CN112029037A

CN112029037A - 一种高强度可降解的抗菌水凝胶及其制备方法

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Publication number: CN112029037A
Application number: CN202010832495.XA
Authority: CN
Inventors: 张静; 冯杰; 钱隼翔
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-12-04
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN112029037B

Abstract

本发明涉及水凝胶领域，针对水凝胶对高强度、可降解性和抗菌性能的技术发展趋势和需求，公开一种高强度可降解的抗菌水凝胶及其制备方法，该抗菌水凝胶由壳聚糖、多价态负离子、两性离子聚合物、蛋白质制成，两性离子聚合物和蛋白质通过化学键作用原位交联形成第二交联网络，壳聚糖和多价态负离子通过配位作用形成第一交联网络，所述抗菌水凝胶具有由第一网络和第二网络相互贯穿形成的双网络结构，具有较好的力学强度和抗细胞黏附性能、良好的抗菌性能，拉伸强度可达1.25 MPa甚至更高，并在满足力学强度的同时能够实现可降解性能。

Description

一种高强度可降解的抗菌水凝胶及其制备方法

技术领域

本发明涉及水凝胶领域，具体涉及一种高强度可降解的抗菌水凝胶及其制备方法。

背景技术

水凝胶是一种由三维网络与大量水组成的高分子多孔材料，在组织工程、药物传递以及生物传感器等领域均有广泛应用。传统水凝胶有着力学性能低、韧性差以及有限的可回复性等缺点，无法满足实际应用需求，限制了其应用范围。近年来，双网络技术被认为是提高水凝胶材料的力学强度和韧性的有效方法之一，引起广泛关注。例如，Rong Jianhua等人(Gan S,Lin W,Zou Y,et al,Nano-hydroxyapatite enhanced double networkhydrogels with excellent mechanical properties for potential application incartilage repair[J].Carbohydrate Polymers,2020,229,115523.)开发了一种双物理交联的聚(乙烯醇)-纳米羟基磷灰石/季铵化壳聚糖水凝胶，该水凝胶具有出色的拉伸强度(2.70±0.24MPa)，韧性(14.09±2.06MJ/m³)耐磨性和优异的细胞相容性，可用于软骨修复。

与不可降解的水凝胶相比，可生物降解型的水凝胶能够降解成安全无毒的小分子，对人体造成的伤害最小，该类型材料更符合医用材料的要求。水凝胶的可降解能力越来越被人们所重视。Wang Yanqin等人(Wang Y,Xue Y,Wang J,et al.A Composite Hydrogelwith High Mechanical Strength,Fluorescence,and Degradable Behavior for BoneTissue Engineering[J].Polymers，2019,11,1112.)制备了纳米填料和双网结构共增强的碳点/羟基磷灰石/聚(乙烯醇)的复合水凝胶，其具有高力学强度和突出的可降解行为，用于骨组织工程领域。

此外，细菌感染是致病菌或条件致病菌侵入血循环中生长繁殖，产生毒素和其他代谢产物所引起的急性全身性感染，临床上以寒战、高热、皮疹、关节痛及肝脾肿大为特征，部分可能导致感染性休克等症状。目前感染性疾病仍然是全球第二大致死病因。所以用于生物医用领域的水凝胶的抗菌和抗粘附特性对于避免细菌感染和促进伤口愈合是必需的。Guo Baolin等人(Zhao X,Liang Y,Huang Y,et al.Physical Double-Network HydrogelAdhesives with Rapid Shape Adaptability,Fast Self-Healing,Antioxidant andNIR/pH Stimulus-Responsiveness for Multidrug-Resistant Bacterial Infectionand Removable Wound Dressing[J].Advanced Functional Materials,2020,30,1910748.)开发了一种具有高愈合效率和光热抗菌活性的物理双网(DN)可移动水凝胶粘合剂以应对多药耐药细菌感染，该水凝胶具有快速的自我修复性能，良好的组织粘附性，降解性，光热抗菌活性以及近红外辐射或酸性溶液洗涤的辅助去除性，用于伤口敷料。

发明内容

针对水凝胶对高强度、可降解性和抗菌性能的技术发展趋势和需求，本发明的目的在于提供一种高强度可降解的抗菌水凝胶，具有高强度、可降解和抗菌特性，满足医用领域的使用需求。

本发明的另一目的还在于提供该抗菌水凝胶的制备方法。

本发明提供如下的技术方案：

一种高强度可降解的抗菌水凝胶，所述抗菌水凝胶由壳聚糖、多价态负离子、两性离子聚合物、蛋白质制成，两性离子聚合物由两性离子单体在蛋白质存在下聚合得到，蛋白质上有可与两性离子聚合物形成化学键作用的交联官能团，两性离子聚合物和蛋白质通过化学键作用原位交联形成第二交联网络，壳聚糖和多价态负离子通过配位作用形成第一交联网络，所述抗菌水凝胶具有由第一网络和第二网络相互贯穿形成的双网络结构。

本发明的抗菌水凝胶采用双网络结构，具有高强度、可降解和抗菌特性。其中第二交联网络中以蛋白质作为交联剂在两性离子聚合物之间架桥，实现可降解性。目前的蛋白质水凝胶中多是蛋白质之间通过蛋白质分子间的疏水作用、静电等物理作用形成。将这种形成蛋白质水凝胶的蛋白质直接引入到第二网络结构中与两性离子聚合物作用，第二网络中的成网作用仅限于两性离子聚合物之间的电荷作用和两性离子聚合物与蛋白质之间的物理作用，这种成网作用一方面不够强，导致抗菌水凝胶的强度受影响；另一方面这种成网作用中蛋白质并不实质参于到两性离子聚合物的网络结构中，虽然在降解环境下蛋白质实现降解，但是对于两性离子聚合物的网络结构影响不大，因此不能实现抗菌水凝胶的真正降解。而本申请的发明人在研究中考虑到上述现象，在蛋白质上引入可与两性离子聚合物发生反应的交联官能团，使蛋白质作为交联剂参与到两性离子聚合物网络的形成中，在两性离子聚合物之间形成架桥，这样当一定条件下蛋白质发生降解时也必然破坏两性离子聚合物的聚合网络，从而实现抗菌水凝胶的可降解性。

作为本发明的优选，所述蛋白质为牛血清蛋白，所述交联官能团通过以下过程引入到牛血清蛋白上：

将牛血清蛋白溶解于PBS缓冲溶液中，然后将4-二甲氨基吡啶和三乙胺的N，N-二甲基甲酰胺共混溶液滴加到PBS缓冲溶液中，再滴加甲基丙烯酰氯的N，N-二甲基甲酰胺溶液，磁力搅拌后置于浓度依次减小的PBS缓冲溶液中阶梯透析，然后去离子水中透析、冷冻干燥得到引入交联官能团的牛血清蛋白。

发明人将牛血清蛋白经过上述处理引入不饱和双键基团，可以在光照下反应，并创造性的将其应用于两性离子聚合网络的形成中，提供抗菌水凝胶的可降解性能。

作为本发明的优选，牛血清蛋白、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、甲基丙烯酰氯的用量依次为1～4g、40～500μL、50～300mg、100～700μL。

作为本发明的优选，PBS缓冲溶液的pH值为7.4，透析时所用PBS缓冲溶液的浓度由高到低依次为：0.2mol/L，0.1mol/L，0.05mol/L，0.02mol/L，0.01mol/L。

作为本发明的优选，所述两性离子单体至少选自磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯或者羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯。

作为本发明的优选，所述多价态负离子至少选自硫酸根离子或柠檬酸根离子。

作为本发明的优选，壳聚糖分子量≤10000Da；壳聚糖的脱乙酰度≥90％。

上述高强度可降解的抗菌水凝胶制备方法，包括以下步骤：

(1)配制壳聚糖、两性离子单体、蛋白质和引发剂的混合溶液；

(2)去除混合溶液中的气泡，得到预液；

(3)将预液密封于透光模具中，除氧，然后紫外光照射反应得到与凝胶；

(4)将预凝胶置于多价态负离子的溶液中浸泡，得到高强度可降解的抗菌水凝胶。

上述混合溶液的配制中，将壳聚糖、两性离子单体、蛋白质和引发剂溶解于溶剂中随后搅拌均匀即可，所用溶剂可选择水等，所用引发剂在紫外光照下可以引发两性离子单体的聚合反应，可以选择α-酮戊二酸。上述制备过程中，气泡可以采用超声等手段脱除，氧气的脱除则可以采用通入氮气或惰性气体以降低氧气溶解性的方式进行。所用透光磨具可以为玻璃模具或者透明塑料模具。

作为本发明方法的优选，步骤(1)中壳聚糖的浓度为0.02～0.20g/mL，两性离子单体浓度为0.2～4.0mol/L，蛋白质的浓度为0.01～0.20g/mL；引发剂用量为相对于两性离子单体的0.5～4.0mol％。

作为本发明方法的优选，步骤(3)中紫外光照射反应的波长为365nm，紫外光照射反应时长为6～8h。

本发明的有益效果如下：

本发明的抗菌水凝胶为双网络结构，由两个交联网络相互贯穿得到，具有较好的力学强度和抗细胞黏附性能、良好的抗菌性能，拉伸强度可达1.25MPa甚至更高，并在满足力学强度的同时能够实现可降解性能，在胰蛋白酶作用下10天左右基本彻底降解，而且抗菌水凝胶仅需要两步聚合交联反应即可，制备方法简洁，高效且对环境友好。

附图说明

图1是不同含量的牛血清蛋白mBSA制备的水凝胶的应力-应变曲线。

图2是不同含量的磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯SBMA制备的水凝胶的应力-应变曲线。

图3是不同含量的壳聚糖CS制备的水凝胶的应力-应变曲线图。

图4是大肠杆菌分别附着实施例2制备的水凝胶(图A)和空白对照组(图B)的荧光显微镜图像。

图5为小鼠成纤维细胞附着实施例2制备的水凝胶(图C)和空白对照组(图D)的荧光显微镜图像。

图6为实施例2制备的水凝胶添加胰蛋白酶(测试组)和不添加胰蛋白酶(空白组)的降解过程照片。

图1中，A曲线表示mBSA浓度50.0mg/mL，B曲线表示mBSA浓度62.5mg/mL，C曲线表示mBSA浓度75.0mg/mL，D曲线表示mBSA浓度87.5mg/mL，E曲线表示mBSA浓度100.0mg/mL；

图2中，A曲线表示SBMA浓度1M，B曲线表示SBMA浓度2M，C曲线表示SBMA浓度3M，D曲线表示SBMA浓度4M；

图3中，A曲线表示CS浓度0.04g/mL，B曲线表示CS浓度0.06g/mL，C曲线表示CS浓度0.08mg/mL，D曲线表示CS浓度0.10g/mL，E曲线表示CS浓度0.12g/mL。

具体实施方式

下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。

如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。

实施例1～16

一种高强度可降解的抗菌水凝胶，抗菌水凝胶由壳聚糖、多价态负离子、两性离子聚合物、蛋白质制成，两性离子聚合物由两性离子单体在蛋白质存在下聚合得到，蛋白质上有可与两性离子聚合物形成化学键作用的交联官能团，两性离子聚合物和蛋白质通过化学键作用原位交联形成第二交联网络，壳聚糖和多价态负离子通过配位作用形成第一交联网络，所述抗菌水凝胶具有由第一网络和第二网络相互贯穿形成的双网络结构；

其中，所用两性离子单体为磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯；

所用壳聚糖的脱乙酰度为90％，分子量平均8000Da；

所用多价态负离子为柠檬酸根离子；

所用蛋白质为牛血清蛋白，所述交联官能团通过以下过程引入到牛血清蛋白上：

将1.33g牛血清白蛋白BSA溶解于40mL浓度为0.2mol/L、pH值＝7.4的PBS缓冲溶液中，随后加入5mL混合了50mg的4-二甲氨基吡啶DMAP和125μL的三乙胺TEA的N，N-二甲基甲酰胺DMF中，再缓慢滴加5mL混有80μL甲基丙烯酰氯MAC的DMF溶液，磁力搅拌6h，然后依次经0.2mol/L，0.1mol/L，0.05mol/L，0.02mol/L，0.01mol/L的pH值＝7.4的PBS缓冲液中进行透析，最后在去离子水中进行透析，然后冷冻干燥，获得白色絮状固体。

上述高强度可降解的抗菌水凝胶制备方法，包括以下步骤：

(1)将壳聚糖、两性离子单体、牛血清蛋白和引发剂溶解于水溶剂中随后搅拌均匀得到混合溶液，所用引发剂为α-酮戊二酸；

(2)超声处理混合溶液以去除混合溶液中的气泡，得到预液；

(3)将预液至于密封于透光模具中，通过通入氮气降低氧气含量除氧，然后以波长365nm的紫外光照射反应6h得到预凝胶；

(4)将预凝胶置于柠檬酸根离子的溶液中浸泡，得到高强度可降解的抗菌水凝胶。

上述各实施例的具体条件见下表1所示。

表1实施例1～16的实施条件

对上述实施例1～16制备的抗菌水凝胶的性能进行如下测试。

1、力学性能测试。

1)水凝胶胶样片的制备：用1mm厚的玻璃模具，制备出长为40mm，宽为10mm的水凝胶样条，使用“哑铃”形裁刀制得标距为16mm，宽4mm，厚1mm的水凝胶样片。

2)拉伸力学性能测试：以实施例1～5和实施例4、7～9和实施例4、10～13的水凝胶为例，取每个待测实施例制备的水凝胶的3个样片在Instron 5966万能材料试验机上进行力学拉伸实验，拉伸速度100mm/min，测定其力学性能，取平均结果。

其中实施例1～5的测试结果见图1所示，实施例4、7～9的测试结果见图2所示，实施例4、10～13的测试结果见图3所示。

从图1中可以看出，实施例1～5所制得水凝胶中，当mBSA含量逐渐增大时，曲线A、B、C、D、E表示的水凝胶样品力学性能曲线先提高后降低，在mBSA含量达到87.5mg/mL(即0.175g)时，其拉伸强度达到峰值1.25MPa，断裂伸长率为419.80％。

从图2中可以看出，实施例4、7～9所制得水凝胶中，随着SBMA含量的增加，曲线A、B、C、D表示的水凝胶样品的力学性能曲线先增加后降低，在SBMA含量为2M时，其拉伸强度达到峰值1.25MPa。

从图3中可以看出，实施例4、10～13所制得水凝胶中，当CS含量增加，曲线A、B、C、D、E表示的水凝胶的拉伸强度曲线整体呈增大趋势，断裂伸长率随之降低。

2、抗菌性能测试。

以实施例2为例，将水凝胶样片置于12孔板中，在每个孔中加入1mL大肠杆菌菌液，控制菌液的光密度(OD)为0.1，然后将12孔板放入摇床中，使样品与菌液在37℃下以120rpm的转速共培养24h，在无光条件下将其用染色剂染色15min，用磷酸缓冲液洗涤后用倒置荧光显微镜观察大肠杆菌的黏附情况，并设置不加入水凝胶样品的空白对照组，结果如图4所示，其中图A为水凝胶样片组，B为不向孔板中添加水凝胶样片的空白对照组。

图4中黑色的背景为水凝胶(A)或者孔板(B)，零散分布的灰色区域或灰色点为大肠杆菌菌群，从图4可以看出，与空白对照组B相比，A中大肠杆菌群分布较少，表明所制得的水凝胶具有良好的抗菌效果。

3、细胞黏附性能测试。

以实施例2为例，将在紫外线下灭菌60min后的水凝胶样片置于24孔板中，将1mL浓度为5×10⁴/mL的小鼠成纤维细胞(L929细胞)悬液加入含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中培养24h，撤去培养基，用PBS缓冲液洗涤所有样品5次。将所有样品置于新的12孔板中，用浓度为5mg/mL的FDA溶液培养5min。最后，再用PBS缓冲液洗涤5次后，通过倒置荧光显微镜观察实验结果，结果如图5所示，其中图C为水凝胶样片组，D为不添加水凝胶样片孔板的空白对照组。

图5中黑色的背景区域为水凝胶(C)或者孔板(D)，灰色区域或者灰色点为小鼠成纤维细胞，从图5中可以看出，与空白对照组D相比，图C中基本呈黑色背景，无小鼠成纤维细胞附着，表明所制得的水凝胶具有低细胞黏附性能。

4、降解性能测试。

以实施例2为例，将两份水凝胶置于PBS缓冲液中完全溶胀，随后将水凝胶取出置于十二孔板中，其中一份添加含有0.25wt％胰蛋白酶的PBS溶液浸没制成测试组，另一份添加相同量的PBS溶液浸没制成空白组，放入37℃摇床中，120rpm晃动，每天更换，记录水凝胶质量和体积的变化，结果如图6所示。

从图6可以看出，测试组中的水凝胶在第4天体积减小表明开始降解，第10天水凝胶结构基本破坏，表明制备的水凝胶在蛋白酶作用下有很好的降解性能。

实施例17

一种高强度可降解的抗菌水凝胶，与实施例1的不同之处在于，所用壳聚糖浓度为0.02g/mL，磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯的浓度为0.2mol/L，牛血清蛋白的浓度为0.01g/mL；引发剂用量为相对于磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯的0.5mol％；

牛血清蛋白的交联官能团的引入过程如下：。

将4g牛血清白蛋白BSA溶解于40mL浓度为0.2mol/L、pH值＝7.4的PBS缓冲溶液中，随后加入5mL混合了300mg的4-二甲氨基吡啶DMAP和700μL的三乙胺TEA的N，N-二甲基甲酰胺DMF中，再缓慢滴加5mL混有500μL甲基丙烯酰氯MAC的DMF溶液，磁力搅拌6h，然后依次经0.2mol/L，0.1mol/L，0.05mol/L，0.02mol/L，0.01mol/L的pH值＝7.4的PBS缓冲液中进行透析，最后在去离子水中进行透析，然后冷冻干燥，获得白色絮状固体。

实施例18

一种高强度可降解的抗菌水凝胶，与实施例1的不同之处在于，所用壳聚糖浓度为0.20g/mL，所用两性离子单体为羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯，浓度为4.0mol/L，牛血清蛋白的浓度为0.20g/mL；引发剂用量为相对于磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯的4.0mol％；

牛血清蛋白的交联官能团的引入过程如下：。

将1.0g牛血清白蛋白BSA溶解于40mL浓度为0.2mol/L、pH值＝7.4的PBS缓冲溶液中，随后加入5mL混合了50mg的4-二甲氨基吡啶DMAP和100μL的三乙胺TEA的N，N-二甲基甲酰胺DMF中，再缓慢滴加5mL混有40μL甲基丙烯酰氯MAC的DMF溶液，磁力搅拌6h，然后依次经0.2mol/L，0.1mol/L，0.05mol/L，0.02mol/L，0.01mol/L的pH值＝7.4的PBS缓冲液中进行透析，最后在去离子水中进行透析，然后冷冻干燥，获得白色絮状固体。

对比例1

与实施例2的不同之处在于，所用牛血清蛋白不经过交联官能团的引入修饰。

由对比例1制备的水凝胶的最大拉伸强度与实施例2相比下降20％，且采用相同的降解性能测试，10天后水凝胶基本没有降解，完整度保持约92％。

通过上述大量的检测结果表明，本发明技术方案所制得的高强度可降解的抗菌水凝胶确实具有优异的力学性能以及出色的抗细胞粘附性和抗菌性能，在胰蛋白酶作用下能在一定时间内逐步降解，在生物医用领域，尤其是作为骨组织支架等方面具有广阔的应用前景。

Claims

1.一种高强度可降解的抗菌水凝胶，其特征在于，所述抗菌水凝胶由壳聚糖、多价态负离子、两性离子聚合物、蛋白质制成，两性离子聚合物由两性离子单体在蛋白质存在下聚合得到，蛋白质上有可与两性离子聚合物形成化学键作用的交联官能团，两性离子聚合物和蛋白质通过化学键作用原位交联形成第二交联网络，壳聚糖和多价态负离子通过配位作用形成第一交联网络，所述抗菌水凝胶具有由第一网络和第二网络相互贯穿形成的双网络结构。

2.根据权利要求1所述的高强度可降解的抗菌水凝胶，其特征在于，所述蛋白质为牛血清蛋白，所述交联官能团通过以下过程引入到牛血清蛋白上：

3.根据权利要求2所述的高强度可降解的抗菌水凝胶，其特征在于，牛血清蛋白、4-二甲氨基吡啶、三乙胺、甲基丙烯酰氯的用量依次为1~4 g、40~500 μL、50~300 mg、100~700 μL。

4.根据权利要求2或3所述的高强度可降解的抗菌水凝胶，其特征在于，PBS缓冲溶液的pH值为7.4，透析干燥中所用PBS缓冲溶液的浓度由高到低依次为：0.2 mol/L，0.1 mol/L，0.05 mol/L，0.02 mol/L，0.01 mol/L。

5.根据权利要求1所述的高强度可降解的抗菌水凝胶，其特征在于，所述两性离子单体至少选自磺酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯或者羧酸甜菜碱甲基丙烯酸甲酯。

6.根据权利要求1所述的高强度可降解的抗菌水凝胶，其特征在于，所述多价态负离子至少选自硫酸根离子或柠檬酸根离子。

7.根据权利要求1所述的高强度可降解的抗菌水凝胶，其特征在于，壳聚糖分子量≤10000 Da；壳聚糖的脱乙酰度≥90 %。

8.一种如权利要求1至7任一所述的高强度可降解的抗菌水凝胶制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）配制壳聚糖、两性离子单体、蛋白质和引发剂的混合溶液；

（2）去除混合溶液中的气泡，得到预液；

（3）将预液密封于透光模具中，除氧，然后紫外光照射反应得到预凝胶；

（4）将预凝胶置于多价态负离子的溶液中浸泡，得到高强度可降解的抗菌水凝胶。

9.根据权利要求8所述的高强度可降解的抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中壳聚糖的浓度为0.02～0.20 g/mL，两性离子单体浓度为0.2～4.0 mol/L，蛋白质的浓度为0.01~0.20 g/mL；引发剂用量为相对于两性离子单体的0.5～4.0 mol%。

10.根据权利要求8所述的高强度可降解的抗菌水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤（3）中紫外光照射反应的波长为365 nm，紫外光照射反应时长为6～8 h。