CN112023035A

CN112023035A - 一种以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗及其制备

Info

Publication number: CN112023035A
Application number: CN202010783722.4A
Authority: CN
Inventors: 刘龙丁; 李恒; 郭磊; 郑惠文; 梁燕; 杨泽宁; 陈燕丽; 和占龙; 施海晶; 李菁
Original assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Current assignee: Institute of Medical Biology of CAMS and PUMC
Priority date: 2020-04-07
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明公开了一种以SARS‑CoV‑2病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗及其制备。将带有SARS‑CoV‑2病毒S蛋白RBD区基因序列的表达载体转染进293T、293i、CHO细胞系中进行抗体表达，再经蛋白提取、超滤富集、抗体亲和层析纯化、纯化后蛋白收集、PBS透析和氢氧化铝佐剂混合孵育后得到所需疫苗。该疫苗是一种表达SARS‑CoV‑2病毒S蛋白RBD区氨基酸序列的蛋白，在细胞内24个单体能自组装成球体结构，并且融合表达的SARS‑CoV‑2病毒S蛋白RBD肽段展示在球体表面。疫苗对SARS‑CoV‑2病毒具有良好的中和活性，可以有效抑制病毒对vero细胞的感染。攻毒实验表明其能够明显有效保护SARS‑CoV‑2对恒河猴的感染及损伤，为当前新冠疫情防控提供了一种优良的候选疫苗。

Description

一种以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗及其制备

技术领域

本发明属于冠状病毒疫苗制备技术领域，具体是涉及一种特别针对 SARS-CoV-2病毒具备良好中和活性的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。同时，本发明还涉及所述纳米自组装颗粒蛋白疫苗的制备方法。

背景技术

近年来，疫苗制备技术不断发展，新近出现的纳米自组装颗粒疫苗具有以下优势：制备快速、纯化工艺简便、易放大、多个抗原单体聚合展示使抗原性较高、通过人源细胞发酵生产安全性较高。例如将流感病毒保守抗原位点展示在纳米自组装颗粒表面、以增强疫苗抗原性和安全性的技术，已经广泛应用于通用流感疫苗的研发。

SARS-CoV-2病毒(Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2)属于冠状病毒科，β冠状病毒属的Sarbecovirus亚型。该病毒引起新型冠状病毒感染肺炎(COVID-19)。SARS-CoV-2病毒的潜伏期比SARS-CoV病毒潜伏期长，传染性比SARS-CoV病毒强，虽然致死率比SARS-CoV病毒弱，但也会引发病人尤其是慢性病患者危重致死。目前，专门的治疗药物仍处于临床实验阶段，而预防性疫苗尚处于临床研发阶段，并且常规的SARS-CoV-2病毒灭活疫苗制备技术要求病毒操作必须在生物安全级别达到三级以上条件的实验室进行。

虽然，纳米自组装颗粒疫苗技术有望为SARS-CoV-2病毒的预防和治疗提供新的突破口，但现有技术中尚未见有相关报道。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术的不足，特别是为应对COVID-19疫情防控的严峻形势，提供一种能够快速制备的、以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区为抗原的、对SARS-CoV-2病毒具备良好中和活性的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。

本发明的目的还在于提供一种制备所述纳米自组装颗粒蛋白疫苗的方法。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现。

一种以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗，其特征在于：该疫苗是一种表达SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区氨基酸序列的蛋白，其单体氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，在细胞内24个单体能自组装成球体结构，并且融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD肽段展示在球体表面。

制备所述纳米疫苗的方法，具体包括以下步骤：

(1)将带有SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区基因序列的表达载体转染进293T、293i、CHO细胞系中进行抗体表达，所述的SARS-CoV-2病毒 S蛋白RBD区基因序列如序列表SEQ IDNO.2所示；其中，293T细胞表达体系使用无血清培养基，转染试剂为FuGENE HDTransfection(Promega)； 293i和CHO细胞表达体系为悬浮表达系统，使用无血清培养基，转染试剂为PEI25000；其余操作按照293T、293i和CHO细胞表达体系的常规操作方法进行；

(2)使用非变性提取方法包括研磨、冻融和超声方法提取细胞中蛋白；培养基直接超滤富集；

(3)Ni-NTA柱进行抗体的亲和层析纯化，并收集纯化后的蛋白；其中，洗脱时使用梯度洗脱方法，基础缓冲液组成为50mM磷酸二氢钠， 300mM氯化钠，0.05％吐温20和5％甘油，pH 7.5；洗脱缓冲液由基础缓冲液加入不同浓度的咪唑配制；梯度洗脱方法为使用10mM，20mM和40 mM咪唑的洗脱缓冲液依次洗脱至无蛋白流出，然后依次使用200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，并收集200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液，富集收集的200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液；

(4)纯化后的蛋白使用pH 7.5的2mM PBS进行过夜透析，透析后蛋白检测浓度备用；

(5)将目的蛋白总量与终浓度为1mg/ml的氢氧化铝佐剂混合孵育2 h以上，形成稳定的混合物即为所需的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。

为鉴定所述纳米自组装颗粒蛋白疫苗的生物学功能，本发明将制备的纳米自组装颗粒蛋白疫苗免疫小鼠和恒河猴，采集免疫血清进行SARS- CoV-2病毒中和实验，并进行恒河猴攻毒保护性实验。其中小鼠免疫剂量为滴鼻每只2ug，皮下注射每只6ug，恒河猴免疫剂量为滴鼻或肌肉注射每只20ug。实验表明，本发明的纳米自组装颗粒蛋白疫苗产生的中和抗体可以有效抑制SARS-CoV-2病毒对vero细胞的感染，并且恒河猴攻毒保护性实验表明，本发明的纳米自组装颗粒蛋白疫苗能够明显有效地保护 SARS-CoV-2对恒河猴的感染损伤。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明首次运用纳米自组装颗粒技术制备抗SARS-CoV-2病毒疫苗，所得疫苗对SARS-CoV-2病毒具有良好的中和活性，产生的中和抗体可以有效抑制SARS-CoV-2病毒对vero细胞的感染，并且恒河猴攻毒保护性实验表明，本发明的纳米自组装颗粒蛋白疫苗能够明显有效地保护SARS- CoV-2对恒河猴的感染损伤，为当前新冠疫情防控提供了一种优良的候选疫苗。

2、纳米自组装颗粒技术能够快速制备应急疫苗，抗原位点多并且展示于纳米颗粒表面，有利于产生良好抗原性。

3、本发明的疫苗制备过程只需在普通实验室即可完成，安全性高，并且利于工艺扩大。

附图说明

图1：使用his和SARS Spike蛋白抗体western blot检测293T体系细胞、 293i体系培养上清、CHO体系培养上清中RBD融合表达ferritin。

图2：293T中使用his和SARS spike蛋白抗体激光共聚焦检测RBD融合表达ferritin。

图3：蛋白纯化后使用SARS Spike S1蛋白抗体变性条件下western blot 检测293T体系细胞、293i体系培养上清、CHO体系培养上清中RBD融合表达ferritin。

图4：蛋白纯化后使用SARS Spike S1蛋白抗体非变性条件下western blot检测293T体系细胞、293i体系培养上清、CHO体系培养上清中RBD 融合表达ferritin。

图5：蛋白纯化后使用非变性条件下PAGE-考马斯亮蓝染色检测293T 体系细胞、293i体系培养上清、CHO体系培养上清中RBD融合表达 ferritin。

图6：蛋白纯化后投射电子显微镜观察293T体系细胞、293i体系培养上清、CHO体系培养上清中RBD融合表达ferritin纳米颗粒。

图7：BALB/C小鼠、C57小鼠、恒河猴免疫后血清中抗体检测RBD 融合表达ferritin。

图8：小鼠皮下注射和滴鼻免疫后血清中和SARS-CoV-2病毒实验。

图9：恒河猴肌肉注射和滴鼻免疫后血清中和SARS-CoV-2病毒实验。

图10：SARS-CoV-2感染恒河猴后鼻和咽排毒病毒载量检测。

图11：SARS-CoV-2感染恒河猴肺HE染色观察病理损伤。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，但附图和实施例并不是对本发明技术方案的限定，所有基于本发明教导所作出的变化和等同替换均应属于本发明的保护范围。

实施例1：制备本发明的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。

细胞转染质粒制备

1)将SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区基因序列(如序列表SEQ ID NO.2所示)根据人源表达系统密码子优化并进行全基因合成，构建到 pc3.1+载体骨架上。

2)构建质粒经测序验证表达框正确，建立目的质粒大肠杆菌种子库。

3)使用去内毒素大提质粒试剂盒提取SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD 区表达质粒。

不同细胞系蛋白表达条件

1、293T细胞系统的蛋白表达

将SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区表达质粒瞬时转染293T细胞：

1)使用10cm培养板进行转染实验，待293T细胞密度达到70-90％时，开始进行转染；

2)转染前弃掉原有培养基，加入8ml 2％胎牛血清的新培养基；

3)配制转染试剂混悬液，每板加入20ug目的质粒，按照每0.8ug质粒使用50ul的比例将质粒加入无血清培养基中，配成A液；每板加入60 ul转染试剂，按照每2ul质粒使用50ul的比例将转染试剂加入无血清培养基中，配成B液；

4)配制好的A液和B液放置5分钟后加到一起混匀，室温放置20分钟以上缓慢加入到细胞培养板中；

5)将培养板十字混匀法混匀，并于37℃5％CO₂培养，48小时后收获细胞。细胞培养48h使用激光共聚焦显微镜观察蛋白表达情况(图2所示)。

6)将收获细胞使用PBS清洗，3000rpm离心5min，洗涤两次。弃 PBS，加入RIPA，冰浴30min，12000rpm离心30min，收获上清。将收获的上清进行Western-Blot检测(图1所示)，结果表明293T细胞表达体系可以表达出目的蛋白。

2、293i细胞系统的蛋白大量表达

1)将带有目的基因大肠杆菌甘油菌，摇菌，用无内毒素质粒大提试剂盒进行大提，将大提的质粒过0.22μm滤器进行过滤；质粒浓度最好保证在 1mg/ml，质粒浓度偏低时，需进行浓缩。

2)转染前一天，将准备转染的细胞从培养箱中取出进行计数，粗略计算细胞的密度以及活率。

3)收集细胞并替换新鲜的培养基，转移至1L培养瓶中，终体积为 360mL，置37℃、8％CO₂、125r/min培养箱中培养16h。

4)转染前进行细胞计数，转染细胞密度为每250ml体系中含有5×10⁸个细胞。将5×10⁸个细胞用预热的30mL RPMI 1640培养基轻柔重悬细胞，重悬的细胞转移到250mL培养瓶中。

5)将500μg质粒加入到28mL的RPMI 1640培养基中，振荡混匀，加入1.5mL的PEI至每管，立即涡旋震荡20s，转染混合液室温孵育20min。并将转染混合液缓慢加入到细胞中，并置于37℃、8％CO₂、125r/min培养箱中培养。

6)4-6小时后，将转染的细胞转移至1L培养瓶中，添加培养基至 250mL；然后将细胞置于37℃、8％CO₂、125r/min培养箱中培养5天。

7)收获上清，并使用10kD超滤管进行蛋白浓缩。将收获的上清进行Western-Blot检测(图1所示)，结果表明293i细胞表达体系可以表达出目的蛋白。

3、使用CHO细胞进行蛋白的大量表达

1)将带有目的基因大肠杆菌甘油菌，摇菌，用无内毒素质粒大提试剂盒进行大提，将大提的质粒过0.22μm滤器进行过滤；质粒浓度最好保证在 1mg/ml，质粒浓度偏低时，需进行进行浓缩。

2)将质粒、Opti-MEM溶液、FreeStyle^TM CHO细胞培养基从冰箱中取出，恢复至室温。在FreeStyle^TM CHO细胞培养基中按照体积比1/100加入谷氨酰胺(终浓度为8mM)，补加双抗；

3)在转染前，保证CHO悬浮细胞的密度为1.2×10⁶-1.5×10⁶个/mL，为了保证高的转染效率，活细胞比例应大于95％。

4)在使用FreeStyle^TM MAX转染试剂之前，将溶液轻微混匀几次，不要振荡混匀；

5)将37.5μg质粒DNA加入至Opti-MEM溶液中，使得总体积为 0.6ml，混匀；将37.5μl FreeStyle^TM MAX Transfection Reagent加入至Opti- MEM溶液中，使得总体为0.6ml；

6)立即将稀释好的FreeStyle^TM MAX转染试剂稀释液加入至稀释好的 DNA溶液中，使得总体积为1.2ml，轻轻混匀；

7)将DNA-FreeStyle^TM MAX混合溶液室温放置10分钟，使得DNA- FreeStyleTM MAX复合物形成；将1.2ml DNA-FreeStyle^TM MAX复合物加入至125-ml的悬浮细胞培养瓶中；将转染后的细胞在37℃，CO2温箱中培养，在振荡摇床中培养，培养6-7天；

8)收获上清，并使用10kD超滤管进行蛋白浓缩。将收获的上清进行 Western-Blot检测(图1所示)，结果表明CHO细胞表达体系可以表达出目的蛋白。

蛋白纯化

纯化洗脱时使用梯度洗脱方法，基础缓冲液组成为50mM磷酸二氢钠， 300mM氯化钠，0.05％吐温20和5％甘油，pH 7.5；洗脱缓冲液由基础缓冲液加入不同浓度的咪唑配制。

1)将Ni-NTA Agarose beads以及所有溶液平衡至室温；

2)将非变性提取蛋白使用DNAse I消化30分钟，然后加入1M咪唑使终浓度在10mM，使用0.22um滤器将蛋白液过滤到beads中，并室温颠倒混匀2小时；

3)将蛋白-beads砂浆加入层析柱中，依次使用10mM、20mM、40mM 咪唑的洗脱缓冲液清洗柱子。

4)使用分光光度计检测流出洗脱液和40mM咪唑洗脱缓冲液的蛋白浓度，当柱子流出洗脱液的蛋白浓度小于等于40mM咪唑洗脱缓冲液的蛋白浓度，加入200mM、300mM咪唑洗脱缓冲液梯度洗脱目的蛋白，收集流出的200mM、300mM咪唑洗脱缓冲液。

5)将洗脱目的蛋白使用10kD超滤管富集，使用2mM PBS(pH 7.5) 透析过夜，收集蛋白并进行native-PAGE考马斯亮蓝染色(图5所示)，结果表明得到单一条带的纯度较高的目的蛋白、Western-Blot检测(图3，图4所示)，结果表明得到大小正确的目的条带。将纯化富集蛋白使用透射电子显微镜观察，形成纳米颗粒(图6所示)。

6)使用BCA法对纯化蛋白进行蛋白定量。

综上分析，293T、293i和CHO表达体系都可以产生目的蛋白并组装成纳米颗粒，其中293T表达体系可用于小中量疫苗制备，293i和CHO表达体系可用于中大量疫苗制备。

应用实施例：疫苗抗病毒效果验证

纯化蛋白免疫动物

1)动物实验均符合3R原则，即替代(Replacement)、减少 (reduction)、优化(Refinement)；动物实验通过中国医学科学院医学生物学研究所IACUC(InstitutionalAnimal Care and Use Committee)组织的批准。六只健康的8月龄的恒河猴，体重为1.5kg±0.5kg。使用的BALB/C小鼠和 C57BL/6小鼠均为4周龄小鼠。

2)肌肉或皮下注射疫苗制备：将纯化蛋白按照所需浓度与氢氧化铝佐剂混合，佐剂终浓度为1mg/ml。滴鼻疫苗制备：将1ml 100ug/ml纯化蛋白加入10ug重组人干扰素α1b干粉。

3)恒河猴经由上呼吸道滴鼻注射为20ug/200ul或肌肉注射为20 ug/0.5ml的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。BALB/C小鼠和C57BL/6小鼠经由上呼吸道滴鼻注射为2ug/20ul或皮下注射为6ug/50ul的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。等量空白动物使用PBS替代蛋白疫苗进行同步实验。隔三周进行第二次及第三次加强免疫。

4)加强免疫三周后取动物血清，并作为一抗按照1：200比例稀释，进行纯化蛋白的western blot检测(图7所示)，结果表明免疫动物可以产生SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD肽段的抗体。

免疫动物血清进行SARS-CoV-2病毒中和实验检测

1)样本血清灭活猴灭活血清样本：56度，30分钟。小鼠血清使用 RDE II处理16h，再使用56度，30分钟终止反应。

2)将病毒与不同稀释度的动物血清进行中和，室温作用2小时。

3)使用对数生长期的vero细胞，胰酶消化后，使用完全细胞培养基进行吹打混匀，稀释成为3×10⁴个/100ul，按照100μl/孔加入至中和后的病毒- 血清混合液中。将细胞培养板置于37℃，5％CO2继续培养72-96小时，观察细胞病变。实验表明，所述纳米自组装颗粒蛋白疫苗产生的中和抗体可以有效抑制SARS-CoV-2病毒对vero细胞的感染(图8，图9所示)。

SARS-CoV-2攻毒免疫恒河猴保护性实验

免疫恒河猴及对照恒河猴滴鼻感染1*10⁵TCID50 SARS-CoV-2。感染后每天采集恒河猴鼻拭子、咽拭子，进行病毒排毒检测(图10所示)。感染后7天处死恒河猴，采集恒河猴各组织进行病理检测(图11所示)。结果表明，本纳米颗粒蛋白疫苗经三次免疫后有效保护SARS-CoV-2对恒河猴的感染及损伤。

序列表

<110> 中国医学科学院医学生物学研究所

<120> 一种以SARS-CoV-2 病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗及其制备

<141> 2020-08-06

<150> 2020102642338

<151> 2020-04-07

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 460

<212> PRT

<213> 人工序列

<223>根据SARS-Cov2病毒S蛋白RBD序列及纳米自组装颗粒骨架蛋白ferritin序列设计

<400> 1

Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp His His His His His His Asn Ile Thr Asn Leu

20 25 30

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

35 40 45

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

50 55 60

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

65 70 75 80

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

85 90 95

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

100 105 110

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

115 120 125

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

130 135 140

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

145 150 155 160

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

165 170 175

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

180 185 190

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

195 200 205

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

210 215 220

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

225 230 235 240

Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe

245 250 255

Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala

260 265 270

Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ser Gly Gly Met Leu Ser Lys Asp

275 280 285

Ile Ile Lys Leu Leu Asn Glu Gln Val Asn Lys Glu Met Asn Ser Ser

290 295 300

Thr Val Tyr Met Ser Met Ser Ser Trp Cys Tyr Thr His Ser Leu Asp

305 310 315 320

Gly Ala Gly Leu Phe Leu Phe Asp His Ala Ala Glu Glu Tyr Glu His

325 330 335

Ala Lys Lys Leu Ile Ile Phe Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Val Gln

340 345 350

Leu Thr Ser Ile Ser Ala Pro Glu His Lys Phe Glu Gly Leu Thr Gln

355 360 365

Ile Phe Gln Lys Ala Tyr Glu His Glu Gln His Ile Ser Glu Ser Ile

370 375 380

Asn Asn Ile Val Asp His Ala Ile Lys Ser Lys Asp His Ala Thr Phe

385 390 395 400

Asn Phe Leu Gln Trp Tyr Val Ala Glu Gln His Glu Glu Glu Val Leu

405 410 415

Phe Lys Asp Ile Leu Asp Lys Ile Glu Leu Ile Gly Asn Glu Asn His

420 425 430

Gly Leu Tyr Leu Ala Asp Gln Tyr Val Lys Gly Ile Ala Lys Ser Arg

435 440 445

Lys Ser His His His His His His His His His His

450 455 460

<210> 2

<211> 1383

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggagacag acacactcct gctatgggta ctgctgctct gggttccagg ttccactggt 60

gaccaccacc atcatcacca caacatcacc aacctgtgcc ccttcggcga ggtgttcaac 120

gccacccgct tcgccagcgt gtacgcctgg aaccgcaagc gcatcagcaa ctgcgtggcc 180

gactacagcg tgctgtacaa cagcgccagc ttcagcacct tcaagtgcta cggcgtgagc 240

cccaccaagc tgaacgacct gtgcttcacc aacgtgtacg ccgacagctt cgtgatccgc 300

ggcgacgagg tgcgccagat cgcccccggc cagaccggca agatcgccga ctacaactac 360

aagctgcccg acgacttcac cggctgcgtg atcgcctgga acagcaacaa cctggacagc 420

aaggtgggcg gcaactacaa ctacctgtac cgcctgttcc gcaagagcaa cctgaagccc 480

ttcgagcgcg acatcagcac cgagatctac caggccggca gcaccccctg caacggcgtg 540

gagggcttca actgctactt ccccctgcag agctacggct tccagcccac caacggcgtg 600

ggctaccagc cctaccgcgt ggtggtgctg agcttcgagc tgctgcacgc ccccgccacc 660

gtgtgcggcc ccaagaagag caccaacctg gtgaagaaca agtgcgtgaa cttcaacttc 720

aacggcctga ccggcaccgg cgtgctgacc gagagcaaca agaagttcct gcccttccag 780

cagttcggcc gcgacatcgc cgacaccacc gacgccgtgc gcgaccccca gaccctggag 840

agcggcggca tgctgagcaa ggacatcatc aagctgctga acgagcaggt gaacaaggag 900

atgaacagca gcaccgtgta catgagcatg agcagctggt gctacaccca cagcctggac 960

ggcgccggcc tgttcctgtt cgaccacgcc gccgaggagt acgagcacgc caagaagctg 1020

atcatcttcc tgaacgagaa caacgtgccc gtgcagctga ccagcatcag cgcccccgag 1080

cacaagttcg agggcctgac ccagatcttc cagaaggcct acgagcacga gcagcacatc 1140

agcgagagca tcaacaacat cgtggaccac gccatcaaga gcaaggacca cgccaccttc 1200

aacttcctgc agtggtacgt ggccgagcag cacgaggagg aggtgctgtt caaggacatc 1260

ctggacaaga tcgagctgat cggcaacgag aaccacggcc tgtacctggc cgaccagtac 1320

gtgaagggca tcgccaagag ccgcaagagc caccatcacc accatcatca tcaccaccac 1380

tag 1383

Claims

1.一种以SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区为抗原的纳米疫苗，其特征在于：该疫苗是一种表达SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区氨基酸序列的蛋白，其单体氨基酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示，在细胞内24个单体能自组装成球体结构，并且融合表达的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD肽段展示在球体表面。

2.制备权利要求1所述纳米疫苗的方法，具体包括以下步骤：

(1)将带有SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区基因序列的表达载体转染进293T、293i、CHO细胞系中进行抗体表达，所述的SARS-CoV-2病毒S蛋白RBD区基因序列如序列表SEQ ID NO.2所示；其中，293T细胞表达体系使用无血清培养基，转染试剂为FuGENE HD Transfection(Promega)；293i和CHO细胞表达体系为悬浮表达系统，使用无血清培养基，转染试剂为PEI25000；其余操作按照293T、293i和CHO细胞表达体系的常规操作方法进行；

(3)Ni-NTA柱进行抗体的亲和层析纯化，并收集纯化后的蛋白；其中，洗脱时使用梯度洗脱方法，基础缓冲液组成为50mM磷酸二氢钠，300mM氯化钠，0.05％吐温20和5％甘油，pH7.5；洗脱缓冲液由基础缓冲液加入不同浓度的咪唑配制；梯度洗脱方法为使用10mM，20mM和40mM咪唑的洗脱缓冲液依次洗脱至无蛋白流出，然后依次使用200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱，并收集200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液，富集收集的200mM和300mM咪唑的洗脱缓冲液；

(5)将目的蛋白总量与终浓度为1mg/ml的氢氧化铝佐剂混合孵育2h以上，形成稳定的混合物即为所需的纳米自组装颗粒蛋白疫苗。