-Cas9复合物的crRNA将复合物引导至靶核酸，crRNA可以杂交至该靶核酸。crRNA与靶核酸的杂交激活用于靶向核酸切割的Cas9。II型CRISPR系统中的靶核酸称为前间隔区邻近基序(PAM)。实际上，PAM对于促进定点多肽(例如Cas9)对靶核酸的结合而言是必要的。II型系统(也称为Nmeni或CASS4)进一步细分为II-A型(CASS4)和II-B型(CASS4a)。Jinek,M.等，(2012).Science,337(6096):816-821表明CRISPR/Cas9系统可用于RNA可编程的基因组编辑，并且国际专利申请公布号WO 2013/176772提供了用于位点特异性基因编辑的CRISPR/Cas核酸内切酶系统的多个实例和应用。
V型CRISPR系统
V型CRISPR系统与II型系统具有多个重要区别。例如，Cpf1是单一RNA引导的核酸内切酶，它与II型系统相比缺少tracrRNA。实际上，与Cpf1相关联的CRISPR阵列无需额外的反式激活的tracrRNA即可被加工为成熟的crRNA。将V型CRISPR阵列加工成长度为42-44个核苷酸的短的成熟crRNA，每个成熟crRNA均以19个核苷酸的直接重复序列开始，然后是23-25个核苷酸的间隔区序列。与之相比，II型系统中的成熟crRNA以20-24个核苷酸的间隔区序列开始，随后为或约为22个核苷酸的直接重复序列。还有，Cpf1利用富含T的前间隔区邻近基序使得Cpf1-crRNA复合物有效地切割前面为短的富含T的PAM的靶DNA，这与II型系统的跟随靶DNA之后的富含G的PAM对比鲜明。因此，V型系统在远离PAM的点切割，而II型系统在与PAM相邻的点切割。此外，与II型系统相比，Cpf1通过交错的DNA双链断裂切割DNA，所述断裂具有4个或5个核苷酸的5′突出端(overhang)。II型系统通过平的双链断裂切割。与II型系统相似，Cpf1包含预测的RuvC样核酸内切酶结构域，但与II型系统相比之下，缺少第二个HNH核酸内切酶结构域。
定点多肽或DNA核酸内切酶
归因于NHEJ和/或HDR的靶DNA的修饰可引起例如突变、缺失、改变、整合、基因修正、基因置换、基因标签、转基因插入、核苷酸缺失、基因破坏、易位和/或基因突变。将非天然核酸整合入基因组DNA中的过程是基因组编辑的实例。
定点多肽是在基因组编辑中用于切割DNA的核酸酶。可以将定点多肽作为一种或多种多肽、或编码该多肽的一种或多种mRNA给予至细胞或受试者。
在CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的上下文中，定点多肽可结合至向导RNA，而所述向导RNA转而指定该多肽所指向的靶DNA中的位点。在本文的CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1系统的实施方式中，定点多肽是核酸内切酶，例如DNA核酸内切酶。本文所使用的“Cas核酸内切酶”或“Cas核酸酶”包括但不限于例如与CRISPR(成簇的规律的间隔短回文重复序列)获得性免疫系统关联的RNA引导的DNA核酸内切酶。在本文中，“Cas核酸内切酶”是指天然存在的Cas核酸内切酶和重组Cas核酸内切酶二者。
在一些实施方式中，定点多肽具有多个核酸切割(例如核酸酶)结构域。可以通过接头将两个以上的核酸切割结构域连接在一起。在一些实施方式中，接头具有柔性接头。接头的长度可以为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个、35个、40个或更多个氨基酸。
天然存在的野生型Cas9酶具有两个核酸酶结构域，HNH核酸酶结构域和RuvC结构域。在本文中，“Cas9”是指天然存在的Cas9和重组的Cas9二者。在本文考虑之列的Cas9酶具有HNH或HNH样核酸酶结构域和/或RuvC或RuvC样核酸酶结构域。
HNH或HNH样结构域具有McrA样折叠。HNH或HNH样结构域具有α螺旋和两个反平行的β链。HNH或HNH样结构域具有金属结合位点(例如二价阳离子结合位点)。HNH或HNH样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如crRNA靶向链的互补链)。
RuvC或RuvC样结构域具有RNaseH或RNaseH样折叠。RuvC/RNaseH结构域参与多种多样的基于核酸的功能，包括作用于RNA和DNA二者。RNaseH结构域具有被多个α螺旋围绕的5条β链。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH样结构域具有金属结合位点(例如二价阳离子结合位点)。RuvC/RNaseH或RuvC/RNaseH样结构域可以切割靶核酸的一条链(例如，双链靶DNA的非互补链)。
在一些实施方式中，定点多肽具有与野生型示例性定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，US 2014/0068797序列ID No.8或Sapranauskas,R.等，(2011).Nucl.AcidsRes.,39(21):9275-9282，和其它各种定点多肽)具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，定点多肽具有与野生型示例性定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，同上)的核酸酶结构域具有至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
在一些实施方式中，定点多肽与野生型定点多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在10个连续的氨基酸上具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施方式中，定点多肽与野生型定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在10个连续的氨基酸上具有至多：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施方式中，定点多肽与野生型定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上具有至少：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施方式中，定点多肽与野生型定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在定点多肽的HNH核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上具有至多：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施方式中，定点多肽与野生型定点多肽(例如，来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。在一些实施方式中，定点多肽与野生型定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，同上)在定点多肽的RuvC核酸酶结构域中的10个连续氨基酸上具有至多：70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％同一性。
在一些实施方式中，定点多肽具有野生型示例性定点多肽的修饰形式。野生型示例性定点多肽的修饰形式具有降低定点多肽的核酸切割活性的突变。在一些实施方式中，野生型示例性定点多肽的修饰形式具有小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的野生型示例性定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，同上)的核酸切割活性。定点多肽的修饰形式可以不具有实质的核酸切割活性。当定点多肽是不具有实质的核酸切割活性的修饰形式时，它在本文中称为“酶促失活的”。
在一些实施方式中，定点多肽的修饰形式具有突变，以使得它可以诱导靶核酸上的单链断裂(SSB)(例如，通过仅切割双链靶核酸的一个糖磷酸骨架)。在一些实施方式中，突变引起野生型定点多肽(例如来自酿脓链球菌的Cas9，同上)的多个核酸切割结构域的一个或多个中的小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％、小于5％或小于1％的核酸切割活性。在一些实施方式中，突变引起多个核酸切割结构域的一个或多个保留切割靶核酸的互补链的能力，但是降低了其切割靶核酸的非互补链的能力。在一些实施方式中，突变引起多个核酸切割结构域的一个或多个保留切割靶核酸的非互补链的能力，但是降低了其切割靶核酸的互补链的能力。例如，野生型示例性酿脓链球菌Cas9多肽中的残基(例如Asp10、His840、Asn854和Asn856)被突变以使多个核酸切割结构域的一个或多个(例如核酸酶结构域)失活。在一些实施方式中，待突变的残基对应于野生型示例性酿脓链球菌Cas9多肽中的残基Asp10、His840、Asn854和Asn856(例如，如通过序列和/或结构比对确定的)。突变的非限制性实例包括D10A、H840A、N854A或N856A。本领域技术人员将认识到，丙氨酸置换以外的突变是合适的。
在一些实施方式中，D10A突变与H840A、N854A或N856A突变中的一种或多种结合以产生实质上缺乏DNA切割活性的定点多肽。在一些实施方式中，H840A突变与D10A、N854A或N856A突变中的一种或多种结合以产生实质上缺乏DNA切割活性的定点多肽。在一些实施方式中，N854A突变与H840A、D10A或N856A突变中的一种或多种结合以产生实质上缺乏DNA切割活性的定点多肽。在一些实施方式中，N856A突变与H840A、N854A或D10A突变中的一种或多种结合以产生实质上缺乏DNA切割活性的定点多肽。具有一个实质上无活性的核酸酶结构域的定点多肽被称为“切口酶”。
在一些实施方式中，RNA引导的核酸内切酶(例如Cas9)的变体可以用于增加CRISPR介导的基因组编辑的特异性。例如，野生型Cas9通常由设计成与靶序列(例如内源基因组基因座)中的指定的～20个核苷酸序列杂交的单个向导RNA进行引导。然而，在向导RNA和靶基因座之间可以容许数个错配，从而有效地将靶位点中的所需的同源性长度减少到例如低至13nt的同源性，从而引起CRISPR/Cas9复合物在靶基因组其它地方进行结合和双链核酸切割的提高的潜力-也称为脱靶切割。因为Cas9的切口酶变体每个都只切割一条链，所以为了产生双链断裂，需要一对切口酶紧挨着并在靶核酸的相对链上结合，从而产生一对切口，这相当于双链断裂。这要求两个分开的向导RNA(每个切口酶一个)必须紧挨着并在靶核酸的相对链上结合。该要求实质上使发生双链断裂所需的最小同源长度加倍，从而降低了双链切割事件将在基因组中的其它地方发生的可能性，其中这两个向导RNA位点(如果它们存在)不太可能彼此足够接近使得能够形成双链断裂。如本领域中所述，切口酶也可以用于相比NHEJ促进HDR。通过使用有效介导期望的变化的特定供体序列，HDR可用于将选定的变化引入基因组中的靶位点。用于基因编辑的各种CRISPR/Cas系统的描述可以见于例如国际专利申请公开号WO2013/176772以及Sander J.D.等，(2014).Nat.Biotechnol.,32(4):347-355，以及本文引用的参考文献。
在一些实施方式中，定点多肽(例如变体、突变、酶促失活的和/或条件性酶促失活的定点多肽)靶向核酸。在一些实施方式中，定点多肽(例如变体、突变的、酶促失活的和/或条件性酶促失活的核糖核酸内切酶)靶向DNA。在一些实施方式中，定点多肽(例如变体、突变的、酶促失活的和/或条件性酶促失活的核糖核酸内切酶)靶向RNA。
在一些实施方式中，定点多肽具有一个或多个非天然序列(例如，定点多肽是融合蛋白)。
在一些实施方式中，定点多肽具有与来自细菌(例如酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、核酸结合结构域和两个核酸切割结构域(例如HNH结构域和RuvC结构域)。
在一些实施方式中，定点多肽具有与来自细菌(例如酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、以及两个核酸切割结构域(例如HNH结构域和RuvC结构域)。
在一些实施方式中，定点多肽具有与来自细菌(例如酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、以及两个核酸切割结构域，其中核酸切割结构域中的一个或两个与来自细菌(例如酿脓链球菌)的Cas9的核酸酶结构域具有至少50％的氨基酸同一性。
在一些实施方式中，定点多肽具有与来自细菌(例如酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、两个核酸切割结构域(例如HNH结构域和RuvC结构域)、以及非天然序列(例如核定位信号)或将定点多肽连接至非天然序列的接头。
在一些实施方式中，定点多肽具有与来自细菌(例如酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、两个核酸切割结构域(例如HNH结构域和RuvC结构域)，其中定点多肽在一个或两个核酸切割结构域中具有突变，所述突变使核酸酶结构域的切割活性降低至少50％。
在一些实施方式中，定点多肽具有与来自细菌(例如酿脓链球菌)的Cas9具有至少15％氨基酸同一性的氨基酸序列、以及两个核酸切割结构域(例如HNH和RuvC结构域)，其中核酸酶结构域之一具有天冬氨酸10突变，和/或其中核酸酶结构域之一具有组氨酸840突变，并且其中突变将核酸酶结构域的切割活性降低了至少50％
在一些实施方式中，所述一种或多种定点多肽(例如DNA核酸内切酶)包括一起引起基因组中的特定基因座处的一个双链断裂的两个切口酶，或一起引起基因组中的特定基因座处的两个双链断裂的四个切口酶。或者，一种定点多肽(例如DNA核酸内切酶)作用于基因组中的特定基因座处的一个双链断裂。
在一些实施方式中，编码定点多肽的多核苷酸可用于编辑基因组。在一些此类实施方式中，根据本领域的标准的方法对编码定点多肽的多核苷酸进行密码子优化，以在包含感兴趣的靶DNA的细胞中表达。例如，如果预期的靶核酸处于人细胞中，则考虑将经人密码子优化的编码Cas9的多核苷酸用于产生Cas9多肽。
Cas基因/多肽和前间隔区邻近基序
示例性的CRISPR/Cas多肽包括如下的图1中的Cas9多肽：Fonfara I.等，(2014).Nucl.Acids Res.,42(4):2577-2590(以引用的方式并入本文)。自从发现Cas基因以来，CRISPR/Cas基因命名系统已经历了广泛的重写。Fonfara等(2014)的图5提供了来自各种物种的Cas9多肽的PAM序列。
核酸
靶向基因组的核酸或向导RNA
本公开内容提供了靶向基因组的核酸，其可以将相关多肽(例如定点多肽或DNA核酸内切酶)的活性指向至靶核酸内的特定的靶序列(例如感兴趣的基因)。在一些实施方式中，靶向基因组的核酸是RNA。靶向基因组的RNA在本文中被称为“向导RNA”或“gRNA”。向导RNA至少具有杂交至感兴趣的靶核酸序列以及CRISPR重复序列的间隔区序列。在II型系统中，gRNA还具有称为tracrRNA序列的第二RNA。在II型向导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列和tracrRNA序列彼此杂交以形成双链体。在V型向导RNA(gRNA)中，CRISPR重复序列RNA(crRNA)形成双链体。在这两个系统中，双链体结合定点多肽，从而使向导RNA和定点多肽形成复合物。靶向基因组的核酸由于其与定点多肽的关联而为复合物提供靶标特异性。因此，靶向基因组的核酸指向定点多肽的活性。
在一些实施方式中，靶向基因组的核酸是双分子向导RNA。在一些实施方式中，靶向基因组的核酸是单分子向导RNA。双分子向导RNA具有两条RNA链。第一链在5′至3′方向上具有任选的间隔区延伸序列、间隔区序列和最小的CRISPR重复序列。第二链具有最小的tracrRNA序列(与最小的CRISPR重复序列互补)、3′tracrRNA序列以及任选的tracrRNA延伸序列。II型系统中的单分子向导RNA(sgRNA)在5′至3'方向上具有任选的间隔区延伸序列、间隔区序列、最小的CRISPR重复序列、单分子向导接头、最小的tracrRNA序列、3′tracrRNA序列和任选的tracrRNA延伸序列。任选的tracrRNA延伸可以具有为向导RNA提供额外的功能性(例如稳定性)的元件。单分子向导接头将最小的CRISPR重复序列和最小的tracrRNA序列连接，以形成发夹结构。任选的tracrRNA延伸具有一个或多个发夹。V型系统中的单分子向导RNA(sgRNA)在5'至3′方向上具有最小的CRISPR重复序列和间隔区序列。
作为说明，CRISPR/Cas/Cpf1系统中使用的向导RNA或其它较小的RNA可以通过如下所述的化学方法和本领域描述的化学方法容易地合成。随着化学合成程序的不断发展，由于多核苷酸长度显著增加超过约一百个核苷酸，通过诸如高效液相色谱法(HPLC，避免使用诸如PAGE的凝胶)的程序对此类RNA进行纯化趋于更具挑战性。用于生产更大长度的RNA的一种方式是产生连结在一起的两个以上的分子。更长的RNA(例如编码Cas9或Cpf1核酸内切酶的RNA)更容易酶促产生。如本领域所述，可以在RNA的化学合成和/或酶促生成期间或之后引入各种类型的RNA修饰(例如，增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度、和/或增强其它属性的修饰)。
间隔区延伸序列
在靶向基因组的核酸的一些实施方式中，间隔区延伸序列可以修饰活性、提供稳定性和/或提供用于修饰靶向基因组的核酸的位置。间隔区延伸序列可以修饰中靶或脱靶活性或特异性。在一些实施方式中，提供了间隔区延伸序列。间隔区延伸序列的长度可以为大于1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、140个、160个、180个、200个、220个、240个、260个、280个、300个、320个、340个、360个、380个、400个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个或7000个或更多个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可以为或约为1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、140个、160个、180个、200个、220个、240个、260个、280个、300个、320个、340个、360个、380个、400个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个或7000个或更多个核苷酸。间隔区延伸序列的长度可以为小于1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、140个、160个、180个、200个、220个、240个、260个、280个、300个、320个、340个、360个、380个、400个、1000个、2000个、3000个、4000个、5000个、6000个、7000个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区延伸序列的长度小于10个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区延伸序列的长度在10-30个核苷酸之间。在一些实施方式中，间隔区延伸序列的长度在30-70个核苷酸之间。
在一些实施方式中，间隔区延伸序列具有另一部分(例如，稳定性控制序列、核糖核酸内切酶结合序列、核酶)。在一些实施方式中，该部分降低或增加了靶向基因组的核酸的稳定性。在一些实施方式中，该部分是转录终止子片段(例如转录终止序列)。在一些实施方式中，该部分在真核细胞中起作用。在一些实施方式中，该部分在原核细胞中起作用。在一些实施方式中，该部分在真核细胞和原核细胞两者中起作用。合适部分的非限制性实例包括：5′帽(例如7-甲基鸟苷酸帽(m7 G))、核糖开关序列(例如，允许通过蛋白质和蛋白质复合物的经调节的稳定性和/或经调节的可及性)、形成dsRNA双链体的序列(例如发夹)、将RNA靶向至亚细胞位置(例如核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供追踪的序列或修饰(例如，直接缀合至荧光分子、缀合至有助于荧光检测的部分、允许进行荧光检测的序列等)和/或提供蛋白质(例如作用于DNA的蛋白质，包括转录激活因子、转录阻遏因子、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)的结合位点的序列或修饰。
间隔区序列
间隔区序列杂交至感兴趣的靶核酸中的序列。靶向基因组的核酸的间隔区通过杂交(例如碱基配对)以序列特异性的方式与靶核酸相互作用。因此，间隔区的核苷酸序列根据感兴趣的靶核酸的序列而变化。
在本文的CRISPR/Cas系统中，将间隔区序列设计成杂交至靶核酸，所述靶核酸定位于系统中使用的Cas酶(例如Cas9酶)的PAM的5′。间隔区可以完好匹配靶序列或可以具有错配。每个Cas酶都具有其在靶DNA中识别的特定的PAM序列。例如，酿脓链球菌Cas9在靶核酸中识别具有序列5′-NRG-3′的PAM，其中R具有A或G，其中N是任何核苷酸，并且N紧邻间隔区序列靶向的靶核酸序列的3′。
在一些实施方式中，靶核酸序列具有20个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸具有少于20个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸具有多于20个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸具有至少：5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸具有至多：5个、10个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、30个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，靶核酸序列具有紧邻PAM的第一核苷酸的5′的20个碱基。例如，在具有5′-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNRG-3的序列中，靶核酸具有对应于Ns的序列，其中N是任何核苷酸，并且带下划线的NRG序列(R是G或A)是酿脓链球菌Cas9 PAM。在一些实施方式中，作为被酿脓链球菌Cas9识别的序列的在本公开内容的组合物和方法中使用的PAM序列为NGG。
在一些实施方式中，杂交至靶核酸的间隔区序列的长度为至少或至少约6个核苷酸(nt)。间隔区序列可以为至少或至少约6nt、约10nt、约15nt、约18nt、约19nt、约20nt、约25nt、约30nt、约35nt或约40nt、从或从约6nt至或至约80nt、从或从约6nt至或至约50nt、从或从约6nt至或至约45nt、从或从约6nt至或至约40nt、从或从约6nt至或至约35nt、从或从约6nt至或至约30nt、从或从约6nt至或至约25nt、从或从约6nt至或至约20nt、从或从约6nt至或至约19nt、从或从约10nt至或至约50nt、从或从约10nt至或至约45nt、从或从约10nt至或至约40nt、从或从约10nt至或至约35nt、从或从约10nt至或至约30nt、从或从约10nt至或至约25nt、从或从约10nt至或至约20nt、从或从约10nt至或至约19nt、从或从约19nt至或至约25nt、从或从约19nt至或至约30nt、从或从约19nt至或至约35nt、从或从约19nt至或至约40nt、从或从约19nt至或至约45nt、从或从约19nt至或至约50nt、从或从约19nt至或至约60nt、从或从约20nt至或至约25nt、从或从约20nt至或至约30nt、从或从约20nt至或至约35nt、从或从约20nt至或至约40nt、从或从约20nt至或至约45nt、从或从约20nt至或至约50nt、或者从或从约20nt至或至约60nt。在一些实施方式中，间隔区序列具有20个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区具有19个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区具有18个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区具有17个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区具有16个核苷酸。在一些实施方式中，间隔区具有15个核苷酸。
在一些实施方式中，间隔区序列与靶核酸之间的互补百分比为至少或至少约30％、至少或至少约40％、至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约65％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、或100％。在一些实施方式中，间隔区序列与靶核酸之间的互补百分比为至多或至多约30％、至多或至多约40％、至多或至多约50％、至多或至多约60％、至多或至多约65％、至多或至多约70％、至多或至多约75％、至多或至多约80％、至多或至多约85％、至多或至多约90％、至多或至多约95％、至多或至多约97％、至多或至多约98％、至多或至多约99％、或约100％。在一些实施方式中，间隔区序列与靶核酸之间在靶核酸的互补链的靶序列的六个连续的最5′的核苷酸上的互补百分比为100％。在一些实施方式中，间隔区序列与靶核酸之间在20个连续核苷酸上或约20个连续核苷酸上的互补百分比为至少60％。在一些实施方式中，间隔区序列和靶核酸的长度可以相差1个至6个核苷酸，这可以被认为是凸起(bulge)。
在一些实施方式中，间隔区序列使用计算机程序设计或选择。该计算机程序可以使用变量，例如预测的解链温度、二级结构形成、预测的退火温度、序列同一性、基因组背景、染色质可及性、GC％、(相同或相似的序列但由于错配、插入或缺失而在一个或多个点中不同的序列的)基因组发生的频率、甲基化状态、SNP的存在等。
最小的CRISPR重复序列
在一些实施方式中，最小的CRISPR重复序列是与参照CRISPR重复序列(例如来自酿脓链球菌的crRNA)具有至少或至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，最小的CRISPR重复序列具有可杂交至细胞中的最小的tracrRNA序列的核苷酸。最小的CRISPR重复序列和最小的tracrRNA序列形成双链体，例如碱基配对的双链结构。最小的CRISPR重复序列和最小的tracrRNA序列一起结合至定点多肽。最小的CRISPR重复序列的至少一部分杂交至最小的tracrRNA序列。在一些实施方式中，最小的CRISPR重复序列的至少一部分与最小的tracrRNA序列具有至少或至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的互补。在一些实施方式中，最小的CRISPR重复序列的至少一部分与最小的tracrRNA序列具有至多或至多约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的互补。
最小的CRISPR重复序列的长度可以为从或从约7个核苷酸至或至约100个核苷酸。例如，最小的CRISPR重复序列的长度为从或从约7个核苷酸(nt)至或至约50nt、从或从约7nt至或至约40nt、从或从约7nt至或至约30nt、从或从约7nt至或至约25nt、从或从约7nt至或至约20nt、从或从约7nt至或至约15nt、从或从约8nt至或至约40nt、从或从约8nt至或至约30nt、从或从约8nt至或至约25nt、从或从约8nt至或至约20nt、从或从约8nt至或至约15nt、从或从约15nt至或至约100nt、从或从约15nt至或至约80nt、从或从约15nt至或至约50nt、从或从约15nt至或至约40nt、从或从约15nt至或至约30nt、或者从或从约15nt至或至约25nt。在一些实施方式中，最小的CRISPR重复序列的长度为约9个核苷酸。在一些实施方式中，最小的CRISPR重复序列的长度为约12个核苷酸。
在一些实施方式中，最小的CRISPR重复序列与参照的最小的CRISPR重复序列(例如来自酿脓链球菌的野生型crRNA)在至少6个、7个或8个连续的核苷酸的伸长段(stretch)上至少或至少约60％相同。例如，最小的CRISPR重复序列与参照的最小的CRISPR重复序列在至少6个、7个或8个连续核苷酸的伸长段上至少或至少约65％相同、至少或至少约70％相同、至少或至少约75％相同、至少或至少约80％相同、至少或至少约85％相同、至少或至少约90％相同、至少或至少约95％相同、至少或至少约98％相同、至少或至少约99％相同或100％相同。
最小的tracrRNA序列
在一些实施方式中，最小的tracrRNA序列是与参照tracrRNA序列(例如来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)具有至少或至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，最小的tracrRNA序列具有杂交至细胞中的最小的CRISPR重复序列的核苷酸。最小的tracrRNA序列和最小的CRISPR重复序列形成双链体，例如碱基配对的双链结构。最小的tracrRNA序列和最小的CRISPR重复序列一起结合至定点多肽。最小的tracrRNA序列的至少一部分可以杂交至最小的CRISPR重复序列。在一些实施方式中，最小的tracrRNA序列与最小的CRISPR重复序列至少或至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％互补。
最小的tracrRNA序列的长度可以为从或从约7个核苷酸至或至约100个核苷酸。例如，最小的tracrRNA序列的长度可以从或从约7个核苷酸(nt)至或至约50nt、从或从约7nt至或至约40nt、从或从约7nt至或至约30nt、从或从约7nt至或至约25nt、从或从约7nt至或至约20nt、从或从约7nt至或至约15nt、从或从约8nt至或至约40nt、从或从约8nt至或至约30nt、从或从约8nt至或至约25nt、从或从约8nt至或至约20nt、从或从约8nt至或至约15nt、从或从约15nt至或至约100nt、从或从约15nt至或至约80nt、从或从约15nt至或至约50nt、从或从约15nt至或至约40nt、从或从约15nt至或至约30nt、或者从或从约15nt至或至约25nt。在一些实施方式中，最小的tracrRNA序列的长度为约9个核苷酸。在一些实施方式中，最小的tracrRNA序列为约12个核苷酸。在一些实施方式中，最小的tracrRNA由在如下中描述的23-48nt的tracrRNA组成：Jinek M.等，(2012).Science,337(6096):816-821。
在一些实施方式中，最小的tracrRNA序列与参照的最小的tracrRNA(例如来自酿脓链球菌的野生型tracrRNA)序列在至少6个、7个或8个连续的核苷酸的伸长段上至少或至少约60％相同。例如，最小的tracrRNA序列与参照的最小的tracrRNA序列在至少6个、7个或8个连续核苷酸的伸长段上至少或至少约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同、约99％相同或100％相同。
在一些实施方式中，最小的CRISPR RNA和最小的tracrRNA之间的双链体具有双螺旋。在一些实施方式中，最小的CRISPR RNA和最小的tracrRNA之间的双链体具有至少或至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，最小的CRISPR RNA和最小的tracrRNA之间的双链体具有至多或至多约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸。
在一些实施方式中，该双链体具有错配(例如，双链体的两条链不是100％互补)。在一些实施方式中，该双链体具有至少或至少约1个、2个、3个、4个或5个错配。在一些实施方式中，该双链体具有至多或至多约1个、2个、3个、4个或5个错配。在一些实施方式中，该双链体具有不超过2个错配。
3'tracrRNA序列
在一些实施方式中，3′tracrRNA序列具有与参照tracrRNA序列(例如来自酿脓链球菌的tracrRNA)具有至少或至少约30％、约40％、约50％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％或100％的序列同一性的序列。
在一些实施方式中，3′tracrRNA序列的长度为从或从约6个核苷酸至或至约100个核苷酸。例如，3′tracrRNA序列的长度可为从或从约6个核苷酸(nt)至或至约50nt、从或从约6nt至或至约40nt、从或从约6nt至或至约30nt、从或从约6nt至或至约25nt、从或从约6nt至或至约20nt、从或从约6nt至或至约15nt、从或从约8nt至或至约40nt、从或从约8nt至或至约30nt、从或从约8nt至或至约25nt、从或从约8nt至或至约20nt、从或从约8nt至或至约15nt、从或从约15nt至或至约100nt、从或从约15nt至或至约80nt、从或从约15nt至或至约50nt、从或从约15nt至或至约40nt、从或从约15nt至或至约30nt、或者从或从约15nt至或至约25nt。在一些实施方式中，3′tracrRNA序列的长度约为14个核苷酸。
在一些实施方式中，3′tracrRNA序列与参照3′tracrRNA序列(例如来自酿脓链球菌的野生型3′tracrRNA序列)在至少6个、7个或8个连续核苷酸的伸长段上至少或至少约60％相同。例如，3′tracrRNA序列与参照3′tracrRNA序列(例如来自酿脓链球菌的野生型3′tracrRNA序列)在至少6个、7个或8个连续核苷酸的伸长段上至少或至少约60％相同、约65％相同、约70％相同、约75％相同、约80％相同、约85％相同、约90％相同、约95％相同、约98％相同、约99％相同或100％相同。
在一些实施方式中，3′tracrRNA序列具有多于一个的双链体区域(例如发夹、杂交区域)。在一些实施方式中，3′tracrRNA序列具有两个双链体区域。
在一些实施方式中，3′tracrRNA序列具有茎环结构。在一些实施方式中，3′tracrRNA中的茎环结构具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，3′tracrRNA中的茎环结构具有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，茎环结构具有功能部分。例如，茎环结构可以具有适体、核酶、与蛋白质相互作用的发夹、CRISPR阵列、内含子或外显子。在一些实施方式中，茎环结构具有至少或至少约1个、2个、3个、4个或5个或更多个功能部分。在一些实施方式中，茎环结构具有至多或至多约1个、2个、3个、4个或5个或更多个功能部分。
在一些实施方式中，3'tracrRNA序列中的发夹具有P结构域。在一些实施方式中，P结构域在发夹中具有双链区。
tracrRNA延伸序列
在一些实施方式中，无论tracrRNA在单分子向导还是双分子向导的背景下，都可以提供tracrRNA延伸序列。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度为从或从约1个核苷酸至或至约400个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度大于1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、140个、160个、180个、200个、220个、240个、260个、280个、300个、320个、340个、360个、380个或400个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度为从或从约20个至或至约5000个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度大于1000个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度小于1个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、120个、140个、160个、180个、200个、220个、240个、260个、280个、300个、320个、340个、360个、380个、400个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度可以小于1000个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度小于10个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度为10-30个核苷酸。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列的长度为30-70个核苷酸。
在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列具有功能部分(例如，稳定性控制序列、核酶、核糖核酸内切酶结合序列)。在一些实施方式中，功能部分具有转录终止子片段(例如转录终止序列)。在一些实施方式中，功能部分的总长度为从或从约10个核苷酸(nt)至或至约100个核苷酸、从或从约10nt至或至约20nt、从或从约20nt至或至约30nt、从或从约30nt至或至约40nt、从或从约40nt至或至约50nt、从或从约50nt至或至约60nt、从或从约60nt至或至约70nt、从或从约70nt至或至约80nt、从或从约80nt至或至约90nt、或者从或从约90nt至或至约100nt、从或从约15nt至或至约80nt、从或从约15nt至或至约50nt、从或从约15nt至或至约40nt、从或从约15nt至或至约30nt、或者从或从约15nt至或至约25nt。在一些实施方式中，功能部分在真核细胞中起作用。在一些实施方式中，功能部分在原核细胞中起作用。在一些实施方式中，功能部分在真核细胞和原核细胞中均起作用。
合适的tracrRNA延伸功能部分的非限制性实例包括3′聚腺苷酸化的尾部、核糖开关序列(例如，以允许通过蛋白和蛋白质复合物的经调节的可及性和/或经调节的稳定性)、形成dsRNA双链体的序列(例如发夹)、将RNA靶向至亚细胞位置(例如核、线粒体、叶绿体等)的序列、提供追踪(例如，与荧光分子直接缀合、与有助于荧光检测的部分缀合、允许进行荧光检测的序列等)的序列或修饰、和/或为蛋白(例如作用于DNA的蛋白，包括转录激活因子、转录阻遏因子、DNA甲基转移酶、DNA脱甲基酶、组蛋白乙酰转移酶、组蛋白脱乙酰基酶等)提供结合位点的序列或修饰。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列具有引物结合位点或分子索引(例如条形码序列)。在一些实施方式中，tracrRNA延伸序列具有一个或多个亲和标签。
凸起
在一些实施方式中，在最小的CRISPR RNA和最小的tracrRNA之间的双链体中存在“凸起”。凸起是双链体内的核苷酸的未配对区域。在一些实施方式中，凸起有助于双链体结合至定点多肽。凸起在双链体的一侧具有未配对的5′-XXXY-3′(其中X是任何嘌呤，而Y具有可以与相对的链上的核苷酸形成摆动(wobble)配对的核苷酸)，并且在双链体的另一侧上具有未配对的核苷酸区域。双链体两侧上的未配对的核苷酸数量可以不同。
在一个实例中，凸起在该凸起的最小的CRISPR重复序列链上具有未配对的嘌呤(例如腺嘌呤)。在一些实施方式中，凸起具有该凸起的最小的tracrRNA序列链的未配对的5'-AAGY-3′，其中Y具有可以与最小的CRISPR重复序列链上的核苷酸形成摆动配对的核苷酸。
在一些实施方式中，双链体的最小的CRISPR重复序列侧上的凸起具有至少1个、2个、3个、4个或5个或更多个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，双链体的最小的CRISPR重复序列侧上的凸起具有至多1个、2个、3个、4个或5个或更多个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，双链体的最小的CRISPR重复序列侧上的凸起具有1个未配对的核苷酸。
在一些实施方式中，双链体的最小的tracrRNA序列侧上的凸起具有至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，双链体的最小的tracrRNA序列侧上的凸起具有至多1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个未配对的核苷酸。在一些实施方式中，双链体的第二侧(例如，双链体的最小的tracrRNA序列侧)上的凸起具有4个未配对的核苷酸。
在一些实施方式中，凸起具有至少一个摆动配对。在一些实施方式中，凸起具有至多一个摆动配对。在一些实施方式中，凸起具有至少一个嘌呤核苷酸。在一些实施方式中，凸起具有至少3个嘌呤核苷酸。在一些实施方式中，凸起序列具有至少5个嘌呤核苷酸。在一些实施方式中，凸起序列具有至少一个鸟嘌呤核苷酸。在一些实施方式中，凸起序列具有至少一个腺嘌呤核苷酸。
发夹
在各种实施方式中，一个或多个发夹位于3′tracrRNA序列中的最小的tracrRNA的3′。
在一些实施方式中，发夹从最小的CRISPR重复序列和最小的tracrRNA序列双链体中的最末配对的核苷酸的3′的至少或至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个核苷酸开始。在一些实施方式中，发夹可在最小的CRISPR重复序列和最小的tracrRNA序列双链体中的最末配对的核苷酸的3′的至多或至多约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个或更多个核苷酸开始。
在一些实施方式中，发夹具有至少或至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或20个或更多个连续的核苷酸。在一些实施方式中，发夹具有至多或至多约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个或更多个连续的核苷酸。
在一些实施方式中，发夹具有CC二核苷酸(例如两个连续的胞嘧啶核苷酸)。
在一些实施方式中，发夹具有双链体核苷酸(例如，杂交在一起的发夹中的核苷酸)。例如，发夹具有杂交至3′tracrRNA序列的发夹双链体中的GG二核苷酸的CC二核苷酸。
一个或多个发夹可以与定点多肽的向导RNA相互作用区域相互作用。
在一些实施方式中，存在两个以上的发夹，并且在一些实施方式中，存在三个以上的发夹。
单分子向导接头序列
在一些实施方式中，单分子向导核酸的接头序列的长度为从或从约3个核苷酸至或至约100个核苷酸。例如在Jinek,M.等，(2012).Science,337(6096):816-821中，使用了简单的4个核苷酸的“tetraloop”(-GAAA-)。说明性的接头的长度为从或从约3个核苷酸(nt)至或至约90nt、从或从约3nt至或至约80nt、从或从约3nt至或至约70nt、从或从约3nt至或至约60nt、从或从约3nt至或至约50nt、从或从约3nt至或至约40nt、从或从约3nt至或至约30nt、从或从约3nt至或至约20nt、从或从约3nt至或至约10nt。例如，接头的长度可以为从或从约3nt至或至约5nt、从或从约5nt至或至约10nt、从或从约10nt至或至约15nt、从或从约15nt至或至约20nt、从或从约20nt至或至约25nt、从或从约25nt至或至约30nt、从或从约30nt至或至约35nt、从或从约35nt至或至约40nt、从或从约40nt至或至约50nt、从或从约50nt至或至约60nt、从或从约60nt至或至约70nt、从或从约70nt至或至约80nt、从或从约80nt至或至约90nt、或者从或从约90nt至或至约100nt。在一些实施方式中，单分子向导核酸的接头在4个至40个核苷酸之间。在一些实施方式中，接头为至少或至少约100个、500个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、6500个或7000个或更多个核苷酸。在一些实施方式中，接头至多或至多约100个、500个、1000个、1500个、2000个、2500个、3000个、3500个、4000个、4500个、5000个、5500个、6000个、6500个或7000个或更多个核苷酸。
接头可以具有多种序列中的任何序列，尽管在一些实施方式中，接头将不具有与向导RNA的其它部分具有广泛的同源性区域的序列，这可能引起能够干扰向导的其它功能区域的分子内结合。在Jinek等，(2012).Science,337(6096):816-821中，使用了简单的4个核苷酸的序列-GAAA-，但是同样可以使用许多其它序列，包括更长的序列。
在一些实施方式中，接头序列具有功能部分。例如，接头序列可具有一个或多个特征，包括适体、核酶、与蛋白相互作用的发夹、蛋白结合位点、CRISPR阵列、内含子或外显子。在一些实施方式中，接头序列具有至少或至少约1个、2个、3个、4个或5个或更多个功能部分。在一些实施方式中，接头序列具有至多或至多约1个、2个、3个、4个或5个或更多个功能部分。
供体DNA或供体模板
定点多肽(例如DNA核酸内切酶)可以在核酸(例如基因组DNA)中引入双链断裂或单链断裂。双链断裂可刺激细胞的内源性DNA修复途径(例如，同源依赖性修复(HDR)或非同源末端连接或替代性非同源末端连接(A-NHEJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ))。NHEJ可以无需同源模板而修复经切割的靶核酸。这有时可能在切割位点处引起靶核酸中的小的缺失或插入(插入缺失)，并可能引起基因表达的破坏或改变。当可获得同源修复模板或供体时，可能发生HDR(也称为同源重组(HR))。
同源供体模板具有与侧接靶核酸切割位点的序列同源的序列。姐妹染色单体通常被细胞用作修复模板。然而，出于基因组编辑的目的，修复模板通常作为外源核酸(例如质粒、双链体寡核苷酸、单链寡核苷酸、双链寡核苷酸或病毒核酸)提供。对于外源供体模板，通常在同源的侧接区域之间引入额外的核酸序列(例如转基因)或修饰(例如单碱基或多碱基改变或缺失)，以便额外或改变的核酸序列也被并入靶基因座中。MMEJ引起与NHEJ相似的遗传结果，其中在切割位点处可能发生小的缺失和插入。MMEJ利用具有侧接切割位点的若干个碱基对的同源序列来驱动有利的末端连接DNA修复结果。在一些情况下，有可能基于核酸酶靶区域中的潜在的微同源性(microhomologies)的分析来预测可能的修复结果。
因此，在一些情况下，使用同源重组将外源多核苷酸序列插入靶核酸切割位点中。外源多核苷酸序列在本文中称为供体多核苷酸(或供体或供体序列或供体模板)。在一些实施方式中，将供体多核苷酸、供体多核苷酸的一部分、供体多核苷酸的拷贝或供体多核苷酸的拷贝的一部分插入靶核酸切割位点中。在一些实施方式中，供体多核苷酸是外源多核苷酸序列，例如不会天然存在于靶核酸切割位点处的序列。
当在发生双链断裂的细胞核内以足够的浓度提供外源DNA分子时，可以在NHEJ修复过程中将外源DNA插入双链断裂处，从而可以稳定地维持在基因组中，例如成为基因组的永久添加物。在一些实施方式中，这些外源DNA分子被称为供体模板。如果供体模板包含感兴趣的基因组位点或感兴趣的基因的编码序列以及任选的相关的调控序列(如启动子、增强子、polyA序列和/或剪接受体序列)，则可以从基因组中的整合的拷贝中表达感兴趣的基因，引起在细胞生命中的永久表达。而且，当细胞分裂时，供体DNA模板的整合的拷贝可以被传递到子细胞。
在足够浓度的供体DNA模板存在的情况下，供体DNA模板可以通过HDR途径进行整合，所述供体模板包含与双链断裂任一侧的DNA序列具有同源性的侧接的DNA序列(称为同源臂)。同源臂充当供体模板与双链断裂任一侧的序列之间的同源重组的底物。这可以引起供体模板的无错误插入，其中，双链断裂任一侧的序列没有自未修饰基因组中的序列发生改变。
所提供的用于通过HDR进行编辑的供体显著不同，但通常包含具有小或大的侧接同源臂的预期序列，以允许退火至基因组DNA。侧接所引入的遗传变化的同源性区域可以是30bp或更小，或者大至可以包含启动子、cDNA等的数千碱基的盒。单链寡核苷酸供体和双链寡核苷酸供体二者均可使用。这些寡核苷酸的大小的范围从小于100nt至超过许多kb，尽管也可以生成和使用更长的ssDNA。通常使用双链供体，包括PCR扩增子、质粒和微环(mini-circle)。通常，已经发现AAV载体(尽管本文公开的基因编辑方法不限于此)是递送供体模板的非常有效的手段，尽管单个供体的包装限制为<5kb。供体的主动转录使HDR增加三倍，表明包含启动子可以提高转化率。相反，供体的CpG甲基化可降低基因表达和HDR。
在一些实施方式中，可以通过各种不同的方法(例如通过转染、纳米颗粒、微注射(micro-injection)或病毒转导)独立地提供供体DNA或与核酸酶一起提供。在一些实施方式中，可以使用一系列的栓系选项(tethering options)来增加用于HDR的供体的可用性。实例包括将供体连接至核酸酶、连接至附近结合的DNA结合蛋白或连接至参与DNA末端结合或修复的蛋白。
除了通过NHEJ或HDR进行基因组编辑外，还可以利用NHEJ途径和HR二者进行位点特异性基因插入。组合方法可以适用于某些设置，可能包括内含子/外显子边界。NHEJ可以证明对内含子中的连接有效，而无错误的HDR则在编码区域中更适合。
编码定点多肽或DNA核酸内切酶的核酸
在一些实施方式中，基因组编辑的方法和组合物因此可以使用编码定点多肽或DNA核酸内切酶的核酸序列(或寡核苷酸)。编码定点多肽的核酸序列可以是DNA或RNA。如果编码定点多肽的核酸序列是RNA，则它可以共价连接至gRNA序列或作为单独的序列存在。在一些实施方式中，可以使用定点多肽或DNA核酸内切酶的肽序列代替其核酸序列。
基因编辑载体
在另一方面，本公开内容提供了如下核酸，所述核酸具有编码本公开内容的靶向基因组的核酸、本公开内容的定点多肽和/或实施本公开内容的方法的实施方式所需要的任何核酸或蛋白质性质的分子的核苷酸序列。在一些实施方式中，此类的核酸是载体(例如重组表达载体)。
在考虑之列的表达载体包括但不限于基于牛痘病毒、脊髓灰质炎病毒、腺病毒、腺相关病毒、SV40、单纯疱疹病毒、人免疫缺陷病毒、逆转录病毒(例如鼠类白血病病毒、脾脏坏死病毒；以及衍生自如下逆转录病毒的载体，例如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、慢病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳腺肿瘤病毒)的病毒载体、和其它重组载体。考虑用于真核靶细胞的其它载体包括但不限于载体pXT1、pSG5、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVLSV40(Pharmacia)。考虑用于真核靶细胞的额外的载体包括但不限于载体pCTx-1、pCTx-2和pCTx-3。只要它们与宿主细胞相容，也可以使用其它载体。
在一些实施方式中，载体具有一个或多个转录和/或翻译控制元件。取决于使用的宿主/载体系统，可以在表达载体中使用多种合适的转录和翻译控制元件(包括组成型和诱导型启动子、转录增强子元件、转录终止子等)中的任一者。在一些实施方式中，载体是使病毒序列或CRISPR机制的组件或其它元件失活的自灭活载体。
合适的真核启动子(例如在真核细胞中起作用的启动子)的非限制性实例包括来自如下的启动子：巨细胞病毒(CMV)即早(cytomegalovirus(CMV)immediate early)、单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶、早期和晚期SV40、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTR)、人类延伸因子1启动子(EF1)、具有融合至鸡β-肌动蛋白启动子(CAG)的巨细胞病毒(CMV)增强子的杂交构建体、鼠类干细胞病毒启动子(MSCV)、磷酸甘油酸激酶-1基因座启动子(PGK)以及小鼠金属硫蛋白-I。在进一步的实施方式中，启动子是MND启动子(例如，包括SEQ ID NO：33的核酸序列的MND启动子)。
为了表达小RNA，包括与Cas核酸内切酶结合使用的向导RNA、各种启动子(诸如RNA聚合酶III启动子，包括例如U6和H1)可能是有利的。增强此类启动子的用途的描述和参数是本领域已知的，并且定期描述额外的信息和方法；参见例如，Ma,H.等，(2014).Mol.Ther.-Nucleic Acids 3:e161,doi:10.1038/mtna.2014.12。
表达载体还可包含用于翻译起始的核糖体结合位点和转录终止子。表达载体还可包含用于扩增表达的合适序列。表达载体还可以包含编码融合至定点多肽的非天然标签(例如组氨酸标签、血凝素标签、绿色荧光蛋白等)的核苷酸序列，从而产生融合蛋白。
在一些实施方式中，启动子是诱导型启动子(例如热激启动子、四环素调节的启动子、类固醇调节的启动子、金属调节的启动子、雌激素受体调节的启动子等)。在一些实施方式中，启动子是组成型启动子(例如CMV启动子、UBC启动子)。在一些实施方式中，启动子是空间受限的启动子和/或时间受限的启动子(例如组织特异性启动子、细胞类型特异性启动子等)。在一些实施方式中，如果在将至少一个基因插入基因组中之后将会在基因组中存在的内源性启动子下表达该基因，则该载体不具有用于该至少一个基因在宿主细胞中表达的启动子。
在一些实施方式中，载体含有编码CISC的一种或多种组分的一种或多种核酸序列(例如本文公开的任何CISC多肽，包括包含截短的ILR2β细胞内信号传导结构域的CISC多肽)。本文公开的基因编辑载体还可以包含编码本文公开的任何裸露的FRB结构域多肽的核酸序列。在一些实施方式中，载体包括SEQ ID NO：3的核酸序列。在进一步的实施方式中，载体包括SEQ ID NO：8的核酸序列。
定点多肽和靶向基因组的核酸的复合物
靶向基因组的核酸与定点多肽(例如核酸引导的核酸酶，诸如Cas9)相互作用，从而形成复合物。靶向基因组的核酸(例如gRNA)将定点多肽引导至靶核酸。
如前所述，在一些实施方式中，可以各自分开地向细胞或受试者给予定点多肽和靶向基因组的核酸。另一方面，在一些实施方式中，定点多肽可以与一个或多个向导RNA、或者同tracrRNA一起的一个或多个crRNA进行预复合。然后可以向细胞或受试者给予预复合的材料。此类预复合材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
制备表达裸露的FRB结构域多肽和/或CISC组分的细胞的方法
在本文所述的一些实施方式中，可能期望将蛋白质序列或表达载体引入宿主细胞，诸如哺乳动物细胞，例如淋巴细胞，以用于雷帕霉素调节的细胞因子信号传导和/或用于选择性扩增表达二聚化CISC组分以及细胞内表达的裸露的FRB结构域多肽的细胞。例如，二聚化CISC可以允许具有引入的CISC组分的细胞中的细胞因子信号传导，所述CISC组分用于在与配体接触时将信号传递到细胞(诸如哺乳动物细胞)内部，而细胞内表达的裸露的FRB结构域多肽赋予针对雷帕霉素对细胞的不利作用的抗性。另外，如本文中所述，可以控制细胞(诸如哺乳动物细胞)的选择性扩增，以仅选择那些已经历两个特定的遗传修饰事件(诸如由CRISPR/Cas系统介导的遗传修饰事件)的细胞。这些细胞的制备可以根据基于本公开内容对于本领域技术人员而言显而易见的已知技术来进行。
在一些实施方式中，提供了制备荷载CISC的细胞(诸如哺乳动物细胞)的方法，其中所述细胞表达二聚化CISC以及细胞内表达的裸露的FRB结构域多肽。该方法可包括将本文所述的任一实施方式或实施方式的蛋白质序列或本文所述的实施方式或实施方式的表达载体递送至细胞(诸如哺乳动物细胞)，并递送至细胞、诸如哺乳动物细胞。在一些实施方式中，蛋白质序列包含第一序列和第二序列。在其它实施方式中，蛋白质序列包含第一序列、第二序列、第三序列和第四序列。在一些实施方式中，第一序列编码第一CISC组分，该组分包含第一细胞外结合结构域、铰链结构域、具有指定长度的接头(其中对长度进行了优化)、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方式中，第二序列编码第二CISC组分，该组分包含第二细胞外结合结构域、铰链结构域、具有指定长度的接头(其中对长度进行了优化)、跨膜结构域和信号传导结构域。在一些实施方式中，接头的长度为1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸或为在由上述长度中的任意两个限定的范围内的长度。在一些实施方式中，信号传导结构域包含白细胞介素-2信号传导结构域，诸如IL2Rβ(包括截短的IL2Rβ)或IL2Rγ结构域。在一些实施方式中，细胞外结合结构域是与雷帕霉素或雷帕霉素类似物结合的结合结构域，该结构域包括FKBP或FRB或其功能衍生物。在一些实施方式中，细胞是CD8+细胞或CD4+细胞。在一些实施方式中，细胞是选自于由以下组成的组中的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和本体CD8+T细胞。在一些实施方式中，细胞是选自于由以下组成的组中的CD4+T辅助淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和本体CD4+T细胞。在一些实施方式中，细胞是前体T细胞。在一些实施方式中，细胞是干细胞。在一些实施方式中，细胞是造血干细胞。在一些实施方式中，细胞是B细胞。在一些实施方式中，细胞是神经元干细胞。在一些实施方式中，细胞是NK细胞。
经遗传修饰的细胞和细胞群
在一方面，本公开内容提供了编辑细胞中的基因组从而创建经遗传修饰的细胞的方法。在一些方面，提供了经遗传修饰的细胞群。因此，经遗传修饰的细胞包括具有通过基因组编辑(例如通过使用CRISPR/Cas系统)引入的至少一种遗传修饰的细胞。在一些实施方式中，经遗传修饰的细胞是经遗传修饰的淋巴细胞，例如T细胞，例如人CD4+T细胞。在本文考虑之列的是具有经整合的核酸的经遗传修饰的细胞，所述核酸编码裸露的FRB结构域多肽并且任选地进一步编码CISC。
本文所述的组合物提供了经遗传修饰的宿主细胞，诸如哺乳动物细胞，其包括本文所示和所述的蛋白质序列或表达载体。因此，本文提供了用于二聚化CISC表达以及细胞内表达的裸露的FRB结构域表达的细胞、诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含本文所述的任一实施方式的蛋白质序列或本文所述的任一实施方式的表达载体。在一些实施方式中，细胞是细菌细胞或哺乳动物细胞，诸如淋巴细胞。在一些实施方式中，细胞是大肠杆菌。在一些实施方式中，细胞是允许蛋白质表达的昆虫细胞。在一些实施方式中，细胞是淋巴细胞。
在一些实施方式中，宿主细胞是前体T细胞或调节性T细胞。在一些实施方式中，细胞是干细胞，诸如造血干细胞。在一些实施方式中，细胞是NK细胞。在一些实施方式中，细胞是CD34+、CD8+和/或CD4+T淋巴细胞。在一些实施方式中，细胞是B细胞。在一些实施方式中，细胞是神经元干细胞。
在一些实施方式中，宿主细胞是CD8+T细胞毒性淋巴细胞，其可包括幼稚CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞或本体CD8+T细胞。在一些实施方式中，细胞是CD4+T辅助淋巴细胞，其可包括幼稚CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞或本体CD4+T细胞。
淋巴细胞(T淋巴细胞)可以根据已知技术进行收集，并通过已知技术(诸如与抗体的亲和结合，诸如流式细胞术和/或免疫磁性选择)进行富集或耗尽。在富集和/或耗尽步骤之后，可根据对于本领域技术人员而言显而易见的已知技术或其变型进行期望的T淋巴细胞的体外扩增。在一些实施方式中，所述T细胞是获自受试者的自体T细胞。
例如，可通过以下扩增期望的T细胞群或亚群：在体外向培养基中添加初始T淋巴细胞群，然后向培养基中加入饲养细胞(诸如非分裂外周血单核细胞(PBMC))(例如，使得所得细胞群对于待扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞含有至少5个、10个、20个或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育所述培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。非分裂饲养细胞可包含经γ辐照的PBMC饲养细胞。在一些实施方式中，用在3000拉德至3600拉德范围内的γ射线辐照PBMC以防止细胞分裂。在一些实施方式中，用3000拉德、3100拉德、3200拉德、3300拉德、3400拉德、3500拉德或3600拉德或任何所列值的任意两个端点之间的任何拉德值的γ射线辐照PBMC，以防止细胞分裂。如果期望，可以颠倒向培养基中添加T细胞和饲养细胞的顺序。通常可在适合T淋巴细胞生长的温度等条件下孵育培养物。例如，对于人T淋巴细胞的生长，温度通常为至少或至少约25℃、至少或至少约30℃、至少或至少约37℃。在一些实施方式中，人T淋巴细胞生长的温度为约22℃、约24℃、约26℃、约28℃、约30℃、约32℃、约34℃、约36℃、约37℃，或任何所列值的任意两个端点之间的任何其它温度。
在分离T淋巴细胞后，可在扩增之前或之后将细胞毒性T淋巴细胞和辅助T淋巴细胞分选为幼稚T细胞亚群、记忆T细胞亚群和效应T细胞亚群。
CD8+细胞可以通过使用标准方法获得。在一些实施方式中，通过鉴定与这些类型的CD8+细胞中的每一种相关联的细胞表面抗原，将CD8+细胞进一步分选为幼稚细胞、中央记忆细胞和效应记忆细胞。在一些实施方式中，记忆T细胞存在于CD8+外周血淋巴细胞的CD62L+和CD62L-亚群中。在用抗CD8抗体和抗CD62L抗体染色后，将PBMC分选为CD62L-CD8+和CD62L+CD8+级分。在一些实施方式中，中央记忆TCM的表型标志物的表达包括CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127，并且对于粒酶B而言是阴性的或低的。在一些实施方式中，中央记忆T细胞是CD45RO+T细胞、CD62L+T细胞和/或CD8+T细胞。在一些实施方式中，效应TE对于CD62L、CCR7、CD28和/或CD127而言是阴性的，对于粒酶B和/或穿孔素而言是阳性的。在一些实施方式中，幼稚CD8+T淋巴细胞的特征在于包含CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和/或CD45RA的幼稚T细胞的表型标志物的表达。
通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群，将CD4+T辅助细胞分选为幼稚细胞、中央记忆细胞和效应细胞。CD4+淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方式中，幼稚CD4+T淋巴细胞是CD45RO-T细胞、CD45RA+T细胞、CD62L+T细胞和/或CD4+T细胞。在一些实施方式中，中央记忆CD4+细胞是CD62L+和/或CD45RO+。在一些实施方式中，效应CD4+细胞是CD62L-和/或CD45RO-。
是否选择细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群(诸如哺乳动物细胞群)进行扩增取决于该细胞或细胞群是否经历了两个不同的遗传修饰事件。在一些实施方式中，遗传修饰事件由CRISPR/Cas系统介导。在一些实施方式中，遗传修饰事件由CRISPR/Cas9系统介导。如果细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群(诸如哺乳动物细胞群)已经历了一个或数个遗传修饰事件，则添加配体将不会引起二聚化。然而，如果细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群(诸如哺乳动物细胞群)已经历了两个遗传修饰事件，则添加配体将引起CISC组分的二聚化以及随后的信号传导级联。因此，可以基于其对配体接触的应答来选择细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群(诸如哺乳动物细胞群)。在一些实施方式中，以0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM或100nM的量或在由上述值中的任意两个限定的范围内的浓度添加配体。
在一些实施方式中，基于作为信号传导途径的结果的标志物的表达，细胞(诸如哺乳动物细胞)或细胞群(诸如哺乳动物细胞群)对二聚化CISC以及细胞内表达的裸露的FRB结构域多肽而言可为阳性的。因此，可以使用利用针对表面标志物的特异性抗体和同种型匹配的对照抗体进行染色，通过流式细胞术来确定对二聚化CISC而言阳性的细胞群。在一些实施方式中，标志物是荧光蛋白或发光蛋白，诸如GFP或mCherry。在一些实施方式中，标志物是低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)。
在一些实施方式中，细胞不是生殖细胞。
激活细胞内部中的信号的方法
在一些实施方式中，提供了激活细胞(诸如哺乳动物细胞)内部中的信号的方法。该方法可包括提供如本文所述的细胞、诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含如本文所示的蛋白质序列或如本文所示的表达载体。在一些实施方式中，该方法还包括表达编码如本文所述的二聚化CISC的蛋白质序列，或表达如本文所述的载体。在一些实施方式中，该方法包括使细胞(诸如哺乳动物细胞)与配体接触，这引起第一和第二CISC组分二聚化，这将信号转导至细胞内部。在一些实施方式中，配体是雷帕霉素或雷帕霉素类似物。在一些实施方式中，以0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM或100nM的量或在由上述值中的任意两个限定的范围内的浓度提供用于诱导二聚化的配体的有效量。
在一些实施方式中，本文所述的用于信号传导复合物的化学诱导的方式中使用的配体或试剂可包括：雷帕霉素(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。雷帕霉素可包括西罗莫司
Figure BDA0002746221120000631
(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-十六氢-9,27-二羟基-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-羟基-3-甲氧基环己基]-1-甲基乙基]-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-23,27-环氧-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂环三十一烯-1,5,11,28,29(4H,6H,31H)-戊酮)；依维莫司(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。依维莫司可包括RAD001、Zortress、Certican、Afinitor、Votubia、42-O-(2-羟乙基)雷帕霉素、(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-羟基乙氧基)-3-甲氧基环己基]丙-2-基]-19,30-二甲氧基-15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮)；merilimus(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。Merilimus可包括SAR943、42-O-(四氢呋喃-3-基)雷帕霉素(Merilimus-1)；42-O-(氧杂环丁-3-基)雷帕霉素(Merilimus-2)、42-O-(四氢吡喃-3-基)雷帕霉素(Merilimus-3)、42-O-(4-甲基,四氢呋喃-3-基)雷帕霉素、42-O-(2,5,5-三甲基,四氢呋喃-3-基)雷帕霉素、42-O-(2,5-二乙基-2-甲基,四氢呋喃-3-基)雷帕霉素、42-O-(2H-吡喃-3-基,四氢-6-甲氧基-2-甲基)雷帕霉素、或42-O-(2H-吡喃-3-基,四氢-2,2-二甲基-6-苯基)雷帕霉素)；novolimus(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。Novolimus可包括16-O-去甲基雷帕霉素)；吡美莫司(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。吡美莫司可包括
Figure BDA0002746221120000641
(3S,4R,5S,8R,9E,12S,14S,15R,16S,18R,19R,26aS)-3-((E)-2-((1R,3R,4S)-4-氯-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基)-8-乙基5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,26,26a-十六氢-5,19-环氧-3H-吡啶并(2,1-c)(1,4)氧杂氮杂环二十三烯-1,17,20,21(4H,23H)-四酮33-表-氯-33-脱氧子囊霉素)；ridaforolimus(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。Ridaforolimus可包括AP23573、MK-8669、deforolimus、(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-12-((1R)-2-((1S,3R,4R)-4-((二甲基膦酰)氧基)-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙基)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基15,17,21,23,29,35-六甲基-11,36-二氧杂-4-氮杂三环(30.3.1.04,9)三十六烷-16,24,26,28-四烯-2,3,10,14,20-戊酮)；他克莫司(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。他克莫司可包括FK-506、藤霉素(fujimycin)、普乐可复
Figure BDA0002746221120000642
protopic、3S-[3R*[E(1S*,3S*,4S*)],4S*,5R*,8S*,9E,12R*,14R*,15S*,16R*,18S*,19S*,26aR*]-5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-十六氢-5,19-二羟基-3-[2-(4-羟基-3-甲氧基环己基)-1-甲基乙烯基]-14,16-二甲氧基-4,10,12,18-四甲基-8-(2-丙烯基)-15,19-环氧基-3H-吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂环二十三烯-1,7,20,21(4H,23H)-四酮,一水合物)；替西罗莫司(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。替西罗莫司可包括CCI-779、CCL-779、
Figure BDA0002746221120000651
(1R,2R,4S)-4-{(2R)-2-[(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,27-二羟基-10,21-二甲氧基-6,8,12,14,20,26-六甲基-1,5,11,28,29-五氧代-1,4,5,6,9,10,11,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,28,29,31,32,33,34,34a-二十四氢-3H-23,27-环氧基吡啶并[2,1-c][1,4]氧杂氮杂环三十一烯-3-基]丙基}-2-甲氧基环己基3-羟基-2-(羟基甲基)-2-甲基丙酸酯)；umirolimus(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。Umirolimus可包括Biolimus、Biolimus A9、BA9、TRM-986、42-O-(2-乙氧基乙基)雷帕霉素；佐他莫司(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。佐他莫司可包括ABT-578、(42S)-42-脱氧-42-(1H-四唑-1-基)-雷帕霉素)；C20-甲代烯丙基雷帕霉素(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。C20-甲代烯丙基雷帕霉素可包括C20-Marap)；C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素可包括C16-iRap)；AP21967(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。AP21967可包括C-16-(S)-7-甲基吲哚雷帕霉素)；霉酚酸钠(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。霉酚酸钠可包括
Figure BDA0002746221120000652
Myfortic、(4E)-6-(4-羟基-6-甲氧基-7-甲基-3-氧代-1,3-二氢-2-苯并呋喃-5-基)-4-甲基己-4-烯酸)；盐酸贝尼地平(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。盐酸贝尼地平可包括Coniel)；或者AP1903(包括类似物、衍生物，并包括其药学上可接受的盐。AP1903可包括rimiducid、[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[3-[2-[2-[[2-[3-[(1R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羰基]氧基丙基]苯氧基]乙酰基]氨基]乙基氨基]-2-氧代乙氧基]苯基]丙基](2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基]哌啶-2-羧酸酯)；或它们的任意组合。
在一些实施方式中，在这些方式中使用的配体是雷帕霉素或雷帕霉素类似物，包括例如依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP23573或AP1903、或它们任一种的代谢物、衍生物和/或组合。额外的有用的雷帕霉素类似物可包括例如相对于雷帕霉素具有一种或多种以下修饰的雷帕霉素的变体：C7、C42和/或C29处的甲氧基的去甲基化、消除或取代；在C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生或取代；在C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生化；5元脯氨酰环对6元哌啶甲酸酯环的替代；和/或在环己基环上的可选替代或用经替代的环戊基环对环己基环的取代。额外的有用的雷帕霉素类似物可包括novolimus、吡美莫司、ridaforolimus、他克莫司、替西罗莫司、umirolimus或佐他莫司，或它们的任一种的代谢产物、衍生物和/或组合。在一些实施方式中，配体是IMID类药物(例如沙利度胺、泊马度胺、来那度胺或相关类似物)。
在一些实施方式中，检测细胞(诸如哺乳动物细胞)内部中的信号可以通过检测作为信号传导途径的结果的标志物的方法来实现。因此，例如，可通过蛋白质印迹、流式细胞术的方法或其它蛋白质检测和定量方法确定细胞(诸如哺乳动物细胞)中的Akt或其它信号传导标志物的水平来检测信号。用于检测的标志物可包括例如JAK、Akt、STAT、NF-κ、MAPK、PI3K、JNK、ERK或Ras、或指示细胞信号传导事件的其它细胞信号传导标志物。
在一些实施方式中，信号的转导影响细胞因子的信号传导。在一些实施方式中，信号的转导影响IL2R的信号传导。在一些实施方式中，信号的转导影响细胞因子受体的下游靶标的磷酸化。在一些实施方式中，激活信号的方法在表达CISC的细胞(诸如哺乳动物细胞)中诱导增殖，并且在非CISC表达细胞中诱导伴随的抗增殖。
为了发生细胞信号传导，不仅细胞因子受体必须二聚化或异二聚化，而且它们必须处于适当的构型以发生构象变化(Kim,M.J.等，(2007).J.Biol.Chem.,282(19):14253-14261)。因此，二聚化与信号传导结构域的正确构象定位相结合是适当的信号传导的期望过程，因为单独的受体二聚化或异二聚化不足以驱动受体激活。本文所述的化学诱导的信号传导复合物通常处于下游信号传导事件发生的正确朝向。
选择性扩增细胞群的方法
在一些实施方式中，本文提供了选择性扩增细胞(诸如哺乳动物细胞)群的方法。在一些实施方式中，该方法包括提供如本文所述的细胞、诸如哺乳动物细胞，其中所述细胞包含如本文所示的蛋白质序列或如本文所示的表达载体。在一些实施方式中，该方法还包括表达编码如本文所述的裸露的FRB结构域多肽和/或二聚化CISC的蛋白质序列，或表达如本文所述的载体。在一些实施方式中，该方法包括使细胞(诸如哺乳动物细胞)与配体接触，这使得第一和第二CISC组分二聚化，这将信号转导至细胞内部。在一些实施方式中，配体是雷帕霉素或雷帕霉素类似物(诸如本文公开的任意的雷帕霉素或雷帕霉素类似物化合物)。在一些实施方式中，所提供的用于诱导二聚化的配体的有效量是0.01nM、0.02nM、0.03nM、0.04nM、0.05nM、0.06nM、0.07nM、0.08nM、0.09nM、0.1nM、0.2nM、0.3nM、0.4nM、0.5nM、0.6nM、0.7nM、0.8nM、0.9nM、1.0nM、1.5nM、2.0nM、2.5nM、3.0nM、3.5nM、4.0nM、4.5nM、5.0nM、5.5nM、6.0nM、6.5nM、7.0nM、7.5nM、8.0nM、8.5nM、9.0nM、9.5nM、10nM、11nM、12nM、13nM、14nM、15nM、20nM、25nM、30nM、35nM、40nM、45nM、50nM、55nM、60nM、65nM、70nM、75nM、80nM、85nM、90nM、95nM或100nM的量或在由上述值中的任意两个限定的范围内的浓度。
在一些实施方式中，所使用的配体是雷帕霉素或雷帕霉素类似物，包括例如依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、或AP23573、AP1903、或它们中任一种的代谢物、衍生物和/或组合。另外的有用的雷帕霉素类似物可包括例如相对于雷帕霉素具有一个或多个以下修饰的雷帕霉素的变体：C7、C42和/或C29处的甲氧基的去甲基化、消除或替代；C13、C43和/或C28处的羟基的消除、衍生或替代；C14、C24和/或C30处的酮的还原、消除或衍生；五元脯氨酰环对六元哌啶甲酸酯环的替代；和/或环己基环上的可选取代或取代的环戊基环对环己基环的替代。另外的有用的雷帕霉素类似物可包括novolimus、吡美莫司、ridaforolimus、他克莫司、替西罗莫司、umirolimus或佐他莫司，或它们中的任一种的代谢物、衍生物和/或组合。
在一些实施方式中，仅在发生两个不同的遗传修饰事件(诸如由CRISPR/Cas9系统介导的遗传修饰)时才发生细胞(诸如哺乳动物细胞)群的选择性扩增。一个遗传修饰事件是二聚化的化学诱导的信号传导复合物的一个组分，并且另一个遗传修饰事件是二聚化的化学诱导的信号传导复合物的另一个组分。当两个事件都在细胞群(诸如哺乳动物细胞群)中发生时，化学诱导的信号传导复合物组分在配体存在的情况下二聚化，引起活化的化学诱导的信号传导复合物并产生进入细胞内部的信号。
基因组编辑方法
在一些实施方式中，本文提供了编辑细胞基因组的方法，特别是编辑细胞基因组以允许表达：i)细胞的胞质内的裸露的FRB结构域多肽；以及任选的ii)二聚化可激活的化学诱导的信号传导复合物(CISC)的一种或多种多肽组分，其中，具有信号传导能力的CISC能够在信号传导途径中产生促进细胞存活和/或增殖的刺激性信号。
在一个方面，本文提供了编辑细胞基因组的方法，该方法包括向细胞提供：i)脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码该DNA核酸内切酶的核酸；ii)向导RNA(gRNA)或编码该gRNA的核酸，所述向导RNA包含与细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及iii)包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，其中，DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过DNA内切酶与gRNA的关联而形成的复合物能够促进供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。
在一个方面，本文提供了编辑细胞基因组的方法，该方法包括向细胞提供：a)指向感兴趣的基因组序列或基因的gRNA，b)根据本文所述任意实施方式的RGEN或编码RGEN的核酸，c)编码裸露的FRB结构域的核酸，以及d)一个或多个供体模板，所述供体模板包括编码如下的核酸：i)第一CISC组分，包括第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；以及ii)第二CISC组分，包括第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物，其中，第一CISC组分和第二CISC组分被配置(例如被定位)以使得当由T细胞表达时，它们在配体(例如雷帕霉素)存在下二聚化，以产生能够产生下游信号(例如存活信号或增殖信号)的具有信号传导能力的CISC。在一些实施方式中，CISC组分中的一个包括截短的IL2Rβ细胞内信号传导结构域。
在一些实施方式中，根据本文所述的任一种编辑细胞基因组的方法，一个或多个核酸编码：i)第一CISC组分，包括第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；以及ii)第二CISC组分，包括第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物，其中，编码第一CISC组分和第二CISC组分的一个或多个核酸在一个或多个载体中表达。细胞外结合结构域还可以包括内质网信号序列，以将蛋白质靶向至细胞外空间。在一些实施方式中，载体包括根据SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQID NO：30中的一个或多个的核酸序列。
在一些实施方式中，根据本文所述的任一种编辑细胞基因组的方法，RGEN选自于由如下所组成的组：Cas1、Cas1B、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csn1和Csx12)、Cas100、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1核酸内切酶或其功能衍生物。在一些实施方式中，RGEN是Cas9。在一些实施方式中，编码RGEN的核酸是核糖核酸(RNA)序列。在一些实施方式中，编码RGEN的RNA序列通过共价键连接至第一gRNA或第二gRNA。在一些实施方式中，在提供给细胞之前，将RGEN与第一gRNA和/或第二gRNA预复合，形成RNP复合物。在一些实施方式中，RGEN分别与第一gRNA和/或第二gRNA以1:1至20:1之间的gRNA与RGEN的摩尔比预复合。
靶向整合
在一些实施方式中，本文提供的方法允许在宿主基因组中的特定位置处整合编码裸露的FRB结构域多肽或其功能衍生物的序列，该过程称为“靶向整合”。在一些实施方式中，通过使用序列特异性核酸酶，使得靶向整合能够在基因组DNA中产生双链断裂，所述序列特异性核酸酶例如定点多肽、例如DNA核酸内切酶(例如，诸如Cas9的核酸引导的核酸酶)。
在一些实施方式中使用的CRISPR-Cas系统具有以下优势：可以快速筛选大量基因组靶标以鉴别最佳的CRISPR-Cas设计。CRISPR-Cas系统使用称为单向导RNA(sgRNA)的RNA分子，所述sgRNA将相关的Cas核酸酶(例如Cas9核酸酶)靶向至DNA中的特定序列。这种靶向作用通过sgRNA与sgRNA的约20bp靶向序列内的基因组序列之间的沃森-克里克碱基配对来发生。一旦在靶位点结合，Cas核酸酶切割基因组DNA的两条链来形成双链断裂。设计靶向特定DNA序列的sgRNA的唯一要求是：靶序列必须包含与基因组序列互补的sgRNA序列的3′端的前间隔区邻近基序(PAM)序列。对于Cas9核酸酶的情况，PAM序列为NRG(其中R为A或G，N为任何碱基)，或更受限制的PAM序列NGG。因此，可以通过定位与所有PAM基序相邻的20bp序列，计算机设计靶向基因组任何区域的sgRNA分子。PAM基序在真核生物的基因组中平均每15bp出现。但是，通过计算机方法设计的sgRNA将在细胞中以不同效率产生双链断裂，并且无法使用计算机方法预测一系列sgRNA分子的切割效率。由于sgRNA可以在体外快速合成，这使得能够快速筛选给定基因组区域中的所有潜在的sgRNA序列，以鉴别出产生最有效切割的sgRNA。通常，当在细胞中测试给定基因组区域内的一系列sgRNA时，观察到0％至90％的切割效率范围。计算机算法以及实验室实验也可以用于确定任何给定的sgRNA的脱靶潜能。尽管与sgRNA的20bp识别序列的完美匹配在大多数真核基因组中主要仅发生一次，但在基因组中将会有与sgRNA错配的一个或多个碱基的多个额外的位点。这些位点能够以不同频率切割，并且基于错配的数量或位置而常常是不可预测的。通过计算机分析未鉴别的额外的脱靶位点处的切割也可能发生。因此，在相关的细胞类型中筛选多个sgRNA以辨别具有最有利脱靶性质的sgRNA是选择用于治疗用途的最佳sgRNA的关键组分。有利的脱靶性质不仅考虑了实际脱靶位点的数量以及在这些位点处的切割频率，还考虑了这些位点在基因组中的位置。例如，与功能上重要的基因(特别是癌基因或抗癌基因)接近或位于其中的脱靶位点将被认为不如功能未知的基因间区域中的位点有利。因此，不能简单地通过生物体的基因组序列的计算机分析来预测最佳的sgRNA的鉴别，而是需要进行实验测试。尽管计算机分析有助于缩小待测向导的数量，但它无法预测具有高的中靶切割的向导、或预测具有低的期望的脱靶切割的向导。实验数据表明，各自具有对感兴趣的区域(例如纤维蛋白原-α内含子1)中的基因组的完美匹配的sgRNA的切割效率从无切割至>90％切割变化，并且无法通过任何已知算法预测。给定的sgRNA促进Cas酶的切割的能力可能与基因组DNA中的特定位点的可及性有关，所述可及性可通过该区域中的染色质结构来确定。尽管静止期分化细胞中的大多数基因组DNA存在于高度凝缩的异染色质中，但活跃转录的区域则以更开放的染色质状态存在，已知所述状态对如蛋白质(如Cas蛋白)的大分子可及性更高。即使在活跃转录的基因内，DNA的某些特定区域也由于存在或不存在结合的转录因子或其它调节蛋白而比其它区域更具可及性。无法预测基因组中的位点、或特定基因组基因座内或基因组基因座的区域内的位点，因此需要在相关细胞类型中通过实验确定。一旦选择了一些位点作为潜在的插入位点，就能够向此类位点添加一些变化(例如，通过从选定位点的上游或下游移动数个核苷酸)，进行或不进行实验测试。
在一些实施方式中，可以在本文公开的方法中使用的gRNA包括与细胞中的FOXP3基因座、AAVS1基因座或TCRa(TRAC)基因座内的序列互补的间隔区序列。在一些实施方式中，可用于本文公开的方法中的gRNA包括来自SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：57中的任一项的核苷酸序列的一个或多个间隔区序列，或与SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：57中的任一项的核苷酸序列具有至少或至少约85％的核苷酸序列同一性的它们的任何衍生物。
核酸修饰
在一些实施方式中，引入细胞中的多核苷酸具有可单独或组合使用的一种或多种修饰，例如用于增强活性、稳定性或特异性、改变递送、减少宿主细胞中的先天免疫应答、或用于如本文进一步描述的和本领域已知的其它增强。
在某些实施方式中，在CRISPR/Cas9/Cpf1系统中使用经修饰的多核苷酸，在这种情况下，可以对引入到细胞中的编码Cas或Cpf1核酸内切酶的DNA或RNA和/或向导RNA(单分子向导或双分子向导)进行修饰，如下文所述和所示。此类经修饰的多核苷酸可用于CRISPR/Cas9/Cpf1系统中以编辑任何一个或多个基因组基因座。
出于对这一使用的非限制性说明目的使用CRISPR/Cas9/Cpf1系统，向导RNA的修饰可以用于增强CRISPR/Cas9/Cpf1基因组编辑复合物的形成或稳定性，所述复合物具有向导RNA以及Cas或Cpf1核酸内切酶，所述向导RNA可以是单分子向导或双分子向导。向导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强基因组编辑复合物与基因组中的靶序列之间的相互作用的起始、稳定性或动力学，这可以例如用于增强中靶活性。向导RNA的修饰也可以或可替代地用于增强特异性，例如，与在其它(脱靶)位点的作用相比的在中靶位点的基因组编辑的相对速率。
修饰也可以或可替代地用于增加向导RNA的稳定性，例如通过增加其对细胞中存在的核糖核酸酶(RNase)的降解的抗性，从而引起其在细胞中的半衰期增加。增强向导RNA半衰期的修饰在实施方式中特别有用，在所述实施方式中将Cas或Cpf1核酸内切酶通过需要翻译以产生核酸内切酶的RNA引入待编辑细胞，因为增加与编码核酸内切酶的RNA同时引入的向导RNA的半衰期可用于增加向导RNA与编码的Cas或Cpf1核酸内切酶在细胞中共存的时间。
修饰也可以或可替代地用于降低引入细胞中的RNA引发先天免疫应答的可能性或程度。如在下文中或在本领域中描述的，已经在RNA干扰(RNAi)(包括小干扰RNA(siRNA))的上下文中充分表征的此类应答倾向于与降低的RNA的半衰期和/或细胞因子或与免疫应答有关的其它因子的引发相关联。
还可以对引入细胞中的编码核酸内切酶的RNA进行一种或多种类型的修饰，包括但不限于增强RNA稳定性的修饰(例如通过增加其由细胞中存在的RNA酶进行的降解)、增强所得产物(例如核酸内切酶)的翻译的修饰和/或降低引入细胞的RNA引发先天免疫应答的可能性或程度的修饰。
同样可以使用修饰(如前述修饰和其它修饰)的组合。例如，在CRISPR/Cas9/Cpf1的情况下，可以对向导RNA进行一种或多种类型的修饰(包括上文所例示的)，和/或可以对编码Cas核酸内切酶的RNA进行一种或多种类型的修饰(包括上文所例示的)。
作为说明，用于CRISPR/Cas9/Cpf1系统中的向导RNA或其它较小的RNA可以通过化学方法容易地合成，使许多修饰能够很容易地并入，如下文所说明和本领域所描述。随着化学合成程序的不断发展，由于多核苷酸长度显著增加超过约一百个核苷酸，通过诸如高效液相色谱法(HPLC，其避免使用诸如PAGE的凝胶)的程序对此类RNA进行纯化趋于更具挑战性。用于生产更大长度的化学修饰的RNA的一种方式是产生连结在一起的两个以上的分子。更长的RNA(例如编码Cas9核酸内切酶的RNA)更容易酶促产生。尽管通常可用于酶促产生的RNA中的修饰的类型较少，但仍存在可用于例如增强稳定性、降低先天免疫应答的可能性或程度和/或增强其它属性的修饰，如下文进一步所述以及本领域中所述；并且定期开发新的修饰类型。
作为各种类型的修饰(特别是经常与较小的化学合成的RNA一起使用的修饰)的说明，可以在糖的2′位置具有一个或多个经修饰的核苷酸，在一些实施方式中为2′-O-烷基、2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟修饰的核苷酸。在一些实施方式中，RNA修饰包括在RNA的3′端的倒位的碱基、无碱基残基或嘧啶的核糖上的2′-氟、2'-氨基或2'O-甲基修饰。此类修饰常规地并入寡核苷酸中，并且已显示出这些寡核苷酸比起针对给定靶标的2′-脱氧寡核苷酸具有更高的Tm(例如更高的靶结合亲和力)。
已显示出许多核苷酸和核苷修饰使并入了它们的寡核苷酸比天然寡核苷酸对核酸酶消化的抗性更强。这些经修饰的寡核苷酸比未修饰的寡核苷酸完整地存活更长的时间。经修饰的寡核苷酸的具体实例包括具有经修饰的骨架(例如硫代磷酸酯、磷酸三酯、甲基膦酸酯、短链烷基或环烷基糖间连接或者短链杂原子或杂环糖间连接)的寡核苷酸。一些寡核苷酸是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸、以及具有杂原子骨架的寡核苷酸，特别是CH2-NH-O-CH2、CH,～N(CH3)～O～CH2(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架)、CH2-O-N(CH3)-CH2、CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2以及O-N(CH3)-CH2-CH2骨架，其中天然的磷酸二酯骨架表示为O-P-O-CH；酰胺骨架(参见De Mesmaeker,A.等，(1995).Acc.Chem.Res.,28:366-374)；吗啉代骨架结构(参见Summerton和Weller，U.S.Pat.No.5,034,506)；肽核酸(PNA)骨架(其中，用聚酰胺骨架替代寡核苷酸的磷酸二酯骨架，核苷酸直接或间接结合至聚酰胺骨架的氮杂氮原子，参见Nielsen,P.E.等，(1991).Science,254(5037):1497-1500)。包含磷的连接包括但不限于具有正常3′-5′连接的boranophosphates、硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、具有3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯的甲基和其它烷基的膦酸酯、次膦酸酯、具有3′-氨基磷酰胺酯和氨基烷基磷酰胺酯的磷酰胺酯、硫羰磷酰胺酯(thionophosphoramidates)、硫羰烷基膦酸酯(thionoalkylphosphonates)和硫羰烷基磷酸三酯，它们的2′-5′连接类似物、以及具有反极性的那些(其中，相邻的核苷单元对以3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接)；参见美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；以及5,625,050。
基于吗啉代的寡聚化合物描述于如下中：Braasch,D.A.等，(2002).Biochemistry,41(14):4503-4510；Genesis，第30卷，第3期，(2001)；Heasman,J.(2002).Dev.Biol.,243(2):209-214；Nasevicius,A.等，(2000).Nat.Genet.,26(2):216-220；Lacerra,G.等，(2000).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,97(17):9591-9596；以及1991年7月23日授权的U.S.Pat.No.5,034,506。
环己烯基核酸寡核苷酸模拟物描述如下中：Wang,J.等，(2000).J.Am.Chem.Soc.,122(36):8595-8602。
在其中不包含磷原子的经修饰的寡核苷酸骨架具有由如下形成的骨架：短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或者一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接。这些骨架具有：具有吗啉代连接(部分地由核苷的糖部分形成)的骨架；硅氧烷骨架；硫化物骨架、亚砜骨架和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)骨架和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基骨架和亚甲基硫代甲酰乙酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基骨架和亚甲基肼基骨架；磺酸酯骨架和磺胺骨架；酰胺骨架；以及具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其它的骨架；参见美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；以及5,677,439，以引用的方式将其各自并入本文。
也可以包括一个或多个取代的糖部分，例如在2′位置的如下之一：OH、SH、SCH3、F、OCN、OCH3、OCH3O(CH2)nCH3、O(CH2)nNH2或O(CH2)nCH3，其中n为1至或至约10；C1至C10低级烷基、烷氧基烷氧基、取代的低级烷基、烷芳基或芳烷基；Cl；Br；CN；CF3；OCF3；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；SOCH3；SO2CH3；ONO2；NO2；N3；NH2；杂环烷基；杂环烷芳基；氨基烷基氨基；多烷基氨基；取代的甲硅烷基；RNA切割基团；报告子基团；嵌入剂；用于改善寡核苷酸的药代动力学性质的基团；或用于改善寡核苷酸的药效学性质的基团、以及具有类似性质的其它取代基。在一些实施方式中，修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O-CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基))(Martin,P.等，(1995).Helv.Chim.Acta,78(2):486-504)。其它修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)、2′-丙氧基(2′-OCH2CH2CH3)以及2′-氟(2'-F)。类似的修饰也可以在寡核苷酸上的其它位置进行，特别是在3′末端核苷酸上的糖的3'位置和5'末端核苷酸的5'位置。寡核苷酸也可以具有糖模拟物，例如取代戊呋喃糖基团的环丁基。
在一些实施方式中，核苷酸单元的糖和核苷间连接(诸如骨架)均用新的基团取代。碱基单元被保留用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种此类寡聚化合物(已显示具有良好的杂交性质的寡核苷酸模拟物)被称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被含酰胺的骨架(例如氨基乙基甘氨酸骨架)取代。核碱基保留并且直接或间接地结合至骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。教导制备PNA化合物的代表性的美国专利有但不限于：美国专利号5,539,082、5,714,331和5,719,262。PNA化合物的进一步教导可见于Nielsen,P.E.等，(1991).Science,254(5037):1497-1500。
在一些实施方式中，向导RNA还可以额外或替代地包含核碱基(本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。本文所使用的“未修饰的”或“天然的”核碱基包括腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括仅在天然核酸中偶尔或短暂地发现的核碱基，例如次黄嘌呤、6-甲基腺嘌呤、5-甲基嘧啶(特别是5-甲基胞嘧啶，也称为5-甲基-2′脱氧胞嘧啶，并且在本领域中通常称为5-Me-C；5-羟甲基胞嘧啶(HMC)、糖基HMC和龙胆二糖基HMC)，以及合成的核碱基(例如2-氨基腺嘌呤、2-(甲氨基)腺嘌呤、2-(咪唑基烷基)腺嘌呤、2-(氨基烷氨基)腺嘌呤、或其它杂原子取代的烷基腺嘌呤、2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、8-氮杂鸟嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤、N6(6-氨基己基)腺嘌呤、以及2,6-二氨基嘌呤。Kornberg,A.等，(1980).DNA Replication(第2版，pp.75-77).San Francisco,CA:W.H.Freeman&Co.；Gebeyehu,G.等，(1987).Nucl AcidsRes.,15(11):4513-4534。也可以包括本领域已知的“通用”碱基，例如肌苷。已表明5-Me-C置换提高了核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi,Y.S.(1993).Antisense Research andApplications,(pp.276-278).Crooke,S.T.和Lebleu,B.(编)，Boca Raton,FL:CRC Press)并且是碱基置换的实施方式。
在一些实施方式中，经修饰的核碱基包括其它的合成的和天然的核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)；5-羟甲基胞嘧啶；黄嘌呤；次黄嘌呤；2-氨基腺嘌呤；腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其它烷基衍生物；腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其它烷基衍生物；2-硫尿嘧啶、2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶；5-卤素尿嘧啶和5-卤素胞嘧啶；5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶；6-偶氮尿嘧啶、6-偶氮胞嘧啶和6-偶氮胸腺嘧啶；5-尿嘧啶(假尿嘧啶)；4-硫尿嘧啶；8-卤素、8-氨基、8-硫醇、8-硫代烷基、8-羟基和其它的8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤；5-卤素(特别是5-溴)、5-三氟甲基和其它的5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶；7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤；8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤；7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤以及3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。
进一步的，核碱基包括：在美国专利号3,687,808中公开的碱基；在Kroschwitz,J.(1990).Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering，(858-859页)NewYork,NY:Wiley中公开的碱基；通过Englisch,U.等，(1991).Angewandte ChemieInternational Edition,30(6):613-722公开的碱基；以及通过Sanghvi,Y.S.(1993).第15章，Antisense Research and Applications，(289-302页)，Crooke,S.T.和Lebleu,B.(编)，Boca Raton，FL:CRC Press公开的碱基。这些核碱基中的一些对于增高本公开内容的寡聚化合物的结合亲和力是特别有用的。这些核碱基包括：5-取代的嘧啶；6-氮杂嘧啶；以及N-2、N-6和O-6取代的嘌呤，具有2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已表明5-甲基胞嘧啶置换增高了核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi，Y.S.(1993)，Antisense Research and Applications,(276-278页)；Crooke，S.T.和Lebleu，B.编，BocaRaton，FL:CRC Press)，并且是碱基置换的实施方式，甚至更特别是当与2'-O-甲氧基乙基糖修饰组合时。经修饰的核碱基描述于美国专利号3,687,808，以及4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,596,091；5,614,617；5,681,941；5,750,692；5,763,588；5,830,653；6,005,096；以及美国专利申请公开2003/0158403。
在一些实施方式中，编码核酸内切酶的向导RNA和/或mRNA(或DNA)化学上连接至一个或多个部分或缀合物，所述部分或缀合物增强寡核苷酸的细胞摄取、活性或细胞分布。此类部分包括但不限于：脂质部分如胆固醇部分(Letsinger,R.L.等，(1989).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86(17):6553-6556)；胆酸(Manoharan,M.等，(1994).Bioorg.Med.Chem.Let.,4(8):1053-1060)；硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharan,M.等，(1992).Ann.N.Y.Acad.Sci.,660(1):306-309；以及Manoharan,M.等，(1993).Bioorg.Med.Chem.Let.,3(12):2765-2770)；硫代胆固醇(Oberhauser,B.等，(1992).Nucl.Acids Res.,20(3):533-538)；脂肪链，例如十二烷二醇或十一烷基残基(Kabanov,A.V.等，(1990).FEBS Lett.,259(2):327-330以及Svinarchuk,F.P.等，(1993).Biochimie,75(1-2):49-54)；磷脂，例如二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯(Manoharan等，(1995).Tetrahedron Lett.,36(21):3651-3654以及Shea,R.G.等，(1990).Nucl.Acids Res.,18(13):3777-3783)；聚胺或聚乙二醇链(Manohoran,M.等，(1995).Nucleos.Nucleot.Nucl.,14(3-5):969-973)；金刚烷乙酸(Manoharan,M.等，(1995).Tetrahedron Lett.,36(21):3651-3654)；棕榈酰部分(Mishra,R.K.等，(1995).Biochim.Biophys.Acta,1264(2):229-237)；或十八烷基胺或己基氨基-羰基-t氧基胆固醇部分(Crooke,S.T.等，(1996).J.Pharmacol.Exp.Ther.,277(2):923-937)。另请参见美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928；和5,688,941。
在一些实施方式中，糖和其它部分可用于将蛋白质和具有核苷酸的复合物(例如阳离子多核糖体和脂质体)靶向至特定位点。例如，肝细胞定向转移可以通过去唾液酸糖蛋白受体(ASGPRs)介导。参见例如，Hu,J.等，(2014).Protein Pept.Lett.,21(10):1025-1030。可以使用本领域已知的和常规开发的其它系统将本情况下使用的生物分子和/或其复合物靶向至特定的感兴趣的靶细胞。
在一些实施方式中，这些靶向部分或缀合物可包括共价键合至官能团(例如伯羟基或仲羟基)的缀合物基团。本公开内容的缀合物基团包括嵌入剂、报告分子、多胺、聚酰胺、聚乙二醇、聚醚、增强寡聚物的药效学性质的基团和增强寡聚物的药代动力学性质的基团。示例性的缀合物基团包括胆固醇、脂质、磷脂、生物素、吩嗪、叶酸盐、菲啶、蒽醌、吖啶、荧光素、罗丹明、香豆素和染料。在本公开的上下文中，增强药效学性质的基团包括改善摄取、增强对降解的抗性和/或强化与靶核酸的序列特异性杂交的基团。在本公开的上下文中，增强药代动力学性质的基团包括改善本公开内容的化合物的摄取、分布、代谢或排泄的基团。代表性的缀合物基团公开于1992年10月23日提交的国际专利申请号PCT/US92/09196和美国专利号6,287,860，以引用的方式将其并入本文。缀合物部分包括但不限于脂质部分(如胆固醇部分)、胆酸、硫醚(例如己基-5-三苯甲基硫醇)、硫代胆固醇、脂肪链(例如十二烷二醇或十一烷基残基)、磷脂(例如，二-十六烷基-消旋-甘油或三乙基铵1,2-二-O-十六烷基-消旋-甘油-3-H-膦酸酯)、多胺或聚乙二醇链或金刚烷乙酸、棕榈基部分或十八烷基胺或己氨基-羰基-氧基胆固醇部分。参见例如，美国专利号4,828,979；4,948,882；5,218,105；5,525,465；5,541,313；5,545,730；5,552,538；5,578,717；5,580,731；5,580,731；5,591,584；5,109,124；5,118,802；5,138,045；5,414,077；5,486,603；5,512,439；5,578,718；5,608,046；4,587,044；4,605,735；4,667,025；4,762,779；4,789,737；4,824,941；4,835,263；4,876,335；4,904,582；4,958,013；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,082,830；5,112,963；5,214,136；5,245,022；5,254,469；5,258,506；5,262,536；5,272,250；5,292,873；5,317,098；5,371,241；5,391,723；5,416,203；5,451,463；5,510,475；5,512,667；5,514,785；5,565,552；5,567,810；5,574,142；5,585,481；5,587,371；5,595,726；5,597,696；5,599,923；5,599,928以及5,688,941。
较不顺从化学合成并且通常通过酶促合成产生的较长的多核苷酸也可以通过各种手段进行修饰。此类修饰可以包括例如某些核苷酸类似物的引入、在分子的5′端或3′端并入特定序列或其它部分、以及其它修饰。作为说明，编码Cas9的mRNA的长度约为4kb，并可以通过体外转录合成。对mRNA的修饰可应用于例如增加其翻译或稳定性(例如通过增加其对细胞降解的抗性)、或降低RNA引发先天免疫应答的趋势，所述免疫应答经常在引入外源RNA(特别是较长的RNA，例如编码Cas9的RNA)后在细胞中观察到。
在本领域中已经描述了许多此类修饰，例如polyA尾、5′帽类似物(例如，抗反向帽类似物(Anti Reverse Cap Analog，ARCA)或m7G(5′)ppp(5′)G(mCAP))、经修饰的5′或3′非翻译区(UTR)、经修饰的碱基(例如假-UTP、2-硫代-UTP、5-甲基胞苷-5′-三磷酸酯(5-甲基-CTP)或N6-甲基-ATP)的使用、或用磷酸酶处理以去除5′末端磷酸酯。这些和其它修饰是本领域已知的，并且RNA的新修饰定期被开发。
经修饰的RNA的商业供应商很多，包括例如TriLink Biotech、AxoLabs、Bio-Synthesis Inc.、Dharmacon和许多其它供应商。例如，如TriLink所述，可以使用5-甲基CTP赋予期望的特性，例如增加的核酸酶稳定性、增加的翻译或减少的先天免疫受体与体外转录的RNA的相互作用。5-甲基胞苷-5′-三磷酸酯(5-甲基-CTP)、N6-甲基-ATP以及假-UTP和2-硫代-UTP也已显示出在培养物中和体内减少先天性免疫刺激而同时增加翻译，如通过在下文引用的Kormann等(2011)和Warren等(2010)的出版物中所说明的。
已显示出体内递送的经化学修饰的mRNA可用于实现改善的治疗效果；参见例如，Kormann,M.S.D.等，(2011).Nat.Biotechnol.,29:154-157。此类修饰可用于例如增加RNA分子的稳定性和/或降低其免疫原性。使用化学修饰(如假-U、N6-甲基-A、2-硫代-U和5-甲基-C)，发现分别用2-硫代-U和5-甲基-C置换尿苷和胞苷残基的仅四分之一引起小鼠中的toll样受体(TLR)介导的对mRNA的识别的显著降低。通过降低先天免疫系统的激活，这些修饰可用于有效提高体内mRNA的稳定性和持久性，参见例如，Kormann等(2011)。
还已经显示出，重复给予合成的信使RNA可以将分化的人类细胞重新编程为多能性，所述信使RNA并入被设计为绕过先天抗病毒应答的修饰。参见例如Warren,L.等，(2010).Cell Stem Cell,7(5):618-630。充当初级重编程蛋白的此类经修饰的mRNA可为重编程多种人类细胞类型的有效手段。此类细胞被称为诱导的多能干细胞(iPSC)，并且发现并入5-甲基-CTP、假-UTP和抗反向帽类似物(ARCA)的酶促合成RNA可用于有效规避细胞的抗病毒应答；参见例如，Warren等(2010)。
本领域中描述的多核苷酸的其它修饰包括例如，polyA尾的使用、5′帽类似物(例如m7G(5′)ppp(5')G(mCAP))的添加、5′或3′非翻译区(UTR)的修饰、或用磷酸酶处理以移除5′末端磷酸酯-且新的方式定期被开发。
已经结合RNA干扰(RNAi)(包括小干扰RNA(siRNA))的修饰开发了可适用于产生用于本文的经修饰的RNA的许多组合物和技术。siRNA在体内存在特定的挑战，因为它们通过mRNA干扰对基因沉默的影响通常是短暂的，可能需要重复给予。此外，siRNA是双链RNA(dsRNA)，并且哺乳动物细胞具有已进化为检测和中和dsRNA的免疫应答，所述dsRNA通常是病毒感染的副产物。因此，存在哺乳动物酶如PKR(dsRNA应答性激酶)和潜在的视黄酸诱导基因I(RIG-1)，它们可以介导对dsRNA的细胞应答以及可以响应此类分子而触发细胞因子的诱导的Toll样受体(例如TLR3、TLR7和TLR8)；参见例如由如下进行的综述：Angart,P.等，(2013).Pharmaceuticals,6(4):440-468；Kanasty,R.L.等，(2012).Mol.Ther.,20(3):513-524；Burnett,J.C.等，(2011).Biotechnol.J.,6(9):1130-1146；Judge,A.D.(2008).Hum.Gene Ther.,19(2):111-124；以及其中引用的参考文献。
已开发出大量不同的修饰并将其应用于增强RNA稳定性、减少先天免疫应答和/或实现可用于与将多核苷酸引入人细胞结合的其它益处，如本文所述；参见例如，由如下进行的综述：Whitehead,K.A.等，(2011).Ann.Rev.Chem.Biomolec.Eng.,2:77-96；Gaglione,M.等，(2010).Mini Rev.Med.Chem.,10(7):578-595；Chernolovskaya,E.L.等，(2010).Curr.Opin.Mol Ther.,12(2):158-167；Deleavey,G.G.等，(2009).Curr.Protoc.NucleicAcid Chem.,39(1):16.3.1-16.3.22；Behlke,M.A.(2008).Oligonucleotides,18(4):305-319；Fucini,R.V.等，(2012).Nucleic Acid Ther.,22(3):205-210；Bremsen,J.B.等，(2012).Front.Genet.,3:154。
如上所述，存在许多经修饰的RNA的商业供应商，其中许多专门从事设计成提高siRNA的效力的修饰。基于文献中报道的各种发现，提供了多种方式。例如，Dharmacon指出，用硫(硫代磷酸酯，PS)替代非桥连氧已广泛用于改善siRNA的核酸酶抗性，如Kole,R.(2012).Nat.Rev.Drug Disc.,11(2):125-140所报道的。核糖的2′-位置的修饰已经报道改善核苷酸间磷酸键的核酸酶抗性，同时增加双链体稳定性(Tm)，这也显示出提供对免疫激活的保护。适度的PS骨架修饰与小的、良好耐受的2′取代基(2′-O-甲基、2′-氟、2′-氢)的组合与在体内应用的高度稳定的siRNA相关，如Soutschek,J.等，(2004).Nature,432:173-178所报道的；并且如Volkov,A.A.等，(2009).Oligonucleotides,19:191-202所报道的，已经报道2′-O-甲基修饰有效地改善稳定性。关于减少先天免疫应答的诱导，已经报道用2′-O-甲基、2′-氟、2′-氢修饰特定序列减少TLR7/TLR8相互作用，同时通常保留沉默活性；参见例如，Judge,A.D.等，(2006).Mol.Ther.,13:494-505；以及Cekaite,L.等，(2007).J.Mol.Biol.,365(1):90-108。还已经显示出额外的修饰(例如2-硫尿嘧啶、假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-甲基尿嘧啶和N6-甲基腺苷)最小化由TLR3、TLR7和TLR8介导的免疫作用；参见例如，Kariko,K.等，(2005).Immunity,23(2):165-175。
如本领域中已知并可商购的，许多缀合物可应用于本文中使用的多核苷酸(例如RNA)，可增强它们的递送和/或被细胞摄入，所述缀合物包括例如胆固醇、生育酚和叶酸、脂质、肽、聚合物、接头和适体；参见例如Winkler,J.(2013).Ther.Deliv.,4(7):791-809的综述，以及其中引用的参考文献。
递送
在一些实施方式中，将在本文提供的方法中使用的任何核酸分子(例如编码本公开内容的靶向基因组的核酸和/或定点多肽的核酸)包装至递送媒介(vehicle)内或媒介表面上以递送到细胞。本文考虑之列的递送媒介包括但不限于纳米球、脂质体、量子点、纳米颗粒、聚乙二醇颗粒、水凝胶和胶束。如本领域中所述，多种靶向部分可用于增强此类载体与期望的细胞类型或位置的优先相互作用。
可以通过病毒或噬菌体感染、转染、缀合、原生质体融合、脂转染、电穿孔、核转染、磷酸钙沉淀、聚乙烯亚胺(PEI)介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体介导的转染、粒子枪技术、磷酸钙沉淀、直接微量注射、纳米粒子介导的核酸递送等，将本公开内容的复合物、多肽和核酸引入细胞中。
在实施方式中，向导RNA多核苷酸(RNA或DNA)和/或核酸内切酶多核苷酸(RNA或DNA)可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介进行递送。或者，可以通过本领域已知的病毒或非病毒递送媒介(例如电穿孔或脂质纳米颗粒)递送核酸内切酶多肽。在一些实施方式中，DNA核酸内切酶可以作为一种或多种多肽单独进行递送，或者与一种或多种向导RNA、或同tracrRNA一起的一种或多种crRNA预复合进行递送。
在实施方式中，多核苷酸可通过非病毒递送媒介进行递送，所述非病毒递送媒介包括但不限于纳米颗粒、脂质体、核糖核蛋白、带正电荷的肽、小分子RNA-缀合物、适体-RNA嵌合体、以及RNA融合蛋白复合物。一些示例性非病毒递送媒介描述于Peer,D.等，(2011).Gene Ther.,18:1127-1133(聚焦于也可用于递送其它多核苷酸的siRNA的非病毒递送媒介)。
在实施方式中，可以通过脂质纳米颗粒(LNP)将多核苷酸(如向导RNA、sgRNA和编码核酸内切酶的mRNA)递送至细胞或受试者。
尽管已经在动物模型和人二者中测试了若干种用于核酸的非病毒递送方法，但是最充分开发的系统是脂质纳米颗粒。脂质纳米颗粒(LNP)通常由可电离的阳离子脂质和3种以上的额外的组分组成，所述额外的组分通常为胆固醇、DOPE和含脂质的聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质可以结合至带正电的核酸，形成致密的复合物，该复合物保护核酸不被降解。在通过微流体系统期间，组分自组装以形成尺寸范围为50nM至150nM的颗粒，其中核酸被封装在与阳离子脂质复合并被脂质双层样结构包围的核中。内吞后，LNP以内涵体存在。经封装的核酸经历由阳离子脂质的可电离性质介导的内涵体逃逸过程。这将核酸递送至细胞质中，在细胞质中mRNA可以翻译成编码的蛋白质。因此，在一些实施方式中，将编码Cas9的mRNA和gRNA封装到LNP中用于在IV注射后将两个组分有效地递送至细胞。内涵体逃逸后，将Cas9 mRNA翻译成Cas9蛋白，并可以与gRNA形成复合物。在一些实施方式中，将核定位信号包括到Cas9蛋白序列中促进Cas9蛋白/gRNA复合物向核的移位。或者，小gRNA穿过核孔复合物并与核中的Cas9蛋白形成复合物。一旦在核中，gRNA/Cas9复合物扫描基因组的同源靶位点，并优先在基因组中的期望的靶位点产生双链断裂。RNA分子在体内的半衰期通常很短，约数小时至数天。类似地，蛋白质的半衰期倾向于很短，大约数小时至数天。因此，在一些实施方式中，使用LNP递送gRNA和Cas9 mRNA可以仅引起gRNA/Cas9复合物的瞬时表达和活性。在一些实施方式中，这可以提供减少脱靶切割的频率的优势，并因此使遗传毒性的风险最小化。LNP通常比病毒颗粒具有更小的免疫原性。尽管许多人已预先存在对AAV的免疫力，但没有对LNP的预先存在的免疫力。此外，不太可能发生针对LNP的免疫应答，这使得能够重复给予LNP。
已经开发出若干种不同的可电离的阳离子脂质用于LNP中。其中，这些阳离子脂质包括C12-200(Love,K.T.等，(2010).Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,107(5):1864-1869)、MC3、LN16、MD1等。在一种类型的LNP中，GalNac部分连接到LNP的外部，并充当用于通过唾液酸糖蛋白受体进行摄取的配体。这些阳离子脂质中的任一种均用于配制LNP，以将gRNA和Cas9 mRNA递送至细胞。
在一些实施方式中，LNP是指直径小于1000nm、500nm、250nm、200nm、150nm、100nm、75nm、50nm或25nm的任何颗粒。或者，纳米颗粒的尺寸范围可以是1-1000nm、1-500nm、1-250nm、25-200nm、25-100nm、35-75nm或25-60nm。
LNP可以由阳离子脂质、阴离子脂质或中性脂质制成。中性脂质(如膜融合磷脂DOPE或膜成分胆固醇)可以作为“辅助脂质”包含在LNP中，以增强转染活性和纳米颗粒稳定性。阳离子脂质的局限性包括归因于差的稳定性和快速清除的低效率、以及炎症或抗炎应答的产生。LNP也可以具有疏水性脂质、亲水性脂质、或疏水性脂质和亲水性脂质二者。
本领域已知的任何脂质或脂质组合可用于产生LNP。用于产生LNP的脂质的实例包括：DOTMA、DOSPA、DOTAP、DMRIE、DC-胆固醇、DOTAP-胆固醇、GAP-DMORIE-DPyPE和GL67A-DOPE-DMPE-聚乙二醇(PEG)。阳离子脂质的实例为：98N12-5、C12-200、DLin-KC2-DMA(KC2)、DLin-MC3-DMA(MC3)、XTC、MD1和7C1。中性脂质的实例为：DPSC、DPPC、POPC、DOPE和SM。经PEG修饰的脂质的实例为：PEG-DMG、PEG-CerC14和PEG-CerC20。
在实施方式中，脂质可以以任何数量的摩尔比进行结合以产生LNP。此外，多核苷酸可以以宽范围的摩尔比与脂质结合以产生LNP。
在实施方式中，可各自分开地向细胞或受试者给予定点多肽和靶向基因组的核酸。另一方面，定点多肽可以与一个或多个向导RNA、或同tracrRNA一起的一个或多个crRNA进行预复合。然后可以向细胞或受试者给予预复合的材料。此类预复合材料被称为核糖核蛋白颗粒(RNP)。
RNA可以与RNA或DNA形成特异性相互作用。尽管在许多生物学过程中利用了这种特性，但它也伴随着在富含核酸的细胞环境中发生混杂相互作用的风险。解决该问题的一种方案是形成核糖核蛋白颗粒(RNP)，其中RNA与核酸内切酶预复合。RNP的另一优势是保护RNA免受降解。
在一些实施方式中，RNP中的核酸内切酶可以是经修饰的或未经修饰的。同样，gRNA、crRNA、tracrRNA或sgRNA可以是经修饰的或未经修饰的。许多修饰是本领域已知的并且可以被使用。
核酸内切酶和sgRNA通常可以以1:1的摩尔比组合。或者，核酸内切酶、crRNA和tracrRNA通常可以以1:1:1的摩尔比组合。然而，可以使用宽范围的摩尔比来生产RNP。
基因编辑组分可以通过若干种机制递送到细胞核。这些机制通常可以分类为病毒递送和非病毒递送。对于许多应用，可以使用病毒递送和非病毒递送的组合。
在一些实施方式中，重组腺相关病毒(AAV)载体可用于递送。适用于制造rAAV颗粒的策略、技术和系统是本领域已知的，其中，将待包装的AAV基因组和辅助病毒功能提供至细胞，所述AAV基因组包括待递送的多核苷酸、rep和cap基因。生产rAAV通常需要在单个细胞(在本文中称为包装细胞)中存在以下成分：rAAV基因组、从rAAV基因组分离(例如不在其中)的AAV rep和cap基因以及辅助病毒功能。产生rAAV的常见方式包括瞬时转染、昆虫杆状病毒双重感染和昆虫杆状病毒单一感染。在这方面的进一步的信息可以见于例如：Ayuso,E.等，(2010).Curr.Gene Ther.,10(6):423-436；Mietzsch,M.等，(2014).Hum.GeneTher.,25(3):212-222；Mietzsch,M.等，(2015).Hum.Gene Ther.,26(10):688-697；以及Mietzsch,M.等，(2017).Hum.Gene Ther.Method,28(1):15-22。
通常，AAV rep和cap基因可以来自可以衍生重组病毒的任何AAV血清型，并且可以来自与rAAV基因组ITR不同的AAV血清型，包括但不限于AAV血清型AAV-1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、AAV-10、AAV-11、AAV-12、AAV-13和AAV rh.74。此外，病毒的不同的天然产生的和/或合成的血清型可以用于靶向特定的组织类型。假型(pseudotyped)rAAV的生产公开在例如国际专利申请公开号WO 01/83692中。表1A列出了一些选定的AAV的AAV血清型和Genbank登录号。
表1A
Figure BDA0002746221120000861
在一些实施方式中，产生包装细胞的方法包括创建稳定表达用于生产AAV颗粒的所有必需组分的细胞系。例如，将质粒(或多个质粒)整合入细胞的基因组中，所述质粒具有缺少AAV rep和cap基因的rAAV基因组、与rAAV基因组分开的AAV rep和cap基因、以及选择标志物(如新霉素抗性基因)。已经通过如下的程序将AAV基因组引入细菌质粒中：GC加尾(Samulski,R.J.等，(1982).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,79(6):2077-2081)、添加包含限制性核酸内切酶切割位点的合成接头(Laughlin,C.A.等，(1983).Gene,23(1):65-73)或通过直接的平末端连接(Senapathy,P.(1984).J.Biol.Chem.,259:4661-4666)。然后用辅助病毒(如腺病毒)感染包装细胞系。该方法的优势在于细胞可选择并且适合于rAAV的大规模生产。合适方法的其它实例采用腺病毒或杆状病毒而不是质粒，以将rAAV基因组和/或rep和cap基因引入包装细胞中。
rAAV产生的一般原理综述于例如Carter,B.J.(1992).Curr.Opin.Biotechnol.,3(5):533-539；以及Muzyczka,M.(1992).Curr.Topics Microbial.Immunol.,158:97-129。各种方式描述于Tratschin,J.D.等，(1984).Mol.Cell.Biol.,4(10):2072-2081；Hermonat,P.L.等，(1984).Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,81(2):6466-6470；Tratschin,J.D.等，(1985).Mo1.Cell.Biol.,5(11):3251-3260；McLaughlin,S.K.等，(1988).J.Virol.,62(6):1963-1973；以及Lebkowski,J.S.等，(1988).Mol.Cell.Biol.,8(10):3988-3996；Samulski,R.J.等，(1989).J.Virol.,63(9):3822-3828)；美国专利号5,173,414；WO 95/13365以及对应的美国专利号5,658,776；WO 95/13392；WO 96/17947；PCT/US98/18600；WO 97/09441(PCT/US96/14423)；WO 97/08298(PCT/US96/13872)；WO 97/21825(PCT/US96/20777)；WO 97/06243(PCT/FR96/01064)；WO 99/11764；Perrin,P.等，(1995)Vaccine,13(13):1244-1250；Paul,R.W.等，(1993).Hum.Gene Ther.,4(5):609-615；Clark,K.R.等，(1996)Gene Ther.,3(12):1124-1132；美国专利号5,786,211；美国专利号5,871,982；以及美国专利号6,258,595。
AAV载体血清型可以与靶细胞类型匹配。例如，其中，以下示例性细胞类型可以通过所指出的AAV血清型等进行转导。例如，适合于肝组织/细胞类型的AAV载体的血清型包括但不限于AAV3、AAV5、AAV8和AAV9。在一些情况下，选择AAV血清型以在待治疗的群体或个体中具有低免疫原性。
除腺相关病毒载体外，还可以使用其它病毒载体。此类病毒载体包括但不限于慢病毒、α病毒、肠道病毒、瘟病病毒、杆状病毒、疱疹病毒、Epstein Barr病毒、乳多空病毒、痘病毒、牛痘病毒和单纯疱疹病毒。
在一些实施方式中，将Cas9 mRNA、靶向纤维蛋白原-α基因中的一个或两个基因座的sgRNA和供体DNA各自单独配制为脂质纳米颗粒，或全部共同配制为一个脂质纳米颗粒，或共同配制为两个以上的脂质纳米颗粒。
在一些实施方式中，将Cas9 mRNA配制在脂质纳米颗粒中，而将sgRNA和供体DNA以AAV载体递送。在一些实施方式中，将Cas9 mRNA和sgRNA共同配制在脂质纳米颗粒中，而以AAV载体递送供体DNA。
作为DNA质粒、mRNA或蛋白质来递送Cas9核酸酶的选项是可用的。向导RNA可以从相同的DNA表达，或者可以作为RNA递送。可以对RNA进行化学修饰，以改变或改善其半衰期和/或降低免疫应答的可能性或程度。核酸内切酶蛋白可以在递送前与gRNA复合。病毒载体使得能够有效递送；Cas9的分拆版本和Cas9的较小的直系同源物可以包装在AAV中，HDR的供体也可以包装在AAV中。还存在可以递送这些组分中的每一个的一系列非病毒递送方法，或者可以串联使用非病毒和病毒方法。例如，可以使用纳米颗粒来递送蛋白质和向导RNA，而可使用AAV递送供体DNA。
在与递送用于治疗的基因组编辑组分有关的一些实施方式中，向待转化的细胞(例如淋巴细胞)的核中递送至少两个组分，序列特异性核酸酶(诸如位点-定向的多肽，例如DNA核酸内切酶，例如核酸引导的核酸酶)和DNA供体模板。在一些实施方式中，将供体DNA模板包装到对淋巴细胞具有嗜性的腺相关病毒(AAV)中。在一些实施方式中，AAV选自血清型AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV5、AAV6或AAV-DJ。在一些实施方式中，首先通过外周IV注射向受试者(例如患者)给予经AAV包装的DNA供体模板，然后给予序列特异性核酸酶(例如，DNA核酸内切酶)。首先递送经AAV包装的供体DNA模板的优势在于，经递送的供体DNA模板将稳定地保持在转导细胞的核中，这允许随后给予序列特异性核酸酶(例如，DNA核酸内切酶)，其将在基因组中产生双链断裂，随后通过HDR或NHEJ整合DNA供体。在一些实施方式中，期望序列特异性核酸酶(例如DNA核酸内切酶)仅促进转基因以对期望的治疗效果而言足够的水平进行靶向整合所需要的时间内在靶细胞中保持活性。如果序列特异性核酸酶(例如DNA核酸内切酶)在延长的时间中在细胞中保持活性，这将引起在脱靶位点处的增加的双链断裂频率。通常，脱靶切割的频率是脱靶切割效率乘以核酸酶激活的时间的函数。因为mRNA和翻译的蛋白质在细胞中的寿命很短，以mRNA形式递送序列特异性核酸酶(例如DNA核酸内切酶)引起数小时至数天范围内的短的核酸酶活性持续时间。因此，预期将序列特异性核酸酶(例如DNA核酸内切酶)递送至已经包含供体模板的细胞中引起相对于脱靶整合的靶向整合的最高可能比率。此外，由于病毒必须感染细胞、使内涵体逃逸、转运至细胞核并经历通过宿主组分将单链AAV基因组转化为双链DNA分子，因此外周i.v.注射后的AAV介导的供体DNA模板向细胞核的递送需要时间，通常为一至十四天。因此，在至少一些实施方式中，因为这些核酸酶组分通常具有约一天至三天的活性，在提供CRISPR-Cas组分之前完成供体DNA模板向核的递送。
在一些实施方式中，序列特异性核酸酶(例如DNA核酸内切酶)是CRISPR-Cas9，所述CRISPR-Cas9由Cas9核酸酶与指向纤维蛋白原-α基因的内含子1内的DNA序列的sgRNA一起组成。在一些实施方式中，Cas9核酸酶作为编码可操作地融合至一个或多个核定位信号(NLS)的Cas9蛋白的mRNA进行递送。在一些实施方式中，通过包装到脂质纳米颗粒中，来将sgRNA和Cas9 mRNA递送至细胞。在一些实施方式中，脂质纳米颗粒包含脂质C12-200(Love,K.T.等，(2010).Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,107(5):1864-1869)。在一些实施方式中，包装在LNP中的Cas9mRNA与sgRNA的比例为1:1(质量比)，以引起小鼠体内的DNA的最大切割。在替代实施方式中，可以使用包装在LNP中的sgRNA与Cas9mRNA的不同质量比，例如10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、4:1、3:1或2:1或颠倒的比例。在一些实施方式中，将Cas9 mRNA和sgRNA包装到分开的LNP制剂中，并且在LNP包含sgRNA之前约1至约8小时，将包含Cas9 mRNA的LNP递送至受试者，以允许在递送sgRNA之前翻译Cas9 mRNA的最佳时间。
在一些实施方式中，向受试者(例如患者)给予封装gRNA和Cas9mRNA的LNP制剂(“LNP-核酸酶制剂”)，所述受试者先前被给予包装入AAV中的DNA供体模板。在一些实施方式中，在给予AAV供体DNA模板后的1天至28天内或7天至28天内或7天至14天内，向受试者给予LNP核酸酶制剂。可以使用本领域已知的技术(例如在包括小鼠和猴的动物模型中进行的研究)确定LNP核酸酶制剂相对于AAV供体DNA模板的有效递送时机。
在一些实施方式中，使用非病毒递送方法将DNA供体模板递送至受试者(例如患者)的细胞。尽管一些受试者(通常为30％)具有针对最常用的AAV血清型的预先存在的中和抗体，其阻止了通过AAV进行的有效的基因递送，更多的受试者可以用非病毒递送方法进行治疗。在本领域中已知数种非病毒递送方法学。特别地，已知在动物和人中的静脉内注射后，脂质纳米颗粒(LNP)有效地将它们封装的货物递送到细胞的胞质中。这些LNP通过受体介导的内吞作用被细胞积极吸收。
在一些实施方式中，为了促进供体模板的核定位，可以向供体模板添加可以促进质粒的核定位的DNA序列，例如猿猴病毒40(SV40)复制起点和早期启动子的366bp区域。结合至细胞蛋白的其它DNA序列也可用于改善DNA的核进入。
在一些实施方式中，在AAV供体DNA模板之后，首先给予LNP核酸酶制剂(例如包含gRNA和Cas9核酸酶或编码Cas9核酸酶的mRNA)之后，在受试者(例如患者)的血液中测量引入的POI(例如FVIII)编码序列的表达或活性的水平。如果POI水平不足以治愈疾病，例如定义为正常水平的至少5％至50％、特别是5％至20％的POI水平，则可以提供LNP核酸酶制剂的第二次或第三次给予，以促进向纤维蛋白原-α内含子1位点中的额外的靶向整合。可以使用本领域已知的技术(例如使用动物模型、包括小鼠模型和猴模型的测试)来测试和优化使用多剂量的LNP核酸酶制剂以获得POI的期望的治疗水平的可行性。
在一些实施方式中，根据本文所述的任何方法，所述方法包括向受试者给予：i)包含供体盒的AAV供体DNA模板，以及ii)LNP核酸酶制剂，在向受试者给予AAV供体DNA模板后的一天至二十八天内，向受试者给予初始剂量的LNP核酸酶制剂。在一些实施方式中，在允许供体DNA模板递送至靶细胞的核的足够的时间之后，向受试者给予初始剂量的LNP核酸酶制剂。在一些实施方式中，在允许靶细胞核中的单链AAV基因组转化为双链DNA分子的足够的时间后，向受试者给予初始剂量的LNP核酸酶制剂。在一些实施方式中，在给予初始剂量之后，向受试者给予一个或多个(例如2个、3个、4个、5个或更多个)额外剂量的LNP核酸酶制剂。在一些实施方式中，向受试者给予一个或多个剂量的LNP核酸酶制剂，直到达到供体盒的靶向整合的目标水平和/或供体盒的表达的目标水平。在一些实施方式中，方法进一步包括在每次给予LNP核酸酶制剂后测量供体盒的靶向整合的水平和/或供体盒的表达水平，并且如果未达到供体盒的靶向整合的目标水平和/或供体盒的表达的目标水平，则给予额外剂量的LNP核酸酶制剂。在一些实施方式中，LNP核酸酶制剂的一个或多个额外的剂量中的至少一个的量与初始剂量相同。在一些实施方式中，LNP核酸酶制剂的一个或多个额外的剂量中的至少一个的量小于初始剂量。在一些实施方式中，LNP核酸酶制剂的一个或多个额外的剂量中的至少一个的量大于初始剂量。
治疗方式
在一个方面，本文提供了用于通过使用根据本文所述的任何方法编辑的细胞的过继性细胞疗法来治疗受试者的基因治疗方式。例如，在一些实施方式中，所述紊乱或健康状况为自身免疫性疾病(例如IPEX综合征)或由器官移植引起的紊乱(例如GVHD)，并且经编辑的细胞具有Treg表型。在一些实施方式中，基因治疗方式将包含编码裸露的FRB结构域多肽和CISC的序列的核酸整合至受试者中的相关细胞类型的基因组中，从而提供稳定的治疗(例如在长的一段时间中缓解紊乱或健康状况的一种或多种症状的治疗)和/或提供紊乱或健康状况的永久性的治愈或缓解。在一些实施方式中，经受基因治疗方式的细胞类型(其中整合编码裸露的FRB结构域多肽和CISC的序列)是淋巴细胞，例如CD4+T细胞。
在一些实施方式中，基于离体细胞的治疗使用分离自受试者的淋巴细胞(例如源自脐带血的自体CD4+T细胞)进行。然后，使用本文所述的系统、组合物和方法编辑这些细胞的染色体DNA。最后，将经编辑的细胞植入受试者中。
离体细胞治疗方式的一个优势是能够在给予之前对治疗进行全面分析的能力。所有基于核酸酶的治疗都具有一定水平的脱靶作用。离体进行基因修正使人能够在植入前完全表征经修正的细胞群。本公开内容的方面包括对经修正的细胞的整个基因组进行测序，以确保脱靶切割(如果有的话)位于与对受试者而言的最小风险相关的基因组位置。此外，可以在植入之前分离特定细胞的群体，包括克隆群体。
此类方法的另一实施方式是基于体内的疗法。在该方法中，使用本文所述的系统、组合物和方法修正受试者中的细胞的染色体DNA。在一些实施方式中，该细胞是淋巴细胞，例如CD4+细胞，诸如T细胞。
体内基因治疗的优势是易于产生和给予治疗。可以使用相同的治疗方式和疗法来治疗多于一个的受试者，例如，共有相同或相似基因型或等位基因的多个受试者。相比之下，离体细胞治疗通常使用受试者自身的细胞，所述细胞被分离、处理并返回至同一受试者。
更多的实施方式关注经遗传修饰的细胞，其中通过本文所述的方法之一编辑细胞的基因组，以用于抑制或治疗与FOXP3相关的疾病或病症，例如炎性疾病或自身免疫性疾病。额外的实施方式关注经遗传修饰的细胞的用途，其中通过本文的任一种方法编辑细胞的基因组作为药物。
将细胞植入受试者
在一些实施方式中，本公开内容的离体方法涉及将经基因组编辑的细胞植入需要此类方法的受试者中。该植入步骤可以使用本领域已知的任何植入方法来完成。例如，可以将经遗传修饰的细胞直接注射到受试者的血液中或以其它方式向受试者给予。
在一些实施方式中，本文公开的方法包括通过方法或途径向受试者中给予经遗传修饰的治疗性细胞，所述给予可与“引入”和“移植”互换使用，所述方法或途径引起经引入的细胞至少部分定位在期望的位点，从而产生期望的效果。可以通过任何合适的途径给予治疗性细胞或其分化的子代，所述途径引起递送至受试者中的期望的位置，其中至少一部分植入的细胞或细胞组分保持存活。给予受试者后的细胞的存活周期可以短至数小时(例如二十四小时)、至数天、至长达数年、或者甚至是受试者的寿命，例如作为长期移植。
当预防性提供时，可以在待治疗的疾病或病症的任何症状之前向受试者给予本文所述的治疗性细胞。因此，在一些实施方式中，经遗传修饰的干细胞群的预防性给予用于预防疾病或病症的症状的发生。
当在一些实施方式中治疗性地提供时，在疾病或病症的症状或指征发作时(或之后)提供经遗传修饰的干细胞，例如，在疾病或病症发作时。
为了用于本文所述的各种实施方式，有效量的治疗细胞(例如经基因组编辑的干细胞)可以是至少102个细胞、至少5×102个细胞、至少103个细胞、至少5×103个细胞、至少104个细胞、至少5×104个细胞、至少105个细胞、至少2×105个细胞、至少3×105个细胞、至少4×105个细胞、至少5×105个细胞、至少6×105个细胞、至少7×105个细胞、至少8×105个细胞、至少9×105个细胞、至少1×106个细胞、至少2×106个细胞、至少3×106个细胞、至少4×106个细胞、至少5×106个细胞、至少6×106个细胞、至少7×106个细胞、至少8×106个细胞、至少9×106个细胞、或它们的倍数。治疗性细胞可以源自一个或多个供体，或者可以从自体来源获得。在本文所述的一些实施方式中，在向有需要的受试者给予之前，将治疗性细胞在培养物中扩增。
在实施方式中，通过方法或途径将治疗性细胞组合物(例如，包含根据本文所述的任何细胞的多个细胞的组合物)递送至受试者中引起细胞组合物的至少部分定位在期望的位点。可以通过在受试者中引起有效治疗的任何适当途径来给予细胞组合物，例如，给予引起递送至受试者中的期望的位点，其中至少一部分递送的组合物(例如至少1×104个细胞)递送至期望的位点一段时间。给予方式包括注射、输注、滴注或摄食。“注射”包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、心室内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下腔、脊柱内、脑脊内和胸骨内注射和输注。在一些实施方式中，途径为静脉内。为了递送细胞，可以通过注射或输注进行给予。
在一个实施方式中，系统性地给予细胞，换言之，将治疗性细胞群以直接给予至靶位点、组织或器官之外的方式进行给予，而使得其进入受试者的循环系统，并因此经受代谢和其它类似过程。
具有用于治疗疾病或病症的组合物的治疗的效力可以由熟练的临床医师确定。但是，如果疾病的任何一种或所有征象或症状或标志物得到改善或缓解，则认为该治疗为有效治疗。效力还可通过如由住院治疗或需要医学干预评价的个体不再恶化(例如，疾病的进展停止或至少减缓)而测量。测量这些指标的方法对于本领域技术人员来说是已知的和/或在本文得以描述。治疗包括个体或动物(一些非限制性实例包括人或哺乳动物)中的疾病的任何治疗，并包括：(1)抑制疾病，例如阻滞或减缓症状的进展；或(2)缓和疾病，例如引起症状消退；以及(3)预防或减少症状进展的可能性。
组合物
在一个方面，本公开内容提供了用于实施本文公开的方法的组合物。组合物可包含以下的一种或多种：靶向基因组的核酸(例如gRNA)；定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列；以及待插入的多核苷酸(例如供体模板)，用于实现本文所公开方法的期望的遗传修饰。
在一些实施方式中，组合物具有编码靶向基因组的核酸(例如gRNA)的核苷酸序列。
在一些实施方式中，组合物具有定点多肽(例如DNA核酸内切酶)。在一些实施方式中，组合物具有编码定点多肽的核苷酸序列。
在一些实施方式中，组合物具有待插入基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在一些实施方式中，组合物具有：(i)编码靶向基因组的核酸(例如gRNA)的核苷酸序列，以及(ii)定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列。
在一些实施方式中，组合物具有：(i)编码靶向基因组的核酸(例如gRNA)的核苷酸序列，以及(ii)待插入基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在一些实施方式中，组合物具有：(i)定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列，以及(ii)待插入基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在一些实施方式中，组合物具有：(i)编码靶向基因组的核酸(例如gRNA)的核苷酸序列，(ii)定点多肽(例如DNA核酸内切酶)或编码定点多肽的核苷酸序列，以及(iii)待插入基因组中的多核苷酸(例如供体模板)。
在上述组合物的任一种的一些实施方式中，组合物具有单分子的向导靶向基因组的核酸。在上述组合物的任一种的一些实施方式中，组合物具有双分子的靶向基因组的核酸。在上述组合物的任一种的一些实施方式中，该组合物具有两个以上的双分子向导或单分子向导。在一些实施方式中，组合物具有编码靶向基因组的核酸的载体。在一些实施方式中，靶向基因组的核酸是DNA核酸内切酶，特别是Cas9。
在一些实施方式中，组合物可包含可用于基因组编辑的一个或多个gRNA，所述基因组编辑特别是将编码裸露的FRB结构域多肽和CISC的序列插入细胞的基因组中。该一个或多个gRNA可以靶向位于内源FOXP3基因处、在内源FOXP3基因之内或邻近内源FOXP3基因的基因组位点。因此，在一些实施方式中，该一个或多个gRNA可具有互补至基因组序列的间隔区序列，所述基因组序列位于FOXP3基因处、在FOXP3基因之内或邻近FOXP3基因。
在一些实施方式中，用于组合物的gRNA包括选自SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：57中的任一个的间隔区序列，以及与SEQ ID NO：40-SEQ ID NO：57中的任一个具有至少或至少约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％的同一性或同源性的它们的变体。在一些实施方式中，用于试剂盒的gRNA的变体包括与SEQ IDNO：40-SEQ ID NO：57中的任何一个具有至少或至少约85％同源性的间隔区序列。
在一些实施方式中，用于组合物的gRNA具有与基因组中的靶位点互补的间隔区序列。在一些实施方式中，间隔区序列的长度为15个碱基至20个碱基。在一些实施方式中，间隔区序列与基因组序列之间的互补性为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或至少约100％。
在一些实施方式中，组合物可以具有DNA核酸内切酶或编码DNA核酸内切酶的核酸和/或供体模板，所述供体模板具有编码裸露的FRB结构域多肽和CISC的核酸序列。在一些实施方式中，编码裸露的FRB结构域多肽和CISC的核酸序列与根据SEQ ID NO：3-SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28-SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：37-SEQ IDNO：39的序列具有至少或至少约70％的序列同一性，例如至少或至少约75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方式中，编码裸露的FRB结构域多肽和CISC的核酸序列与根据SEQ ID NO：32的序列具有至少或至少约70％的序列同一性，例如至少或至少约75％、80％、85％、90％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。在一些实施方式中，DNA核酸内切酶是Cas9。在一些实施方式中，编码DNA核酸内切酶的核酸是DNA或RNA。
在一些实施方式中，用于试剂盒的一种或多种任意核酸可以在腺相关病毒(AAV)载体中编码。因此，在一些实施方式中，gRNA可以在AAV载体中编码。在一些实施方式中，编码DNA核酸内切酶的核酸可以在AAV载体中编码。在一些实施方式中，供体模板可以在AAV载体中编码。在一些实施方式中，可以在单个AAV载体中编码两种以上的核酸。因此，在一些实施方式中，可以在单个AAV载体中编码gRNA序列和编码DNA核酸内切酶的核酸。
在一些实施方式中，组合物可具有脂质体或脂质纳米颗粒。因此，在一些实施方式中，可以将组合物的任何化合物(例如DNA核酸内切酶或编码它的核酸、gRNA和供体模板)配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，一种或多种此类化合物通过共价键或非共价键与脂质体或脂质纳米颗粒相关联。在一些实施方式中，任何化合物可以单独或一起包含在脂质体或脂质纳米颗粒中。因此，在一些实施方式中，将DNA核酸内切酶或编码它的核酸、gRNA和供体模板各自分别配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，将DNA核酸内切酶与gRNA配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。在一些实施方式中，将DNA核酸内切酶或编码它的核酸、gRNA和供体模板一起配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。
在一些实施方式中，上述组合物进一步具有一种或多种额外的试剂，其中此类额外的试剂选自缓冲液、用于将多肽或多核苷酸引入细胞中的缓冲液、洗涤缓冲液、对照试剂、对照载体、对照RNA多核苷酸、用于从DNA体外生产多肽的试剂、用于测序的衔接子等。缓冲剂可以是稳定化缓冲液、重构缓冲液、稀释缓冲液等。在一些实施方式中，组合物还可包含一种或多种组分，所述组分可用于促进或增强核酸内切酶的DNA切割或中靶结合，或改善靶向的特异性。
在一些实施方式中，取决于具体的给予方式和剂型，用药学上可接受的赋形剂如运载体、溶剂、稳定剂、辅料、稀释剂等配制组合物的任何组分。在实施方式中，通常将向导RNA组合物配制成实现生理相容的pH，并且取决于制剂和给予途径，范围从pH为或约为3至pH为或约为11，从pH为或约为3至pH为或约为7。在一些实施方式中，将pH调节至范围从或从约pH 5.0至或至约pH 8。在一些实施方式中，组合物具有治疗有效量的至少一种本文所述的化合物、以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。任选地，组合物可以具有本文所述化合物的组合，或可以包含可用于治疗或预防细菌生长的第二活性成分(例如但不限于抗菌剂或抗微生物剂)，或可以包含本公开内容的试剂的组合。在一些实施方式中，gRNA与其它的一种或多种核酸一起进行配制，所述核酸例如编码DNA核酸内切酶的核酸和/或供体模板。或者，用上述用于gRNA配制的方法将编码DNA核酸酶内切的核酸和供体模板分开地或与其它核酸组合配制。
合适的赋形剂可包括例如运载体分子，所述运载体分子包括大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、聚合氨基酸、氨基酸共聚物和无活性的病毒颗粒。其它示例性赋形剂包括抗氧化剂(例如但不限于抗坏血酸)、螯合剂(例如但不限于EDTA)、碳水化合物(例如但不限于糊精、羟烷基纤维素和羟烷基甲基纤维素)、硬脂酸、液体(例如但不限于油、水、盐水、甘油和乙醇)、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。
在一些实施方式中，可将组合物的任何化合物(例如DNA核酸内切酶或编码它的核酸、gRNA和供体模板)通过转染(如化学转染(例如脂质转染)或电穿孔)递送至细胞中。在一些实施方式中，在提供至细胞之前，可以将DNA核酸内切酶与gRNA预复合，形成核糖核蛋白(RNP)复合物。在一些实施方式中，通过转染将RNP复合物递送到细胞中。在此类实施方式中，通过转染将供体模板递送到细胞中。
在一些实施方式中，组合物是指具有用于离体治疗方法中的治疗性细胞的治疗性组合物。
在实施方式中，治疗性组合物包含生理上可耐受的载体以及作为活性成分溶解或分散在其中的细胞组合物，以及任选的如本文所述的至少一种额外的生物活性试剂。在一些实施方式中，除非期望如此，否则当向哺乳动物或人类受试者给予以用于治疗目的时，治疗组合物本质上没有免疫原性。
通常，本文所述的经遗传修饰的治疗性细胞作为与药学上可接受的载体的混悬剂进行给予。本领域技术人员将认识到，待在细胞组合物中使用的药学上可接受的运载体将不包含实质上干扰待递送至受试者的细胞的存活的量的缓冲液、化合物、冷冻保存剂、防腐剂或其它试剂。具有细胞的制剂可以包含例如渗透缓冲液(所述缓冲液允许维持细胞膜的完整性)、以及任选的维持细胞存活或在给予时增强移植的营养物。此类制剂和混悬剂是本领域技术人员已知的，和/或如本文所述可以使用常规实验使其适于与祖细胞一起使用。
在一些实施方式中，只要乳化程序不会不利地影响细胞存活，细胞组合物也可以是乳化的或作为脂质体组合物存在。可以将细胞和任何其它活性成分与一种或多种药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合，并且其量适合用于本文所述的治疗方法。
细胞组合物中包含的额外的试剂可包括其中的组分的药学上可接受的盐。药学上可接受的盐包括与无机酸或有机酸形成的酸加成盐(与多肽的游离氨基基团形成)，所述无机酸例如盐酸或磷酸，所述有机酸例如乙酸、酒石酸、扁桃酸等。与游离羧基基团形成的盐也可以衍生自无机碱和有机碱，所述无机碱例如钠、钾、铵、钙或铁的氢氧化物，所述有机碱例如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
生理上可耐受的载体是本领域公知的。示例性液体载体是无菌水性溶液，所述无菌水性溶液不包含除活性成分和水以外的物质；或者包含缓冲液，如生理pH值下的磷酸钠、生理盐水或二者，诸如磷酸盐缓冲盐水。更进一步，水性载体可以包含多于一种的缓冲盐，以及诸如氯化钠和氯化钾的盐、右旋糖、聚乙二醇和其它溶质。液体组合物还可包含除水以外并排除水的液相。此类额外的液相的实例是甘油、植物油(如棉籽油)和水油乳剂。在细胞组合物中使用的在治疗特定紊乱或病症中有效的活性化合物的量将取决于紊乱或病症的性质，并且可以通过已知的临床技术确定。
试剂盒和系统
本文还提供了试剂盒和系统，其包括本文提供和描述的细胞、表达载体和蛋白质序列，以及制备和使用它们的书面说明。因此，例如，本文提供了试剂盒，其包含以下的一种或多种：本文所述的蛋白质序列；本文所述的表达载体；和/或本文所述的细胞。还提供了用于选择性地将信号激活到雷帕霉素抗性细胞的内部中的系统，所述系统包含：如本文所述的细胞，其中所述细胞包含如本文所述的表达载体，所述表达载体包含编码如本文所述的蛋白质序列的核酸。
一些实施方式提供了试剂盒，其包含用于本文所述的基因组编辑的CRISPR/Cas系统的一个或多个组分。
在一些实施方式中，试剂盒可具有一种或多种额外的治疗剂，所述治疗剂可与其它试剂盒组分同时或依次给予，用于期望的目的(例如基因组编辑或细胞疗法)。
在一些实施方式中，试剂盒可进一步包含关于使用该试剂盒的组分以实践方法的说明书。用于实践该方法的说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以被印刷在诸如纸或塑料等的基材上。说明书可以作为包装插页存在于试剂盒中、存在于试剂盒或其组分的容器的标签中(例如与包装或分包装(subpackaging)相关联)等。说明书可以作为存在于合适的计算机可读存储介质(例如CD-ROM、软盘、闪存驱动器等)上的电子存储数据文件而存在。在一些情况下，试剂盒中不存在实际的说明书，但是可以提供从远程来源(例如通过互联网)获取说明书的手段。该实施方式的实例是包含网址的试剂盒，可以在所述网址中查看说明书和/或可以从所述网址下载说明书。与说明书一样，用于获得说明书的手段可以记录在合适的基材上。
关于本文中的复数和/或单数术语的使用，为了适于上下文和/或应用，本领域技术人员可将复数转化为单数和/或将单数转化为复数。为清楚起见，可以在本文中明确地阐述各种单数/复数置换。
本领域技术人员将理解，通常，本文中、尤其是在所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中使用的术语通常旨在作为“开放式”术语(例如，术语“包括/包含”应当被解释为“包括但不限于”，术语“具有”应当被解释为“至少具有”，术语“包括/包含”应当被解释为“包括但不限于”等)。
第一至第十一方面的实施方式的任何特征均可适用于本文中说明的所有方面和实施方式。此外，第一至第十一方面的实施方式的任何特征可以以任何方式与本文描述的其它实施方式独立地部分或全部地组合，例如，可将一个、两个或三个以上的实施方式全部或部分组合。另外，可使第一至第十一方面的实施方式的任何特征对于其它方面或替代方案是可选的。尽管上文就各种示例性实施方式和实行进行了描述，但应该理解，在单个实施方式的一个或多个中描述的各种特征、方面和功能性不限于它们对用以描述它们的特定实施方式的适用性，而是相反地，可以单独或以各种组合应用于本申请的一个或多个另外的实施方式，无论是否描述了此类实施方式，以及这些特征是否被呈现为所描述的实施方式的一部分。因此，本申请的广度和范围不应受任何上述示例性实施方式的限制。
应当理解，本文所述的实施例和实施方式仅出于说明性目的，并且将向本领域技术人员教导依据其进行的各种修改或改变，并且将包括在本申请的精神和权限以及所附权利要求的范围之内。本文引用的所有出版物、专利和专利申请为了所有目的以引用的方式将其整体并入本文。
通过以下非限制性实例对本文提供的公开内容的一些实施方式进行进一步说明。
实施例
除非另外指出，否则本发明的实施将采用本领域技术人员所公知的分子生物学、微生物学、细胞生物学、生物化学、核酸化学和免疫学的常规技术。此类技术在如下文献中完全解释，例如Sambrook,J.,&Russell,D.W.(2012).Molecular Cloning:A LaboratoryManual(第四版)，Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory以及Sambrook,J.,&Russel,D.W.(2001).Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第三版)，Cold Spring Harbor,NY:Cold Spring Harbor Laboratory(以下统称为“Sambrook”)；Ausubel,F.M.(1987).Current Protocols in Molecular Biology New York,NY:Wiley(包括2014年的补充)；Mullis,K.B.,Ferré,F.&Gibbs,R.(1994).PCR:The PolymeraseChain Reaction,Boston:Birkhauser Publisher；Harlow,E.,&Lane,D.(1999).Antibodies:A Laboratory Manual(第二版)New York,NY:Cold Spring HarborLaboratory Press；Beaucage,S.L.等，(2000).Current Protocols in Nucleic AcidChemistry,New York,NY:Wiley(包括2014年的补充)；以及Makrides,S.C.(2003).GeneTransfer and Expression in Mammalian Cells Amsterdam,NL:Elsevier SciencesB.V.。
实施例1：DISC构建体的生成和表征
本实施例描述了编码CISC的慢病毒构建体的创建和测试，以在宿主细胞的细胞质中细胞内表达裸露的“诱饵”FRB结构域。
用位于CISC嵌合受体蛋白的3′的额外的裸露的FRB*结构域修饰包含调节IL-2信号的CISC的慢病毒构建体(图1)。将与CISC一起表达额外的裸露的FRB*结构域的构建体称为“诱饵-CISC”或“DISC”。不受理论的束缚，据信裸露的FRB结构域将与mTOR的内源FRB结构域竞争结合雷帕霉素，从而引起通过CISC的雷帕霉素介导的细胞内信号传导，但没有与雷帕霉素对宿主细胞的作用相关的伴随的细胞毒性，从而克服抑制增殖的问题。
如图2所示，含有FKBP结构域的蛋白质在细胞的细胞质中天然表达，并且mTOR包含FRB结构域。在不存在雷帕霉素的情况下，CISC亚基不会二聚化，并且细胞内mTOR信号传导正常(左子图)。在雷帕霉素存在的情况下，CISC亚基二聚化并提供细胞内信号，但是mTOR信号被抑制，从而限制细胞的生长(中子图)。在裸露的FRB结构域共表达的DISC细胞中，细胞内信号仍由雷帕霉素诱导的二聚化提供，但是因为细胞内雷帕霉素被细胞内表达的裸露的FRB和内源性FKBP多肽结合，许多mTOR蛋白仍然可以信号传导。
然后测试新的DISC构建体，以确定与不表达裸露的细胞内FRB结构域的CISC构建体相比，在维持宿主细胞生长和存活方面其如何执行。简而言之，将分离的CD4+T细胞激活61个小时，在分离后产生1.9×107个总的细胞。然后在24孔培养皿中用4μg/mL硫酸鱼精蛋白在无珠的情况下进行慢病毒转导(100万个细胞/500μL/孔，10μL构建体#1272(仅CISC的构建体)/10μL DN-1272(含DISC的构建体)(2孔/LV)。在32℃下以800g进行30min的离心接种(spinoculation)。孵育5小时后添加培养基(1.5mL)。将经转导的T细胞在37℃下与细胞因子(IL-2 50ng/mL、IL-7 5ng/mL和IL-15 5ng/mL)孵育48小时，然后验证转导效率。然后，将100万个细胞/孔接种到装有2mL培养基的24孔培养皿中。然后，将T细胞用雷帕霉素(0.1nM、1nM和10nM)、雷帕霉素类似物AP21967(100nM)或IL-2(50ng/mL)处理，每两天更换培养基。该实验中还包括仅具有培养基的“无处理”组。然后评价T细胞的存活和mCherry阳性信号。
如图3所示，在雷帕霉素存在的情况下，表达DISC的T细胞在所有剂量下都比表达CISC的T细胞扩增得更好。这个结果表明，DISC构建体可以修复雷帕霉素或雷帕霉素相关化合物对宿主细胞的生长和存活的负面影响，这是DISC构建体的构思的证明。因为雷帕霉素类似物不会结合内源性mTor，在雷帕霉素类似物AP21967存在的情况下，CISC和DISC构建体两者同等好地扩增。
实施例2：DISC的经修饰的CISC组分
这个实施例描述了DISC构建体的CISC组分的经修饰的受体蛋白的创建。基于计算机的蛋白质建模预测了DISC构建体的CISC组分的两个受体蛋白之间的间隔(spacing)可能不是最佳。就其而言，制备了若干种额外的构建体，以测试改变嵌合受体蛋白的某些部分(例如，细胞外结构域和跨膜结构域之间的交界面)的长度是否会增加生长信号。
使用各种氨基酸添加来创建版本4到版本7(V4-V7)，以查看这是否用雷帕霉素改善T细胞的扩增。创建了额外的四对FRB-IL2Rβ/FKBP-IL2Rγ受体蛋白(V4-V7)，所述受体蛋白包含一个或多个PAAL间隔区氨基酸序列和/或GGS或GGSP接头氨基酸序列。额外的间隔区和接头氨基酸序列位于细胞外FRB/FKBP结构域和IL2Rβ/IL2Rγ结构域之间的交界面处或位于IL2Rβ结构域内(图4)。V3标准DISC具有FRB、FKBP、IL2Rβ、IL2Rγ；V4在IL2Rβ的N末端具有FRB、FKBP、IL2Rβ、IL2Rγ和PAAL间隔区；V5具有FRB、FKBP、IL2Rβ、IL2Rγ、GGS接头和PAAL间隔区，其中IL2Rβ在N末端具有接头和PAAL间隔区；V6具有FRB、FKBP、IL2Rβ、IL2Rγ、PAAL间隔区和GGSP接头，其中PAAL间隔区在IL2Rβ的N末端，而GGSP接头在IL2Rγ的N末端。V7具有FRB、FKBP、IL2Rβ、IL2Rγ，其中IL2Rβ具有GGS接头和PAAL间隔区，而IL2Rγ包含GGSP接头。
一旦构建，就测试新的DISC构建体(V4-V7)，以确定与实施例1中描述的最初创建的DISC构建体相比，在雷帕霉素存在的情况下它们是否改善细胞增殖和存活。用于在原代人T细胞中测试这些新的DISC构造的程序的时间轴如下。在CD4分离和CD3/CD28珠刺激之前将PBMC3解冻约二十四小时。约六十一小时后，移除珠。慢病毒离心接种在800×g下以500μL的体积进行，然后添加1.5mL补充有细胞因子的培养基。将经转导的细胞分入4个处理群组：(1)1nM雷帕霉素，(2)50ng/mL IL-2，(3)100nM AP21967，以及(4)无处理；并通过用于共表达的mCherry的流式细胞术以及在两天、四天、十一天、十五天和二十天后对总细胞数计数来监测经转导的细胞的生长。
将流式细胞术研究的结果显示在下表1中，其中在用雷帕霉素处理48小时后确定T细胞扩增。示出了具有mCherry共表达的细胞的百分比，并且指出了每个群组中的构建体的相似的转导效率。如下表1B所示，与原始的DISC构建体(V3)相比，经修饰的DISC构建体各自表现出相似的转导效率。
表1B
DISC构建体 mCherry共表达％
V3(原始) 9.92
V4 11.8
V5 10.6
V6 12.9
V7 11.0
空白对照 0.67
类似地，如图5所例示的，在用1nM雷帕霉素处理后直至二十天，以所有版本的DISC在所有时间点都观察到相同数量的细胞。最后，如图6中详细描述的，用雷帕霉素或雷帕霉素类似物处理的培养物中的慢病毒转导的T细胞随时间的富集百分比测量表明，与IL-2或未经处理的(NT)对照相比，所有LV处理组中的mCherry+的细胞百分比相似。因此，该实施例显示出，在转导效率、细胞生长和扩增以及经转导的细胞的富集方面，经修饰的DISC构建体的所有测试版本均表现出相似的性能。
实施例3：μDISC构建体的生成和表征
在基因编辑中可能出现的一个问题是，可被包装到递送载体(例如病毒)中的材料的量受到限制。该实施例描述了CISC结合对的一半的IL2Rβ细胞质组分的修饰，所述CISC结合对被工程化至T细胞中以控制具有雷帕霉素处理的增殖。该修饰是对IL2Rβ结构域的截短，该截短保留了其在结合至雷帕霉素后响应于异二聚化而激活下游IL2信号传导事件的能力。
进行修饰以减少必须包装到病毒中的遗传物质的量，所述病毒用于将CISC和/或DISC组分递送至宿主细胞。该修饰基于先前的报道(Lord,J.D.等，(2000).J.Immunol.,164(5):2533-2541，以引用的方式并入本文)，所述报道鉴别了IL2Rβ内的必需的信号传导结构域。然后将该信息用于从IL2Rβ结构域中删除非必需氨基酸。被创建以并入该截短的IL2Rβ结构域以及实施例1中描述的细胞内表达的裸露的FRB结构域的构建体被称为“微-DISC(micro-DISC)”或“μDISC”(图7)。
然后测试原始的CISC构建体、来自实施例1的DISC构建体和μDISC构建体，以确定各自转导入细胞中并用雷帕霉素处理后各自诱导T细胞扩增的能力。在原代人T细胞中用于测试新的μDISC构建体的程序的时间轴如下。在分离CD4和CD3/CD28珠刺激之前，将PBMC解冻约两个小时。约二十四小时后，移除珠。使用以下构建体以约100万个细胞进行慢病毒转导：V3 CISC、V3 DICS和V3μDISC。然后将经转导的细胞扩增约一天，并分入三个处理群组：(1)1nM雷帕霉素，(2)5nM雷帕霉素，(3)10nM雷帕霉素。每种处理使用约40万个细胞。通过用于共表达的mCherry的流式细胞术以及对总细胞数计数来检测经转导细胞的生长。
下表2中示出了病毒转导效率，其中在10nM雷帕霉素存在的情况下，在用DISC和μDISC构建体二者转导的T细胞中观察到相似的病毒转导效率。示出了具有mCherry共表达的细胞的百分比，并且指出了每个群组中的构建体的相似的转导效率。
表2
CISC/DISC构建体 mCherry共表达％
CISC 55.7
DISC 46.3
μDISC 36.9
空白对照 1.32
图8示出了在所使用的雷帕霉素的所有浓度下，尽管比全长DISC构建体略少，用μDISC构建体转导的T细胞均类似地扩增。这些结果表明，μDISC构建体为T细胞的生长和扩增提供了足够的IL2R信号。
如图9所示，在9天培养后，用DISC和CISC慢病毒构建体处理的细胞中，mCherry+细胞的百分比相似。用μDISC构建体转导的T细胞产生略微较少的mCherry+(～80％相比于90％)，但仍然高度富集。图10示出了在具有不同剂量的雷帕霉素的培养物中21天后，经LV转导的(mCherry+)细胞的成倍数量扩增(fold numerical expansion)。就其而言，该实施例证明在用μDISC构建体转导的细胞中可以实现可比水平的雷帕霉素介导的T细胞扩增。μDISC具有如下的追加益处：具有用于将进一步的遗传元件或标志物包装到病毒中的额外的空间，该病毒用于基因转移实验或治疗。
实施例4：在FOXP3基因座处具有DISC构建体的靶向整合的细胞的生成和表征
该实施例说明了使用基因编辑技术以在CD4+T细胞中的内源FOXP3(Forkhead boxP3)基因座的上游敲入编码DISC和启动子的构建体。图11示意性地示出了该实验中使用的实验方案。简而言之，将含有向导RNA(gRNA)的CRISPR/CAS9核糖核蛋白与用于FOXP3基因编辑的腺相关病毒6(AAV6)供体模板结合使用，所述向导RNA对FOXP3的外显子1的5′的基因座而言是特异性的。gRNA包含具有SEQ ID NO：58的序列的间隔区。引入异位MND启动子以在内源FOXP3上游驱动DISC表达。FOXP3的表达被设计为与N末端血凝素(HA)表位标签和核定位序列在读码框内(in-frame)，以生成嵌合蛋白。
如下表3所示，在含有雷帕霉素或AP21967的培养物中选择性地扩增表达上述DISC的经编辑的Treg细胞。在该实验中，在培养基中单独培养或与IL-2、雷帕霉素或雷帕霉素类似物AP21967一起培养后，将细胞用APC标记的抗HA标签和PE-抗FOXP3+T细胞标记。示出了每个群组中的双阳性细胞(表达HA-FOXP3)的百分比。
表3
Figure BDA0002746221120001061
Figure BDA0002746221120001071
此外，如下表4所示，当分析调节性T细胞标志物的存在时，由于表达T细胞标志物FOXP3、CTLA、LAG3和ICOS、相对高的量的CD25和相对低的量的CD127，表达DISC的经编辑的Treg细胞在表型上与对于这种类型的细胞所期望的一致。示出了每个群组中的单阳性细胞(仅表达T细胞标志物)和双阳性细胞(表达T细胞标志物和FOXP3)的百分比。
表4
Figure BDA0002746221120001072
然后，使用实施例3中描述的μDISC构建体或图12所示的构建体中插入的DISC构建体来编辑CD4+T细胞中的内源基因。对于这些实验，MND启动子驱动加HA标签的内源FOXP3基因上游的DISC/μDISC表达。
如下表5所示，在雷帕霉素存在的情况下，经μDISC和DISC编辑的Treg细胞类似地优先富集。如所期望的，单独的培养基或IL-2不富集表达HA-FOXP3的级分。在表5中，示出了每个群组中的双阳性细胞(表达DISC/μDISC和HA-FOXP3的经编辑的细胞)的百分比。
表5
Figure BDA0002746221120001073
Figure BDA0002746221120001081
这些数据表明，DISC和μDISC构建体二者均可用于编辑T细胞中的基因，并使其扩增依赖于雷帕霉素的存在。
实施例5：DISC细胞扩增的优化
该实施例描述了用DISC构建体进行的实验，以在相同培养物中相对于未编辑细胞优先扩增edTreg细胞。这些实验的合理之处是一旦实现雷帕霉素富集的群，则推进T细胞扩增。通常，在使用DISC FOXP3 AAV供体模板编辑原代人CD4+T细胞后，结果为混合的细胞群：成功编辑的细胞(DISC edTreg)和尚未编辑的细胞。相对于常规T细胞，表达FOXP3的Treg细胞在培养物中的生长更为缓慢。因此，在IL-2存在的情况下，混合培养物中的Treg细胞的百分比将迅速下降。将混合细胞群与雷帕霉素而无IL-2一起进行培养可以引起经编辑的细胞的富集。但是，无TCR信号，则总细胞数缓慢增加。因此，在扩增过程中添加抗CD3/CD28珠以提供TCR信号将是有用的。但是，在编辑后添加珠可能激活也存在的未编辑的细胞，引起它们分泌IL-2，并由此消除雷帕霉素处理对无重组IL-2的培养基中的DISC edTregs的选择性优势。在这种情况下，无FOXP3表达的细胞可能会比表达FOXP3的DISC edTreg更快。因此，进行了数次试验以优化DISC edTreg的数量和富集(％)。如以下更详细描述的，这些优化试验使用两种不同的方案进行：两阶段扩增方案和三阶段扩增方案。
两阶段扩增方案
在两阶段扩增方案中，细胞扩增以两个阶段进行：扩增阶段1测试在恢复培养基(recovery media)中有或没有IL-2(50ng/mL)的雷帕霉素选择，随后为扩增阶段2，添加抗CD3/CD28珠、并从培养基中移除IL-2。通常，在第-4天从在具有50μg/mL IL-2和抗人CD3/CD28珠的T细胞培养基中培养的人PBMC中分离CD4 T细胞。在第-1天，移除CD3/CD28珠。在扩增阶段1(第0-9天)期间，用CRISPR/Cas9 RNP和AAV6进行基因编辑(示例性构建体在图13A中示出)。如下所述将细胞分为三个扩增群组。在第2天进行流式细胞术以评价基因编辑。在第9天，将细胞进一步分为两个扩增群组以测试珠和抗体CD3/CD28刺激。在扩增阶段2(第16天)完成后，进行流式细胞术以评价经编辑的细胞的富集和扩增。
对于该实验，使用了表达μDISC的构建体(具有缩短的IL2Rβ序列，以及融合FOXP3的HA标签)。在该实验中使用的AAV构建体的结构在图13A中示出，其中MND启动子驱动微-DISC的细胞表面表达和加HA标签的FOXP3的细胞内表达。
不受理论的束缚，据信扩增阶段1促进雷帕霉素中的DISC edTreg/μDISC edTreg的选择性富集，这允许经编辑的细胞在扩增阶段2之前竞争超过未编辑的细胞，其中CD3/CD28刺激将引起DISC edTreg数量的扩增。通常，扩增阶段1包括同源依赖性修复(HDR)、DISC表达、从电穿孔恢复以及CD4+T细胞扩增。以下的群组测试了在恢复培养基中有或没有IL-2(50ng/mL)的雷帕霉素或雷帕霉素类似物：(1)具有50ng/mL IL-2的雷帕霉素；(2)具有50ng/mL IL-2的雷帕霉素类似物；以及(3)没有IL-2的雷帕霉素。
在扩增阶段2期间，测试了第二CD3/CD28刺激以改善DISC edTreg的数量。以下群组测试了CD3/CD28扩增珠相比于可溶性抗CD3/CD28抗体：(1)无(无珠/无抗体)；(2)T细胞扩增珠；以及(3)可溶性CD3/CD8抗体。在该实验中，在第三天、第六天、第八天、第十天、十三天和第十五天，移除培养基的一半，并补充包含两倍浓度的雷帕霉素、雷帕霉素类似物或IL-2的相同体积的培养基。
该实验的结果在图13B中示出，其中如通过HA+FOXP3+细胞的流式细胞术读数所确定的，观察到在扩增阶段2期间接受珠刺激的细胞引起最高的细胞总数以及μDISC edTreg的最高数量。可溶性抗体刺激也改善了扩增，但程度较小。尽管扩增阶段1期间的培养基中的IL-2的存在改善了最终的细胞数量，但未编辑的细胞数量相对于经编辑的细胞更高，因此限制阶段1中的IL2的量很重要。具有最高的μDISC edTreg百分比的群组在扩增阶段1期间不会接受IL-2，但在扩增阶段2期间经珠刺激，因为没有足够的细胞用于珠刺激条件。从这些实验得出的结论包括：(1)在珠扩增之前限制培养基中的IL-2可以改善μDISC edTreg的富集；(2)编辑后的IL-2改善了总的细胞产量；以及(3)相比于使用可溶性CD3和CD28抗体或无刺激，抗CD3/CD28珠改善细胞扩增。
三阶段扩增方案
设计了三阶段扩增方案，以测试在编辑后立即限制IL-2而不是完全消除IL-2是否会改善富集和细胞产量。与上述的两阶段扩增方案相比，在三阶段扩增方案中紧随编辑后包含额外的短扩增阶段(扩增阶段0；第0-3天)被设计为允许在含有不同量的IL-2(或雷帕霉素或雷帕霉素类似物)的培养基中的DISC表达以及细胞恢复。然后将扩增阶段0之后的经恢复的细胞转移至G-Rex烧瓶，并在雷帕霉素中扩增(扩增阶段1；第3-10天)，以允许DISCedTreg富集，然后添加抗CD3/CD28珠(扩增阶段2；第10-15天)。在该实验中使用与图13A中所示的AAV构建体相同的AAV构建体。
在用抗FOXP3和抗HA标签(HA标签与FOXP3融合在读码框内以产生融合蛋白)细胞内染色后的第3天进行流式细胞术，这示出了编辑后扩增阶段0中的IL-2浓度与μDISCedTreg细胞的百分比的直接关联。结果示于下表6。成功编辑的细胞为HA+FOXP3+(参见Q2)。还示出了HA-FOXP3+的天然产生的tTreg和/或上调FOXP3表达的经激活的T细胞(参见Q1)。
表6
第3天流式细胞术 Q1 Q2 Q3 Q4
经空白对照编辑 15.40 1.03 4.08 79.50
50μg/mL IL-2 4.42 16.40 2.88 76.30
5μg/mL IL-2 2.71 8.24 3.61 85.20
0.5μg/mL IL-2 1.59 6.54 5.44 86.4
仅培养基 0.68 5.46 1.32 92.50
10nM雷帕霉素 0.38 6.41 1.48 91.70
100nM AP21967 0.39 11.90 1.74 86.00
观察到编辑率与IL-2水平直接相关，表明在3天的编辑后扩增阶段(阶段0)期间的IL-2信号改善了HDR结果。此外，观察到在该时间点，在不存在IL-2的情况下，雷帕霉素并未拯救编辑率。
在扩增阶段1(第10天)后，通过流式细胞术评价成功编辑的细胞。将示出了扩增阶段1(第10天)后的μDISC edTreg的富集的流式细胞术的结果在下表7中示出。
表7
第10天流式细胞术 Q1 Q2 Q3 Q4
经空白对照编辑 6.10 0.00 0.078 93.8
50μg/mL IL-2 2.59 23.8 2.45 71.2
5μg/mL IL-2 0.53 50.0 5.18 44.3
0.5μg/mL IL-2 0.46 58.3 9.10 32.2
仅培养基 0.26 53.6 15.2 30.9
10nM雷帕霉素 0.44 70.1 9.31 20.1
100nM AP21967 0.59 80.5 5.54 13.3
将成功编辑的细胞HA+FOXP3+在Q2列中指出。HA-FOXP3+天然产生的tTreg仅在细胞于扩增阶段0(包括经空白对照编辑的)期间接受50ng/mL IL-2时存在。在第10天的流式细胞术显示出，在扩增阶段0期间以较高剂量的IL-2培养的细胞的DISC edTreg富集较少，这可能是因为来自扩增阶段0的一些IL-2培养基被携带到扩增阶段1培养基中。在该实验中，整个过程在雷帕霉素中或用雷帕霉素类似物AP21967培养的细胞具有最高的富集率。
在下表8中示出了在第15天(例如在完成扩增阶段2时)进行的流式细胞术的结果，所述结果示出了在扩增阶段2之后的μDISC edTreg的富集水平。
表8
Figure BDA0002746221120001111
Figure BDA0002746221120001121
虽然在扩增阶段2之后，每个IL-2群组和雷帕霉素群组的富集均改善，但此处在扩增阶段0期间以较高剂量的IL-2培养的细胞的DISC edTreg仍然是较少富集的，而在扩增阶段0过程期间在雷帕霉素或雷帕霉素类似物AP21967中培养的细胞即使在第15天也具有最高的富集率。
如图14A和图14B所示，扩增阶段1和2(分别在编辑后的第10天和第15天)后的细胞计数显示，当在扩增阶段0期间于培养基中存在50ng/mL IL-2时，获得了最高数量的HA+(在此处标记为μDISC+)FOXP3+编辑的细胞。但是相对于未编辑的细胞，该条件的富集率(％)最低。在扩增阶段0期间在5ng/mL IL-2中培养的细胞具有略少的μDISC edTreg，但是该群包含总细胞的将近70％。因此推断出，在扩增阶段0期间使用5ng/mL IL-2可以最佳地优化μDISC edTreg的总产量，而不会显著降低总体的细胞的μDISC edTreg纯度。
对μDISC FOXP3 cDNA edTreg使用三阶段扩增方案
在随后的实验中，使用不同的用于编辑的rAAV6供体构建体测试了类似的三阶段扩增方案，所述构建体具有用于治疗患有例如IPEX(免疫失调、多内分泌病、肠病、X连锁)的受试者的潜在的应用前景。该实验中使用的rAAV6供体构建体包括用于HA标签-FOXP3cDNA-μDISC(从N末端到C末端的朝向)的编码序列。整合后，将插入的构建体设计为表达HA-FOXP3 cDNA融合蛋白以及μDISC。将编辑后立即包含的额外的短扩增阶段(扩增阶段0；第0-3天)设计为允许细胞恢复和DISC表达。然后将扩增阶段0之后的经恢复的细胞转移至G-Rex烧瓶，并在10nM雷帕霉素中扩增以选择经编辑的细胞(扩增阶段1；第3-10天)，并允许DISCedTreg富集，然后添加抗人CD3/CD28(扩增阶段2；第10-17天)进行第二次刺激。就该实验，扩增阶段2延长至17天，以改善细胞产量。
使用上述三阶段方案，与未编辑的细胞的扩增相比，实现了增加的μDISC FOXP3cDNA edTreg的扩增。特别是，从第3天到第17天，经编辑的细胞数量实现了26倍的扩增，在第17天的时间点，经编辑的细胞约富集78％(数据未示出)。观察到起始编辑率约为10％，这可能反映了用于该研究的AAV供体的较大包装尺寸。
使用经优化的DISC扩增的细胞的扩增的汇编
随后，使用上文讨论的经优化的三阶段扩增方案测试候选的临床AAV供体的编辑和扩增，将其设计为在三阶段扩增方案后与未编辑的细胞的扩增相比来确定DISC edTreg的扩增。在该实验中，将供体AAV设计为用于多种自身免疫应用中，其中全长DISC元件和内源性FOXP3受上游MND启动子的控制。融合至内源FOXP3的具有HA标签的AAV供体(AAV供体模板#3187；SEQ ID NO：38)或不具有HA标签的AAV供体(AAV供体模板#3195；SEQ ID NO：39)。使用这些AAV供体的编辑引起在上游MND启动子的控制下的内源FOXP3表达以及全长DISC元件的表达。第一测试载体(AAV供体模板#3187；测试1)使用了包含融合至内源FOXP3的HA标签的AAV构建体；接下来的三个测试(测试2、测试3和测试4)使用了更多的临床相关性，其为无HA标签的AAV供体(AAV供体模板#3195)。在该实验中，将编辑后立即包含的额外的短扩增阶段(扩增阶段0；第0-3天；在存在5ng/mL IL-2的情况下)设计为允许细胞恢复和DISC表达。然后将扩增阶段0之后的经恢复的细胞转移至G-Rex烧瓶，并在10nM雷帕霉素存在的情况下进行扩增，以选择经编辑的细胞(扩增阶段1；第3-10天)，并允许DISC edTreg富集，然后进行流式细胞术并加入抗CD3/CD28珠(扩增阶段2；第10-17天；在10nM雷帕霉素存在的情况下)。在第17天，在完成扩增阶段2时，进行流式细胞术，并对细胞计数和冷冻。
观察到从第3天到珠激活开始时(第10-13天)，经编辑的细胞(带有或不带有HA标签)的平均扩增倍数为2±1.6倍；珠激活期间(从第10-13天到第16-20天)的平均扩增倍数为20.5±5.9倍(具有2个供体的4个实验的平均值±s.d.)(数据未示出)。由于起始的第3天的编辑率(例如双阳性FOXP3+P2A+细胞的百分比)为上述示出的实验的约两倍高，因此这些实验在完成第三阶段扩增时在活细胞门控内一致地产生具有很高纯度(93.5±2.4％)的终产物。
实施例6：雷帕霉素对μDISC GFP edTreg体内存活或扩增的影响
该实施例描述了如下实验：进行所述实验以测试表达μDISC构建体的edTreg细胞通过雷帕霉素处理在体内扩增的能力。这是重要的构思，因为经工程化的T细胞或经扩增的天然Tregs通常不会充分扩增至患者中。还存在不期望扩增Tregs的条件，例如在某些感染情况下。因此，具有Treg特征的本文提供的经工程化的细胞的有用特征是能够对体内扩增施加控制。使用人源化小鼠模型进行实验以确定雷帕霉素是否可以增加体内μDISC edTreg的数量，该小鼠模型包含转移至免疫功能不全的NOD-scid-IL2RgNULL(NSG)小鼠中的人类细胞。对于这些实验，使用AAV供体编辑细胞以驱动来自MND启动子的内源FOXP3和μDISC的顺式连接表达。该AAV供体模板在内源FOXP3的N末端处并入GFP融合蛋白。将经GFP标记的FOXP3融合蛋白用于促进在体内细胞样品中检测经基因编辑的细胞的能力。在本研究中使用的三阶段扩增方案中，在第-4天，将CD4+细胞与抗CD3/CD28扩增珠一起在50ng/mL IL-2中培养。然后在第-1天移除珠。紧随编辑后，在5ng/mL IL-2存在的情况下进行扩增阶段0(第0-3天)。在此实验中使用的三阶段扩增方案中，扩增阶段0流式细胞术的时机在第2天。然后，将扩增阶段0之后的经恢复的细胞转移至G-Rex烧瓶，并在10nM雷帕霉素存在的情况下进行扩增以选择经编辑的细胞(扩增阶段1；第3-9天)，并允许DISC edTreg富集，然后进行流式细胞术并添加抗CD3/CD28珠(扩增阶段2；第9-16天；在10nM雷帕霉素存在的情况下)。在第2天、第9天、第12天和第16天进行流式细胞术，以监测经编辑的GFP+FOXP3+细胞的扩增。如下表9所示，观察到至第16天，最终细胞产物为>80％的GFP+编辑的细胞，并且经编辑的细胞已扩增超过20倍。
表9
时间点 第2天 第9天 第12天 第16天
经编辑的GFP+FOXP3+细胞 22％ 79％ 88％ 89％
在第16天，在完成扩增阶段2时，如下所述将细胞用于静脉内注射。
将NSG小鼠用雷帕霉素预处理，以使雷帕霉素结合蛋白饱和并在血清中提供雷帕霉素。如下表10所示，然后对一些小鼠进行辐照(辐照＝200cGy)，模仿体内免疫抑制试验中使用的辐照。
表10
雷帕霉素 辐照 #小鼠
经空白对照编辑 - + 3
μDISC edTreg - + 5
μDISC edTreg + + 5
μDISC edTreg - - 5
μDISC edTreg + - 7
然后根据以下的一般程序i.v.注射μDISC GFP edTreg(或经空白对照编辑的细胞)。从第-4天开始，每隔一天腹膜内(i.p.)注射雷帕霉素0.1mg/kg，直到第21天。在第0天，进行辐照，并且i.v.注射μDISC edTreg。收集外周血样品以测试雷帕霉素水平(第2天)或用于流式细胞术(第7天、第14天、第21天和第28天)以追踪包括GFP+edTreg细胞在内的经转移的人T细胞的表型和数量。
为了说明在经雷帕霉素处理相比于媒介中的μDISC GFP edTreg的扩增，将转移至NSG后7天来自外周血的流式细胞术结果示出在下表11中(门控：活的、hCD45+、hCD4+)，其中示出了来自每个群组的代表性小鼠的人T细胞标志物和GFP+。
表11
Figure BDA0002746221120001151
在图15A-图15B中还总结了流式细胞术实验的结果，进行所述实验以说明在转移到NSG后7天，在经雷帕霉素处理相比于媒介中的μDISC GFP edTreg的扩增。在这些图中，图表为在75μL外周血样品中的GFP+细胞的百分比(图15A)或GFP+细胞的数量(图15B)的平均值±s.d.。
在图16A-图16B中示出了将细胞转移到小鼠后14天，外周血的流式细胞术结果。在第14天，对外周血样品进行人CD45、CD4、CD127和CD25的染色。在这两天，大多数人CD45+CD4+细胞均为GFP+。在第7天的图显示出，如对Treg所预期的，GFP+细胞为CD25+和CD127-。当用雷帕霉素处理小鼠时，血清样品中的GFP+细胞的百分比以及GFP+细胞的数量更高。
每周持续追踪这些小鼠的外周血中的μDISC GFP edTreg的水平，共计四个星期。将所得的GFP+细胞的百分比和数量总结在图17的图中。从该实验得出的结论是，经雷帕霉素处理的小鼠在每个时间点具有更高水平的μDISC GFP edTreg，在细胞转移后的两到三周达到峰值。辐照稍微改善细胞数量，这可能是由于鼠类细胞向过继转移的人edTreg细胞的抗原呈递水平更高。
总而言之，这项研究的结果(例如，表9-表11和图17中所示的数据)清楚地表明可以使用雷帕霉素在体内扩增表达DISC平台的一个版本的edTreg。这提供了如下的直接的证据：这些构建体和方法可用于治疗，例如，该平台可用于体内扩增和支持表达DISC的edTreg产品用于治疗自身免疫性疾病。
实施例7：雷帕霉素对μDISC GFP edTreg体内存活或扩增的影响的测试
在该实施例中，我们测试了已在体外在雷帕霉素中扩增的DISC edTreg(作为我们的三阶段扩增方案中概述的细胞产品制造工艺的一部分)是否具有在体内发挥功能的能力(例如抑制效应T细胞免疫应答)。在我们用来测试这点的模型中，将人CD4 T效应细胞注射到最小辐照的NSG小鼠中，引起由人T细胞介导的针对小鼠组织的大规模炎症应答。这种炎症应答依赖于小鼠MHC-II的表达，表明该模型可以模拟例如发生在移植物抗宿主疾病中的同种异体T细胞应答。天然存在的自体胸腺Treg和先前报道的新edTreg产物可以抑制这种免疫应答。因此，将本实验中使用的AAV供体模板设计为生成FOXP3融合蛋白，所述融合蛋白在其N末端包含允许追踪成功地基因编辑的细胞的HA表位。该AAV供体模板表达在加HA标签的FOXP3蛋白的上游具有DISC元件的盒，由MND启动子驱动(缩写为DISC HA ki edTreg；ki＝敲入)。HDR之后，该盒将插入FOXP3基因座中，引起MND启动子介导的DISC和内源FOXP3二者的表达。如下所述，使用三阶段扩增方案进行人T细胞编辑和扩增。在第-4天，在50ng/mLIL-2存在的情况下，将CD4+细胞与抗CD3/CD28扩增珠一起培养。然后在第-1天移除珠。紧随编辑后，在5ng/mL IL-2的存在下进行扩增阶段0(第0-3天)。然后将在扩增阶段0之后的恢复的细胞转移至G-Rex烧瓶，并在10nM雷帕霉素存在的情况下进行扩增，以选择经编辑的细胞(扩增阶段1；第3-10天)，并允许DISC edTreg富集，然后进行流式细胞术并加入抗CD3/CD28珠(扩增阶段2；第9-16天；在10nM雷帕霉素存在的情况下)。在完成扩增阶段2时，在第16天收集细胞并冷冻。如下表12所示，在第14天进行流式细胞术表明从第3天到第14天，细胞产物扩增并引起HA+FOXP3+细胞增加18.4倍，最终细胞纯度>90％。
表12
扩增时间点 第3天 第10天 第14天
HA+FOXP3+细胞 35.6％ 63.3％ 90.9％
进行了进一步的实验以测试DISC HA ki edTreg在体内抑制激活的CD4 T效应细胞的能力。下表13提供了各种NSG小鼠群组的详情，所述群组指出了通过IV过继转移递送的T细胞群。LNGFR edTreg被用作功能上活化的edTreg的阳性对照。这些经编辑的T细胞在细胞表面上表达LNGFR表位标签和FOXP3 cDNA，并且先前显示出将在该模型中为免疫抑制的。
表13
Figure BDA0002746221120001171
本实验中使用的一般程序如下。经辐照的受体NSG小鼠i.v.输注DISC HA kiedTregs或空白对照编辑的细胞。三天后(以允许edTreg移植)，然后通过i.v.注射递送CD4T效应细胞。通过追踪体重并对GvHD症状打分，对动物进行长达59天的监测。如果小鼠达到预定的人道终点(如它们的体重减轻>20％)，则被安乐死。
发现接受伴随着T效应细胞的空白对照编辑的细胞的小鼠具有最严重的后果，这些群组中的所有小鼠都在四十五天内死亡。由于空白对照编辑的细胞的针对鼠类抗原安排上的产生性(productive)炎症应答的能力，因此该群组的结果比接受单独的T效应细胞的小鼠更糟。接受表达LNGFR的edTreg(由我们实验室中的其它小组证实为免疫抑制性的阳性对照细胞)或DISC HA ki edTreg的小鼠相对于仅T效应子组和带有T效应子的空白对照edTreg组二者而言，具有改善的存活率，表明edTreg(包括DISC HAki edTreg)抑制T效应子的炎症。这些组合的发现清楚地表明，含有DISC构建体的edTreg可以在体内表现出Treg样的功能活性；从而支持将类似的经编辑的Treg产品用于自身免疫性病症的治疗。将体内免疫抑制模型的Kaplan-Meier存活曲线示出在图18中。
实施例8：使用抗P2A抗体染色或ddPCR对DISC edTreg的HDR率进行评价
抗P2A染色以检测经编辑的细胞
该实例描述了开发临床相关方法，以不依赖于表位标签或用于标记经编辑的细胞的荧光蛋白而追踪DISC edTreg并测量混合的群中成功地编辑的细胞的比率。尽管使用诸如GFP或HA的标签使得能够对培养物中或体内的经编辑的细胞进行灵敏和定量检测，但此类标签不会在临床细胞产品中使用，因为它们可能介导对该标签的免疫应答和/或抑制FOXP3功能。
我们开发的新的细胞追踪方法使用了P2A核糖体跳跃肽的细胞内染色。将P2A序列并入AAV供体序列中，以分离出每个DISC元件的编码序列和FOXP3起始序列。在HDR编辑的细胞中，将一部分肽序列在DISC元件的C末端引入经编辑的细胞中。在该实验中还使用了P2A抗体(针对CGDVEENPG的3H4克隆)，该抗体通过Novus Biologicals可商购。抗P2A单克隆抗体用荧光团标记，该荧光团用于细胞内染色。如下表14所示，虽然一些经空白对照编辑的细胞表达FOXP3(该混合细胞群中的胸腺Treg表达FOXP3的预期结果)，但它们并未分别用P2A或HA标签抗体染色。在该实验中，在编辑后三天，对细胞进行细胞内FOXP3、HA标签和P2A肽的染色。用不含HA标签的AAV供体模板#3195编辑的细胞以高水平表达FOXP3和P2A二者。用引入HA标签的AAV供体模板#3187编辑的那些细胞表现出相似水平的P2A+FOXP3+和HA+FOXP3+细胞，证明了P2A染色和HA染色之间的直接相关性。因此，P2A染色的使用可以允许对制造的edTreg进行系列评价和/或在体内追踪这些细胞。在下表14中，显示了每个群组中的双阳性细胞(表达P2A-FOXP3或HA-FOXP3)的百分比。
表14
Figure BDA0002746221120001191
ddPCR测定以在分子基础上定量HDR事件
对于临床细胞产品，证实(例如通过流式细胞术确定的)表达感兴趣的基因的细胞百分比与在DNA水平确定的同源介导修复事件百分比之间的相关性是有用的。作为这一有用性的说明，即使没有基因编辑，也可以在TCR刺激后在效应T细胞中上调FOXP3的表达；此外，在“脱靶”双链断裂中插入的AAV模板也可以表达P2A标记的蛋白。因此，我们开发了灵敏的方法来量化在混合的细胞群中经历HDR事件的FOXP3基因的百分比。本节描述了数字液滴PCR(ddPCR)测定法，开发所述测定法以从基因组DNA样品中定量HDR事件。设计引物和探针组，使得它们将允许使用Bio-Rad QX200微滴数字PCR系统和Bio-Rad ddPCR Supermix forprobes对靶基因座中的成功的HDR进行检测。下表15中示出了所使用的PCR和探针引物的序列，并且退火温度为63℃。
表15
Figure BDA0002746221120001201
在下表16中总结了在编辑时间点后10天，相对于通过P2A抗体染色的流式细胞术的结果，通过ddPCR计算的HDR率的结果。
表16
Figure BDA0002746221120001202
在这些实验中，在编辑后10天用AAV 3195(编辑1至9)或AAV 3187或空白对照编辑对9个独立样品的流式细胞术进行了评价，示出了FOXP3和P2A的细胞内染色。示出了每个群组中的双阳性细胞(表达P2A-FOXP3)的百分比。平行于ddPCR测定，从细胞中分离基因组DNA。还示出了ddPCR测定的结果。观察到，如通过流式细胞术所评价的，ddPCR值与阳性细胞之间存在密切相关(对于编辑1，ddPCR为68.9，相比于流式细胞术为61.3，等等)。因此，ddPCR提供了在体外追踪DISC edTreg的比例的第二测定法，并且该方法与通过流式细胞术的P2A染色的使用良好相关。
尽管已经公开了本公开内容的具体实施方式，但是将理解的是，可以进行各种修改和组合并且将这些修改和组合考虑为在所附权利要求的真正的精神和范围内。因此，并不旨在限制本文展示出的确切的摘要和公开内容。
序列表
除本公开内容中的其它地方公开的序列外，提供以下序列，因为它们在出于说明的目的提供的本公开内容的各种示例性实施方式中被提及或使用。
Figure BDA0002746221120001211
Figure BDA0002746221120001221
Figure BDA0002746221120001231
Figure BDA0002746221120001241
Figure BDA0002746221120001251
Figure BDA0002746221120001261
Figure BDA0002746221120001271
Figure BDA0002746221120001281
Figure BDA0002746221120001291
Figure BDA0002746221120001301
Figure BDA0002746221120001311
Figure BDA0002746221120001321
Figure BDA0002746221120001331
Figure BDA0002746221120001341
Figure BDA0002746221120001351
Figure BDA0002746221120001361
Figure BDA0002746221120001371
Figure BDA0002746221120001381
Figure BDA0002746221120001391
序列表
<110> 西雅图儿童医院(DBA西雅图儿童研究所)（SEATTLE CHILDREN'S HOSPITAL(DBA SEATTLE CHILDREN'S RESEARCH INSTITUTE)）
<120> 雷帕霉素抗性细胞
<130> SCRI.186WO
<150> US 62/663,562
<151> 2018-04-27
<160> 58
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 裸露的FRB野生型多肽
<400> 1
Met Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His
20 25 30
Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn
35 40 45
Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys
50 55 60
Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu
65 70 75 80
Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90
<210> 2
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 裸露的FRB突变多肽
<400> 2
Met Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His
20 25 30
Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn
35 40 45
Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys
50 55 60
Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu
65 70 75 80
Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90
<210> 3
<211> 4187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> DISC载体DNA
<400> 3
gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 60
cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt 120
aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc 180
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tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gcactgcccg 1200
tgaccgccct gctgctgcct ctggccctgc tgctgcacgc agcccggcct atcctgtggc 1260
acgagatgtg gcacgagggc ctggaggagg ccagcaggct gtattttggc gagcgcaacg 1320
tgaagggcat gttcgaggtg ctggagcctc tgcacgccat gatggagaga ggcccacaga 1380
ccctgaagga gacatccttt aaccaggcct atggacggga cctgatggag gcacaggagt 1440
ggtgcagaaa gtacatgaag tctggcaatg tgaaggacct gctgcaggcc tgggatctgt 1500
actatcacgt gtttcggaga atctccaagg gcaaagacac gattccgtgg cttgggcatc 1560
tgctcgttgg gctgagtggt gcgtttggtt tcatcatctt ggtctatctc ttgatcaatt 1620
gcagaaatac aggcccttgg ctgaaaaaag tgctcaagtg taataccccc gacccaagca 1680
agttcttctc ccagctttct tcagagcatg gaggcgatgt gcagaaatgg ctctcttcac 1740
cttttccctc ctcaagcttc tccccgggag ggctggcgcc cgagatttca cctcttgagg 1800
tacttgaacg agacaaggtt acccaacttc tccttcaaca ggataaggta cccgaacctg 1860
cgagccttag ctccaaccac tctcttacga gctgcttcac caatcaggga tacttctttt 1920
tccaccttcc cgatgcgctg gaaatcgaag cttgtcaagt ttactttacc tatgatccat 1980
atagcgagga agatcccgac gaaggagtcg ccggtgcgcc cacgggttcc tcaccccaac 2040
ctctccagcc tctctcagga gaagatgatg cttattgcac ttttcccagt agagacgatc 2100
tcctcctctt ttctccatct cttttggggg gaccttcccc cccttctacg gcacctggcg 2160
ggtctggtgc tggcgaggag cggatgccgc cgtccctcca ggagcgagta ccacgagatt 2220
gggatcccca gccacttgga ccccccaccc ccggcgtacc tgaccttgtc gattttcaac 2280
ctccccctga attggtgctg cgagaggctg gggaggaagt tccggacgct gggccgaggg 2340
agggcgtgtc ctttccatgg agtaggcctc caggtcaagg cgagtttagg gctctcaacg 2400
cgcggctgcc gttgaataca gacgcttatc tctcactgca ggaactgcaa ggtcaggacc 2460
caacacatct tgtaggatct ggtgctacta atttttctct tttgaagcaa gctggagatg 2520
ttgaagagaa ccccggtccg gagatgtggc atgagggtct ggaagaagcg tctcgactgt 2580
actttggtga gcgcaatgtg aagggcatgt ttgaagtcct cgaacccctt catgccatga 2640
tggaacgcgg accccagacc ttgaaggaga caagttttaa ccaagcttac ggaagagacc 2700
tgatggaagc ccaggaatgg tgcaggaaat acatgaaaag cgggaatgtg aaggacttgc 2760
tccaagcgtg ggacctgtac tatcatgtct ttaggcgcat tagtaagggc agcggcgcca 2820
ccaacttcag cctgctgaag caggccggcg acgtggagga gaaccccggc cccgtgagca 2880
agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag gtgcacatgg 2940
agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc cgcccctacg 3000
agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc ttcgcctggg 3060
acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac cccgccgaca 3120
tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc gtgatgaact 3180
tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc tctgcaggac ggcgagttca 3240
tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta atgcagaaga 3300
agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc gccctgaagg 3360
gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct gaggtcaaga 3420
ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc aacatcaagt 3480
tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa cgcgccgagg 3540
gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaagtg aactagtgtc gacaatcaac 3600
ctctggatta caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta 3660
cgctatgtgg atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt 3720
tcattttctc ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg 3780
ttgtcaggca acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg 3840
gcattgccac cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca 3900
cggcggaact catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca 3960
ctgacaattc cgtggtgttg tcggggaagc tgacgtcctt tccatggctg ctcgcctgtg 4020
ttgccacctg gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag 4080
cggaccttcc ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc 4140
gccctcagac gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcctgga 4187
<210> 4
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 微-DISC DNA（仅胞质尾；密码子差异化的）
<400> 4
ccagcagctc tcggcaaaga cacgattccg tggcttgggc atctgctcgt tgggctgagc 60
ggtgcgtttg gtttcatcat cttggtctat ctcttgatca attgcagaaa tacaggccct 120
tggctgaaaa aagtgctcaa gtgtaatacc cccgacccaa gcaagttctt ctcccagctt 180
tcttcagagc atggaggcga tgtgcagaaa tggctctctt caccttttcc ctcctcaagc 240
ttctccccgg gagggctggc gcccgagatt tcacctcttg aggtacttga acgagacaag 300
gttacccaac ttctccttca acaggataag gtacccgaac ctgcgagcct tagcttgaat 360
acagacgctt atctctcact gcaggaactg caa 393
<210> 5
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 微-DISC 多肽（仅胞质尾）
<400> 5
Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu
1 5 10 15
Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu
20 25 30
Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys
35 40 45
Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His
50 55 60
Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser
65 70 75 80
Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu
85 90 95
Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro
100 105 110
Glu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln
115 120 125
Glu Leu Gln
130
<210> 6
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> FKBP CISC结构域
<400> 6
Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro
1 5 10 15
Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp
20 25 30
Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
35 40 45
Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
50 55 60
Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
85 90 95
Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Gly Glu
100 105
<210> 7
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 整个微-DISC多肽（FRB截短的IL2Rβ）
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu
20 25 30
Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met
35 40 45
Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln
50 55 60
Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met
65 70 75 80
Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys
85 90 95
Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile
100 105 110
Ser Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His
115 120 125
Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr
130 135 140
Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu
145 150 155 160
Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser
165 170 175
Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu
195 200 205
Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys
210 215 220
Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser
225 230 235 240
Leu Gln Glu Leu Gln
245
<210> 8
<211> 3623
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 微-DISC载体DNA
<400> 8
gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 60
cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt 120
aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc 180
tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc 240
ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc 300
tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgct agcaccggtg 360
ccgccaccat gcctctgggc ctgctgtggc tgggcctggc cctgctgggc gccctgcacg 420
cccaggccgg cgtgcaggtg gagacaatct ccccaggcga cggacgcaca ttccctaagc 480
ggggccagac ctgcgttgtg cactatacag gcatgctgga ggatggcaag aagtttgaca 540
gctcccggga tagaaacaag ccattcaagt ttatgctggg caagcaggaa gtgatcagag 600
gctgggagga gggcgtggcc cagatgtctg tgggccagag ggccaagctg accatcagcc 660
cagactacgc ctatggagca acaggccacc caggaatcat cccacctcac gccaccctgg 720
tgttcgatgt ggagctgctg aagctgggcg agggatccaa cacatcaaaa gagaacccct 780
ttctgttcgc attggaggcc gtagtcatat ctgttggatc catgggactt attatctccc 840
tgttgtgtgt gtacttctgg ctggaacgga ctatgcccag gatccccacg ctcaagaatc 900
tggaagatct cgtcacagaa taccatggta atttcagcgc ctggagcgga gtctctaagg 960
gtctggccga atccctccaa cccgattatt ctgaacggtt gtgcctcgta tccgaaatac 1020
caccaaaagg cggggctctg ggtgagggcc caggggcgag tccgtgcaat caacacagcc 1080
cgtattgggc ccctccttgt tatacgttga agcccgaaac tggaagcgga gctactaact 1140
tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacctatg gcactgcccg 1200
tgaccgccct gctgctgcct ctggccctgc tgctgcacgc agcccggcct atcctgtggc 1260
acgagatgtg gcacgagggc ctggaggagg ccagcaggct gtattttggc gagcgcaacg 1320
tgaagggcat gttcgaggtg ctggagcctc tgcacgccat gatggagaga ggcccacaga 1380
ccctgaagga gacatccttt aaccaggcct atggacggga cctgatggag gcacaggagt 1440
ggtgcagaaa gtacatgaag tctggcaatg tgaaggacct gctgcaggcc tgggatctgt 1500
actatcacgt gtttcggaga atctccaagg gcaaagacac gattccgtgg cttgggcatc 1560
tgctcgttgg gctgagtggt gcgtttggtt tcatcatctt ggtctatctc ttgatcaatt 1620
gcagaaatac aggcccttgg ctgaaaaaag tgctcaagtg taataccccc gacccaagca 1680
agttcttctc ccagctttct tcagagcatg gaggcgatgt gcagaaatgg ctctcttcac 1740
cttttccctc ctcaagcttc tccccgggag ggctggcgcc cgagatttca cctcttgagg 1800
tacttgaacg agacaaggtt acccaacttc tccttcaaca ggataaggta cccgaacctg 1860
cgagccttag cttgaataca gacgcttatc tctcactgca ggaactgcaa ggatctggtg 1920
ctactaattt ttctcttttg aagcaagctg gagatgttga agagaacccc ggtccggaga 1980
tgtggcatga gggtctggaa gaagcgtctc gactgtactt tggtgagcgc aatgtgaagg 2040
gcatgtttga agtcctcgaa ccccttcatg ccatgatgga acgcggaccc cagaccttga 2100
aggagacaag ttttaaccaa gcttacggaa gagacctgat ggaagcccag gaatggtgca 2160
ggaaatacat gaaaagcggg aatgtgaagg acttgctcca agcgtgggac ctgtactatc 2220
atgtctttag gcgcattagt aagggcagcg gcgccaccaa cttcagcctg ctgaagcagg 2280
ccggcgacgt ggaggagaac cccggccccg tgagcaaggg cgaggaggat aacatggcca 2340
tcatcaagga gttcatgcgc ttcaaggtgc acatggaggg ctccgtgaac ggccacgagt 2400
tcgagatcga gggcgagggc gagggccgcc cctacgaggg cacccagacc gccaagctga 2460
aggtgaccaa gggtggcccc ctgcccttcg cctgggacat cctgtcccct cagttcatgt 2520
acggctccaa ggcctacgtg aagcaccccg ccgacatccc cgactacttg aagctgtcct 2580
tccccgaggg cttcaagtgg gagcgcgtga tgaacttcga ggacggcggc gtggtgaccg 2640
tgacccagga ctcctctctg caggacggcg agttcatcta caaggtgaag ctgcgcggca 2700
ccaacttccc ctccgacggc cccgtaatgc agaagaagac catgggctgg gaggcctcct 2760
ccgagcggat gtaccccgag gacggcgccc tgaagggcga gatcaagcag aggctgaagc 2820
tgaaggacgg cggccactac gacgctgagg tcaagaccac ctacaaggcc aagaagcccg 2880
tgcagctgcc cggcgcctac aacgtcaaca tcaagttgga catcacctcc cacaacgagg 2940
actacaccat cgtggaacag tacgaacgcg ccgagggccg ccactccacc ggcggcatgg 3000
acgagctgta caagtgaact agtgtcgaca atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa 3060
gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa 3120
tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat 3180
cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt 3240
gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc 3300
tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc 3360
ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg 3420
ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga 3480
cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc 3540
tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc 3600
tttgggccgc ctccccgcct gga 3623
<210> 9
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rγ-CISC多肽
<400> 9
Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
His Ala Gln Ala Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly
20 25 30
Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly
35 40 45
Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys
50 55 60
Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu
65 70 75 80
Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro
100 105 110
Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Gly Glu
115 120 125
Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala
130 135 140
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
145 150 155 160
Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys
165 170 175
Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp
180 185 190
Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser
195 200 205
Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu
210 215 220
Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp
225 230 235 240
Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
245 250
<210> 10
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rγ-CISC多肽
<400> 10
Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
His Ala Gln Ala Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly
20 25 30
Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly
35 40 45
Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys
50 55 60
Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu
65 70 75 80
Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro
100 105 110
Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr
130 135 140
Leu His Lys Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg
145 150 155 160
Phe Leu Asn His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp
165 170 175
Asp His Ser Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser
180 185 190
Leu Pro Ser Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser
195 200 205
Arg Phe Asn Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser
210 215 220
His Pro Ile His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu
225 230 235 240
Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile
245 250 255
Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg
260 265 270
Ile Pro Thr Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly
275 280 285
Asn Phe Ser Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu
290 295 300
Gln Pro Asp Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro
305 310 315 320
Lys Gly Gly Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln
325 330 335
His Ser Pro Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
340 345 350
<210> 11
<211> 349
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rγ-CISC多肽
<400> 11
Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
His Ala Gln Ala Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly
20 25 30
Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly
35 40 45
Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys
50 55 60
Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu
65 70 75 80
Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro
100 105 110
Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly
115 120 125
Gln Asn Leu Val Ile Pro Trp Ala Pro Glu Asn Leu Thr Leu His Lys
130 135 140
Leu Ser Glu Ser Gln Leu Glu Leu Asn Trp Asn Asn Arg Phe Leu Asn
145 150 155 160
His Cys Leu Glu His Leu Val Gln Tyr Arg Thr Asp Trp Asp His Ser
165 170 175
Trp Thr Glu Gln Ser Val Asp Tyr Arg His Lys Phe Ser Leu Pro Ser
180 185 190
Val Asp Gly Gln Lys Arg Tyr Thr Phe Arg Val Arg Ser Arg Phe Asn
195 200 205
Pro Leu Cys Gly Ser Ala Gln His Trp Ser Glu Trp Ser His Pro Ile
210 215 220
His Trp Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu
225 230 235 240
Glu Ala Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu
245 250 255
Leu Cys Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr
260 265 270
Leu Lys Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser
275 280 285
Ala Trp Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp
290 295 300
Tyr Ser Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly
305 310 315 320
Ala Leu Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro
325 330 335
Tyr Trp Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
340 345
<210> 12
<211> 251
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rγ-CISC多肽
<400> 12
Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
His Ala Gln Ala Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly
20 25 30
Arg Thr Phe Pro Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly
35 40 45
Met Leu Glu Asp Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys
50 55 60
Pro Phe Lys Phe Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu
65 70 75 80
Glu Gly Val Ala Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Pro Asp Tyr Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro
100 105 110
Pro His Ala Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu Gly
115 120 125
Gly Ser Asn Thr Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala
130 135 140
Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
145 150 155 160
Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys
165 170 175
Asn Leu Glu Asp Leu Val Thr Glu Tyr His Gly Asn Phe Ser Ala Trp
180 185 190
Ser Gly Val Ser Lys Gly Leu Ala Glu Ser Leu Gln Pro Asp Tyr Ser
195 200 205
Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu
210 215 220
Gly Glu Gly Pro Gly Ala Ser Pro Cys Asn Gln His Ser Pro Tyr Trp
225 230 235 240
Ala Pro Pro Cys Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
245 250
<210> 13
<211> 429
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rβ-CISC多肽
<400> 13
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu
20 25 30
Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met
35 40 45
Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln
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Val Leu Trp Lys Lys Arg Ile Lys Pro Ile Val Trp Pro Ser Leu Pro
165 170 175
Asp His Lys Lys Thr Leu Glu His Leu Cys Lys Lys Pro Arg Lys Asn
180 185 190
Leu Asn Val Ser Phe Asn Pro Glu Ser Phe Leu Asp Cys Gln Ile His
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Arg Val Asp Asp Ile Gln Ala Arg Asp Glu Val Glu Gly Phe Leu Gln
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Asp Thr Phe Pro Gln Gln Leu Glu Glu Ser Glu Lys Gln Arg Leu Gly
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Gly Asp Val Gln Ser Pro Asn Cys Pro Ser Glu Asp Val Val Ile Thr
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Pro Glu Ser Phe Gly Arg Asp Ser Ser Leu Thr Cys Leu Ala Gly Asn
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Val Ser Ala Cys Asp Ala Pro Ile Leu Ser Ser Ser Arg Ser Leu Asp
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<223> 合成的多肽
<220>
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165 170 175
His Arg Val Leu Gly Gln Tyr Leu Arg Asp Thr Ala Ala Leu Ser Pro
180 185 190
Pro Lys Ala Thr Val Ser Asp Thr Cys Glu Glu Val Glu Pro Ser Leu
195 200 205
Leu Glu Ile Leu Pro Lys Ser Ser Glu Arg Thr Pro Leu Pro Leu Cys
210 215 220
Ser Ser Gln Ala Gln Met Asp Tyr Arg Arg Leu Gln Pro Ser Cys Leu
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<213> 人工序列
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<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
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tgataccatg ggccccagaa aatctcacac ttcataaact ttccgaatca caactcgaac 2820
tcaactggaa taaccggttc ctgaatcact gtcttgaaca cctggtacaa tatcggaccg 2880
actgggatca ctcatggaca gaacaatctg tggactatag gcacaaattc tcactcccaa 2940
gcgtagacgg ccaaaaaaga tacacttttc gcgtacgatc ccgctttaat cctctctgcg 3000
gctctgctca gcactggagt gaatggtccc atcccattca ttggggatcc aacacatcaa 3060
aagagaaccc ctttctgttc gcattggagg ccgtagtcat atctgttgga tccatgggac 3120
ttattatctc cctgttgtgt gtgtacttct ggctggaacg gactatgccc aggatcccca 3180
cgctcaagaa tctggaagat ctcgtcacag aataccatgg taatttcagc gcctggagcg 3240
gagtctctaa gggtctggcc gaatccctcc aacccgatta ttctgaacgg ttgtgcctcg 3300
tatccgaaat accaccaaaa ggcggggctc tgggtgaggg cccaggggcg agtccgtgca 3360
atcaacacag cccgtattgg gcccctcctt gttatacgtt gaagcccgaa actggaagcg 3420
gagctactaa cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta 3480
tggcactgcc cgtgaccgcc ctgctgctgc ctctggccct gctgctgcac gcagcccggc 3540
ctatcctgtg gcacgagatg tggcacgagg gcctggagga ggccagcagg ctgtattttg 3600
gcgagcgcaa cgtgaagggc atgttcgagg tgctggagcc tctgcacgcc atgatggaga 3660
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aggcacagga gtggtgcaga aagtacatga agtctggcaa tgtgaaggac ctgctgcagg 3780
cctgggatct gtactatcac gtgtttcgga gaatctccaa gggaggttca aaaccttttg 3840
agaaccttag actgatggcg cccatctctc tgcaggtagt tcacgttgag acccatagat 3900
gcaatataag ctgggaaatc tcacaagcca gccattactt tgaacggcat ttggaattcg 3960
aggcccgaac actttccccc ggtcatacgt gggaagaagc tcctctcttg acgctgaagc 4020
agaagcagga gtggatttgt ctggagactt tgactcctga tactcagtat gagttccaag 4080
ttcgggtgaa accactccaa ggcgagttca cgacgtggtc tccgtggagt caaccgttgg 4140
cgttccgcac gaagcccgct gcccttggca aagacacgat tccgtggctt gggcatctgc 4200
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tcttctccca gctttcttca gagcatggag gcgatgtgca gaaatggctc tcttcacctt 4380
ttccctcctc aagcttctcc ccgggagggc tggcgcccga gatttcacct cttgaggtac 4440
ttgaacgaga caaggttacc caacttctcc ttcaacagga taaggtaccc gaacctgcga 4500
gccttagctc caaccactct cttacgagct gcttcaccaa tcagggatac ttctttttcc 4560
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tccagcctct ctcaggagaa gatgatgctt attgcacttt tcccagtaga gacgatctcc 4740
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cccctgaatt ggtgctgcga gaggctgggg aggaagttcc ggacgctggg ccgagggagg 4980
gcgtgtcctt tccatggagt aggcctccag gtcaaggcga gtttagggct ctcaacgcgc 5040
ggctgccgtt gaatacagac gcttatctct cactgcagga actgcaaggt caggacccaa 5100
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tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg tggatacgct gctttaatgc 6000
ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt ctcctccttg tataaatcct 6060
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agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt 6960
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ctagctatcc cgcccctaac tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta 7080
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ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 7680
gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 7740
tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 7800
ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgt ttacaatttc ccaggtggca cttttcgggg 7860
aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt tttctaaata cattcaaata tgtatccgct 7920
catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat 7980
tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc 8040
tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg 8100
ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg 8160
ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc gcggtattat cccgtattga 8220
cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct cagaatgact tggttgagta 8280
ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc 8340
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acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga ccacttctgc gctcggccct 8640
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taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata ctttagattg atttaaaact 8880
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cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc 9000
ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct 9060
accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact ctttttccga aggtaactgg 9120
cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt ccttctagtg tagccgtagt taggccacca 9180
cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc 9240
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ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg 9540
acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag 9600
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tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc 9720
tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc 9780
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cggataacaa tttcacacag gaaacagcta tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa 10020
ccctcactaa agggaacaaa agctggagct gca 10053
<210> 30
<211> 10035
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> CISC载体DNA
<400> 30
agcttaatgt agtcttatgc aatactcttg tagtcttgca acatggtaac gatgagttag 60
caacatgcct tacaaggaga gaaaaagcac cgtgcatgcc gattggtgga agtaaggtgg 120
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acaggatcag aagaacttag atcattatat aatacagtag caaccctcta ttgtgtgcat 840
caaaggatag agataaaaga caccaaggaa gctttagaca agatagagga agagcaaaac 900
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taacaattac acaagcttaa tacactcctt aattgaagaa tcgcaaaacc agcaagaaaa 1500
gaatgaacaa gaattattgg aattagataa atgggcaagt ttgtggaatt ggtttaacat 1560
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aagaatagtt tttgctgtac tttctatagt gaatagagtt aggcagggat attcaccatt 1680
atcgtttcag acccacctcc caaccccgag gggacccgac aggcccgaag gaatagaaga 1740
agaaggtgga gagagagaca gagacagatc cattcgatta gtgaacggat ctcgacggta 1800
tcggttaact tttaaaagaa aaggggggat tggggggtac agtgcagggg aaagaatagt 1860
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aaattttatc gatcacgaga ctagcctcga gaagcttgat atcgaattcc cacggggttg 1980
gacgcgtagg aacagagaaa caggagaata tgggccaaac aggatatctg tggtaagcag 2040
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cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 6060
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ctttttaaaa gaaaaggggg gactggaagg gctaattcac tcccaacgaa gacaagatct 6600
gctttttgct tgtactgggt ctctctggtt agaccagatc tgagcctggg agctctctgg 6660
ctaactaggg aacccactgc ttaagcctca ataaagcttg ccttgagtgc ttcaagtagt 6720
gtgtgcccgt ctgttgtgtg actctggtaa ctagagatcc ctcagaccct tttagtcagt 6780
gtggaaaatc tctagcagta gtagttcatg tcatcttatt attcagtatt tataacttgc 6840
aaagaaatga atatcagaga gtgagaggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 6900
ataaagcaat agcatcacaa atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg 6960
tggtttgtcc aaactcatca atgtatctta tcatgtctgg ctctagctat cccgccccta 7020
actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca 7080
gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga 7140
ggcctaggct tttgcgtcga gacgtaccca attcgcccta tagtgagtcg tattacgcgc 7200
gctcactggc cgtcgtttta caacgtcgtg actgggaaaa ccctggcgtt acccaactta 7260
atcgccttgc agcacatccc cctttcgcca gctggcgtaa tagcgaagag gcccgcaccg 7320
atcgcccttc ccaacagttg cgcagcctga atggcgaatg gcgcgacgcg ccctgtagcg 7380
gcgcattaag cgcggcgggt gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg 7440
ccctagcgcc cgctcctttc gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc 7500
cccgtcaagc tctaaatcgg gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc 7560
tcgaccccaa aaaacttgat tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga 7620
cggtttttcg ccctttgacg ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa 7680
ctggaacaac actcaaccct atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga 7740
tttcggccta ttggttaaaa aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca 7800
aaatattaac gtttacaatt tcccaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 7860
tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 7920
ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc 7980
ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt 8040
gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct 8100
caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac 8160
ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact 8220
cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa 8280
gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga 8340
taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt 8400
tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga 8460
agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg 8520
caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat 8580
ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat 8640
tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc 8700
agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga 8760
tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc 8820
agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag 8880
gatctaggtg aagatccttt ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc 8940
gttccactga gcgtcagacc ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt 9000
tctgcgcgta atctgctgct tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt 9060
gccggatcaa gagctaccaa ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat 9120
accaaatact gtccttctag tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc 9180
accgcctaca tacctcgctc tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa 9240
gtcgtgtctt accgggttgg actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg 9300
ctgaacgggg ggttcgtgca cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag 9360
atacctacag cgtgagctat gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag 9420
gtatccggta agcggcaggg tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa 9480
cgcctggtat ctttatagtc ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt 9540
gtgatgctcg tcaggggggc ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg 9600
gttcctggcc ttttgctggc cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc 9660
tgtggataac cgtattaccg cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac 9720
cgagcgcagc gagtcagtga gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct 9780
ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc 9840
gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt 9900
acactttatg cttccggctc gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 9960
aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gcgcgcaatt aaccctcact aaagggaaca 10020
aaagctggag ctgca 10035
<210> 31
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多肽
<220>
<221> misc_feature
<223> 接头/间隔区多肽
<400> 31
Pro Ala Ala Leu
1
<210> 32
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 裸露的FRB结构域核酸序列
<400> 32
gagatgtggc atgagggtct ggaagaagcg tctcgactgt actttggtga gcgcaatgtg 60
aagggcatgt ttgaagtcct cgaacccctt catgccatga tggaacgcgg accccagacc 120
ttgaaggaga caagttttaa ccaagcttac ggaagagacc tgatggaagc ccaggaatgg 180
tgcaggaaat acatgaaaag cgggaatgtg aaggacttga cccaagcgtg ggacctgtac 240
tatcatgtct ttaggcgcat tagtaag 267
<210> 33
<211> 353
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> MND启动子
<400> 33
gaacagagaa acaggagaat atgggccaaa caggatatct gtggtaagca gttcctgccc 60
cggctcaggg ccaagaacag ttggaacagc agaatatggg ccaaacagga tatctgtggt 120
aagcagttcc tgccccggct cagggccaag aacagatggt ccccagatgc ggtcccgccc 180
tcagcagttt ctagagaacc atcagatgtt tccagggtgc cccaaggacc tgaaatgacc 240
ctgtgcctta tttgaactaa ccaatcagtt cgcttctcgc ttctgttcgc gcgcttctgc 300
tccccgagct ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagatcgct agc 353
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> DICS HDR FP
<400> 34
cggcgacgtg gaagagaatc 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> DISC HDR RP
<400> 35
ggctgtggtt cagcctgact 20
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> DISC HDR探针（FAM）
<400> 36
aggctctccc cgacctccc 19
<210> 37
<211> 2880
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 3186的编码序列
（信号-FKBP-IL2Rg-P2A-信号-FRB-IL2Rb-P2A-FRB-P2A-GFP-FOXP3
（敲入）
<400> 37
atgccactgg gactgctgtg gcttggactg gcccttcttg gagcactgca tgctcaggct 60
ggcgtgcagg tcgagacaat tagtcctggc gacggccgga cctttcctaa gcgaggacag 120
acatgcgtgg tgcactacac cggcatgctg gaagatggca agaagttcga cagcagccgg 180
gacagaaaca agcctttcaa gttcatgctg ggcaagcaag aagtgatcag aggctgggaa 240
gagggcgtcg cccagatgtc tgttggacag agagccaagc tgacaatcag ccccgattac 300
gcctatggcg ccacaggaca ccctgggatc attcctccac atgccacact ggtgttcgat 360
gtggaactgc tgaagctcgg cgaaggcagc aataccagca aagagaaccc cttcctgttc 420
gccctggaag ccgtggttat cagcgtggga tctatgggcc tgatcatctc cctgctgtgc 480
gtgtacttct ggctggaacg gaccatgcct cggatcccca cactgaagaa tctggaagat 540
ctggtcaccg agtaccacgg caatttcagc gcttggagtg gcgtgtccaa aggcctggct 600
gaaagcctgc agcctgacta ctctgagaga ctgtgcctgg tgtctgagat ccctcctaaa 660
ggcggcgctc tcggagaagg accaggcgct tctccatgca atcagcacag cccttattgg 720
gcccctcctt gctacaccct gaagcctgaa actggaagcg gagctactaa ctttagcctg 780
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tggctctgcc agtgacagct 840
ctgctgcttc ctctggctct gttgctgcat gccgccagac ctattctgtg gcacgagatg 900
tggcatgaag gcctggaaga ggcctccaga ctgtacttcg gcgagagaaa cgtgaagggc 960
atgttcgagg tgctggaacc cctgcatgcc atgatggaaa gaggccctca gacactgaaa 1020
gagacaagct tcaaccaggc ctacggccgg gatctgatgg aagcccaaga gtggtgccgg 1080
aagtacatga agtccggcaa tgtgaaggac ctcctgcagg catgggacct gtactaccac 1140
gtgttccggc ggatctctaa gggcaaagac acaatccctt ggctgggcca tctgctcgtt 1200
ggactgtctg gcgccttcgg cttcatcatc ctggtgtacc tgctgatcaa ctgtcggaac 1260
acaggcccat ggctgaagaa agtgctgaag tgcaacaccc ctgatccgag caagttcttt 1320
agccagctgt ccagcgagca cggcggagat gttcagaagt ggctgagcag cccatttcct 1380
agcagcagct ttagccctgg cggactggct cctgagatca gcccactgga agtgctggaa 1440
agggacaaag tgacccagct gctcctgcaa caggacaagg tgccagaacc tgccagcctg 1500
tctctgaaca ccgatgccta tctgtccctg caagagctgc aaggatccgg cgccaccaac 1560
tttagtctgc tcaagcaagc cggggacgtc gaggaaaatc ctgggccaga aatgtggcac 1620
gaaggactcg aggaagccag tcggctgtat tttggcgagc ggaatgtgaa agggatgttt 1680
gaagtgctcg agcctctcca cgctatgatg gaacggggac cccagactct caaagaaacc 1740
agctttaatc aggcttacgg acgcgacctc atggaagctc aagaatggtg tagaaagtat 1800
atgaagagtg gcaacgtgaa agatctgctg caagcctggg atctctatta tcacgtgttc 1860
agacgcatca gcaaaggcag cggcgccaca aatttctccc tgctgaaaca ggccggcgac 1920
gtggaagaga atcccggacc tatgcctaat cctcggcctt ccaaaggcga ggaactgttt 1980
acaggcgtgg tgcccatcct ggtggaactg gacggggatg tgaacggcca caagtttagc 2040
gttagcggcg aaggcgaagg ggatgccaca tacggaaagc tgaccctgaa gttcatctgc 2100
accaccggca agctgcctgt gccttggcct acactggtca ccacactgac atacggcgtg 2160
cagtgcttca gcagataccc cgaccatatg aagcagcacg acttcttcaa gagcgccatg 2220
cctgagggct acgtgcaaga gcggaccatc ttctttaagg acgacggcaa ctacaagacc 2280
agggccgaag tgaagttcga gggcgacacc ctggtcaacc ggatcgagct gaagggcatc 2340
gacttcaaag aggacggcaa catcctgggc cacaagctcg agtacaacta caacagccac 2400
aacgtgtaca tcatggccga caagcagaaa aacggcatca aagtgaactt caagatccgg 2460
cacaacatcg aggacggctc tgtgcagctg gccgatcact accagcagaa cacacccatc 2520
ggagatggcc ctgtgctgct gcccgataac cactacctga gcacacagag cgccctgagc 2580
aaggacccca acgagaagag ggatcacatg gtgctgctgg aattcgtgac cgccgctggc 2640
atcacactcg gcatggatga gctgtacaag atgcccaatc ctagacctgg caagcccagc 2700
gctccttctc ttgctcttgg accttctcct ggtgcctcgc ccagctggag ggctgcaccc 2760
aaagcctcag acctgctggg ggcccggggc ccagggggaa ccttccaggg ccgagatctt 2820
cgaggcgggg cccatgcctc ctcttcttcc ttgaacccca tgccaccatc gcagctgcag 2880
<210> 38
<211> 2742
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 3187的编码序列
（信号-FKBP-IL2Rg-P2A-信号-FRB-IL2Rb-P2A-FRB-P2A-HA-FOXP3
（敲入）
<400> 38
atgccactgg gactgctgtg gcttggactg gcccttcttg gagcactgca tgctcaggct 60
ggcgtgcagg tcgagacaat tagtcctggc gacggccgga cctttcctaa gcgaggacag 120
acatgcgtgg tgcactacac cggcatgctg gaagatggca agaagttcga cagcagccgg 180
gacagaaaca agcctttcaa gttcatgctg ggcaagcaag aagtgatcag aggctgggaa 240
gagggcgtcg cccagatgtc tgttggacag agagccaagc tgacaatcag ccccgattac 300
gcctatggcg ccacaggaca ccctgggatc attcctccac atgccacact ggtgttcgat 360
gtggaactgc tgaagctcgg cgaaggcagc aataccagca aagagaaccc cttcctgttc 420
gccctggaag ccgtggttat cagcgtggga tctatgggcc tgatcatctc cctgctgtgc 480
gtgtacttct ggctggaacg gaccatgcct cggatcccca cactgaagaa tctggaagat 540
ctggtcaccg agtaccacgg caatttcagc gcttggagtg gcgtgtccaa aggcctggct 600
gaaagcctgc agcctgacta ctctgagaga ctgtgcctgg tgtctgagat ccctcctaaa 660
ggcggcgctc tcggagaagg accaggcgct tctccatgca atcagcacag cccttattgg 720
gcccctcctt gctacaccct gaagcctgaa actggaagcg gagctactaa ctttagcctg 780
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tggctctgcc agtgacagct 840
ctgctgcttc ctctggctct gttgctgcat gccgccagac ctattctgtg gcacgagatg 900
tggcatgaag gcctggaaga ggcctccaga ctgtacttcg gcgagagaaa cgtgaagggc 960
atgttcgagg tgctggaacc cctgcatgcc atgatggaaa gaggccctca gacactgaaa 1020
gagacaagct tcaaccaggc ctacggccgg gatctgatgg aagcccaaga gtggtgccgg 1080
aagtacatga agtccggcaa tgtgaaggac ctcctgcagg catgggacct gtactaccac 1140
gtgttccggc ggatctctaa gggcaaagac acaatccctt ggctgggcca tctgctcgtt 1200
ggactgtctg gcgccttcgg cttcatcatc ctggtgtacc tgctgatcaa ctgtcggaac 1260
acaggcccat ggctgaagaa agtgctgaag tgcaacaccc ctgatccgag caagttcttt 1320
agccagctgt ccagcgagca cggcggagat gttcagaagt ggctgagcag cccatttcct 1380
agcagcagct ttagccctgg cggactggct cctgagatca gcccactgga agtgctggaa 1440
agggacaaag tgacccagct gctcctgcaa caggacaagg tgccagaacc tgccagcctg 1500
tctagcaatc acagcctgac cagctgcttt accaaccagg gctacttctt cttccatctg 1560
cctgacgctc tggaaatcga ggcctgccag gtgtacttca cctacgatcc ctacagcgaa 1620
gaggaccccg atgaaggtgt tgccggtgct cctaccggaa gctctcctca acctctgcaa 1680
ccactgagcg gcgaggatga cgcctactgc acattcccca gcagagatga cctgctgctg 1740
ttcagccctt ctctgctcgg cggaccttct ccaccatcta cagctccagg tggaagcgga 1800
gccggcgagg aaagaatgcc tccaagcctg caagagcggg tgcccagaga ttgggatcct 1860
caaccactgg gccctccaac acctggcgtg ccagatctcg tggatttcca gcctcctcca 1920
gagctggtgc tgagagaagc tggcgaagaa gtgccagacg ctggccctag agagggcgtt 1980
agctttcctt ggagcagacc tcctggacag ggcgagttca gagccctgaa tgctagactg 2040
cccctgaaca ccgatgccta tctgtccctg caagagctgc aaggacaaga ccccacacac 2100
ctggttggat ccggcgccac caactttagt ctgctcaagc aagccgggga cgtcgaggaa 2160
aatcctgggc cagaaatgtg gcacgaagga ctcgaggaag ccagtcggct gtattttggc 2220
gagcggaatg tgaaagggat gtttgaagtg ctcgagcctc tccacgctat gatggaacgg 2280
ggaccccaga ctctcaaaga aaccagcttt aatcaggctt acggacgcga cctcatggaa 2340
gctcaagaat ggtgtagaaa gtatatgaag agtggcaacg tgaaagatct gctgcaagcc 2400
tgggatctct attatcacgt gttcagacgc atcagcaaag gcagcggcgc cacaaatttc 2460
tccctgctga aacaggccgg cgacgtggaa gagaatcccg gacctatgta tccatacgat 2520
gtcccagatt atgcgcccaa tcctagacct ggcaagccca gcgctccttc tcttgctctt 2580
ggaccttctc ctggtgcctc gcccagctgg agggctgcac ccaaagcctc agacctgctg 2640
ggggcccggg gcccaggggg aaccttccag ggccgagatc ttcgaggcgg ggcccatgcc 2700
tcctcttctt ccttgaaccc catgccacca tcgcagctgc ag 2742
<210> 39
<211> 2715
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 3195的编码序列
（信号-FKBP-IL2Rg-P2A-信号-FRB-IL2Rb-P2A-FRB-P2A-FOXP3
（敲入）
<400> 39
atgccactgg gactgctgtg gcttggactg gcccttcttg gagcactgca tgctcaggct 60
ggcgtgcagg tcgagacaat tagtcctggc gacggccgga cctttcctaa gcgaggacag 120
acatgcgtgg tgcactacac cggcatgctg gaagatggca agaagttcga cagcagccgg 180
gacagaaaca agcctttcaa gttcatgctg ggcaagcaag aagtgatcag aggctgggaa 240
gagggcgtcg cccagatgtc tgttggacag agagccaagc tgacaatcag ccccgattac 300
gcctatggcg ccacaggaca ccctgggatc attcctccac atgccacact ggtgttcgat 360
gtggaactgc tgaagctcgg cgaaggcagc aataccagca aagagaaccc cttcctgttc 420
gccctggaag ccgtggttat cagcgtggga tctatgggcc tgatcatctc cctgctgtgc 480
gtgtacttct ggctggaacg gaccatgcct cggatcccca cactgaagaa tctggaagat 540
ctggtcaccg agtaccacgg caatttcagc gcttggagtg gcgtgtccaa aggcctggct 600
gaaagcctgc agcctgacta ctctgagaga ctgtgcctgg tgtctgagat ccctcctaaa 660
ggcggcgctc tcggagaagg accaggcgct tctccatgca atcagcacag cccttattgg 720
gcccctcctt gctacaccct gaagcctgaa actggaagcg gagctactaa ctttagcctg 780
ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tggctctgcc agtgacagct 840
ctgctgcttc ctctggctct gttgctgcat gccgccagac ctattctgtg gcacgagatg 900
tggcatgaag gcctggaaga ggcctccaga ctgtacttcg gcgagagaaa cgtgaagggc 960
atgttcgagg tgctggaacc cctgcatgcc atgatggaaa gaggccctca gacactgaaa 1020
gagacaagct tcaaccaggc ctacggccgg gatctgatgg aagcccaaga gtggtgccgg 1080
aagtacatga agtccggcaa tgtgaaggac ctcctgcagg catgggacct gtactaccac 1140
gtgttccggc ggatctctaa gggcaaagac acaatccctt ggctgggcca tctgctcgtt 1200
ggactgtctg gcgccttcgg cttcatcatc ctggtgtacc tgctgatcaa ctgtcggaac 1260
acaggcccat ggctgaagaa agtgctgaag tgcaacaccc ctgatccgag caagttcttt 1320
agccagctgt ccagcgagca cggcggagat gttcagaagt ggctgagcag cccatttcct 1380
agcagcagct ttagccctgg cggactggct cctgagatca gcccactgga agtgctggaa 1440
agggacaaag tgacccagct gctcctgcaa caggacaagg tgccagaacc tgccagcctg 1500
tctagcaatc acagcctgac cagctgcttt accaaccagg gctacttctt cttccatctg 1560
cctgacgctc tggaaatcga ggcctgccag gtgtacttca cctacgatcc ctacagcgaa 1620
gaggaccccg atgaaggtgt tgccggtgct cctaccggaa gctctcctca acctctgcaa 1680
ccactgagcg gcgaggatga cgcctactgc acattcccca gcagagatga cctgctgctg 1740
ttcagccctt ctctgctcgg cggaccttct ccaccatcta cagctccagg tggaagcgga 1800
gccggcgagg aaagaatgcc tccaagcctg caagagcggg tgcccagaga ttgggatcct 1860
caaccactgg gccctccaac acctggcgtg ccagatctcg tggatttcca gcctcctcca 1920
gagctggtgc tgagagaagc tggcgaagaa gtgccagacg ctggccctag agagggcgtt 1980
agctttcctt ggagcagacc tcctggacag ggcgagttca gagccctgaa tgctagactg 2040
cccctgaaca ccgatgccta tctgtccctg caagagctgc aaggacaaga ccccacacac 2100
ctggttggat ccggcgccac caactttagt ctgctcaagc aagccgggga cgtcgaggaa 2160
aatcctgggc cagaaatgtg gcacgaagga ctcgaggaag ccagtcggct gtattttggc 2220
gagcggaatg tgaaagggat gtttgaagtg ctcgagcctc tccacgctat gatggaacgg 2280
ggaccccaga ctctcaaaga aaccagcttt aatcaggctt acggacgcga cctcatggaa 2340
gctcaagaat ggtgtagaaa gtatatgaag agtggcaacg tgaaagatct gctgcaagcc 2400
tgggatctct attatcacgt gttcagacgc atcagcaaag gcagcggcgc cacaaatttc 2460
tccctgctga aacaggccgg cgacgtggaa gagaatcccg gacctatgcc caatcctaga 2520
cctggcaagc ccagcgctcc ttctcttgct cttggacctt ctcctggtgc ctcgcccagc 2580
tggagggctg cacccaaagc ctcagacctg ctgggggccc ggggcccagg gggaaccttc 2640
cagggccgag atcttcgagg cggggcccat gcctcctctt cttccttgaa ccccatgcca 2700
ccatcgcagc tgcag 2715
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人FOXP3的T1间隔区
<400> 40
ttccagggcc gagatcttcg 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人FOXP3的T3间隔区
<400> 41
cgcctcgaag atctcggccc 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人FOXP3的T4间隔区
<400> 42
tcgaagatct cggccctgga 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人FOXP3的T7间隔区
<400> 43
ggccctggaa ggttccccct 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人FOXP3的T9间隔区
<400> 44
tccagctggg cgaggctcct 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人FOXP3的T18间隔区
<400> 45
tcagacctgc tgggggcccg 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人FOXP3的R1间隔区
<400> 46
gagccccgcc tcgaagatct 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人AAVS1的P1间隔区
<400> 47
attcccaggg ccggttaatg 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人AAVS1的P3间隔区
<400> 48
gtcccctcca ccccacagtg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人AAVS1的P4间隔区
<400> 49
accccacagt ggggccacta 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人AAVS1的N1间隔区
<400> 50
cctctaaggt ttgcttacga 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人AAVS1的N2间隔区
<400> 51
tataaggtgg tcccagctcg 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向人AAVS1的N3间隔区
<400> 52
ccatcgtaag caaaccttag 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向鼠类FOXP3的mT20间隔区
<400> 53
gactcctggg gatgggccaa 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向鼠类FOXP3的mT22间隔区
<400> 54
ttggcccttg gcccatcccc 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 靶向鼠类FOXP3的mT23间隔区
<400> 55
ccagcttggc aagactcctg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 人TRAC间隔区序列G2
<400> 56
acaaaactgt gctagacatg 20
<210> 57
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 人TRAC间隔区序列G4
<400> 57
tcaagagcaa cagtgctg 18
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<223> 间隔区序列
<400> 58
ccgatgccca accccaggcc 20

Claims (51)

1.一种系统，所述系统包括：
脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；
向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸，所述向导RNA包含与细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及
包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，
其中，所述DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过所述DNA核酸内切酶与所述gRNA的关联而形成的复合物能够促进所述供体盒靶向整合入细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达所述裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。
2.如权利要求1所述的系统，其中，所述DNA核酸内切酶是Cas9核酸内切酶。
3.如权利要求1-2中任一项所述的系统，其中，
将所述编码DNA核酸内切酶的核酸进行密码子优化以用于在所述经遗传修饰的细胞中表达；
将所述编码gRNA的核酸进行密码子优化以用于在所述经遗传修饰的细胞中表达；和/或
将所述供体盒中的一个或多个编码序列进行密码子优化以用于在所述经遗传修饰的细胞中表达。
4.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述供体模板被配置以使得所述供体盒能够通过同源介导修复(HDR)整合入所述靶基因组基因座中。
5.如权利要求1-3中任一项所述的系统，其中，所述供体模板被配置以使得所述供体盒能够通过非同源末端连接(NHEJ)整合入所述靶基因组基因座中。
6.如权利要求1-5中任一项所述的系统，其中，将所述DNA核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸配制在脂质体或脂质纳米颗粒中。
7.如权利要求6所述的系统，其中，所述脂质体或脂质纳米颗粒进一步包含所述gRNA或编码所述gRNA的核酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的系统，所述系统包含与核糖核蛋白(RNP)复合物中的gRNA相关联的DNA核酸内切酶。
9.如权利要求1-8中任一项所述的系统，其中，所述裸露的FRB多肽包含SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
10.如权利要求1-9中任一项所述的系统，其中，所述供体盒进一步包含编码二聚化可激活化学诱导的信号传导复合物(CISC)的多肽组分的一个或多个核酸序列，其中，所述CISC的多肽组分包括：
i)第一CISC组分，所述第一CISC组分包括第一细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；以及
ii)第二CISC组分，所述第二CISC组分包括第二细胞外结合结构域或其功能衍生物、铰链结构域、跨膜结构域、以及信号传导结构域或其功能衍生物；
其中，所述第一CISC组分和所述第二CISC组分被配置以使得当在细胞中表达时，它们能够在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的存在下二聚化，以产生具有信号传导能力的CISC。
11.如权利要求10所述的系统，其中，所述第一细胞外结合结构域或第二细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FK506结合蛋白(FKBP)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的细胞外结合结构域或其功能衍生物包括FRB结构域或其功能衍生物。
12.如权利要求10-11中任一项所述的系统，其中，所述第一CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域，和/或所述第二CISC组分的跨膜结构域包括IL-2受体跨膜结构域。
13.如权利要求10-12中任一项所述的系统，其中，所述第一CISC组分或第二CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体γ亚基(IL2Rγ)结构域或其功能衍生物，和/或另一所述的CISC组分的信号传导结构域或其功能衍生物包括IL-2受体β亚基(IL2Rβ)结构域或其功能衍生物。
14.如权利要求13所述的系统，其中，所述IL2Rβ结构域多肽被截短。
15.如权利要求13所述的系统，其中，编码所述IL2Rβ结构域的核酸包含SEQ ID NO：4的核苷酸序列。
16.如权利要求13所述的系统，其中，所述IL2Rβ结构域包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
17.如权利要求10-16中任一项所述的系统，其中，所述雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903和AP23573以及它们的代谢物和衍生物。
18.如权利要求10-17中任一项所述的系统，其中，编码所述裸露的FRB结构域的核酸在编码所述CISC的多肽组分的所述一个或多个核酸序列的下游。
19.如权利要求1-18中任一项所述的系统，其中，所述供体盒进一步包含编码如下之间的自切割多肽的核酸序列：(i)编码所述CISC的多肽组分的所述一个或多个核酸序列中的每一个；和/或(ii)编码所述裸露的FRB结构域的核酸和编码所述CISC的多肽组分的相邻核酸序列。
20.如权利要求19所述的系统，其中，在所述供体盒中编码的所述自切割多肽的每一个独立地选自于由P2A、T2A、E2A和F2A所组成的组。
21.如权利要求1-20中任一项所述的系统，其中，所述供体盒进一步包括可操作地连接至所述供体盒中的一个或多个编码序列的启动子。
22.如权利要求21所述的系统，其中，所述启动子是诱导型启动子或组成型启动子。
23.如权利要求21或22所述的系统，其中，所述启动子是MND启动子。
24.如权利要求1-23中任一项所述的系统，其中，所述供体盒进一步包括编码可检测标志物的核酸。
25.如权利要求24所述的系统，其中，所述可检测标志物是绿色荧光蛋白(GFP)多肽、mCherry多肽或低亲和力神经生长因子受体(LNGFR)。
26.如权利要求1-25中任一项所述的系统，其中，编码所述裸露的FRB结构域多肽的核酸缺少编码内质网定位信号多肽的核酸。
27.如权利要求1-26中任一项所述的系统，其中，所述供体盒包括来自SEQ ID NO：3的核苷酸序列的核酸序列。
28.如权利要求1-27中任一项所述的系统，其中，所述供体模板是病毒载体。
29.如权利要求28所述的系统，其中，所述病毒载体是慢病毒载体、腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。
30.一种编辑细胞基因组的方法，所述方法包括向所述细胞提供：
脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶或编码所述DNA核酸内切酶的核酸；
向导RNA(gRNA)或编码所述gRNA的核酸，所述向导RNA包含与所述细胞中的靶基因组基因座内的靶序列互补的间隔区序列；以及
包含供体盒的供体模板，所述供体盒包含编码裸露的FKBP-雷帕霉素结合(FRB)结构域多肽的核酸序列，
其中，所述DNA核酸内切酶、gRNA和供体模板被配置以使得通过所述DNA核酸内切酶与所述gRNA的关联而形成的复合物能够促进所述供体盒靶向整合入所述细胞中的靶基因组基因座，以产生能够表达所述裸露的FRB结构域多肽的经遗传修饰的细胞。
31.根据如权利要求30所述的方法制备的经遗传修饰的细胞。
32.如权利要求31所述的细胞，其中，所述供体盒被配置以使得裸露的FRB结构域多肽在细胞内表达。
33.如权利要求31-32中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是真核细胞。
34.如权利要求33所述的细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
35.如权利要求34所述的细胞，其中，所述细胞是造血干细胞。
36.如权利要求35所述的细胞，其中，所述细胞是淋巴细胞。
37.如权利要求36所述的细胞，其中，所述细胞是前体T细胞或调节性T(Treg)细胞。
38.如权利要求36-37中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是CD34+、CD8+或CD4+细胞。
39.如权利要求38所述的细胞，其中，所述细胞是选自于由如下所组成的组中的CD8+T细胞毒性淋巴细胞：幼稚CD8+T细胞、中央记忆CD8+T细胞、效应记忆CD8+T细胞和本体CD8+T细胞。
40.如权利要求38所述的细胞，其中，所述细胞是选自于由如下所组成的组中的CD4+T辅助淋巴细胞：幼稚CD4+T细胞、中央记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞和本体CD4+T细胞。
41.如权利要求31-40中任一项所述的细胞，其中，与所述供体盒缺少编码裸露的FRB结构域多肽的核酸的相应细胞相比，在存在雷帕霉素或雷帕霉素类似物的情况下，所述细胞更大程度地增殖。
42.如权利要求41所述的细胞，其中，雷帕霉素或雷帕霉素类似物以从0.1nM或从约0.1nM至100nM或至约100nM的浓度存在。
43.一种激活如权利要求31-42中任一项所述的经遗传修饰的细胞的方法，所述方法包括使所述细胞与雷帕霉素或雷帕霉素类似物接触。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573，或它们中任一种的代谢物、衍生物和/或组合。
45.如权利要求43-44中任一项所述的方法，其中，与所述细胞接触的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的浓度为从0.1nM或从约0.1nM至100nM或至约100nM。
46.如权利要求43-45中任一项所述的方法，其中，在与雷帕霉素或雷帕霉素类似物接触后，选择性地扩增表达CISC组分的细胞。
47.一种选择性地扩增包含在混合细胞群中的如权利要求31-42中任一项所述的经遗传修饰的细胞的群的方法，所述方法包括使所述混合细胞群与雷帕霉素或雷帕霉素类似物接触，其中，表达所述CISC组分和裸露的FRB结构域的经遗传修饰的细胞被激活并在体外或在体内以比混合细胞群中的其它细胞更高的程度扩增。
48.如权利要求47所述的方法，其中，所述雷帕霉素类似物选自于由如下所组成的组：依维莫司、CCI-779、C20-甲代烯丙基雷帕霉素、C16-(S)-3-甲基吲哚雷帕霉素、C16-iRap、AP21967、霉酚酸钠、盐酸贝尼地平、AP1903或AP23573，或它们中任一种的代谢物、衍生物和/或组合。
49.如权利要求47-48中任一项所述的方法，其中，与所述混合细胞群接触的雷帕霉素或雷帕霉素类似物的浓度为从0.1nM或从约0.1nM至100nM或至约100nM。
50.用于抑制或治疗疾病或病症的如权利要求31-42中任一项所述的经遗传修饰的淋巴细胞，所述疾病或病症例如自身免疫性疾病(例如IPEX综合征)或由器官移植引起的紊乱(例如GVHD)。
51.作为药物的如权利要求31-42中任一项所述的经遗传修饰的淋巴细胞。
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