CN111944052B

CN111944052B - 抗TNF-α/PD-1双特异性抗体及其应用

Info

Publication number: CN111944052B
Application number: CN202010870619.3A
Authority: CN
Inventors: 刘煜; 纪雪梅; 毛颖清; 陈岳; 张祎帆
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2020-08-26
Filing date: 2020-08-26
Publication date: 2022-02-11
Anticipated expiration: 2040-08-26
Also published as: CN111944052A

Abstract

本发明公开了一种抗TNF‑α/PD‑1双特异性抗体及其用途。本发明使用抗人PD‑1抗体与抗人TNF‑α抗体构建成一个双特异性抗体，该双特异性抗体可以中和促进肿瘤细胞增殖的TNF‑α，同时与PD‑1结合，阻断肿瘤细胞与T细胞之间的PD‑1/PD‑L1信号，有效杀伤肿瘤细胞，具有良好的生物学活性和应用前景。

Description

抗TNF-α/PD-1双特异性抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，特别涉及一种抗TNF-α/PD-1双特异性抗体及其应用。

背景技术

双特异性抗体(Bispecific antibodies，BsAbs)可以同时识别相同或不同抗原上的两个不同表位，克服传统单抗的缺点并改善其疗效，能够应用于多个治疗领域，比如：癌症、慢性炎症疾病以及自身免疫疾病等。BsAbs目前已成为抗体工程领域的热点，在肿瘤的免疫治疗中具有广阔的应用前景。BsAbs具有以下优势：(1)介导免疫细胞对肿瘤的杀伤，BsAbs有两条抗原结合臂，其中一条与靶抗原结合，另一条与效应细胞上的标记抗原结合，后者可以激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞；(2)双靶点信号阻断，发挥独特的或重叠的功能，有效防止耐药；(3)具备更强特异性、靶向性和降低脱靶毒性；(4)有效降低治疗成本，相对于组合疗法，BsAbs的成本远远低于两个单药联合治疗。

BsAbs按照结构可以分为两大类：包含Fc区(IgG-like)的BsAbs和不含Fc区(non-IgG-like)的BsAbs。IgG-like的BsAbs保留了恒定区的相应功能，另外其分子量相对较大，故具有较高稳定性和较长半衰期，也更有利于抗体产物的纯化，但其组织渗透率也相对较低。生产BsAbs的主要技术难点在于获得正确配对的BsAbs，目前已经开发了大约23个生产BsAbs的平台技术，包括DuoBody、DVD-Ig、DAF、KiH(Knob-into-hole)和CrossMab等技术。KiH技术是解决HC/HC匹配问题的一大突破，KiH在其中一条重链的CH3区引入突变，形成一个凸起的类似“杵”的结构，在另一条重链的CH3区引入突变形成一个凹陷的“臼”的结构，杵臼结构设计利于两条异源抗体重链的正确匹配。CrossMab技术由Roche开发，涉及对Fab区其中一对HC(Heavy Chain)和LC(Light Chain)的结构域进行互换来解决LC/HC错配问题，这种互换技术保留了原始的抗原亲和力，包括CrossMab^CH1-CL、CrossMab^VH-VL、CrossMab^Fab三种方式。使用CrossMab和KiH两种技术可同时克服LC/HC和HC/HC错配问题。

肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α，TNF-α)属于II型膜蛋白，主要由活化的单核巨噬细胞分泌，以三聚体的形式发挥作用。TNF-α对肿瘤细胞具有双刃剑功能，低浓度的TNF-α具有促肿瘤作用，Egberts等用TNF-α治疗小鼠胰腺癌模型导致肿瘤显著生长和转移。多项研究发现肿瘤微环境中微量的TNF-α还能促进动物胸腔、皮肤和肠道肿瘤的生长和扩散。Rao等研究发现，小鼠接受抗TNF-α抑制剂可以改善肠道病变，和未经抗体治疗的小鼠相比，鼠小肠上皮异常增生和肿瘤浸润显著减少。TNF-α抑制剂英夫利昔单抗大大降低转移性乳腺癌细胞株MDA-MB-231细胞的侵袭、转移以及小鼠乳腺癌模型骨转移。晚期实体瘤的临床试验表明，英夫利昔单抗治疗后，血浆CCL2、IL-6和血清CRP降低，大约20％的晚期癌症患者病情趋于稳定。TNF-α抑制剂依那西普二期临床研究中，30例晚期卵巢癌患者中的6个表现为疾病长期稳定，其他TNF-α抑制剂的临床试验也证明了其安全有效性。

程序性死亡受体1(Programmed cell death protein 1，PD-1)为CD28超家族成员之一，主要表达于淋巴细胞，也有研究表明在某些肿瘤组织如黑色素瘤，非小细胞肺癌等也呈阳性表达。肿瘤细胞表面的程序性死亡配体1(Programmed cell death 1ligand 1，PD-L1)与PD-1相互作用，抑制机体的免疫反应，因此阻断PD-1/PD-L1相关信号通路对于解除机体免疫抑制，抑制肿瘤免疫逃逸具有重要的意义。FDA批准纳武单抗(nivolumab，商品名Opdivo)和帕博利珠单抗(pembrolizumab，商品名Keytruda)用于晚期黑素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌的治疗，它们在多种实体瘤和血液学恶性肿瘤中的疗效在多项研究中得到证实，现今肿瘤免疫治疗已经成为对抗肿瘤的有效手段。

一些患者在接受免疫治疗后出现的恶心、呕吐、腹泻、皮疹、瘙痒等症状，称为免疫相关性不良反应(Immune-related adverse events，irAEs)，这些副作用是由于免疫应答高度活跃引发的自身免疫疾病或炎症。研究发现，伊匹单抗(ipilimumab，商品名Yervoy)与nivolumab联用导致结肠癌小鼠模型中肠道组织TNF-α浓度增加，结肠炎症状加重，当施加TNF-α抑制剂中和TNF-α后，结肠炎症状减轻，肿瘤浸润的CD8⁺T细胞(CD8⁺TILs)活性增加，进而提高了抗肿瘤效果。此外，在黑素瘤小鼠模型中施加PD-1抑制剂导致TNF-α浓度增加，促进CD8⁺T由于细胞活化诱导的细胞死亡，提高PD-L1表达，抑制抗肿瘤反应，若同时阻断PD-1和TNF-α，可以抑制CD8⁺T细胞死亡，提高抗肿瘤效果。

综上所述，共靶向PD-1和TNF-α的双特异性抗体，一方面可以通过中和TNF-α和阻断PD-1/PD-L1通路的作用实现抗肿瘤效应。另一方面由于PD-1抗体治疗会引发TNF-α的浓度升高，通过中和TNF-α，可以减轻irAEs，增加CD8⁺T细胞活性，提高PD-1抗体的作用效果，实现TNF-α和PD-1两种抗体组合的协同抗肿瘤作用。因此，开发共靶向PD-1和TNF-α的双特异性抗体具有重要的临床意义和应用价值。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种抗TNF-α/PD-1双特异性抗体(Anti-TNF-α/PD-1CrossMab)，该抗体共靶向PD-1和TNF-α。本发明还提供了抗TNF-α/PD-1双特异性抗体的应用。

技术方案：本发明第一方面提供了一种双特异性抗体，由抗人PD-1抗体和抗人TNF-α抗体联合构建而成，本发明的双特异性的抗体包括两条重链和两条轻链，构建的方法如图16所示，抗人PD-1重链的Fc段和抗人TNF-α重链的Fc段分别通过定点突变(实现“Knobinto hole”，利于异源抗体重链正确匹配)，抗人PD-1重链的CH1结构域和抗人PD-1轻链的CL结构域进行交换，实现抗体轻链和重链的正确组装。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人PD-1抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的重链可变区含有序列SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的重链可变区含有根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO:5相似的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人PD-1抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的轻链可变区含有根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO:6相似的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人TNF-α抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的重链可变区含有SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的重链可变区含有根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO:7相似的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人TNF-α抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的轻链可变区含有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的轻链可变区含有根据氨基酸编码的简并原则所推演的与SEQ ID NO:8相似的核苷酸序列编码的氨基酸序列。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人PD-1抗体的轻链编码序列含有如SEQ IDNO:10的核苷酸序列。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人PD-1抗体的重链编码序列含有如SEQ IDNO:9的核苷酸序列。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人TNF-α抗体的轻链编码序列含有如SEQ IDNO:12的核苷酸序列。

作为本发明的一种实施方案，所述抗人TNF-α抗体的重链编码序列含有如SEQ IDNO:11的核苷酸序列。

本发明第二方面提供了一种编码所述双特异性抗体的多核苷酸。

本发明第三方面提供了一种表达载体，表达所述双特异性抗体，抗人PD-1抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，抗人PD-1抗体的轻链可变区包含SEQ IDNO:2所示的氨基酸序列，抗人TNF-α抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，抗人TNF-α抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

本发明所述的一种表达所述的双特异性抗体的表达载体，所述表达载体含有编码所述双特异性抗体的核苷酸序列，所述表达载体选自下组：DNA、RNA、病毒载体、质粒、转座子、其他基因转移系统、或其组合，优选哺乳动物细胞表达载体。

本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有所述的多核苷酸或所述的表达载体。

本发明还提供了所述双特异性抗体在制备治疗表达PD-L1和受TNF-α促增殖的肿瘤细胞的药物中的应用。

本发明第五方面提供了所述的双特异性抗体在制备治疗PD-L1阳性肿瘤药物或治疗受TNF-α促进增殖的肿瘤的药物的应用。

本发明的双特异性抗体用于杀伤表达PD-L1的肿瘤细胞，且本发明的双特异性抗体还可用于抑制受TNF-α促进增殖的肿瘤细胞。

本发明第六方面提供了所述双特异性抗体在制备抗癌或癌症检测产品中的应用。

本发明第七方面提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含所述的双特异性抗体。

本发明所述的双特异性抗体是通过以下方法制备：

(1)在合适的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而获得含所述双特异性抗体的培养物；

(2)对步骤(1)中得到的培养物进行纯化和/或分离，获得所述的双特异性抗体。

在另一优选例中，所述的双特异性抗体可以通过Protein A亲和层析纯化获得目标抗体。

有益效果：(1)本发明的双特异性抗体与PD-1和TNF-α均具有良好的抗原结合活性。(2)本发明的双特异性抗体可以阻断PD-1/PD-L1结合，激活T细胞活性。(3)本发明的双特异性抗体可以通过阻断PD-1/PD-L1的结合，中和免疫治疗增加的TNF-α，发挥协同抗肿瘤作用，具有开发成为抗肿瘤药物的潜能。

附图说明

图1为双特异性抗体的Anti-TNF-α质粒构建的琼脂糖凝胶电泳图；图中，A图的1-4泳道为PCR扩增Anti-TNF-αVL区基因，5-8泳道为PCR扩增Kappa基因片段；B图为overlapPCR连接Anti-TNF-αVL区基因和Kappa区基因；C图为PCR扩增pBudCE4.1载体片段；D图的1-4泳道为菌液PCR鉴定Anti-TNF-α轻链基因，5-9泳道为菌液PCR鉴定Anti-TNF-α重链基因；E图的1-4泳道为PCR扩增Anti-TNF-αVH区基因，5-8泳道为PCR扩增Anti-TNF-α恒定区基因；F图为overlap PCR连接Anti-TNFα-VH区基因和恒定区基因；G图为PCR扩增重组TNF-α轻链的pBudCE 4.1载体片段。

图2为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的TNF-α轻链基因正向测序图谱。

图3为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的TNF-α重链基因正向测序图谱。

图4为双特异性抗体的Anti-TNF-α重链基因反向测序图谱。

图5为双特异性抗体的Anti-PD-1质粒构建的琼脂糖凝胶电泳图；图中，A图的1-4泳道为PCR扩增pBudCE 4.1载体片段，5-8泳道为PCR扩增Anti-PD-1轻链基因片段；B图的1-4泳道为PCR扩增Anti-PD-1重链基因片段，5-8泳道为PCR扩增重组PD-1轻链的pBudCE 4.1载体片段；C图的1-4泳道为菌液PCR鉴定Anti-PD-1重链基因，5-8泳道为菌液PCR鉴定Anti-PD-1轻链基因。

图6为双特异性抗体的Anti-PD-1轻链基因正向测序图谱。

图7为双特异性抗体的Anti-PD-1重链基因正向测序图谱。

图8为双特异性抗体的Anti-PD-1重链基因反向测序图谱。

图9为双特异性抗体表达纯化结果；图中，A图为抗体纯化层析谱图；B图为抗体SDS-PAGE电泳图，泳道M：蛋白质分子量标志；泳道1：非还原条件下的抗体条带，分子量在150KD左右；泳道2：还原条件下抗体条带。

图10为双特异性抗体纯化后终产品对TNF-α和PD-L1抗原的亲和力测定；图中，A图为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab与TNF-α亲和力测定结果；B图为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab与PD-1抗原的SPR亲和力测定结果。

图11为双特异性抗体对TNF-α诱导的细胞毒性的抑制作用结果图。

图12为双特异性抗体对TNF-α诱导的细胞毒性的抑制作用中各组的L929细胞形态。

图13为树突状细胞诱导实验结果；图中，A图为物镜10×下聚集成簇的单核细胞；B图为物镜40×成熟的树突状细胞形态；C图为流式鉴定树突细胞CD86表达率；D图为流式鉴定树突细胞PD-L1表达率。

图14为CD4⁺T细胞分选结果；图中，A图：显微镜10×物镜下的PBMC；B图：流式鉴定CD4⁺T细胞分选纯度。

图15为双特异性抗体混合淋巴细胞反应结果图。

图16为双特异性性抗体的结构示意图。

图17为五种肿瘤细胞表面的PD-L1表达鉴定结果，图中A-E图依次为MDA-MB-231、A549、HT-29、TE-13、H157细胞。

图18为TNF-α对三种肿瘤细胞的促增殖作用，图中A-C图依次为TNF-α对A549、HT-29和MDA-MB-231三种细胞的促增殖结果。

图19为MDA-MB-231肿瘤球，图中A-C图分别为肿瘤球中活细胞染色、死细胞染色和Merge图。

图20为各组MDA-MB-231肿瘤球细胞活力鉴定结果。

具体实施方式

发明人团队经过广泛而深入的研究，获得了一种抗TNF-α/PD-1双特异性抗体，其包含抗PD-1抗体和抗TNF-α抗体。实验表明，本发明的双特异性抗体对PD-1和TNF-α分子均具有较好的结合活性，同时能够阻断PD-1与PD-L1的相互作用以及中和肿瘤微环境中的TNF-α，具有良好的抗肿瘤活性。

为了更容易理解本发明，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。

如本文所用，术语“本发明的双特异性抗体”、“本发明的双抗”、“抗TNF-α/PD-1双特异性抗体”和“Anti-TNF-α/PD-1CrossMab”具有相同的含义，均指特异性识别和结合与PD-1和TNF-α的双特异性抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是具有相同结构特征的约150kDa的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(LC)和两个相同的重链(HC)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。存在两种类型的轻链，λ和κ。存在五种主要的重链类型，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，重链可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，统称CH)。轻链和重链的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定区(CH)赋予重要的生物性质，如抗体链结合、分泌、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分别称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链可变区(v区)的CDR集合。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中，它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖与抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本发明双抗的亲和力可以通过KD值(解离常数)进行评估或测定，例如表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR)，使用Biacore仪器测量确定。

如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列，然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或SF9(昆虫卵巢细胞)的昆虫细胞；CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、COS7(非洲绿猴SV40转化的肾细胞)、293(人肾上皮细胞系)的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂，如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化抗体。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶，例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL)；9.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：双特异性抗体的Anti-TNF-α质粒构建

(1)Anti-TNF-αVL区基因和Anti-TNF-αKappa区基因扩增及连接

使用P1、P2扩增Anti-TNF-αVL区基因，使用P3、P4扩增Anti-TNF-αKappa区基因，P1、P2、P3、P4引物序列如下：

P1：5’-GACCCAAGCTTGCATTCCTGCGCCATGGCTCCCGTGCAGCT-3’(SEQ ID NO:17)

P2：5’-GAGCGGCCACGGTCCGTTTGATTTCCACCTTGGTCCC-3’(SEQ ID NO:18)

P3：5’-ACCAAGG TGGAAATCAA ACGGACCGTGGCCGCTC-3’(SEQ ID NO:19)

P4：5’-AAGTACTGCTTAAGATCGATGTCGATCAGCACTCGCCCCTGTT-3’(SEQ ID NO:20)

1)Anti-TNF-αVL区基因扩增。反应体系如表1所示；扩增反应条件如表2所示。

表1 Anti-TNF-αVL区基因扩增反应体系

表2 Anti-TNF-αVL区基因扩增反应条件

2)Anti-TNF-αKappa区基因扩增。反应体系如表3所示；扩增反应条件同表2。

表3 Anti-TNF-αKappa区基因扩增反应体系

配制1.5％(w/v)琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，100V、电泳30min。在凝胶成像仪中观察DNA电泳条带，将目标条带的琼脂糖凝胶回收，结果如图1中A图所示，图1中A的1-4泳道和5-8泳道分别为Anti-TNF-αVL区基因和Kappa基因片段，片段大小正确。

3)Overlap PCR连接Anti-TNF-αVL区基因和Anti-TNF-αKappa区基因。反应体系如表4所示；扩增反应条件同表2。

表4 Overlap PCR反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图1中B图所示，图1中B图显示在600bp处出现条带，符合预期。

(2)Anti-TNF-α轻链载体构建

使用P5、P6扩增pBudCE 4.1载体片段。P5、P6引物序列如下：

P5：5’-GCAGGAATGCAAGCTTGGGTC-3’(SEQ ID NO:21)

P6：5’-TCGACATCGATCTTAAGCAGTACTT-3’(SEQ ID NO:22)

1)PCR扩增pBudCE 4.1载体片段。反应体系如表5所示；扩增反应条件如表6。

表5 pBudCE 4.1载体片段基因扩增反应体系

表6 pBudCE 4.1载体片段基因扩增反应条件

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图1中C图所示，图1中C图显示在4000bp处出现条带，符合预期。

2)Anti-TNF-α轻链基因与载体同源重组。反应体系如表7所示。

表7同源重组反应体系

37℃反应30min。

3)重组产物转化

1、取感受态DH5α细胞置于冰浴5min使其融化，取5μl重组产物，加入到50μl感受态细胞中，用移液枪轻轻混匀，在冰上放置30min；

2、42℃热激90s，立即取出，冰水浴孵育2min；

3、加入450μl不含抗生素的LB培养基，37℃孵育10min充分复苏，37℃、150rpm摇菌60min；

4、将培养菌液在3000rpm离心3min后吸除部分培养液，用剩余的100μl LB培养基重悬菌体，之后将菌液均匀涂布在含有博来霉素的LB平板上，将平板置于37℃静止10min，于37℃避光倒置培养，直至出现菌落；

5、挑取单菌落，在含有博来霉素的LB培养基中进行放大培养(37℃，150rpm)直至培养基变浑浊。

4)菌液PCR鉴定。反应体系如表8所示。

表8菌液PCR反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图1中D图所示，1-4泳道为菌液PCR鉴定Anti-TNF-α轻链基因，图1中D图的1-4泳道显示在600bp处出现条带，符合预期，按质粒小提试剂盒说明书步骤进行质粒小提。

(3)Anti-TNF-αVH区基因和Anti-TNF-α恒定区基因扩增及连接

使用P7、P8扩增Anti-TNF-αVH区基因，使用P9、P10扩增Anti-TNF-α恒定区基因，P7、P8、P9、P10引物序列如下：

P7：5’-GGTACCAGCACAGTGGACTCGAGAGCCATGGCCGTGCTGGGACTG-3’(SEQ ID NO:23)

P8：5’-AGGGCCCTTTGTAGAGGCACTCGAGACGGTGACCAGGGTA-3’(SEQ ID NO:24)

P9：5’-CTGGTCACCGTCTCGAGTGCCTCTACAAAGGGCCCTTC-3’(SEQ ID NO:25)

P10：5’-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTCTCACTTGCCGGGGGAC-3’(SEQ ID NO:26)

1)Anti-TNF-αVH区基因扩增。反应体系如表9所示；扩增反应条件同表2。

表9 Anti-TNF-αVH区基因扩增反应体系

2)Anti-TNF-α恒定区基因扩增。反应体系如表10所示；扩增反应条件同表2。

表10 Anti-TNF-α恒定区基因扩增反应体系

配制1.5％(w/v)琼脂糖凝胶，电泳检测PCR产物，100V、电泳30min。在凝胶成像仪中观察DNA电泳条带，将目标条带的琼脂糖凝胶回收，结果如图1中E图所示，图1中E图的1-4泳道和5-8泳道分别为Anti-TNF-αVH区基因和恒定区基因片段，片段大小正确。

3)Overlap PCR连接Anti-TNF-αVH区基因和Anti-TNF-α恒定区基因。反应体系如表11所示；扩增反应条件同表2。

表11 Overlap PCR反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图1中F图所示，图1中F图显示在1500bp左右出现条带，符合预期。

(4)Anti-TNF-α载体构建

使用P11、P12扩增pBudCE 4.1载体片段。P11、P12引物序列如下：

P11：5’-TCTCGAGTCCACTGTGCTGGTACC-3’(SEQ ID NO:27)

P12：5’-GAAGGTAAGCCTATCCCTAACCCT-3’(SEQ ID NO:28)

1)PCR扩增pBudCE 4.1载体片段。反应体系如表12所示；扩增反应条件同表6。

表12 pBudCE 4.1载体片段基因扩增反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图1中G图所示，图1中G图显示在5000bp左右出现条带，符合预期。

2)Anti-TNF-α重链基因与Anti-TNF-α轻链重组pBudCE 4.1质粒同源重组。反应体系如表13所示。

表13同源重组反应体系

37℃反应30min。

3)重组产物转化

实验步骤同上。

4)菌液PCR鉴定。反应体系如表14所示。

表14菌液PCR反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图1中D的5-9泳道所示，图1D的5-9泳道显示在1500bp处出现条带，符合预期，按质粒小提试剂盒说明书步骤进行质粒小提。

5)测序鉴定

Anti-TNF-α重链基因和Anti-TNF-α轻链基因序列与目的基因序列一致。测序结果见图2、图3和图4所示。图2为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的TNF-α轻链基因正向测序图谱，如SEQ ID NO:12所示，TNF-α轻链基因序列与信号肽连接后的序列如SEQ ID NO:15所示，抗TNF-α/PD-1双特异性抗体的抗人TNF-α轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，编码SEQ ID NO:4氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示；图3为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的TNF-α重链基因正向测序图谱，图4为双特异性抗体的Anti-TNF-α重链基因反向测序图谱，如SEQ ID NO:11所示，TNF-α重链基因序列与信号肽连接后的序列如SEQ IDNO:16所示，抗TNF-α/PD-1双特异性抗体的抗人TNF-α重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，编码SEQ ID NO:3氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。

实施例2：双特异性抗体的Anti-PD-1质粒构建

(1)Anti-PD-1轻链载体构建

使用P13、P14扩增Anti-PD-1轻链基因，使用P5、P6扩增pBudCE 4.1载体片段，P13、P14引物序列如下：

P13：5’-GACCCAAGCTTGCATTCCTGCGCCACCATGGCTCCCGTG-3’(SEQ ID NO:29)

P14：5’-AAGTACTGCTTAAGATCGATGTCGACTCGAGTCAGCAGGACTTGGGC-3’(SEQ ID NO:30)

1)Anti-PD-1轻链基因扩增。反应体系如表15所示；扩增反应条件如表2。

表15 Anti-TNF-αVL区基因扩增反应体系

2)PCR扩增pBudCE 4.1载体片段。反应体系如表5所示；扩增反应条件如表6所示。

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图5中A图所示，1-4泳道为PCR扩增pBudCE 4.1载体片段，5-8泳道为PCR扩增Anti-PD-1轻链基因片段，图5中A图的5-8泳道显示在600bp左右出现条带，符合预期。

3)Anti-PD-1轻链基因与载体同源重组。反应体系如表16所示。

表16同源重组反应体系

37℃反应30min。

4)重组产物转化

实验步骤同上。

5)菌液PCR鉴定。反应体系如表17所示。

表17菌液PCR反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图5中C图所示，图5中C图的5-8泳道显示在600bp处出现条带，符合预期，按质粒小提试剂盒说明书步骤进行质粒小提。

(2)Anti-PD-1载体构建

使用P15、P16扩增pBudCE 4.1载体片段。P15、P16引物序列如下：

P15：5’-GGTACCAGCACAGTGGACTCGAGAGTGGAATTCGCCACCATGG-3’(SEQ ID NO:31)

P16：5’-AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTCTCACTTGCCGGGGGAC-3’(SEQ ID NO:32)

1)PCR扩增Anti-PD-1重链基因片段。反应体系如表18所示；扩增反应条件同表6。

表18 pBudCE 4.1载体片段基因扩增反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图5中B图所示，图5中B图的1-4泳道显示在1500bp左右出现条带，符合预期。

2)PCR扩增Anti-PD-1轻链重组pBudCE 4.1载体片段。反应体系如表19所示，扩增反应条件同表6。

表19 pBudCE 4.1载体片段基因扩增反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图5中B图所示，图5中B图的5-8泳道显示在5000bp左右出现条带，符合预期。

3)Anti-PD-1重链基因与Anti-PD-1轻链重组pBudCE 4.1质粒同源重组。反应体系如表20所示。

表20同源重组反应体系

37℃反应30min。

4)重组产物转化

实验步骤同上。

5)菌液PCR鉴定。反应体系如表21所示。

表21菌液PCR反应体系

对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳及凝胶回收，结果如图5中C图所示，图5中C图的1-4泳道显示在1500bp处出现条带，符合预期，按质粒小提试剂盒说明书步骤进行质粒小提。

6)测序鉴定

Anti-PD-1重链基因和Anti-PD-1轻链基因序列与目的基因序列一致。测序结果见图6、图7和图8。图6为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的PD-1轻链基因正向测序图谱，如SEQ IDNO:10所示，PD-1轻链基因序列与信号肽连接后的序列如SEQ ID NO:13所示，该抗TNF-α/PD-1双特异性抗体的抗人PD-1轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码SEQ IDNO:2氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；图7为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的PD-1重链基因正向测序图谱，图8为Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的PD-1重链基因反向测序图谱，如SEQ ID NO:9所示，PD-1重链基因序列与信号肽连接后的序列如SEQ ID NO:14所示，抗TNF-α/PD-1双特异性抗体的抗人PD-1重链可变区氨基酸序列SEQ ID NO:1，编码SEQ IDNO:1氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。

实施例3：双特异性抗体表达纯化

(1)悬浮细胞培养

复苏293F悬浮细胞，在37℃、8％CO₂的摇床中以120rpm的转速进行培养，使用OPM-293 CD05 Medium培养五代至细胞状态稳定，通过台盼蓝染色观察细胞存活率大于90％后，以1×10⁶个cell/ml密度进行传代，传代12-16h后，待细胞密度达到1.5×10⁶个cell/ml时进行转染。

(2)细胞转染

Anti-PD-1质粒和Anti-TNF-α质粒使用量均为2μg/ml，PEI转染试剂使用量为5μg/ml，根据悬浮细胞体积计算质粒和转染试剂用量。将Anti-PD-1质粒和Anti-TNF-α质粒加入5ml OPM-293 CD05 Medium中，轻轻混匀，静置20min。将PEI转染试剂同样加入5ml OPM-293CD05 Medium中，轻轻混匀，静置20min。质粒与转染试剂轻轻混匀，静置5min后加入悬浮细胞中，重新放回摇床中培养。

(3)蛋白纯化

细胞转染后第七天，收集细胞以13000rpm离心，收获上清。采用ProteinA亲和层析纯化，具体步骤为：

1)将ProteinA柱安装在纯化系统上后用平衡缓冲液进行柱平衡，约10倍柱体积，流速为1mL/min。

2)将过滤除杂的上清液进行过ProteinA柱纯化，流速为0.5mL/min，并收集流穿液。

3)上清液过完ProteinA柱后，再用平衡缓冲液清洗柱子，约10倍柱体积至基线平稳。

4)然后用洗脱液洗脱，流速为1mL/min，收集抗体。

将纯化的抗TNF-α/PD-1双特异性抗体进行SDS-PAGE鉴定。抗TNF-α/PD-1双特异性抗体在非还原条件下条带大小为180kDa左右，还原条件下可以看到50kDa左右的重链和25kDa左右的轻链抗体，结果如图9所示。

实施例4：Biacore X100分析双特异性抗体亲和力

(1)用10mM偶联试剂将Anti-Human IgG(Fc)antibody固定在CM5传感器芯片上，随后用乙醇胺封闭表面残留的活化基团，按照Biacore X-100偶联试剂盒说明书要求操作。

(2)将纯化获得的Anti-TNF-α/PD-1CrossMab作为配体，以阿达木单抗和纳武单抗作为阳性抗体，以20μg/ml进样浓度及接触时间为300s来确定亲和力常数值。

(3)分别用HEPES缓冲液稀释的TNF-α或PD-1抗原作为分析物，以起始浓度为400nM或500nM进行倍比稀释，一共稀释7-9个不同的浓度，将不同浓度的分析物依次流过芯片(30μl/min)，分别得到信号曲线。每个浓度作为1个循环，完成1次循环后用3M的MgCl₂再生芯片以回复到原始未结合的状态。

(4)用BIAcore X-100System软件分析实验结果。得到抗体的亲和力和动力学参数。

结果显示，Anti-TNF-α/PD-1CrossMab与PD-1抗原和TNF-α抗原结合的动力学数据如表22所示。其中，Anti-TNF-α/PD-1CrossMab与PD-1抗原的KD＝17.3nM，Anti-TNF-α/PD-1CrossMab与TNF-α抗原的KD＝0.0897nM，结果如图10所示。

表22 SPR实验数据

实施例5：Anti-TNF-α/PD-1CrossMab对TNF-α细胞毒性的抑制作用

(1)将培养好的L929细胞消化并离心，用完全培养基重悬计数并调整浓度至6×10⁴cells/mL，接种于96孔板，6重复，100μL/孔；继续培养12h。

(2)用含有浓度为10ng/ml的TNFα和5μg/mL放线菌素D的完全培养基将Anti-TNF-α/PD-1CrossMab、阳性对照阿达木单抗和阴性对照人IgG稀释梯度浓度为0.1ng/ml、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml、1μg/ml、10μg/ml，100μL/孔，加入相应孔；同时设空白组(无细胞、有培养基)和细胞对照组(有细胞、不加TNFα)和TNF-α对照组(有细胞、加TNF-α)，继续培养24h。

(3)进行MTT检测。

结果显示，Anti-TNF-α/PD-1CrossMab和阿达木单抗(Adalimumab)均能有效中和培养基中的TNF-α，细胞状态与空白组一致，IC50值分别是0.3864nM和0.2826nM，说明Anti-TNF-α/PD-1CrossMab与阿达木单抗的活性相当，人IgG没有TNF-α中和能力，细胞呈现皱缩、凋亡状态，结果如图11和图12所示。

实施例6：Anti-TNF-α/PD-1CrossMab对T细胞的激活作用

(1)PBMC提取

将新鲜的外周血吸取到干净无菌的离心管中，向离心管中加入等体积的PBS，取4ml室温放置的淋巴细胞分离液于15ml灭菌的离心管中，吸取6ml稀释血液沿离心管壁缓慢均匀的加到淋巴细胞分离液的上层，750g水平离心机中离心30min。离心完成后，离心管中的液体分为四层，用1ml的枪头吸取云雾层的细胞于另一干净的离心管中。向装有PBMC的离心管中加入5ml PBS，充分混匀后，500g，离心10min，弃上清。向PBMC中加入适量的RPMI-1640培养基进行细胞计数，根据实验要求进行后续实验或者冻存。

(2)树突状细胞诱导

将(1)中PBMC中加入浓度均为1000U/ml的GM-CSF和IL-4，37℃培养箱中培养，隔天换液，细胞因子(GM-CSF和IL-4)浓度不变。第六天，更换含50ng/mL的TNF-α培养基，24h后收获细胞，进行流式鉴定细胞成熟。

(3)磁珠分选CD4⁺T细胞

提取PBMC，实验步骤同(1)。使用美天旎CD4⁺T细胞磁珠分选试剂盒分选CD4⁺T细胞，通过流式鉴定细胞分选纯度。

(4)混合淋巴细胞反应

将CD4⁺T与树突状细胞以10:1的比例共培养，分别加入不同浓度的阴性对照人IgG、阳性对照纳武单抗和Anti-TNF-α/PD-1CrossMab处理，48h后，用ELISA试剂盒检测上清液中的IFN-γ含量。

结果显示，流式鉴定树突状细胞表面的PD-L1和CD86表达率，分别为77.5％和87.7％，说明树突状细胞已经成熟，如图13所示。流式鉴定CD4⁺T细胞纯度为96.8％，纯度较高，符合实验要求如图14所示。混合淋巴反应中，树突状细胞的PD-L1对CD4⁺T细胞产生免疫抑制，阳性对照纳武单抗和Anti-TNF-α/PD-1CrossMab均能激活T细胞活性，EC50分别为0.2117μg/ml和0.1591μg/ml，而对照组人IgG无激活细胞能力，如图15所示。

实施例7：Anti-TNF-α/PD-1CrossMab的抗肿瘤活性评估

(1)通过流式细胞术筛选高表达PD-L1的肿瘤细胞系查阅文献，筛选出五种可能高表达PD-L1的肿瘤细胞系，其中包括人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系、人结肠癌细胞HT-29细胞系、人非小细胞肺癌H157和A549细胞系、人食管癌TE-13细胞系。对这五种细胞进行培养，培养基为含有10％胎牛血清的DMEM完全培养基，当细胞密度铺满底部80％用胰酶消化传代，当细胞生长至对数生长期，分别取100万个细胞用流式细胞术分析肿瘤细胞表面PD-L1的表达情况。

(2)通过MTT细胞增殖实验筛选受TNF-α促增殖作用的肿瘤细胞系

1)培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞系、人结肠癌细胞HT-29细胞系以及人非小细胞肺癌A549细胞系，生长至对数生长期后，胰酶消化离心细胞，其中MDA-MB-231细胞和A549细胞制备密度为5×10⁴个细胞/ml的细胞悬液，HT-29细胞悬液密度为1×10⁵个细胞/ml，铺96孔板，每孔100μl细胞悬液，置于37℃细胞培养箱中培养。

2)待第二天细胞贴壁后，配制含200ng/ml TNF-α的完全培养基，然后以两倍浓度梯度稀释13个梯度，将不同浓度的含TNF-α完全培养基加入相应孔中，每孔100μl，继续培养24h。

3)24h后，取出96孔板，每孔加入10μl MTT溶液，继续放入培养箱中培养2-4h取出96孔板，用注射器吸走孔内溶液，每孔加入100μl DMSO使孔底部沉积的甲瓒溶解，在490nm波长下检测吸光度值。

4)最后，使用Graphpad软件处理实验数据，计算不同浓度的TNF-α对肿瘤细胞的促增殖率。

(3)3D肿瘤球细胞毒性实验

1)通过步骤(1)和(2)筛选出高表达PD-L1和受TNF-α促增殖作用的肿瘤细胞系，细胞培养至对数生长期，胰酶消化离心，加入含3.125ng/mlTNF-α的完全培养基重悬细胞，制备细胞密度为7.5×10⁴个细胞/ml的细胞悬液，通过悬滴法制备3D肿瘤球(3000个细胞/每滴40μl)，37℃培养箱中静置3天成球，三天后，收集肿瘤球，加入终浓度为4.5μM的钙黄绿素和1.5μM的PI，37℃培养箱中孵育3h后用激光共聚焦显微镜拍照鉴定肿瘤球直径大小和细胞活力。

2)PBMC提取，实验步骤同实施例6中步骤(1)。

3)PBMC激活。PBMC提取前一天，向T75细胞瓶内加入含有2μg/ml CD3抗体、2μg/mlCD28抗体和300U/ml IL-2的PBS溶液，终体积为10ml，4℃过夜孵育。第二天，倒掉液体，加入新鲜提取的PBMC，置于细胞培养箱中激活24h。

4)收集肿瘤球置于超低吸附6孔板中，每孔10个肿瘤球，加入被激活的PBMC(每孔3×10⁵个细胞)，然后将不同浓度的Anti-TNF-α/PD-1Crossmab、PD-1单抗和TNF-α单抗分别加入不同的孔，细胞培养箱中孵育48h。

5)肿瘤球染色。每孔加入终浓度为4.5μM的钙黄绿素和1.5μM的PI，细胞培养箱中孵育3h用荧光显微镜拍照鉴定细胞活力。

结果显示，HT-29、A549和MDA-MB-231三种肿瘤细胞表面的PD-L1表达率分别为18.3％、21.2％、22.4％，如图17所示，表达率相对较高，而H157和TE-13两种肿瘤细胞表面的PD-L1表达率较低，分别为5.52％和6.65％。再以HT-29、A549和MDA-MB-231三种肿瘤细胞进行MTT实验，当TNF-α浓度在100ng/ml范围内，对A549细胞起抑制增殖作用，对HT-29细胞无明显增殖影响，但对MDA-MB-231细胞具有促增殖作用，在TNF-α浓度为3.125ng/ml时，具有最大促增殖率，为113％，如图18所示。所以后续肿瘤球细胞毒性实验中以含3.125ng/mlTNF-α的完全培养基模拟肿瘤微环境中的TNF-α。

通过悬滴法构建MDA-MB-231肿瘤球，如图19所示，经激光共聚焦拍照显示肿瘤球直径大小在200-300μm左右，大小符合细胞毒性实验要求，肿瘤球内可以看到活细胞发绿色荧光，这是因为不发荧光的Calcein-AM可以穿透活细胞膜，被细胞内酯酶剪切形成发绿光的Calcein，PI可以直接渗透死细胞，使死细胞发红色荧光。肿瘤球细胞活力较好，内部少量细胞可能由于缺氧和缺乏营养物质而死亡。在3D肿瘤球细胞毒性实验中，如图20所示，单纯的肿瘤球细胞活力较好，活细胞经钙黄绿素染料染色，呈现绿色荧光；仅在PBMC或Anti-TNF-α/PD-1双特异性抗体存在下，肿瘤球内部分细胞死亡，在PI染料染色呈现红色荧光。在PBMC存在下，Anti-TNF-α/PD-1双特异性抗体以及PD-1mAb分别以1μM的浓度有效杀死了MDA-MB-231肿瘤球，促进肿瘤细胞死亡。同样，PD-1mAb和TNF-αmAb混合溶液(各0.5μM)在3D肿瘤球中也显示出相当的细胞毒性。

序列表

<110> 中国药科大学

<120> 抗TNF-α/PD-1双特异性抗体及其应用

<160> 32

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 113

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

100 105 110

Ser

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 4

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

caggtgcagc tggtggaaag cggaggcgga gtggtccagc ctggaaggtc cctgaggctc 60

gactgcaagg ccagcggcat caccttcagc aacagcggca tgcactgggt gaggcaggct 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtggccgtg atctggtacg acggctccaa gcggtactac 180

gctgattccg tcaagggaag gttcaccatc tcccgggata acagcaagaa caccctcttc 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaagat accgccgtgt actactgcgc cacaaacgac 300

gattactggg gccagggaac cctggtgaca gtgtcctcc 339

<210> 6

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

gagatcgtgc tgacacagtc ccctgctaca ctgtccctgt cccccggcga gagggctaca 60

ctgagctgtc gggcctccca gtccgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagcct 120

ggccaggctc ccaggctgct gatctacgac gcctccaaca gggccaccgg catccctgcc 180

aggtttagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggagccc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tccagcaact ggcccaggac attcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa g 321

<210> 7

<211> 363

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct atcacttgga atagtggtca catagactat 180

gcggactctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggat acggccgtat attactgtgc gaaagtctcg 300

taccttagca ccgcgtcctc ccttgactat tggggccaag gtaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

<210> 8

<211> 321

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcaagtca gggcatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tataaccgtg caccgtatac ttttggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 9

<211> 1344

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

caggtgcagc tggtggaaag cggaggcgga gtggtccagc ctggaaggtc cctgaggctc 60

gactgcaagg ccagcggcat caccttcagc aacagcggca tgcactgggt gaggcaggct 120

cctggcaagg gcctggaatg ggtggccgtg atctggtacg acggctccaa gcggtactac 180

gctgattccg tcaagggaag gttcaccatc tcccgggata acagcaagaa caccctcttc 240

ctgcagatga acagcctgag ggccgaagat accgccgtgt actactgcgc cacaaacgac 300

gattactggg gccagggaac cctggtgaca gtgtcctccc ggaccgtggc cgctccttcc 360

gtgttcatct tccctcctag cgacgagcag ctgaagagcg gcaccgccag cgtggtgtgc 420

ctgctgaaca acttctaccc cagggaggcc aaggtgcagt ggaaggtgga caacgccctc 480

cagagcggca acagccagga gtccgtgacc gagcaggact ccaaggacag cacctactcc 540

ctgtccagca ccctgaccct gtccaaggct gactacgaga agcacaaggt gtacgcctgc 600

gaggtgaccc atcagggcct gtcctccccc gtgaccaagt ccttcaacag gggcgagtgc 660

gacaagaccc acacctgccc tccttgtcct gctcctgagc tgctgggcgg cccttctgtg 720

tttctgttcc ctcctaagcc caaggacacc ctgatgatct ccaggacccc cgaggtgacc 780

tgcgtggtgg tggacgtgtc tcacgaggac cctgaggtga agtttaactg gtacgtggat 840

ggcgtggagg tgcataacgc taagaccaag cctagggagg agcagtacaa ctccacctac 900

agggtggtgt ccgtgctgac cgtgctgcac caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag 960

tgcaaggtgt ccaacaaggc cctgcctgct cctatcgaga agaccatctc caaggctaag 1020

ggccagccta gagagcccca ggtgtgcacc ctgcccccct ccagggagga gatgaccaag 1080

aaccaggtgt ccctgagctg cgcggtgaag ggcttctacc cctccgacat cgccgtggag 1140

tgggagtcca acggccagcc cgagaacaac tacaagacca ccccccccgt gctggactcc 1200

gacggctcct tcttcctggt ctccaagctg accgtggaca agtccaggtg gcagcagggc 1260

aacgtgttct cctgctccgt gatgcacgag gccctgcaca accactacac ccagaagtcc 1320

ctgtccctgt cccccggcaa gtga 1344

<210> 10

<211> 633

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

gagatcgtgc tgacacagtc ccctgctaca ctgtccctgt cccccggcga gagggctaca 60

ctgagctgtc gggcctccca gtccgtgagc agctacctgg cctggtacca gcagaagcct 120

ggccaggctc ccaggctgct gatctacgac gcctccaaca gggccaccgg catccctgcc 180

aggtttagcg gaagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatctcctc cctggagccc 240

gaggacttcg ccgtgtacta ctgccagcag tccagcaact ggcccaggac attcggccag 300

ggcaccaagg tggagatcaa ggcctctaca aagggccctt ctgtgttccc tctggcccct 360

tcctctaagt ctacatctgg cggaaccgct gctctgggct gtctggtgaa ggactacttc 420

cctgagcctg tgacagtgtc ttggaactct ggcgctctga cctccggcgt gcacaccttc 480

cctgctgtgc tgcagtcctc tggactgtac tctctgtctt ctgtggtgac cgtgccttct 540

tcctctctgg gcacccagac ctacatctgc aacgtgaacc ataagccttc taacacaaag 600

gtggacaaga aggtggagcc caagtcctgc tga 633

<210> 11

<211> 1356

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct atcacttgga atagtggtca catagactat 180

gcggactctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggat acggccgtat attactgtgc gaaagtctcg 300

taccttagca ccgcgtcctc ccttgactat tggggccaag gtaccctggt caccgtctcg 360

agtgcctcta caaagggccc ttctgtgttc cctctggccc cttcctctaa gtctacatct 420

ggcggaaccg ctgctctggg ctgtctggtg aaggactact tccctgagcc tgtgacagtg 480

tcttggaact ctggcgctct gacctccggc gtgcacacct tccctgctgt gctgcagtcc 540

tctggactgt actctctgtc ttctgtggtg accgtgcctt cttcctctct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa ccataagcct tctaacacaa aggtggacaa gaaggtggag 660

cccaagtcct gcgacaagac ccacacctgc cctccttgtc ctgctcctga gctgctgggc 720

ggcccttctg tgtttctgtt ccctcctaag cccaaggaca ccctgatgat ctccaggacc 780

cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg tctcacgagg accctgaggt gaagtttaac 840

tggtacgtgg atggcgtgga ggtgcataac gctaagacca agcctaggga ggagcagtac 900

aactccacct acagggtggt gtccgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 960

aaggagtaca agtgcaaggt gtccaacaag gccctgcctg ctcctatcga gaagaccatc 1020

tccaaggcta agggccagcc tagagagccc caggtgtaca ccctgccccc ctgcagggag 1080

gagatgacca agaaccaggt gtccctgtgg tgcctggtga agggcttcta cccctccgac 1140

atcgccgtgg agtgggagtc caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1200

gtgctggact ccgacggctc cttcttcctg tactccaagc tgaccgtgga caagtccagg 1260

tggcagcagg gcaacgtgtt ctcctgctcc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1320

acccagaagt ccctgtccct gtcccccggc aagtga 1356

<210> 12

<211> 645

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60

atcacttgtc gggcaagtca gggcatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180

cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240

gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tataaccgtg caccgtatac ttttggccag 300

gggaccaagg tggaaatcaa acggaccgtg gccgctcctt ccgtgttcat cttccctcct 360

agcgacgagc agctgaagag cggcaccgcc agcgtggtgt gcctgctgaa caacttctac 420

cccagggagg ccaaggtgca gtggaaggtg gacaacgccc tccagagcgg caacagccag 480

gagtccgtga ccgagcagga ctccaaggac agcacctact ccctgtccag caccctgacc 540

ctgtccaagg ctgactacga gaagcacaag gtgtacgcct gcgaggtgac ccatcagggc 600

ctgtcctccc ccgtgaccaa gtccttcaac aggggcgagt gctga 645

<210> 13

<211> 690

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

atggctcccg tgcagctgct gggactgctg gtgctgttcc tgcccgccat gcggtgtgag 60

atcgtgctga cacagtcccc tgctacactg tccctgtccc ccggcgagag ggctacactg 120

agctgtcggg cctcccagtc cgtgagcagc tacctggcct ggtaccagca gaagcctggc 180

caggctccca ggctgctgat ctacgacgcc tccaacaggg ccaccggcat ccctgccagg 240

tttagcggaa gcggcagcgg caccgacttc accctgacca tctcctccct ggagcccgag 300

gacttcgccg tgtactactg ccagcagtcc agcaactggc ccaggacatt cggccagggc 360

accaaggtgg agatcaaggc ctctacaaag ggcccttctg tgttccctct ggccccttcc 420

tctaagtcta catctggcgg aaccgctgct ctgggctgtc tggtgaagga ctacttccct 480

gagcctgtga cagtgtcttg gaactctggc gctctgacct ccggcgtgca caccttccct 540

gctgtgctgc agtcctctgg actgtactct ctgtcttctg tggtgaccgt gccttcttcc 600

tctctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaaccata agccttctaa cacaaaggtg 660

gacaagaagg tggagcccaa gtcctgctga 690

<210> 14

<211> 1401

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

atggccgtgc tgggactgct gttctgtctg gtgacctttc ctagctgtgt gctgagccag 60

gtgcagctgg tggaaagcgg aggcggagtg gtccagcctg gaaggtccct gaggctcgac 120

tgcaaggcca gcggcatcac cttcagcaac agcggcatgc actgggtgag gcaggctcct 180

ggcaagggcc tggaatgggt ggccgtgatc tggtacgacg gctccaagcg gtactacgct 240

gattccgtca agggaaggtt caccatctcc cgggataaca gcaagaacac cctcttcctg 300

cagatgaaca gcctgagggc cgaagatacc gccgtgtact actgcgccac aaacgacgat 360

tactggggcc agggaaccct ggtgacagtg tcctcccgga ccgtggccgc tccttccgtg 420

ttcatcttcc ctcctagcga cgagcagctg aagagcggca ccgccagcgt ggtgtgcctg 480

ctgaacaact tctaccccag ggaggccaag gtgcagtgga aggtggacaa cgccctccag 540

agcggcaaca gccaggagtc cgtgaccgag caggactcca aggacagcac ctactccctg 600

tccagcaccc tgaccctgtc caaggctgac tacgagaagc acaaggtgta cgcctgcgag 660

gtgacccatc agggcctgtc ctcccccgtg accaagtcct tcaacagggg cgagtgcgac 720

aagacccaca cctgccctcc ttgtcctgct cctgagctgc tgggcggccc ttctgtgttt 780

ctgttccctc ctaagcccaa ggacaccctg atgatctcca ggacccccga ggtgacctgc 840

gtggtggtgg acgtgtctca cgaggaccct gaggtgaagt ttaactggta cgtggatggc 900

gtggaggtgc ataacgctaa gaccaagcct agggaggagc agtacaactc cacctacagg 960

gtggtgtccg tgctgaccgt gctgcaccag gactggctga acggcaagga gtacaagtgc 1020

aaggtgtcca acaaggccct gcctgctcct atcgagaaga ccatctccaa ggctaagggc 1080

cagcctagag agccccaggt gtgcaccctg cccccctcca gggaggagat gaccaagaac 1140

caggtgtccc tgagctgcgc ggtgaagggc ttctacccct ccgacatcgc cgtggagtgg 1200

gagtccaacg gccagcccga gaacaactac aagaccaccc cccccgtgct ggactccgac 1260

ggctccttct tcctggtctc caagctgacc gtggacaagt ccaggtggca gcagggcaac 1320

gtgttctcct gctccgtgat gcacgaggcc ctgcacaacc actacaccca gaagtccctg 1380

tccctgtccc ccggcaagtg a 1401

<210> 15

<211> 702

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

atggctcccg tgcagctgct gggactgctg gtgctgttcc tgcccgccat gcggtgtgac 60

atccagatga cccagtctcc atcctccctg tctgcatctg taggggacag agtcaccatc 120

acttgtcggg caagtcaggg catcagaaat tacttagcct ggtatcagca aaaaccaggg 180

aaagccccta agctcctgat ctatgctgca tccactttgc aatcaggggt cccatctcgg 240

ttcagtggca gtggatctgg gacagatttc actctcacca tcagcagcct acagcctgaa 300

gatgttgcaa cttattactg tcaaaggtat aaccgtgcac cgtatacttt tggccagggg 360

accaaggtgg aaatcaaacg gaccgtggcc gctccttccg tgttcatctt ccctcctagc 420

gacgagcagc tgaagagcgg caccgccagc gtggtgtgcc tgctgaacaa cttctacccc 480

agggaggcca aggtgcagtg gaaggtggac aacgccctcc agagcggcaa cagccaggag 540

tccgtgaccg agcaggactc caaggacagc acctactccc tgtccagcac cctgaccctg 600

tccaaggctg actacgagaa gcacaaggtg tacgcctgcg aggtgaccca tcagggcctg 660

tcctcccccg tgaccaagtc cttcaacagg ggcgagtgct ga 702

<210> 16

<211> 1413

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

atggccgtgc tgggactgct gttctgtctg gtgacctttc ctagctgtgt gctgagcgag 60

gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcttg gtacagcccg gcaggtccct gagactctcc 120

tgtgcggcct ctggattcac ctttgatgat tatgccatgc actgggtccg gcaagctcca 180

gggaagggcc tggaatgggt ctcagctatc acttggaata gtggtcacat agactatgcg 240

gactctgtgg agggccgatt caccatctcc agagacaacg ccaagaactc cctgtatctg 300

caaatgaaca gtctgagagc tgaggatacg gccgtatatt actgtgcgaa agtctcgtac 360

cttagcaccg cgtcctccct tgactattgg ggccaaggta ccctggtcac cgtctcgagt 420

gcctctacaa agggcccttc tgtgttccct ctggcccctt cctctaagtc tacatctggc 480

ggaaccgctg ctctgggctg tctggtgaag gactacttcc ctgagcctgt gacagtgtct 540

tggaactctg gcgctctgac ctccggcgtg cacaccttcc ctgctgtgct gcagtcctct 600

ggactgtact ctctgtcttc tgtggtgacc gtgccttctt cctctctggg cacccagacc 660

tacatctgca acgtgaacca taagccttct aacacaaagg tggacaagaa ggtggagccc 720

aagtcctgcg acaagaccca cacctgccct ccttgtcctg ctcctgagct gctgggcggc 780

ccttctgtgt ttctgttccc tcctaagccc aaggacaccc tgatgatctc caggaccccc 840

gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgtct cacgaggacc ctgaggtgaa gtttaactgg 900

tacgtggatg gcgtggaggt gcataacgct aagaccaagc ctagggagga gcagtacaac 960

tccacctaca gggtggtgtc cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 1020

gagtacaagt gcaaggtgtc caacaaggcc ctgcctgctc ctatcgagaa gaccatctcc 1080

aaggctaagg gccagcctag agagccccag gtgtacaccc tgcccccctg cagggaggag 1140

atgaccaaga accaggtgtc cctgtggtgc ctggtgaagg gcttctaccc ctccgacatc 1200

gccgtggagt gggagtccaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 1260

ctggactccg acggctcctt cttcctgtac tccaagctga ccgtggacaa gtccaggtgg 1320

cagcagggca acgtgttctc ctgctccgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 1380

cagaagtccc tgtccctgtc ccccggcaag tga 1413

<210> 17

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gacccaagct tgcattcctg cgccatggct cccgtgcagc t 41

<210> 18

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gagcggccac ggtccgtttg atttccacct tggtccc 37

<210> 19

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

accaaggtgg aaatcaaacg gaccgtggcc gctc 34

<210> 20

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

aagtactgct taagatcgat gtcgatcagc actcgcccct gtt 43

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gcaggaatgc aagcttgggt c 21

<210> 22

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

tcgacatcga tcttaagcag tactt 25

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggtaccagca cagtggactc gagagccatg gccgtgctgg gactg 45

<210> 24

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

agggcccttt gtagaggcac tcgagacggt gaccagggta 40

<210> 25

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ctggtcaccg tctcgagtgc ctctacaaag ggcccttc 38

<210> 26

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

agggttaggg ataggcttac cttctcactt gccgggggac 40

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

tctcgagtcc actgtgctgg tacc 24

<210> 28

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaaggtaagc ctatccctaa ccct 24

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

gacccaagct tgcattcctg cgccaccatg gctcccgtg 39

<210> 30

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

aagtactgct taagatcgat gtcgactcga gtcagcagga cttgggc 47

<210> 31

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

ggtaccagca cagtggactc gagagtggaa ttcgccacca tgg 43

<210> 32

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

agggttaggg ataggcttac cttctcactt gccgggggac 40

Claims

1.一种双特异性抗体，其特征在于：由抗人PD-1抗体和抗人TNF-α抗体联合构建而成；所述构建的方法为：抗人PD-1重链的Fc段和抗人TNF-α重链的Fc段分别通过定点突变，抗人PD-1重链的CH1结构域和抗人PD-1轻链的CL结构域进行交换，实现抗体轻链和重链的正确组装；所述抗人PD-1抗体的重链可变区为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的重链可变区为序列SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的重链可变区为编码SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列；所述抗人PD-1抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人PD-1抗体的轻链可变区为编码SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的核苷酸序列；所述抗人TNF-α抗体的重链可变区为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的重链可变区为SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的重链可变区为编码SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的核苷酸序列；所述抗人TNF-α抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列，或所述抗人TNF-α抗体的轻链可变区为编码SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述抗人PD-1抗体的轻链编码序列为SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列；所述抗人PD-1抗体的重链编码序列为SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：所述抗人TNF-α抗体的轻链编码序列为SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列；所述抗人TNF-α抗体的重链编码序列为SEQ IDNO:11所示的核苷酸序列。

4.一种编码如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体的多核苷酸。

5.一种表达载体，其特征在于：表达如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体，抗人PD-1抗体的重链可变区为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，抗人PD-1抗体的轻链可变区为SEQID NO:2所示的氨基酸序列，抗人TNF-α抗体的重链可变区为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，抗人TNF-α抗体的轻链可变区为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；所述表达载体的载体质粒为pBudCE 4.1质粒。

6.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有如权利要求4所述的多核苷酸或如权利要求5所述的表达载体。

7.根据权利要求1-3任一所述的双特异性抗体在制备治疗表达PD-L1和受TNF-α促增殖的肿瘤细胞药物中的应用；所述的肿瘤为乳腺癌。

8.根据权利要求1-3任一所述的双特异性抗体在制备PD-L1阳性肿瘤药物或治疗受TNF-α促进增殖的肿瘤药物中的应用；所述肿瘤为乳腺癌。

9.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含如权利要求1-3任一所述的双特异性抗体。