CN111973583A - 芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及芹菜素在制备促进缺血随意皮瓣存活药物的作用，在促进缺血随意皮瓣存活的过程中采用口服的方式，使用方法为每日口服剂量20mg/kg或50mg/kg，5‑7天为一疗程，通过大量的动物实验得出结论，使用芹菜素可以使得超长随意皮瓣的成活面积比明显提高，降低炎症、提高抗氧化能力、血管密度大幅度提升，能够很好地促进缺血随意皮瓣存活。

Description

芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用

技术领域

本发明涉及芹菜素的新用途，具体是芹菜素在促进缺血超长随意皮瓣存活的作用。

背景技术

近年来随着我国经济水平不断提高，工业、能源等行业呈高速发展的趋势，由此导致的与职业、交通行为等相关的大面积创伤及组织缺损等病例也在不断增加。这类创伤在修复后多遗留不同程度的畸形和功能障碍，尤其是手部和颜面部的创伤畸形。而病患对完美外形、功能恢复的要求日益提升，创面问题的修复技术和治疗手段成为医学的一项重要思考。临床上，随意皮瓣作为创面修复最基本且最常用的手术方法因其“灵活性”、“随意性”，被临床上广泛应用于修复组织缺损。而随意皮瓣的血液灌注有限，皮瓣远端往往发生缺血坏死的术后并发症。如何能改善随意皮瓣远端的血供状况以及组织对缺血的耐受能力，有效减少可能发生的缺血坏死，成为创面治疗修复中核心问题之一，具有较强的社会价值、经济价值和理论、实践研究价值。

芹菜素是天然存在的一类黄酮类化合物，广泛存在于多种水果、蔬菜、豆类和茶叶中，尤以芹菜中含量最多。现有的报道中芹菜素对局灶性脑缺血在灌注损伤的作用能够促进血管内皮生长因子(VEGF)的表达，对缺血后血管再生有促进作用，但是对皮瓣存活的治疗效果是未可知的。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供在促进缺血超长随意皮瓣存活中的作用。

进一步的，所述缺血超长随意皮瓣的规格为3cm X 9cm。

进一步的，芹菜素包括制备提高缺血超长随意皮瓣中VEGF表达量的药物用途。

进一步的，芹菜素包括制备促进缺血超长随意皮瓣中血管再生的药物用途。

进一步的，芹菜素包括制备促进缺血超长随意皮瓣中纤维细胞增殖药物的作用。

进一步的，芹菜素包括制备抑制缺血超长随意皮瓣中炎症因子表达的药物用途，所述炎症因子包括IL-6和/或IL-1β和/或TNF-α。

进一步的，芹菜素包括制备促进缺血超长随意皮瓣中抗氧化能力的药物用途，所述抗氧化能力包括抗脂质过氧化的能力。

进一步的，芹菜素包括制备减少缺血超长随意皮瓣中组织水肿的药物用途。

进一步的，使用方法为每日口服剂量20-50mg/kg芹菜素，5-7天为一疗程。

进一步的，所述芹菜素以10mg/ml含量的溶剂形式给药，芹菜素溶剂的溶剂为玉米油。

本发明具有如下优点：本发明涉及的芹菜素在缺血超长随意皮瓣治疗过程中的用途，通过大量的动物灌胃实验得出结论，使用芹菜素可以使得皮瓣的成活面积比明显提高，其主要通过下面几个方面的改进来协同使得皮瓣的存活率大大提升，一方面能很好地促进VEGF表达量的表达量，提高皮瓣的纤维细胞的增生，以提高皮瓣的血管密度以及血流量，同时使用芹菜素可以降低皮瓣的炎症反应以及增强抗氧化能力，来降低皮瓣细胞损伤，并且降低了缺血超长随意皮瓣的水肿程度，进一步促进皮瓣的愈合速度。

附图说明

图1芹菜素(Apigenin)的化学结构式；

图2A.缺血随意皮瓣模型建立；2B.缺血随意皮瓣模型建立佩戴自制头套；

图3术后7d大鼠背部皮瓣存活情况外观对比图；

图4A.术后7d大鼠背部皮瓣内部存活情况外观对比；4B.皮瓣平均存活率；4C.皮瓣水肿程度对比；

图5A.术后7d激光多普勒血流评估；5B.皮瓣平均血液灌注水平对比；

图6术后7d皮瓣明胶-氧化铅造影对比观察；

图7A.显微镜下(100倍，200倍)实验组与对照组中间区域皮瓣HE染色观察情况；7B.皮瓣中端平均微血管密度对比；7C.皮瓣中端中性粒细胞密度对比；

图8A、8B、8C、8D分别为芹菜素实验组与玉米油对照组皮瓣VEGF、IL-6、IL-1β和TNF-α表达(免疫组化×400)；

图9A和9B分别为：芹菜素实验组组与玉米油对照组皮瓣SOD值和MDA含量对比；

图10A：ELISA双抗体法检测的TNF-α表达水平；10B：ELISA双抗体法检测的IL-6表达水平。

具体实施方式

下面将结合实施例和效果例对本发明做进一步的详述，而非限制本发明的范围。

缺血随意皮瓣模型建立

选用健康的雄性SpragueDawley大鼠60只，由温州医科大学实验动物中心提供，清洁级，体重200-250g，2-3个月龄。将大鼠按照随机数字表法分为高剂量芹菜素组、低剂量芹菜素组和玉米油对照组，每组20只。

芹菜素溶剂的配方配比：1g的芹菜素粉末溶于100ml的玉米油，配成10mg/ml溶液，芹菜素的化学结构式如图1所示。

大鼠腹腔注射质量浓度为2％的戊巴比妥钠生理盐水溶液，按40mg/kg的剂量进行麻醉。待麻醉生效后，用剃毛器初步剃去大鼠背部躯干的毛发，蒸馏水滋润未除尽的毛发，并均匀涂抹脱毛膏。等待3分钟后，用塑料薄片轻轻除去乳膏，重复该过程，直到完全去除毛发。在大鼠的背部正中设计一个以其两髂嵴连线为蒂部的皮瓣纵轴与大鼠背部长轴平行的尺寸为3cm X 9cm的改良McFarlane皮瓣：各边予美兰溶液标记，术中沿标记线逐层切开皮肤、分离皮下组织至深筋膜浅层，边暴露边电凝或结扎创面活跃出血处，皮瓣与深筋膜完全分离后，用手术刀切断皮瓣蒂部两条对称骶动脉，保留真皮下毛细血管网，彻底止血。最后，使用4-0医用慕丝尼龙缝线间断原位缝合皮瓣。各组大鼠术后用4万单位庆大霉素腹腔内注射，创缘予碘伏消毒并涂擦红霉素软膏预防感染。为方便术后观察，根据皮瓣血供特点，将皮瓣三等分为皮瓣近端区(I区)、皮瓣中间区(II区)和皮瓣远端区(III区)(图2A)。单只单笼饲养大鼠。大鼠的水的和食物由实验室统一提供，并控制实验室的温度(25摄氏度、湿度40-60％)及光照条件适宜且相同。腹腔注射生理盐水(50ml/kg)抗休克。

高、低剂量芹菜素组：分别以50mg/kg和20mg/kg芹菜素灌胃；玉米油对照组：相同剂量灌胃，均每日1次，时间段相同，连续7天。因大鼠有自残现象，为避免其术后回头撕咬伤口影响皮瓣存活，均为其带上防止其自残的“颈套”(图2B)，并独笼喂养。为减少手术操作带来的误差，所有手术由1人完成。

实施例1：皮瓣存活面积比与皮瓣存活状况检测

术后1～7d，每日肉眼观察大鼠皮瓣色泽、质地、组织弹性以及有无毛发生长或坏死现象并记录。第7天时，各组大鼠在麻醉状态下用透明纸准确测量皮瓣成活及坏死面积，并剪成成活和死亡两部分，分别以电子秤称重。计算皮瓣成活面积百分比[皮瓣成活面积透明纸质量÷皮瓣总表面积透明纸质量×100％]。

皮瓣坏死标准：皮瓣颜色发黑，组织回缩、弹性差，质地坚硬，切割组织不出血。病理表现为组织崩解、细胞核消失、炎症细胞广泛浸润、有局灶出血。

结果如图3所示，术后7天，高剂量芹菜素组和低剂量芹菜素组中间区域皮瓣颜色淡红，表面无痂壳形成，弹性较好，远端区域颜色发黑，表明有痂壳，弹性差，原位掀起皮瓣时见皮瓣出血活跃，出血量多，肉膜下无积血，积液，血管丰富。玉米油组皮瓣中间区域及远端区域颜色均发黑，表面有痂壳形成，弹性极差，原位掀起皮瓣见皮瓣出血较少，肉膜下炎性分泌物较多，血管相对较疏。

结果如图4所示，7天后高剂量实验组皮瓣的成活面积比为(84.51±3.85％)，低剂量实验组皮瓣的成活面积比为(70.66±2.18％)，对照组皮瓣成活面积比为(49.18±2.83％)，比较三组皮瓣的成活面积比，差异有统计学意义(P＜0.01)(图4B)。同时检测皮瓣水肿程度：高剂量芹菜素组水肿面积比为(25.86±3.49％)，低剂量芹菜素组水肿面积比为(38.23±3.61％)，对照组水肿面积比为(60.88±6.59％)，比较三组皮瓣的水肿程度百分比，差异有统计学意义(P＜0.01)(图4C)。

实施例2：皮瓣新生血管状况检测

通过激光多普勒血流仪来检测皮瓣的新生血管状况，是利用激光多普勒原理，监测动物或人体组织微循环血流灌注量的一种设备。本学科实验室拥有该仪器并配套操作软件采集和分析血流信号。术后7天，分别测定大鼠背部皮瓣处血流，报告通用报告、百分比报告、PORH报告及频率报告等形式，观察新生血管处有效血流信号。

如图5所示，7天后激光多普勒血流仪显示芹菜素组皮瓣的血流量明显多于玉米油对照组，高剂量芹菜素组中端皮瓣的血流灌注量为(345.65±71.87)，低剂量芹菜素组中端皮瓣的血流灌注量为(269.72±54.58)，对照组中端皮瓣血流灌注量为(112.53±14.88)，比较三组皮瓣的血流灌注量，差异有统计学意义(P＜0.01)。

术后第7天，麻醉后先通过向大鼠一侧颈动脉注入0.9％生理盐水，同侧颈静脉放血排净大鼠体内血液，然后将预置的明胶+氧化铅灌注液(100ML/kg)缓慢注射入颈动脉，当观察到大鼠巩膜及四肢末端色泽变成造影剂颜色后停止注射。灌注成功后将大鼠冷藏12-24小时，使明胶凝集，最后将大鼠背部皮瓣及周围皮肤解剖，平铺行X线摄影。

结果如图6所示，实验组皮瓣远端造影剂充盈，血管再生质量更高，受体部位和皮瓣边缘的血管重建程度更好，尤其是在高剂量芹菜素组；而对照组的造影剂局限在皮瓣近端和中间区域。

实施例3：组织学检测

术后7天，在皮瓣中点处取样。样本经10％甲醛固定，石蜡包埋，HE染色，术后7d光镜下(×100，×200)观察肉芽组织层厚度、毛细血管的结构变化、组织水肿、坏死、炎性细胞浸润等情况。

结果如图7所示，芹菜素实验组见成纤维细胞增生，肉芽组织较薄，组织水肿较少，炎症细胞浸润少，且高剂量组较低剂量组成纤维细胞多，肉芽组织薄，组织水肿少，炎症细胞浸润少。对照组成纤维细胞增生较少，组织水肿明显，炎症细胞浸润严重。

高剂量芹菜素组在皮瓣中区微血管密度为(31.75±3.85/mm²)，低剂量芹菜素组在皮瓣中区微血管密度为(22.81±3.75/mm²)，对照组在皮瓣中区微血管密度为(11.58±3.12/mm²)，三组皮瓣中区微血管密度比较，差异有统计学意义(P＜0.01)(图7B)。

7天后检测皮瓣中性粒细胞数目：高剂量芹菜素组中性粒细胞数量为(17.37±5.83％)，低剂量芹菜素组中性粒细胞数量为(31.05±7.79％)，对照组中性粒细胞数量为(58.07±9.26％)，比较三组皮瓣的中性粒细胞数量，差异有统计学意义(P＜0.01)(图7C).

实施例4免疫组化观察

石蜡切片进行脱蜡，高温抗原修复，用3％过氧化氢消除过氧化物酶活性，血清封闭后，滴加目的一抗(VEGF，1∶200；bFGF，1∶100)孵育过夜，滴加生物素标记的二抗IgG，再滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，DAB显色，苏木素复染后封，采用Image-Pro Plus 6.0彩色图像分析系统分析各组切片免疫组织化学染色结果

如图8所示，免疫组化分析结果显示，芹菜素呈剂量依赖性上调VEGF表达，下调炎性细胞因子表达。高剂量芹菜素组、低剂量芹菜素组、对照组的VEGF水平分别为(4737.67±267.01IA)、(3090.00±493.32IA)、(1665.83±248.91IA)。各组的IL-6水平分别为(819.83±115.31IA)、(1996.33±230.22IA)和(3710.17±225.38IA)。各组的IL-1β水平分别为(721.67±105.91IA)，

(1293.83±239.67IA)和(2253.33±373.67IA)。各组TNF-α的水平分别为(1196.33±159.29IA)，(2402.5±271.01IA)和(4223.00±206.92IA)。各组之间的差异均具有统计学意义(P＜0.01)。

实施例5超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)表达的检测

术后7天，于皮瓣中区正中部位切取0.5cm×0.5cm全层组织，去除肉膜层，称质量，稀释，冰水匀浆液.按照SOD、MDA检测试剂盒说明书，检测二者含量。

结果如图9所示，高浓度芹菜素组的SOD值为(68.52±3.42U·mg^-1·protein^-1)，低浓度芹菜素组的SOD值为(51.12±6.36U·mg^-1·protein^-1)，对照组的SOD值为(24.81±4.23U·mg^-1·protein^-1)；高浓度芹菜素组的MDA含量为(14.30±3.53nmol·mg^-1·protein^-1)，低浓度芹菜素组的MDA含量为(21.89±1.60nmol·mg^-1·protein^-1)，对照组的MDA含量为(70.50±6.25nmol·mg^-1·protein^-1)，三组SOD值和MDA含量比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。

酶联免疫吸附法(ELISA)检测大鼠血清TNF-α、IL-6水平

芹菜素能够抑制相关炎症通路的激活，从而减少多种细胞分泌TNF-α、IL-6等炎性因子。从每组大鼠获得血液并以5000r离心15分钟后，收集上清液，用ELISA试剂盒测定血清中TNF-α、IL-6的水平。用酶标仪测量所有标准品和样

高浓度芹菜素组的TNF-α表达水平为(95.12±12.11pg/ml)，低浓度芹菜素组的TNF-α表达水平为(125.83±18.65pg/ml)，对照组的TNF-α表达水平为(218.36±136.2lpg/ml)，三组TNF-α表达量比较，差异有统计学意义(P＜0.01)(图10A)。

高浓度芹菜素组的IL-6表达水平为(22.25±3.11pg/ml)，低浓度芹菜素组的IL-6表达水平为(46.89±4.12pg/ml)，对照组的IL-6表达水平为(110.93±12.08pg/ml)，三组IL-6表达量比较，差异有统计学意义(P＜0.01)(图10B)。

最后有必要在此说明的是：以上实施例只用于对本发明的技术方案作进一步详细地说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域的技术人员根据本发明的上述内容作出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用。

2.根据权利要求1所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于，所述缺血超长随意皮瓣的规格为3cmX9cm。

3.根据权利要求1或2所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于，芹菜素包括制备提高缺血超长随意皮瓣中VEGF表达量的药物用途。

4.根据权利要求1或2所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于，芹菜素包括制备促进缺血超长随意皮瓣中血管再生的药物用途。

5.根据权利要求1或2所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于，芹菜素包括制备促进缺血超长随意皮瓣中纤维细胞增殖药物的作用。

6.根据权利要求1或2所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于，芹菜素包括制备抑制缺血超长随意皮瓣中炎症因子表达的药物用途，所述炎症因子包括IL-6和/或IL-1β和/或TNF-α。

7.根据权利要求1或2所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于，芹菜素包括制备促进缺血超长随意皮瓣中抗氧化能力的药物用途，所述抗氧化能力包括抗脂质过氧化的能力。

8.根据权利要求1或2所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于，芹菜素包括制备减少缺血超长随意皮瓣中组织水肿的药物用途。

9.根据权利要求1所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于：使用方法为每日口服剂量20-50mg/kg芹菜素，5-7天为一疗程。

10.根据权利要求9所述的芹菜素在制备促进缺血超长随意皮瓣存活药物的作用，其特征在于：所述芹菜素以10mg/ml含量的溶剂形式给药，芹菜素溶剂的溶剂为玉米油。

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