CN111961707B - 一种核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分析中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分析中的应用，通过第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合进行酶切打断，捕获固定片段范围的DNA序列，然后对捕获的特定序列进行测序，在基因组平均测序深度3×以上时，即可在全基因组范围内进行SNP分析，通过家系样本连锁分析进行胚胎平衡易位等检测。该方法降低了全基因组测序所需要的数据量，同时保证了有效SNP位点及其深度，增加了可用单体型构建的SNP位点数量，以很低的测序数据量，获得足量覆盖全基因组的能用来分析单体型的SNP和indels，也无需针对SNP设计多重PCR引物，大大降低所需数据量和检测成本。

Description

一种核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分 析中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分析中的应用。

背景技术

简化基因组测序是通过限制性内切酶切开基因组DNA，对指定部分采用高通量测序，并得到大量遗传多态性标签序列，以将物种全基因组的测序对策充分展现出来的方法。该方法可减少基因组的复杂度，实施过程简便，节约成本，同时不依靠参考基因组也能得到全基因组中的遗传多态性标签，因此广泛应用于分子标记开发、遗传图谱构建、基因/QTL定位和全基因组关联分析及群体遗传分析与分子育种领域。但现有简化基因组测序可捕获的SNP数目少（一般少于20万个），并且其建库流程相对复杂，或者需要经历末端修复、dA尾添加等繁琐建库流程，或者需要使用Pippin或胶回收等进行片段分选。另外其文库构建方法兼容性低，只能对某一测序平台展开，无法灵活兼容多种高通量测序平台。综合上述原因，导致简化基因组测序鲜少在辅助生殖领域得以应用和推广。

胚胎植入前遗传学检测（Preimplantation Genetic Testing，PGT）是指在体外受精的胚胎移植前，取胚胎的遗传物质进行分析，诊断是否有异常，筛选健康胚胎移植，防止遗传病传递的方法。目前，PGT过程中常用的技术手段有荧光原位杂交（FISH）、SNP全基因组微阵列芯片（SNP-array）和高通量测序（NGS）等。基于高通量测序技术的检测方法是在体外受精后的胚胎发育至3~5天时，取8细胞期的卵裂球细胞或者囊胚期的滋养层细胞，进行单细胞全基因组扩增得到基因组DNA，然后构建测序文库进行测序，根据测序结果进行后续分析。

但是，为了获得胚胎遗传病携带情况，在构建文库时通常需要针对遗传病基因上下游紧密连锁的SNP位点设计多重引物对进行扩增，且需要获得很高的数据量以保证有效SNP位点及其测序深度，检测耗时且成本较高。并且每次针对不同遗传病，需要重新单独设计多重SNP位点扩增引物，然后需要对多重引物对进行验证测试和优化，并在真正检测胚胎前，还需要先进行家系（含夫妻双方和先证者）预实验，在预实验结果能够获得足量有效SNP位点的情况下，才可以展开胚胎样本的检测。这种传统方法整个检测周期过长，失败风险高，不利于临床应用推广，同时因仅针对遗传病基因上下游的少量SNP位点捕获测序，极易因同源重组而导致分析错误。

发明内容

基于此，有必要提供一种可降低全基因组测序所需要的数据量且无需针对SNP设计多重引物的核酸文库构建方法。

一种核酸文库构建方法，包括以下步骤：

获取目标人源样本的基因组DNA；

采用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合对所述基因组DNA进行切割得到高密度酶切产物；所述第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合可以在人基因组上平均每1Mb区段内产生2000~5000个酶切位点，并在其酶切片段两端产生2~5nt的粘性末端；

将所述酶切产物与测序接头连接，得到连接产物；所述测序接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头能够与所述第一核酸内切酶切割产生的粘性末端互补，所述第二接头能够与所述第二核酸内切酶切割产生的粘性末端互补；

从所述连接产物中筛选获得200bp~400bp的片段；

最后使用高通量测序平台通用引物进行PCR扩增，得到测序文库。

在其中一个实施例中，所述第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合为MboI和NspI，BfaI和TaqI，或者MboI和MspI。

在其中一个实施例中，所述第一接头的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二接头的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

在其中一个实施例中，所述高通量测序平台通用引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物能与所述第一接头互补配对，所述下游引物能与所述第二接头互补配对且具有barcode序列。

在其中一个实施例中，所述上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

在其中一个实施例中，在所述切割的步骤中，所述第一核酸内切酶和所述第二核酸内切酶的体积比为1:(0.8~1.2)。

在其中一个实施例中，采用磁珠分选的方法从所述连接产物中筛选获得200bp~400bp的片段。

在其中一个实施例中，获取所述基因组DNA的步骤包括以下步骤：从发育至卵裂期或囊胚期的胚胎获取细胞，并对细胞中的DNA进行全基因组扩增。

在其中一个实施例中，还包括以下步骤：对所述测序文库的浓度进行测定。

本发明还提供了一种基于简化基因组测序的植入前胚胎染色体结构异常分析方法，包括以下步骤：采用上述核酸文库构建方法构建胚胎样本和所述胚胎样本的至少一种亲本的测序文库，然后进行测序，根据测序结果分析所述胚胎样本的染色体。

在其中一个实施例中，所述分析的步骤具体包括：分析染色体结构变异和分析染色体非整倍体变异。

本发明的核酸文库构建方法利用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合对全基因组进行酶切，该第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合可以在人基因组上平均每1Mb区段内产生2000~5000个酶切位点，酶切位点分布均一、覆盖>95%基因组窗口、酶切片段主要分布在100bp~600bp，并且在酶切片段两端产生2~5nt的粘性末端。不同于随机法酶切，我们采用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合仅针对全基因组中特定区域（10%~20%）酶切，目的在于定向捕获而不仅仅是片段化，然后通过筛选获得需要大小的捕获片段进行测序，使得同样数据量拥有更高测序深度，更多有效信息。采用本发明的核酸文库构建方法，通过低数据量（20M、40M、80M）二代测序，可以获得≥90万个SNP位点，≥15万indel（插入缺失标记），其中超过10×测序深度SNP位点≥50万个。本发明以简化基因组测序技术为基础，筛选出优势核酸内切酶组合以获得足量用于全基因组分型的有效SNP位点，同时采用特定测序接头和磁珠法分选策略简化了文库构建流程，建立了一套无需设计多重引物对捕获SNP进行胚胎植入前遗传学分析的技术体系，降低了全基因组测序所需的数据量，且能够一次实验同时进行染色体结构异常分析、染色体非整倍体异常分析。

附图说明

图1为本发明一实施例的核酸文库构建方法的原理示意图；

图2为本发明一实施例的测序接头的结构示意图；

图3为实施例1中5481101E胚胎的检测结果散点图（整倍体）；

图4为实施例1中5481102E胚胎的检测结果散点图（整倍体）；

图5为实施例1中5481103E胚胎的检测结果散点图（整倍体）；

图6为实施例1中5481104E胚胎的检测结果散点图（del(8)(p23.3p23.1);dup(14)(q23.2q32.33)）；

图7为实施例1中5481105E胚胎的检测结果散点图（del(8)(p23.3p23.1); dup(14)(q23.2q32.33)）；

图8为实施例1中各胚胎8号染色体平衡易位分析结果；

图9为实施例1中各胚胎14号染色体平衡易位分析结果；

图10为实施例2中细胞系的检测结果散点图（del(8)-5.2M）。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和／或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

术语解释

染色体是组成细胞核的基本物质，是基因的载体。染色体结构异常是指染色体或染色单体经过断裂-重换或互换机理可产生染色体畸变（chromosome aberration）及染色单体畸变（chromatid aberration）。染色体相互易位是最常见的染色体结构异常，主要是指非同源染色体之间相互交换染色体片段。

平衡易位是指两条不同源的染色体各发生断裂和错误拼接而形成两条结构上重排的染色体，包括相互易位和罗氏易位。由于染色体平衡易位保留原有基因总数，所以平衡易位携带者个体没有明显疾病表型，但多存在生殖障碍。主要是由于平衡易位的携带者减数分裂时可能产生不平衡配子，继而导致某一遗传物质减少或增加，破坏遗传物质的平衡，最终导致胎儿畸形或不孕不育。理论上，两条染色体平衡易位携带者在减数分裂中可形成四射体，根据其分离方式的不同，可以产生的配子类型也多种多样，一般认为通过2:2分离和1:3分离可以产生至少18种不同配子，另外4:0分离可以产生10种配子，研究表明4:0的几率均比较小，常见的分离方式为2:2分离。非同源染色体罗氏异位携带者产生的6种配子中，1/6为正常配子，1/6为携带型，4/6为异常配子。平衡易位患者与正常人生育时，由于配子分离类型导致胚胎中会出现染色体整倍体、不平衡易位产生的单体或三体、平衡易位携带者等情况。染色体非整倍体是导致不明原因的流产、畸胎、不孕不育以及死胎的主要原因。

FISH技术是利用荧光标记探针原位杂交待测样本核酸序列，通过荧光显微镜对DNA进行染色体结构数目分析的方法。对胚胎细胞的特定染色体进行FISH探针杂交检测，可以在荧光显微镜下观察到所检测的染色体是否发生了易位及拷贝数变异常。FISH技术虽具有快速、灵敏等优点。但局限性在于通量较低，由于荧光显微镜目前只能同时观察5种不同染色体探针的荧光信号，若要分析更多数目的染色体，则需进行二轮或更多轮杂交。但是单细胞进行多轮杂交会增加错误率，因此FISH只能对有限的染色体进行检测，无法对所有的染色体非整倍体情况进行检测。

SNP全基因组微阵列芯片（SNP array）是含有大量SNP位点的高密度微阵列芯片，大多数SNP芯片可以检测60万以上SNP。分析等位基因杂合子的信号强度比例，不仅可以检测出整个染色体的拷贝数变异，还能通过家系全基因组范围内的SNP连锁分析，对平衡易位携带胚胎及正常胚胎进行区分。基于SNP array的检测技术，已成功用于区分正常胚胎和平衡易位携带者胚胎。但该技术采用的是固定已知变异的探针，可更改性灵活性较差，对于一些复杂区域杂交后位点较少，杂交后存在背景干扰存在分型失败的风险。对于胚胎样本的检测，CNV检测灵敏度也不高，不能检测10M以下的CNV，对于嵌合体的检测效果不好。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性；单体型（Haplotype）指位于一条染色体特定区域的一组相互关联，并倾向于以整体遗传给后代的单核苷酸多态的组合，又称单倍体型或单元型；测序深度即例如在一个实施方案中，测序深度为1000X，则代表该条特异PCR扩增产物被测序1000次。

PGT-SR是靶向检测胚胎染色体是否存在倒位、平衡易位和罗氏易位，等同于原PGD中的一部分。其中，SR指的是“chromosomal structural rearrangements（染色体结构异常）”。PGT-A是检测胚胎染色体是否存在非整倍体的技术，等同于原PGS。其中，A指的是“aneuploidy（非整倍性）”。PGT-M是靶向检测胚胎是否携带某些可导致单基因病的突变基因，等同于原PGD中的一部分。其中，M指的是“monogenic/single gene defects（单基因疾病或缺陷）”。

本发明一实施例的核酸文库构建方法，包括以下步骤S1~S5：

S1、获取目标人源样本的基因组DNA。

S2、采用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合对基因组DNA进行切割得到高密度酶切产物。该第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合可以在人基因组上平均每1Mb区段内产生2000~5000个酶切位点，并在其酶切片段两端产生2~5nt的粘性末端。

S3、将酶切产物与测序接头连接，得到连接产物。测序接头包括第一接头和第二接头，第一接头能够与第一核酸内切酶切割产生的粘性末端互补，第二接头能够与第二核酸内切酶切割产生的粘性末端互补。

S4、从连接产物中筛选获得200bp~400bp的片段；

S5、最后使用高通量测序平台通用引物进行PCR扩增，得到测序文库。

本发明的核酸文库构建方法利用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合对全基因组进行酶切，该第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合可以在人基因组上平均每1Mb区段内产生2000~5000个酶切位点，酶切位点分布均一、覆盖>95%基因组窗口、酶切片段主要分布在100bp~600bp，并且在酶切片段两端产生2~5nt的粘性末端。不同于随机法酶切，我们采用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合仅针对全基因组中特定区域（10%~20%）酶切，目的在于定向捕获而不仅仅是片段化，然后通过筛选获得需要大小的捕获片段进行测序，使得同样数据量拥有更高测序深度，更多有效信息。采用本发明的核酸文库构建方法，通过低数据量（20M、40M、80M）二代测序，可以获得≥90万个SNP位点，≥15万indel（插入缺失标记），其中超过10×测序深度SNP位点≥50万个。

因此，采用本发明的核酸文库构建方法可以在基因组平均测序深度3×以上时，在全基因组范围内进行SNP分析，通过家系样本连锁分析进行胚胎平衡易位等检测。该方法降低了全基因组测序所需要的数据量，同时保证了有效SNP位点及其深度，增加了可用单体型构件的SNP位点数量，以很低的测序数据量，获得足量覆盖全基因组的能用来分析单体型的SNP和indels，也无需针对SNP设计多重PCR引物，大大降低所需数据量和检测成本。同时对于CNV和嵌合体的检测能力显著增加，能够检测5M以上的CNV及30%以上的嵌合异常。

在一个具体示例中，第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合为MboI和NspI，BfaI和TaqI，或者MboI和MspI，但不限于此。

在一个具体示例中，如表1所示，第一接头的序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，第二接头的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。此为在华大测序平台的两个接头上分别增加了CATG和GATC的粘性末端，从而可与NspI和MboI酶切产生的粘性末端互补。可以理解，用于改造的原始接头序列包括但不限于适用赛默飞、Illumina、华大等测序平台的接头序列，增加的粘性末端序列可根据不同的内切酶进行调整。

表1 接头序列

在一个具体示例中，高通量测序平台通用引物包括上游引物和下游引物，上游引物能与第一接头互补配对，下游引物能与第二接头互补配对且具有barcode序列。如此，在PCR文库扩增的过程中即可带入特定barcode信息，当待测的DNA分子来自多个受试样品时，每个样品可以被加上不同的标签序列（barcode），以用于在测序过程中进行样品的区分，从而实现同时对多个样品进行测序。

在一个具体示例中，如表2所示，上游引物的序列如SEQ ID NO:5所示，下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。此为针对上述华大测序平台的两个接头的通用引物，可以理解，当采用不同的测序接头时，通用引物的序列可以根据需要调整。

表2引物序列

可选地，在切割的步骤中，第一核酸内切酶和第二核酸内切酶的体积比为1:(0.8~1.2)。

在一个具体示例中，采用磁珠分选的方法从连接产物中筛选获得200bp~400bp的片段。优选地，磁珠为AMPure XP磁珠。

在一个具体示例中，获取基因组DNA的步骤包括以下步骤：从发育至卵裂期或囊胚期的胚胎获取细胞，并对细胞中的DNA进行全基因组扩增。

在一个具体示例中，核酸文库构建方法还包括以下步骤：对测序文库的浓度进行测定。

本发明一实施例的基于简化基因组测序的植入前胚胎染色体结构异常分析方法，包括以下步骤：采用上述核酸文库构建方法构建胚胎样本和该胚胎样本的至少一种亲本（如父亲样本和母亲样本）的测序文库，然后进行测序，根据测序结果分析胚胎样本的染色体。

可以理解，该检测方法的检测对象是未植入子宫的胚胎，不是以有生命的人体或者动物体为对象，其检测结果也不涉及其亲代双方的疾病诊断结果，因此不属于疾病的诊断和治疗方法。此外，该方法还可用于对已经死亡的胚胎样本进行检测等非疾病诊断和治疗目的的应用。

可选地，亲代双方的样本选自外周血基因组DNA、精液DNA、口腔粘膜细胞DNA和细胞全基因组扩增产物中的一种或多种。优选地，每份样本中的DNA含量大于500ng。

在一个具体示例中，分析的步骤具体包括：分析染色体结构变异、分析染色体非整倍体变异、分析单基因遗传病和/或分析拷贝数变异等。

在一个具体示例中，对于家族遗传性的平衡易位家系，使用上述核酸文库构建方法对平衡易位携带者夫妇、至少一名易位携带者的亲属及夫妇产生的胚胎构建测序文库，然后进行测序，对测序获得的全基因组序列进行SNP分析，选取夫妇中易位携带者一方杂合、另一方纯合且易位携带者的亲属纯合的SNP位点作为有效SNP位点，对所有样本的这些有效SNP位点进行分析，构建所有样本的单体型图谱，从而确定易位携带者异常的染色单体。定位平衡易位断裂点所在的区域，根据断裂点上下游1~5M范围内的单体型，判断胚胎是否携带了异常的染色单体，从而确定胚胎是否携带了平衡易位。

还可对测序数据进行全基因组CNV分析，分析方法：通过BWA软件将单细胞扩增后经DNA测序得到的碱基序列与人类基因组标准序列hg19进行比对，确定测序获得的每条碱基序列在染色体上的确切位置。去除低质量的、多匹配和非完全匹配到染色体上的碱基序列，确保测序数据的准确性以及每条碱基序列定位的唯一性。将整个染色体划分成100kb片段大小的非重叠区域，进而计算每个100kb窗口上得到的惟一匹配序列数目。进行GC含量偏差校正，窗口合并，均一化窗口数据。与参考数据进行对比，计算log2RR，通过CBS计算断裂点，计算拷贝数，再经过注释生成最终结果。

在一个具体示例中，对于新发的平衡易位携带者家系，使用上述核酸文库构建方法对平衡易位携带者夫妇及夫妇产生的胚胎构建测序文库，然后进行测序。首先对胚胎进行全基因组CNV分析，分析方法同上所述。挑选出由平衡易位导致染色体拷贝数变异的胚胎E1，然后对测序获得的全基因组序列进行SNP分析，选取夫妇中易位携带者一方杂合，另一方纯合的SNP位点作为有效SNP位点，对所有样本的这些有效SNP位点进行分析，构建所有样本的单体型图谱，根据分离定律，其中E1胚胎必然遗传了亲本中异常的染色单体，从而确定易位携带者异常的染色单体。定位平衡易位断裂点所在的区域，根据断裂点上下游1~5M范围内的单体型，判断其他胚胎是否携带了异常的染色单体，从而确定胚胎是否携带了平衡易位。

本发明的植入前胚胎染色体分析方法无需针对不同疾病设计多重PCR引物，可获得全基因组足量SNP位点和indel位点，能同时完成23对染色体的非整倍体筛查。且目标基因所在整条染色体的覆盖，可减少同源重组对分析的影响，通过家系分析有效分析胚胎染色体结构异常成功率高，适用于确定的罗氏易位和相互易位家系中正常胚胎和携带者胚胎。

以下为具体实施例。

实施例1 平衡易位遗传家系胚胎检测

募集了1个接受辅助生殖的染色体平衡易位携带者家庭（已有芯片检测结果），家系信息见表3。抽取平衡易位携带者和妻子以及携带者遗传自亲本一方的外周血样本（共三份血样）各5mL，于EDTA抗凝采血管中保存，同时获取该夫妻5枚胚胎活检样本经过全基因组扩增后的产物。家系基因组DNA采用全血提取试剂盒进行抽提。使用本发明的方法进行胚胎植入前染色体平衡易位分析。

表3 平衡易位家系染色体核型表（芯片结果）

原理如图1所示，首先通过一组核酸内切酶识别基因组上的特定酶切位点，对基因组DNA进行基因组切割，使基因组DNA被打断成固定片段的序列，打断的片段两端形成内切酶切割后留下的粘性末端结构。设计两种能够与内切酶切割产生的粘性末端互补的测序接头，将接头与打断后的基因组序列连接，经过PCR扩增形成测序文库。构建好的测序文库进行特定长度的片段富集后进行上机测序，每个样本所需测序数据为≥8Gb。测序接头结构如图2所示，包括与酶切片段粘性末端互补的序列以及不同测序平台的原始测序接头序列。

1.酶切

胚胎样本采用QIAGEN REPLI-g Single Cell Kit或TaKaRa PicoPLEX SingleCell WGA kit进行全基因组扩增。准备500ng DNA补水至17µL，按下表4配置酶切混合液Mix1，将3µL的酶切混合液Mix1加入到样本中，用枪吹打混匀，短暂离心。

表4 酶切混合液

将离心后的DNA放入PCR仪，PCR仪设置程序如下表5所示。

表5 PCR程序

2.接头连接

本实施例采用华大测序平台两个接头：

接头1：5’-GAACGACATGGCTACGATCCGACTTCATG-3’和5’-AAGTCGGATCGTAGCCATGTCGTTC-3’；

接头2：5’-GATCAAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3’和5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3’

按照下表6配制接头混合液Mix2，将5µL接头混合液Mix2加入到酶切后DNA中，用枪吹打混匀，短暂离心。

表6 接头混合液

将离心后的DNA放入PCR仪，PCR仪设置程序如下表7。

表7 PCR程序

按照下表8配制连接酶混合液Mix3，将5µL连接酶混合液Mix3加入到上述接头DNA中，用枪吹打混匀（不要涡旋），短暂离心。

表8 连接酶混合液

将离心后的DNA放入PCR仪，PCR仪设置程序如下表9。

表9 PCR程序

3.片段筛选

补水到100µL然后加入AMPure XP磁珠60µL，用枪吹打混匀，室温放置5分钟，放置到磁力架上，等液体清亮，转移上清转移到新的EP管子中，加入AMPure XP磁珠20µL，室温放置5分钟，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用200µL的80%酒精清洗，室温干燥后用22µL Low TE洗脱。

4.浓度测定

吸取2µL样本进行Qubit浓度测定。

5.PCR扩增

取10ng筛选的片段进行文库PCR扩增。按照下表10配制PCR反应混合液Mix4。

PCR引物：F: 5’-GAACGACATGGCTACGA-3’

R: 5’-TGTGAGCCAAGGAGTTG(barcode) TTGTCTTCCTAAGACCGC-3’

表10 PCR反应混合液

取片段筛选后的样本20µL到PCR管中，加入28.75µL PCR反应混合液Mix4，然后加入含barcode的特异性引物1.25µL，混合短暂离心。放入PCR仪中，程序设置如下表11所示。

表11 PCR程序

6.文库纯化

反应结束后，短暂离心，加入AMPure XP磁珠50µL，用枪吹打混匀，室温放置5分钟，放置到磁力架上，等液体清亮，去上清，用200µL的80%酒精清洗，重复一次，室温干燥磁珠，用40µL Low TE进行磁珠重悬，洗脱DNA。

7.浓度测定

吸取2µL样本进行Qubit浓度测定。

8.上机测序

根据接头类型选择二代平台进行上机测序，本实施例采用华大测序平台测序。

9.数据分析

将上机获得测序数据与参考基因组进行数据分析和对比，数据经过变异识别，得到SNP位点，通过构建遗传图谱，鉴定胚胎染色体的结构是否存在异常，进而区分平衡易位携带者胚胎或者正常胚胎。

10.检测性能

能检测大于等于5M以上的缺失，能检测确定的平衡易位家系中（罗氏易位的和相互易位）胚胎遗传情况。

11.检测结果

如图3~7所示分别为5个胚胎样本的PGT-A检测结果。如图8所示为各胚胎8号染色体平衡易位分析结果，本次以男方母亲为参考样本，图谱中单体型分析从左至右依次为男方、女方、参考样本（男方母亲）、5481101E胚胎、5481102E胚胎、5481103E胚胎、5481104E胚胎和5481105E胚胎。如图9所示为各胚胎14号染色体平衡易位分析结果，本次以男方母亲为参考样本，图谱中单体型分析从左至右依次为男方、女方、参考样本（男方母亲）、5481101E胚胎、5481102E胚胎、5481103E胚胎、5481104E胚胎和5481105E胚胎。

由于本次受检者男方为易位携带者，易位涉及的染色体为8号和14号染色体，即包括1条正常的8号染色单体、1条正常的14号染色单体和2条易位的染色单体（8p23和14q24易位），根据男方母亲的检测结果，推测男方遗传了母源的2条易位的染色单体，遗传了父源正常的1条8号染色单体和1条14号染色单体。故男方母亲与男方一样颜色的8号和14染色单体颜色为异常色（蓝色），反之，男方另一条染色单体的颜色为正常色（红色）。结合胚胎染色体拷贝数变异检测结果可知：5481101E号胚胎是平衡易位携带者；5481102E号胚胎是平衡易位携带者；5481103E号胚胎是平衡易位携带者；5481104E号胚胎在8号和14号染色体发生拷贝数变异，因此为不平衡易位型胚胎；5481105E号胚胎在8号和14号染色体发生拷贝数变异，因此为不平衡易位型胚胎。

实施例2

采用染色体非整倍体细胞系样本（5细胞）详情见下表12，采用MDA法进行全基因组扩增。

表12 细胞系样本详情

按照实施例1的方法进行检测，细胞系PGT-A数据分析结果如图10所示，检测结果显示该方法能检测5M以上的缺失。

对比例1

本对比例1采用SNP-array芯片（Karyomapping基因芯片）技术对实施例1的胚胎样本进行检测。

对实施例1和对比例1各染色体有效数据进行比较，下表13以5481105E号胚胎为例对各染色体有效位点进行比较，表格中显示实施例1的有效位点数据（胚胎样本）比芯片位点多。

表13 案例1中胚胎各染色体有效位点与芯片进行比较

实施例3

本实施例的方法与实施例1基本相同，区别仅在于内切酶组合分别采用BfaI和TaqI，或者MboI和MspI，同样能够在低数据量下获得足量的SNP位点和indel位点，通过构建遗传图谱，鉴定胚胎染色体的结构是否存在异常，进而区分平衡易位携带者胚胎或者正常胚胎。

对比例2

本对比例2采用NspI和TaqI的组合对基因组DNA进行酶切，其他步骤与实施例1相同。

对实施例1和对比例2各染色体有效数据进行比较，下表14以5481105E号胚胎为例对各染色体有效位点进行比较，表格中显示对比例2的酶切组合有效位点数据（胚胎样本）显著低于实施例1的酶切组合，说明本发明的核酸内切酶组合方式并非可以任意选择。

表14 实施例1和对比例2中胚胎各染色体有效位点比较

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 苏州贝康医疗器械有限公司

<120> 一种核酸文库构建方法及其在植入前胚胎染色体结构异常分析中的应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaacgacatg gctacgatcc gacttcatg 29

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

aagtcggatc gtagccatgt cgttc 25

<210> 3

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gatcaagtcg gaggccaagc ggtcttagga agacaa 36

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgtcttcct aagaccgctt ggcctccgac tt 32

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaacgacatg gctacga 17

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tgtgagccaa ggagttgttg tcttcctaag accgc 35

Claims (10)

1.一种核酸文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

获取目标人源样本的基因组DNA；

采用第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合对所述基因组DNA进行切割得到高密度酶切产物；所述第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合可以在人基因组上平均每1Mb区段内产生2000~5000个酶切位点，并在其酶切片段两端产生2~5nt的粘性末端；所述第一核酸内切酶和第二核酸内切酶组合为MboI和NspI，BfaI和TaqI，或者MboI和MspI；

将所述酶切产物与测序接头连接，得到连接产物；所述测序接头包括第一接头和第二接头，所述第一接头能够与所述第一核酸内切酶切割产生的粘性末端互补，所述第二接头能够与所述第二核酸内切酶切割产生的粘性末端互补；

从所述连接产物中筛选获得200bp~400bp的片段；

最后使用高通量测序平台通用引物进行PCR扩增，得到测序文库。

2.根据权利要求1所述的核酸文库构建方法，其特征在于，所述第一接头的序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示，所述第二接头的序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

3.根据权利要求1所述的核酸文库构建方法，其特征在于，所述高通量测序平台通用引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物能与所述第一接头互补配对，所述下游引物能与所述第二接头互补配对且具有barcode序列。

4.根据权利要求3所述的核酸文库构建方法，其特征在于，所述上游引物的序列如SEQID NO:5所示，所述下游引物的序列如SEQ ID NO:6所示。

5.根据权利要求1所述的核酸文库构建方法，其特征在于，在所述切割的步骤中，所述第一核酸内切酶和所述第二核酸内切酶的体积比为1:(0.8~1.2)。

6.根据权利要求1~5任一项所述的核酸文库构建方法，其特征在于，采用磁珠分选的方法从所述连接产物中筛选获得200bp~400bp的片段。

7.根据权利要求1~5任一项所述的核酸文库构建方法，其特征在于，获取所述基因组DNA的步骤包括以下步骤：从发育至卵裂期或囊胚期的胚胎获取细胞，并对细胞中的DNA进行全基因组扩增。

8.根据权利要求1~5任一项所述的核酸文库构建方法，其特征在于，还包括以下步骤：对所述测序文库的浓度进行测定。

9.一种基于简化基因组测序的植入前胚胎染色体结构异常分析方法，其特征在于，包括以下步骤：采用权利要求1~8任一项所述的核酸文库构建方法构建胚胎样本和所述胚胎样本的至少一种亲本的测序文库，然后进行测序，根据测序结果分析所述胚胎样本的染色体。

10.根据权利要求9所述的植入前胚胎染色体结构异常分析方法，其特征在于，所述分析的步骤具体包括：分析染色体结构异常和分析染色体非整倍体异常。

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