Nothing Special   »   [go: up one dir, main page]

CN111936625A - 调节哺乳动物细胞中的生乳活性 - Google Patents

调节哺乳动物细胞中的生乳活性 Download PDF

Info

Publication number
CN111936625A
CN111936625A CN201980023064.4A CN201980023064A CN111936625A CN 111936625 A CN111936625 A CN 111936625A CN 201980023064 A CN201980023064 A CN 201980023064A CN 111936625 A CN111936625 A CN 111936625A
Authority
CN
China
Prior art keywords
pkm
cell
antibody
cells
mammalian cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201980023064.4A
Other languages
English (en)
Inventor
S·米萨吉
M·K·史拉托里
B·R·斯奈德克尔
M·W·莱尔德
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
F Hoffmann La Roche AG
Original Assignee
F Hoffmann La Roche AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by F Hoffmann La Roche AG filed Critical F Hoffmann La Roche AG
Publication of CN111936625A publication Critical patent/CN111936625A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/102—Mutagenizing nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
    • C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/01—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1)
    • C12Y207/0104—Pyruvate kinase (2.7.1.40)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本公开涉及产生目的产物(例如，重组蛋白)的方法、细胞和组合物。特别地，本公开提供改善的表达目的产物的哺乳动物细胞，其中细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)具有调节的生乳活性。本公开还涉及调节哺乳动物细胞中丙酮酸激酶肌肉(PKM)表达(例如，PKM‑1表达)，旨在由此减少或消除细胞生乳活性的方法和组合物，以及包含具有降低或消除的生乳活性的细胞的组合物和使用前者的方法。

Description

调节哺乳动物细胞中的生乳活性
相关申请的交叉引用
本申请权利要求2018年3月29日提交的美国临时申请号62/649,963的权益，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文。
序列表
本申请含有已经通过EFS网以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。所述ASCII副本创建于2019年3月28日，命名为00B206_0785_SL.txt，并且大小为444,511字节。
1.发明领域
本公开涉及产生目的产物(例如，重组蛋白)的方法和组合物。特别地，本公开涉及表达目的产物的哺乳动物细胞，其中细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)具有调节的生乳活性。本公开还涉及调节哺乳动物细胞中丙酮酸激酶肌肉(PKM)表达(例如，PKM-1表达)，旨在因而减少或消除细胞生乳活性的方法和组合物，以及包含一个或多个具有降低或消除的生乳活性的细胞的组合物和使用前者的方法。
2.发明背景
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞已经广泛用于生产供临床应用的治疗性蛋白，原因在于其正确折叠蛋白质、组装和翻译后应用的能力。正常情况下，CHO细胞，如同其他永生化细胞系，倾向于通过有氧糖酵解(一个称作Warburg效应的过程)，消耗葡萄糖并产生乳酸盐(Warburg,1956,Science 123(3191):309-14)。乳酸盐在生产培养物中的积累可能不利地影响细胞生长、活力和生产率。CHO细胞在生产过程期间的这类生乳(lactogenic)行为(即，乳酸盐生成行为)可以造成活力和生产率下降并且可以改变所产生的治疗性蛋白的质量。
已经开发几种针对工艺条件的方案以减轻生乳性CHO细胞系中的乳酸盐生成。例如，已经显示优化的铜水平在一些CHO细胞系中阻止生乳行为有效(Luo等人,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56；Xu等人,2016,Bioprocess Biosyst.Eng.39(11):1689-702)。也已经显示涉及培养物中渐增pH触发的受控营养补料(高末端pH控制的葡萄糖输送，或HIPDOG)的另一个方案有效减少或消除大规模CHO培养物中的乳酸盐积累(Gagnon等人,2011,Biotechnol.Bioeng.108(6):1328-37)。但是，这些方案有其局限性，因为前者方案不能适用于全部生乳性CHO细胞系，而后者可能使得大规模生产过程复杂化。另外，这些方案没有针对CHO细胞中的基础性机制生乳行为。
因此，本领域需要用于减少细胞培养物中乳酸盐产量的技术。
3.发明简述
本公开涉及产生目的产物(例如，重组蛋白)的方法、细胞和组合物。特别地，本文所述的方法、细胞和组合物包括改善的表达目的产物的哺乳动物细胞，其中细胞(例如，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞)具有调节的生乳活性。本文所述的方法和组合物调节哺乳动物细胞的生乳活性，并且因此减少或消除与生乳活性相关的不利影响，例如，哺乳动物细胞的活力和生产率降低和所产生目的产物的质量改变。
本公开进一步涉及调节哺乳动物细胞中丙酮酸激酶肌肉(PKM)表达(例如，PKM-1表达)，旨在因而减少或消除细胞生乳活性的方法和组合物，以及具有降低或消除的生乳活性的细胞和使用前者的方法。
在一个方面，本公开涉及具有降低或消除的生乳活性的哺乳动物细胞，其中敲减或敲除一个丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型或诸同工型的表达。在某些实施方案中，敲除或敲减的PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型。在某些实施方案中，敲除或敲减的PKM多肽同工型既是PKM-1多肽同工型，又是PKM-2多肽同工型。在某些实施方案中，哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约50％(例如，小于约20％)生乳活性。在某些实施方案中，参考细胞是包含PKM基因的一个或多个野生型等位基因的细胞，例如，PKM基因的两个等位基因均是野生型或未经修饰。在某些实施方案中，哺乳动物细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。在某些实施方案中，哺乳动物细胞在生产阶段期间产生小于约1.0g/L或少于约2.0g/L乳酸盐，例如，在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约1.0g/L或小于约2.0g/L乳酸盐。在某些实施方案中，哺乳动物细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。本公开提供一种哺乳动物细胞，其包含PKM基因的等位基因，所述等位基因包含选自SEQID NOs:39-41的核苷酸序列或包含在SEQ ID NOs:37和38中所述的核苷酸序列。本公开进一步提供组合物，其包含本文公开的一个或多个细胞，例如，哺乳动物细胞。
在某些实施方案中，哺乳动物细胞包含编码目的产物的核酸序列。在某些实施方案中，核酸序列在靶向的位置整合在哺乳动物细胞的细胞基因组中。备选地和/或额外地，编码目的产物的核酸随机整合入哺乳动物细胞的细胞基因组。在某些实施方案中，哺乳动物细胞是CHO细胞。
在某些实施方案中，目的产物包括蛋白质，例如，重组蛋白。在某些实施方案中，目的产物包括抗体或其抗原结合片段。例如，但不限于，抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。在某些实施方案中，抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体和/或单克隆抗体。
在另一个方面，本公开涉及一种用于减少或消除细胞中生乳活性的方法。在某些实施方案中，该方法包括敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉多肽(PKM)同工型的表达。在某些实施方案中，该方法包括向细胞施用基因工程系统，其中基因工程系统敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型的表达。在某些实施方案中，基因工程系统选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统及其组合。在某些实施方案中，该方法产生具有生乳活性的细胞，所述生乳活性比参考细胞的小约50％(例如，小约20％)生乳活性。在某些实施方案中，参考细胞是包含PKM基因的一个或多个野生型等位基因的细胞，例如，PKM基因的两个等位基因均是野生型或未经修饰。在某些实施方案中，细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。在某些实施方案中，细胞在生产阶段期间产生小于约1.0g/L或少于约2.0g/L乳酸盐，例如，在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约1.0g/L或小于约2.0g/L乳酸盐。在某些实施方案中，细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
在某些非限制性实施方案中，用于本公开中的基因工程系统是这样一种CRISPR/Cas9系统，其包含Cas9分子和一种或多种包含导引结构域的向导RNA(gRNAs)，所述导引结构域与PKM基因的靶序列互补。在某些实施方案中，靶序列选自：PKM基因的一部分、侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区、侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区、侧置于PKM基因外显子10的3’内含子区、PKM基因外显子1内部的区域、PKM基因外显子2内部的区域、PKM基因外显子12内部的区域及其组合。在某些实施方案中，一种或多种gRNA包含第一gRNA，其包含与侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区互补的靶序列；和第二gRNA，其包含与侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区互补的靶序列。在某些实施方案中，一种或多种gRNA包含第一gRNA，其包含与PKM基因外显子2内部的区域互补的靶序列；和第二gRNA，其包含与PKM基因外显子12内部的区域互补的靶结构域。例如，但不限于，一种或多种gRNA包含选自SEQ ID NOs:33-34和42-43及其组合的序列。在某些实施方案中，敲除或敲减PKM多肽同工型的表达，并消除细胞中的生乳活性。在某些实施方案中，PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型或PKM-1多肽同工型和PKM-2多肽同工型的组合。
在某些实施方案中，用于本公开中的基因工程系统是锌指核酸酶(ZFN)系统或转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统。在某些非限制性实施方案中，基因工程系统包含选自短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)的RNA，并且RNA与PKM基因表达的mRNA互补。在某些实施方案中，PKM基因表达的mRNA编码PKM-1多肽同工型。在某些实施方案中，敲减PKM-1多肽同工型的表达，并且细胞的生乳活性降低。在某些实施方案中，基因工程系统还包含选自shRNA、siRNA和微RNA miRNA的第二RNA，其中第二RNA与编码PKM-2多肽同工型的PKM基因表达的mRNA的一部分互补。在某些实施方案中，敲除或敲减PKM-1和PKM-2多肽同工型的表达，并且细胞的生乳活性降低。
在又一个方面，本公开提供用于(例如，从本文公开的细胞)产生目的产物的方法。例如，一种产生目的产物的方法包括培养哺乳动物细胞以产生目的产物，其中哺乳动物细胞具有降低或消除的生乳活性。在某些实施方案中，本公开提供一种培养表达目的产物的哺乳动物细胞群体的方法，其中哺乳动物细胞具有降低或消除的生乳活性。在某些实施方案中，生乳活性降低或消除因敲减或敲除哺乳动物细胞中丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型表达所致。在某些实施方案中，PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型。在某些实施方案中，还敲减或敲除PKM-2多肽同工型的表达。在某些实施方案中，该方法还可以包括从细胞培养物分离目的产物。
4.附图简述
图1A-图1F.mAb-1细胞系的乳酸盐水平与PKM-1水平直接相关。低乳酸盐工艺和高乳酸盐工艺下mAb-1细胞系中的细胞活力百分数(图1A)、第14天滴度(图1B)和乳酸盐水平(图1C)。(图1D)在低乳酸盐工艺和高乳酸盐工艺生产期间不同天数时mAb-1细胞裂解物的PKM-1和PKM-2蛋白质印迹分析。使用肌动蛋白作为内参对照。对肌动蛋白归一化的相对PKM-1水平(图1E)和PKM-2水平(图1F)的定量。
图2A-图2F.MAb-2细胞系的乳酸盐水平与PKM-1水平直接相关。在低乳酸盐工艺和高乳酸盐工艺下mAb-2细胞系中的细胞活力百分数(图2A)、第14天滴度(图2B)和乳酸盐水平(图2C)。(图2D)在低乳酸盐工艺和高乳酸盐工艺生产期间不同天数时mAb-2细胞裂解物的PKM-1和PKM-2蛋白质印迹分析。使用肌动蛋白作为内参对照。对肌动蛋白归一化的相对PKM-1水平(图2E)和PKM-2水平(图2F)的定量。
图3A-图3E.CHO细胞表达PKL/R酶，但这些酶的水平与生产培养物中的乳酸盐水平不相关。(图3A)在两种不同CHO宿主细胞系(K1和DHFR-/-)以及人293细胞中PKL/R蛋白的胞内表达的蛋白质印迹分析。使用肌动蛋白作为内参对照。(图3B和图3C)在mAb-1细胞系(图3B)和mAb-2细胞系(图3C)的低乳酸盐和高乳酸盐生产过程期间不同天时PKL/R的胞内蛋白水平。(图3D和图3E)定量mAb-1细胞系(图3D)和mAb-2细胞系(图3E)中对肌动蛋白归一化的相对PKL/R水平。
图4A-图4C.产生PKM-1敲除细胞系。(图4A)PKM基因外显子8-10和用来评价mAb-2细胞系中外显子-9缺失的gRNA及筛选用引物的示意图。两个侧置于PKM基因外显子9的gRNA与Cas9转基因共转染以诱导外显子9缺失。转染的细胞是单一细胞克隆。侧置于缺失区域的PCR引物用来筛选成功缺失PKM等位基因中外显子-9的细胞系。(图4B)通过筛选用PCR引物分析野生型(WT)mAb-2细胞和借助gRNA和Cas9转基因定向缺失外显子-9的细胞系。上部条带代表WT PKM等位基因，而下部条带代表外显子9缺失的PKM等位基因。KO：敲除细胞系，HET：杂合细胞系。(图4C)PKM WT等位基因相对于靶向的细胞系中外显子-9KO等位基因的序列比较。注意，KO-15细胞系在靶向的PKM等位基因中外显子-9的5’区域内携带大于预期(122bp)的缺失。
图5A-图5H.消除或减少PKM-1表达甚至在高乳酸盐工艺下避免mAb-2细胞系中的生乳行为。在使用AMBR15生物反应器的14天补料分批生产测定期间WT和PKM-1 HET与KOmAb-2细胞系的活细胞计数(图5A)、细胞活力百分数(图5B)、第14天滴度(图5C)、第14天比生产率(图5D)和乳酸盐水平(图5E)。工艺控制与图2中的高乳酸盐工艺相同。(图5F)所示细胞系的细胞裂解物对PKM-1蛋白和PKM-2蛋白的蛋白质印迹分析。使用肌动蛋白作为内参对照。(图5G和图5H)来自所示细胞系的mAb-2的抗体产物质量，包括聚集百分数(图5G)和电荷变体百分数(图5H)。
图6A-图6G.使用高乳酸盐工艺时，不考虑细胞年龄或解冻后，PKM-1 KO细胞系或HET mAb-2细胞系中避免或降低了生乳行为。在使用AMBR15生物反应器的14天补料分批生产测定期间低幼细胞年龄的所示细胞系的活细胞计数(图6A)、细胞活力百分数(图6B)、第14天滴度(图6C)、第14天比生产率(图6D)和乳酸盐水平(图6E)。(图6F和图6G)来自所示细胞系的mAb-2的抗体产物质量，包括聚集百分数(图6F)和电荷变体百分数(图6G)。工艺控制与图5中相同。误差线代表来自四个独立试验标准误。
图7.从PKM和PKM-1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物具有相当或更高的Qp和滴度，但生长较低(在摇瓶生产中)。
图8A-图8B.在摇瓶生产中，从PKM和PKM-1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物生成较低的乳酸盐(图8A)，但消耗更多的葡萄糖(图8B)。
图9A.在摇瓶生产中，从PKM和PKM-1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物显示出不同的氨基酸合成/消耗率。
图9B.矩形中封闭的标度和途径显示PKM KO宿主细胞系积累3-磷酸甘油酸。
图9C.矩形中封闭的标度和途径显示WT宿主细胞系积累丙酮酸。
图9D.矩形中封闭的标度和途径显示PKM-1 KO宿主细胞系积累TCA循环产物：α-酮戊二酸(a-KG)。
图9E.矩形中封闭的标度和途径显示PKM-1 KO宿主细胞系积累TCA循环产物：草酰乙酸盐。
图10.葡萄糖、乳酸盐和氨基酸的宿主细胞特异性消耗或生成。
图11.在摇瓶生产中，从PKM和PKM-1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物显示出不同的糖基化特征。PKM KO宿主具有减少的半乳糖基化，并且PKM KO和PKM-1 KO宿主细胞系具有略微地减少的岩藻糖基化。
5.发明详述
为了清晰，但不限于此，本发明所公开主题的发明详述分成以下子部分：
5.1定义；
5.2调节PKM表达；
5.3具有降低或消除的生乳活性的细胞；
5.4细胞培养方法；
5.5产物；和
5.6示例性实施方案。
5.1.定义
在本公开的上下文范围内和在使用每个术语的具体上下文中，本说明书中所用的术语通常具有本领域的普通意思。下文或在本说明书中其他地方讨论了某些术语，以向实施者在描述本公开组合物和方法和如何产生并使用它们方面提供额外指导。
如本文所用，在权利要求和/或本说明书中与术语“包含”联合使用时，词“一个(a)”或“一种(an)”的用途可以意指“一个(one)”，但是它还符合以下含义：“一个或多个”、“至少一个”和“一个或多于一个”。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“具有”、“具备”、“可以”、“含有”及其变体意在是不排除额外行为或结构的可能性的开放式过渡短语、术语或词。本公开还构思了“包含”本文展示的实施方案或要素、“由其组成”和“基本上由其组成”的其他实施方案，无论是否明确阐明。
如本文所用，术语“生乳行为”或“生乳活性”指细胞产生乳酸盐的活性，例如，通过消耗葡萄糖并通过有氧糖酵解生成乳酸盐产生。在某些实施方案中，可以依据细胞培养基中积累的乳酸盐的水平测量细胞的生乳活性。
术语“约”或“大约”意指处于如本领域技术人员所测定的特定值的可接受误差范围内部，所述可接受误差范围将部分地取决于怎样度量或测定该值，即，测量系统的限值。例如，根据本领域的惯例，“约”可以意指处于3个或多于3个标准偏差范围内。备选地，“约”可以意指给定值的至多20％、优选地至多10％、更优选地至多5％和更优选地仍然至多1％的范围。备选地，尤其相对于生物系统或过程，本术语可以意指某个值的某个数量级范围内、优选地5倍范围内和更优选地2倍范围内。
术语“细胞培养基”和“培养基”指用于生长哺乳动物细胞的营养液，其一般提供来自以下分类的一个或多个分类中的至少一种组分：
1)能量源，通常处于糖如葡萄糖形式；
2)全部必需氨基酸，和通常的二十氨基酸的基本组合外加半胱氨酸；
3)按低浓度需要的维生素和/或其他有机化合物；
4)游离脂肪酸；和
5)微量元素，其中微量元素定义为一般以极低浓度(通常在微摩尔范围)需要的无机化合物或天然存在的元素。
营养液可以任选地补充有来自以下任何分类的一种或多种组分：
1)激素和其他生长因子，例如，胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；
2)盐和缓冲剂，例如，钙、镁和磷酸盐；
3)核苷和碱基，例如，腺苷、胸苷和次黄嘌呤；和
4)蛋白质和组织水解物。
“培养”细胞指使细胞与细胞培养基在适合细胞的存活和/或生长和/或增殖的条件下接触。
“分批培养”指其中将用于细胞培养的全部组分(包括细胞和全部培养用养分)在培养过程开始时提供给培养反应器的培养。
如本文所用，“补料分批细胞培养”指这样的分批培养，其中将细胞和培养基初始供应给培养反应器并且将额外的培养用养分在培养期间连续或以分离增量输送至培养物，同时终止培养之前定期收获或不收获细胞和/或产物。
“灌流培养”，有时称作连续培养，是将细胞例如通过过滤、囊化、锚定至微载体等固定在培养物中并且将培养基连续、逐步或间歇(或这些方式的任何组合)引入培养反应器并从中移除的培养。
如本文所用，术语“细胞”指动物细胞、哺乳动物细胞、培养的细胞、宿主细胞、重组细胞和重组宿主细胞。这类细胞通常是从哺乳动物组织获得或衍生的能够在置于含有适宜养分和/或生长因子的介质中之时生长和存活的细胞系。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。后代不需要在核酸含量上与亲本细胞完全相同，而是可以含有突变。本文中包括突变子代，所述突变子代具有与最初转化的细胞中所筛选或选择的相同的功能或生物学活性。
术语“哺乳动物宿主细胞”或“哺乳动物细胞”指衍生自哺乳动物的能够在置于含有适宜养分和生长因子的培养基的单层培养物或在悬浮培养物中生长和存活的细胞系。用于特定细胞系的必需生长因子通过经验轻易确定，无需过多实验，例如Mammalian CellCulture(Mather,J.P.编著,Plenum Press,N.Y.1984)和Barnes与Sato,(1980)Cell,22:649。一般，细胞能够表达并向培养基分泌大量特定的目的蛋白质，例如，糖蛋白。在本公开的背景下合适的哺乳动物宿主细胞的实例可以包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 1980)；dp12.CHO细胞(1989年3月15日公开的EP 307,247)；CHO-K1(ATCC，CCL-61)；由SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(经亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:591977)；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；小鼠支持细胞(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-2511980)；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-681982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。在某些实施方案中，哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216 1980)；dp12.CHO细胞(1989年3月15日公开的EP 307,247)。
术语“蛋白胨”在本公开的背景范围内意指实质上是水解动物蛋白的培养基补充物。这种蛋白质的来源可以是来自屠宰场的动物副产物、纯化的明胶或植物材料。该蛋白质一般使用酸、热或多种酶制剂水解。
细胞培养物的“生长阶段”指其中细胞通常正迅速分裂的细胞指数型生长时期(对数期)。维持细胞处于生长阶段的持续时间可以例如基于细胞类型、细胞生长速率和/或培养条件变动。在某些实施方案中，在这个阶段期间，将细胞培养一段时间(通常在1-4天之间)，并且在此类条件下，细胞生长最大化。可以对构思的特定宿主细胞确定宿主细胞的生长周期，无需过度实验。“一段时间和在细胞生长最大化的此类条件下”指就特定细胞系而言经确定是最佳用于细胞生长和分裂的那些培养条件。在某些实施方案中，在生长阶段期间，将细胞通常在约30-40℃，在加湿、受控的气氛下在含有必需添加物的营养培养基中培养，从而实现特定细胞系的最佳生长。在某些实施方案中，维持细胞处于生长阶段持续约一天和四天之间、通常二天至三天之间的时间。
细胞培养物的“过渡阶段”指在其期间引起生产阶段培养条件的时间段。在过渡阶段期间，环境因素如细胞培养温度、介质重量摩尔渗透压浓度等从生长条件转变成生产条件。
细胞培养物的“生产阶段”指在此期间细胞生长成为或已经达到平台期的时间段。对数细胞生长一般在这个阶段之前或期间下降并且蛋白质生产发生。在生产阶段期间，对数细胞生长已经结束，并且蛋白质生产是主要的。在这个时间段期间，通常对培养基补充以支持持续的蛋白质产生并实现所需的糖蛋白质产物。补料分批和/或灌流细胞培养法在这个阶段期间补充细胞培养基或提供新鲜培养基，以实现和/或维持所需的细胞密度、活力和/或重组蛋白产物滴度。生产阶段可以按大规模实施。
术语“表达”或“表达”在本文中用来指宿主细胞内部出现的转录和翻译。宿主细胞中产物基因的表达水平可以基于细胞中存在的相应mRNA的量或产物基因编码的由细胞产生的蛋白质的量来确定。例如，通过northern杂交合乎需要地定量从产物基因转录的mRNA。Sambrook等人.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验手册),第7.3-7.57页(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)。可以通过以下方式定量产物基因编码的蛋白质：分析该蛋白质的生物学活性或使用与这类活性无关的测定法，如使用能够与该蛋白质反应的抗体的蛋白质印迹法或放射免疫测定。Sambrook等人.,MolecularCloning:A Laboratory Manual(分子克隆实验手册),第18.1-18.88页(Cold SpringHarbor Laboratory Press,1989)。
如本文所用，“多肽”通常指具有多于约十个氨基酸的肽和蛋白质。多肽可以与宿主细胞同源，或优选地，可以是外源的，这意指它们相对于正在利用的宿主细胞是异源的，即，外来的，如中国仓鼠卵巢细胞产生的人蛋白质，或哺乳动物细胞产生的酵母多肽。在某些实施方案中，使用哺乳动物多肽(最初衍生自哺乳动物生物的多肽)，更优选地那些直接分泌入培养基的哺乳动物多肽。
术语“蛋白质”意指其链长度足以产生更高层级三级和/或四级结构的氨基酸序列。这区别于没有这类结构的“肽”或其他小分子量药物。一般，本文中的蛋白质将具有至少约15-20kD、优选地至少约20kD的分子量。本文范围内涵盖的蛋白质的实例包括全部哺乳动物蛋白质，尤其，治疗用和诊断用蛋白质，如治疗用和诊断用抗体，和通常，含有一个或多个二硫键的蛋白质，包括包含一个或多个链间和/或链内二硫键的多链多肽。
术语“抗体”在本文中以最广含义使用并且涵盖多种抗体结构物，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体(例如，由单个重链序列和单个轻链序列组成的抗体，包括这类配对的多聚体)、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段，只要它们显示出所需的抗原结合活性即可。
“抗体片段”、抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)或抗体的“抗原结合片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于，Fv、Fab、Fab’、Fab’-SH、F(ab’)2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如，scFv和scFab)；单结构域抗体(dAbs)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Holliger和Hudson,Nature Biotechnology23:1126-1136(2005)。
术语“嵌合”抗体指一种抗体，其中重链和/或轻链的一部分衍生自特定来源或物种，而重链和/或轻链的剩余部分衍生自不同来源或物种。
抗体的“类别”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在某些实施方案中，抗体是IgG1同种型。在某些实施方案中，抗体是IgG2同种型。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。
如本文所用，术语“滴度”指细胞培养物产生的重组表达的抗体的总量除以给定量的培养基体积。滴度一般以毫克抗体/毫升或升培养基(mg/ml或mg/L)的单位表述。在某些实施方案中，滴度按克抗体/升培养基(g/L)表述。滴度可以从相对量度角度表述或评估，如与不同培养条件下获得的蛋白质产物相比，滴度增加百分数。
术语“核酸”、“核酸分子”或“多核苷酸”包括任何包含核苷酸聚合物的化合物和/或物质。每种核苷酸由碱基，尤其嘌呤碱基或嘧啶碱基(即，胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))、糖(即，脱氧核糖或核糖)和磷酸酯基团组成。经常地，核酸分子依据碱基的序列描述，而所述碱基代表核酸分子的一级结构(线性结构)。碱基的序列一般从5’至3’陈述。这里，术语核酸分子涵盖脱氧核糖核酸(DNA)，例如包含互补性DNA(cDNA)和基因组DNA、核糖核酸(RNA)，尤其信使RNA(mRNA)、合成形式的DNA或RNA、和包含这些分子中两种或更多种的混合聚合物。核酸分子可以是线性或环状。此外，术语核酸分子包括有义链和反义链，以及单链形式和双链形式。另外，本文中所述的核酸分子可以含有天然存在的或非天然存在的核苷酸。非天然存在的核苷酸的实例包括具有衍生化糖或磷酸酯主链键或化学修饰型残基的修饰的核苷酸碱基。核酸分子还涵盖适合作为载体以指导本公开的抗体在体外和/或体内(例如，在宿主或患者中)表达的DNA和RNA分子。这类DNA载体(例如，cDNA)或RNA载体(例如，mRNA)可以是未修饰的或经修饰的。例如，mRNA可以经化学修饰以增强RNA载体和/或所编码分子表达的稳定性，从而可以将mRNA注入受试者以体内产生抗体(参见，例如，Stadler等人,Nature Medicine 2017，2017年6月12日在线发表，doi:10.1038/nm.4356，或EP 2 101 823 B1)。
如本文中所用，术语“载体”指能够运输已经与之连接的另一个核酸的核酸分子。
术语“杂交瘤”指通过免疫来源的永生细胞系与抗体产生细胞融合而产生的杂合细胞系。该术语包括异种杂交骨髓瘤融合物的子代，其是人细胞和鼠骨髓瘤细胞系融合，随后与浆细胞融合的结果，常称作三体瘤细胞系。另外，该术语意图包括产生抗体的任何永生化杂合细胞系，例如，四体瘤(quadroma)。参见，例如，Milstein等人,Nature,537:3053(1983)。
“人抗体”是这样一种抗体，其拥有对应于人或人细胞产生的抗体的氨基酸序列或从利用人抗体库或其他编码人抗体的序列的非人来源衍生。人抗体的这种定义特别排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。
“人源化”抗体指包含来自非人类CDR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些方面，人源化抗体将包含至少一个、并且一般两个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部CDR与非人抗体的那些CDR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体的“人源化形式”例如，非人抗体，指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的下述区域的每一个，所述区域在序列上高变并且决定抗原结合特异性，例如“互补决定区”(“CDR”)。
通常，抗体包含六个CDR；VH中三个(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)和VL中三个(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。本文中的示例性CDR包括：
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(有免疫学意义的蛋白质的序列)、第5版,Public Health Service,NationalInstitutes of Health,Bethesda,MD(1991))；和
(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))。
除非另外说明，否则根据上文的Kabat等人的文章确定CDR。本领域技术人员将理解，也可以根据上文Chothia、上文McCallum或科学接受的任何其他命名体系确定CDR命名。
“免疫缀合物”是与一个或多个异源分子(包括但不限于细胞毒性剂)缀合的抗体。
如本文所用，术语“单克隆抗体”指从基本上同质的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，例外在于例如含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现的可能变体抗体，这类变体通常以微量存在。另外，与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生根据本发明已公开主题的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法，重组DNA方法，噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与抗体结合抗原的结构域。天然抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个保守的构架区(FR)和三个互补决定区(CDR)。(参见，例如，Kindt等人,KubyImmunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007))。单个VH结构域或VL结构域可以足够赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域进行分离以分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库。参见，例如，Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。
如本文所用，术语“细胞密度”指给定培养基体积中细胞的数目。在某些实施方案中，高细胞密度合乎需要，在于它可以导致更高的蛋白质生产率。可以通过本领域已知的任何技术或通过使用引入生物反应器本身(或引入培养基和悬浮细胞从中穿过并且随后返回生物反应器的环路)的合适市售探头监测细胞密度，其中所述技术包括但不限于从培养物提取样品并且在显微镜下使用市售细胞计数装置分析细胞。
如本文所用，术语“接种”指在生产阶段伊始向培养基添加或接种正在生长的细胞。另外，如本文所用，术语“种子库(seed train)”指为维持细胞系，细胞在约20L或更小的培养基体积中连续传代。
如本文所用，术语“重组细胞”指具有不同于原始亲本细胞的一些基因修饰的细胞，其中从所述原始亲本细胞衍生所述细胞。这类基因修饰可以是引入异源基因以表达基因产物(例如，重组蛋白)的结果。
如本文所用，术语“重组蛋白”通常指肽和蛋白质，包括抗体。这类重组蛋白是“异源”的，即，相对于正在利用的宿主细为外来的，如CHO细胞产生的抗体。
如本文所用，“PKM多肽”指由PKM基因编码的多肽。PKM多肽包括PKM-1多肽同工型和/或PKM-2多肽同工型。
5.2.调节PKM表达
糖酵解是哺乳动物细胞(例如，CHO细胞)用来产生能量的葡萄糖代谢过程。糖酵解可以按高通量或低通量状态发生。细胞对葡萄糖水平的反应和在这些通量状态之间的切换可以根据细胞系和糖酵解中存在的同工酶的水平和组合变动(Mulukutla等人,2014,PLoSOne 9(6):e98756)。在正常培养条件下，CHO细胞，如同其他永生化细胞系，倾向于通过有氧糖酵解(一个称作Warburg效应的过程)，消耗葡萄糖并产生乳酸盐(Warburg,1956,Science123(3191):309-14)。乳酸盐在生产培养物中的积累可能不利地影响细胞生长、活力和生产率。因此，可以利用对细胞能量通量和代谢的调节，以避免由细胞培养生产阶段期间乳酸盐积累引起的不利结果(Mulukutla等人,2010,Trends Biotechnol.28(9):476-84；Luo等人,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56；Ahn and Antoniewicz,2012,Biotechnol.J.7(1):61-74)。
糖酵解过程的最终步骤包括磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)转化成丙酮酸，其由丙酮酸激酶(PK)酶介导。已经鉴定到PK的四种不同同工型：PK肝脏型(PKL)、PK红细胞型(PKR)、PK肌肉1型(PKM-1)和PK肌肉2型(PKM-2)。PK酶由两个不同基因PKLR和PKM表达。可变外显子剪接产生不同的PK同工型。来自PKLR基因的mRNA转录物中外显子1和2皆存在导致PKR蛋白表达，而始于外显子2的mRNA转录物导致PKL蛋白表达。PKM基因转录物中外显子9或10的可变剪接分别产生PKM-1或PKM-2。具体而言，PKM-1包括PKM基因的外显子9并且不包括其外显子10，并且PKM-2包括PKM基因的外显子10并且不包括其外显子9。组织特异性启动子、转录因子和可变剪接调节了这些同工型在不同组织和细胞系中的表达(Chaneton和Gottlieb,2012,Trends.Biochem.Sci.37(8):309-16；Israelsen和Vander Heiden,2015,Semin CellDev Biol 43:43-51；Mazurek,2011,Int.J.Biochem.Cell Biol 43(7):969-80；Harada等人,1978,Biochim.Biophys.Acta.524(2):327-39；Noguchi等人,1986,J.Biol.Chem.261(29):13807-12；Noguchi等人,1987,J.Biol.Chem.262(29):14366-71)。
已经充分地研究PKM-2，原因在于其在以葡萄糖高消耗和产生乳酸盐为标志的癌细胞代谢和肿瘤生长中的中心作用。PKM-1酶有组成型活性，而PKM-2活性受寡聚化、底物结合和翻译后修饰调节(Christofk等人,2008,Nature 452(7184):230-3；Chaneton和Gottlieb,2012,Trends Biochem.Sci.37(8):309-16；Israelsen和Vander Heiden,2015,Semin.Cell Dev.Biol 43:43-51)。例如，果糖1.6-二磷酸(FBP)可逆地与PKM-2结合，促进其四聚化及因此促进其活化(Ashizawa等人,1991,J.Biol.Chem.266(25):16842-6；Dombrauckas等人,2005,Biochemistry 44(27):9417-29)。PKM-2在酪氨酸105处的磷酸化或其与其他磷酸酪氨酸蛋白的结合通过阻断FBP结合和阻止PKM-2四聚化，使PKM-2失活(Christofk等人,2008,Nature 452(7184):181-6；Hitosugi等人,2009,Sci.Signal 2(97):ra73)。然而，作为代谢反馈回路的部分，升高的糖酵解水平促进PKM-2在赖氨酸305处乙酰化，这导引PKM-2使其借助伴侣蛋白介导的自噬降解(Lv等人,2011,Mol.Cell 42(6):719-30)(Macintyre和Rathmell,2011,Mol.Cell 42(6):713-4)。另外，已经显示PKM-2二聚体定位至细胞核，利用PEP作为磷酸酯供体，作为蛋白激酶起作用，以通过使STAT3磷酸化及激活MEK5，促进细胞增殖(Gao等人,2012,Mol.Cell 45(5):598-609)。
根据一个方面，本公开涉及通过调节细胞中PKM表达，例如，PKM多肽表达，调节哺乳动物细胞生乳活性的方法。例如，但不限于，调节哺乳动物细胞生乳活性的方法包括敲除或敲减细胞中的PKM多肽表达。在某些实施方案中，敲减或敲除PKM-1的表达。在某些实施方案中，敲减或敲除PKM-2的表达。在某些实施方案中，敲减或敲除PKM-1和PKM-2的表达。如本文所用，表达的敲除涉及与参考细胞相比，在细胞中消除PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)表达。如本文所用，表达的敲减涉及与参考细胞相比，细胞中PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)表达减少。
在某些实施方案中，参考细胞是其中未调节(例如，未减少)PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)表达的细胞。在某些实施方案中，参考细胞是包含PKM基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞。例如，但不限于，参考细胞是具有两个野生型PKM等位基因的细胞。在某些实施方案中，参考细胞是WT CHO细胞。
在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM多肽表达的细胞中PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)的表达少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％或少于约1％的参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM多肽表达。在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM-1多肽表达的细胞中PKM-1多肽的表达少于约90％、少于约80％、少于约70％、少于约60％、少于约50％、少于约40％、少于约30％、少于约20％、少于约10％、少于约5％、少于约4％、少于约3％、少于约2％、或少于约1％的参考细胞(例如，WTCHO细胞)的PKM-1多肽表达。
在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM多肽表达的细胞中PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)的表达是参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM多肽表达的至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％或至少约1％。在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM-1多肽表达的细胞中PKM-1多肽的表达是参考细胞(例如，WTCHO细胞)的PKM-1多肽表达的至少约90％、至少约80％、至少约70％、至少约60％、至少约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％、至少约10％、至少约5％、至少约4％、至少约3％、至少约2％、或至少约1％。
在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM多肽表达的细胞中PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)的表达不多于约90％、不多于约80％、不多于约70％、不多于约60％、不多于约50％、不多于约40％、不多于约30％、不多于约20％、不多于约10％、不多于约5％、不多于约4％、不多于约3％、不多于约2％或不多于约1％的参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM多肽表达。在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM多肽表达的细胞中PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)的表达不多于约40％的参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM多肽表达。在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM-1多肽表达的细胞中PKM-1多肽的表达不多于约90％、不多于约80％、不多于约70％、不多于约60％、不多于约50％、不多于约40％、不多于约30％、不多于约20％、不多于约10％、不多于约5％、不多于约4％、不多于约3％、不多于约2％或不多于约1％的参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM-1多肽表达。
在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM多肽表达的细胞中的PKM多肽(例如，PKM-1和/或PKM-2)表达是参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM-1多肽表达的约1％和约90％之间、约10％和约90％之间、约20％和约90％之间、约25％和约90％之间、约30％和约90％之间、约40％和约90％之间、约50％和约90％之间、约60％和约90％之间、约70％和约90％之间、约80％和约90％之间、约85％和约90％之间、约1％和约80％之间、约10％和约80％之间、约20％和约80％之间、约30％和约80％之间、约40％和约80％之间、约50％和约80％之间、约60％和约80％之间、约70％和约80％之间、约75％和约80％之间、约1％和约70％之间、约10％和约70％之间、约20％和约70％之间、约30％和约70％之间、约40％和约70％之间、约50％和约70％之间、约60％和约70％之间、约65％和约70％之间、约1％和约60％之间、约10％和约60％之间、约20％和约60％之间、约30％和约60％之间、约40％和约60％之间、约50％和约60％之间、约55％和约60％之间、约1％和约50％之间、约10％和约50％之间、约20％和约50％之间、约30％和约50％之间、约40％和约50％之间、约45％和约50％之间、约1％和约40％之间、约10％和约40％之间、约20％和约40％之间、约30％和约40％之间、约35％和约40％之间、约1％和约30％之间、约10％和约30％之间、约20％和约30％之间、约25％和约30％之间、约1％和约20％之间、约5％和约20％之间、约10％和约20％之间、约15％和约20％之间、约1％和约10％之间、约5％和约10％之间、约5％和约20％之间、约5％和约30％之间、约5％和约40％之间。在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM-1多肽表达的细胞中的PKM-1多肽表达是参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM-1多肽表达的约1％和约90％之间、约10％和约90％之间、约20％和约90％之间、约25％和约90％之间、约30％和约90％之间、约40％和约90％之间、约50％和约90％之间、约60％和约90％之间、约70％和约90％之间、约80％和约90％之间、约85％和约90％之间、约1％和约80％之间、约10％和约80％之间、约20％和约80％之间、约30％和约80％之间、约40％和约80％之间、约50％和约80％之间、约60％和约80％之间、约70％和约80％之间、约75％和约80％之间、约1％和约70％之间、约10％和约70％之间、约20％和约70％之间、约30％和约70％之间、约40％和约70％之间、约50％和约70％之间、约60％和约70％之间、约65％和约70％之间、约1％和约60％之间、约10％和约60％之间、约20％和约60％之间、约30％和约60％之间、约40％和约60％之间、约50％和约60％之间、约55％和约60％之间、约1％和约50％之间、约10％和约50％之间、约20％和约50％之间、约30％和约50％之间、约40％和约50％之间、约45％和约50％之间、约1％和约40％之间、约10％和约40％之间、约20％和约40％之间、约30％和约40％之间、约35％和约40％之间、约1％和约30％之间、约10％和约30％之间、约20％和约30％之间、约25％和约30％之间、约1％和约20％之间、约5％和约20％之间、约10％和约20％之间、约15％和约20％之间、约1％和约10％之间、约5％和约10％之间、约5％和约20％之间、约5％和约30％之间、约5％和约40％之间。
在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM多肽表达的细胞中PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)的表达介于约5％和约40％之间的参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM多肽表达。在某些实施方案中，已经过修饰以敲减PKM-1多肽表达的细胞中PKM-1多肽的表达介于约5％和约40％之间的参考细胞(例如，WT CHO细胞)的PKM-1多肽表达。PKM多肽(例如，PKM-1多肽和/或PKM-2多肽)在不同参考细胞(例如，包含PKM基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞)中的表达水平可以变动。例如，种子库细胞或产生低乳酸盐细胞可以产生低水平的PKM-1，而产生高乳酸盐的细胞可以产生高水平的PKM-1。
PKM基因转录物中外显子9或10的可变剪接分别产生PKM-1或PKM-2。敲减或敲除的PKM基因可以是来自人的PKM基因。在某些实施方案中，PKM基因可以来自非人类，例如，恒河猴、犬、绿猴、鸡、牛、猪、小鼠、中国仓鼠、大鼠或兔。
在某些实施方案中，敲减或敲除的PKM基因是中国仓鼠PKM基因。在某些实施方案中，中国仓鼠PKM基因序列具有NCBI参考序列ID NW_003613709.1(范围：200602..223561)(SEQ ID NO:44)。在某些实施方案中，PKM基因序列与NW_003613709.1序列相异1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在某些实施方案中，PKM基因序列与SEQ ID NO:44中所述的序列相异1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更多。
PKM基因的额外非限制性例子包括人PKM基因(例如，NC_000015.10(范围：72199029..72231624)(SEQ ID NO:45))、恒河猴PKM基因(例如，NC_027899.1(范围：49211766..49245983)(SEQ ID NO:46))、绿猴PKM基因(例如，NC_023667.1(范围：11224332..11255538)(SEQ ID NO:47))、犬PKM基因(例如，NC_006612.3(范围：35712853..35737643)(SEQ ID NO:48))、小鼠PKM基因(例如，NC_000075.6(范围：59656368..59679375)(SEQ ID NO:49))、大鼠PKM基因(例如，NC_005107.4(范围：64480963..64502957)(SEQ ID NO:50))、兔PKM基因(例如，NC_013685.1(范围：304096..317843)(SEQ ID NO:51))、鸡PKM基因(例如，NC_006097.4(范围：1506428..1523684)(SEQ ID NO:52))、猪PKM基因(例如，NC_010449.5(范围：60971807..61032780)(SEQ ID NO:53))和牛PKM基因(例如，AC_000167.1(范围：18965981..18992644)(SEQ ID NO:54))。在某些实施方案中，PKM基因序列与SEQ ID NOs:45-54中所述的任一个序列相异1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多个核苷酸。在某些实施方案中，PKM基因序列与SEQ ID NOs:45-54中所述的任一个序列相异1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％或更多。
本领域技术人员将知道，不同哺乳动物细胞系，甚至来自相同物种的那些，例如，两个CHO不同宿主细胞系，可以不共有相同的PKM基因序列。PKM基因序列中的小差异，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个核苷酸差异，可以存在于来自相同物种的两个哺乳动物细胞系之间。
5.2.1调节PKM表达的方法
在某些实施方案中，使用基因工程系统调节(例如，敲减或敲除)PKM多肽表达(例如，PKM-1表达)。本领域已知的各种基因工程系统可以用于本文所公开的方法。这类系统的非限制性实例包括CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统和通过基因沉默敲减蛋白质的其他工具(如小干扰性RNA(siRNAs)、短发夹RNA(shRNA)、和微RNA(miRNA))的用途。可以配合本文所公开的方法使用本领域已知的任何CRISPR/Cas系统，包括传统的、增强的或修饰的Cas系统，以及其他基于细菌的基因组切除工具如Cpf-1。
本领域已知的任何PKM抑制剂也可以配合本文所公开的方法用来调节PKM活性，并且因此调节本文公开的细胞的生乳活性。PKM抑制剂的非限制性实例包括单氟磷酸钠、L-苯丙氨酸、肌酸磷酸酯、Ca2+、氟磷酸酯和吡哆醛5’-磷酸。
在某些实施方案中，缺失PKM基因的一部分，以调节(例如，敲减或敲除)PKM多肽表达。在某些实施方案中，缺失PKM基因的至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％或至少约90％。在某些实施方案中，缺失PKM基因的不多于约2％、不多于约5％、不多于约10％、不多于约15％、不多于约20％、不多于约25％、不多于约30％、不多于约35％、不多于约40％、不多于约45％、不多于约50％、不多于约55％、不多于约60％、不多于约65％、不多于约70％、不多于约75％、不多于约80％、不多于约85％或不多于约90％。在某些实施方案中，约2％和约90％之间、约10％和约90％之间、约20％和约90％之间、约25％和约90％之间、约30％和约90％之间、约40％和约90％之间、约50％和约90％之间、约60％和约90％之间、约70％和约90％之间、约80％和约90％之间、约85％和约90％之间、约2％和约80％之间、约10％和约80％之间、约20％和约80％之间、约30％和约80％之间、约40％和约80％之间、约50％和约80％之间、约60％和约80％之间、约70％和约80％之间、约75％和约80％之间、约2％和约70％之间、约10％和约70％之间、约20％和约70％之间、约30％和约70％之间、约40％和约70％之间、约50％和约70％之间、约60％和约70％之间、约65％和约70％之间、约2％和约60％之间、约10％和约60％之间、约20％和约60％之间、约30％和约60％之间、约40％和约60％之间、约50％和约60％之间、约55％和约60％之间、约2％和约50％之间、约10％和约50％之间、约20％和约50％之间、约30％和约50％之间、约40％和约50％之间、约45％和约50％之间、约2％和约40％之间、约10％和约40％之间、约20％和约40％之间、约30％和约40％之间、约35％和约40％之间、约2％和约30％之间、约10％和约30％之间、约20％和约30％之间、约25％和约30％之间、约2％和约20％之间、约5％和约20％之间、约10％和约20％之间、约15％和约20％之间、约2％和约10％之间、约5％和约10％之间、或约2％和约5％之间的PKM基因缺失。
在某些实施方案中，至少部分地缺失PKM基因的至少一个外显子。如本文所用，“部分缺失的”指至少约2％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、不多于约2％、不多于约5％、不多于约10％、不多于约15％、不多于约20％、不多于约25％、不多于约30％、不多于约35％、不多于约40％、不多于约45％、不多于约50％、不多于约55％、不多于约60％、不多于约65％、不多于约70％、不多于约75％、不多于约80％、不多于约85％、不多于约90％、不多于约95％、在约2％和约90％之间、在约10％和约90％之间、在约20％和约90％之间、在约25％和约90％之间、在约30％和约90％之间、在约40％和约90％之间、在约50％和约90％之间、在约60％和约90％之间、在约70％和约90％之间、在约80％和约90％之间、在约85％和约90％之间、在约2％和约80％之间、在约10％和约80％之间、在约20％和约80％之间、在约30％和约80％之间、在约40％和约80％之间、在约50％和约80％之间、在约60％和约80％之间、在约70％和约80％之间、在约75％和约80％之间、在约2％和约70％之间、在约10％和约70％之间、在约20％和约70％之间、在约30％和约70％之间、在约40％和约70％之间、在约50％和约70％之间、在约60％和约70％之间、在约65％和约70％之间、在约2％和约60％之间、在约10％和约60％之间、在约20％和约60％之间、在约30％和约60％之间、在约40％和约60％之间、在约50％和约60％之间、在约55％和约60％之间、在约2％和约50％之间、在约10％和约50％之间、在约20％和约50％之间、在约30％和约50％之间、在约40％和约50％之间、在约45％和约50％之间、在约2％和约40％之间、在约10％和约40％之间、在约20％和约40％之间、在约30％和约40％之间、在约35％和约40％之间、在约2％和约30％之间、在约10％和约30％之间、在约20％和约30％之间、在约25％和约30％之间、在约2％和约20％之间、在约5％和约20％之间、在约10％和约20％之间、在约15％和约20％之间、在约2％和约10％之间、在约5％和约10％之间、或在约2％和约5％之间的某区域(例如，外显子)缺失。例如，但不限于，可以至少部分地缺失或完全缺失PKM基因的外显子9。在某些实施方案中，可以至少部分地缺失或完全缺失PKM基因的外显子10。在某些实施方案中，可以至少部分地缺失或完全缺失PKM基因的外显子9和10。在某些实施方案中，至少部分地缺失或完全缺失涵盖外显子1-12的区域。
在某些非限制性实施方案中，使用CRISPR/Cas9系统来调节PKM多肽的表达。成簇规律间隔的短回文重复序列(CRISPR)系统是在原核细胞中发现的基因组编辑工具。用于基因组编辑时，该系统包括Cas9(一种蛋白质，能够调节利用crRNA作为其向导物的DNA)、CRISPR RNA(crRNA，含有由Cas9使用以沿着这样区域导引它至宿主DNA正确部分的RNA，所述区域和与Cas9形成活性复合体的tracrRNA(通常处于发夹环形式)结合)、和反式激活性crRNA(tracrRNA、与crRNA结合并与Cas9形成活性复合体)。术语“向导RNA”和“gRNA”指促进RNA导引的核酸酶如Cas9特异性结合(或“导引”)至细胞中靶序列如基因组序列或附加体序列的任何核酸。gRNAs可以是单分子的(包含单个RNA分子，并且备选地称作嵌合)或模块化的(包含通常(例如借助双链体化)彼此结合的多于一个和一般两个独立的RNA分子，如crRNA和tracrRNA)。CRISPR/Cas9策略可以利用载体转染哺乳动物细胞。可以针对每种应用设计向导RNA(gRNA)，因为这是Cas9用来鉴定并与细胞中靶DNA直接结合的序列。多个crRNA和tracrRNA可以包装在一起，以形成单个向导RNA(sgRNA)。sgRNA可以与Cas9基因连接在一起并且制成载体，以转染入细胞中。
在某些实施方案中，用于调节一种或多种PKM多肽表达的CRISPR/Cas9系统包含Cas9分子，和一种或多种包含导引结构域的gRNA，所述导引结构域与PKM基因的靶序列互补。在某些实施方案中，靶基因是PKM基因的一段区域。靶序列可以是PKM基因内部的任何外显子或内含子区，例如，对所述外显子或内含子区打靶消除或减少PKM1多肽和/或PKM2多肽的表达。在某些实施方案中，靶序列可以是侧置于PKM基因外显子1的5’区域、其外显子1内部的区域、侧置于其外显子2的5’区域、其外显子2内部的区域、侧置于其外显子9的5’区域、侧置于其外显子9的3’区域、侧置于其外显子10的3’区域、其外显子12内部的区域和/或侧置于其外显子12的3’区域。例如，但不限于，靶序列选自侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区、侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区、侧置于PKM基因外显子10的3’内含子区及其组合。
在某些实施方案中，使用本文公开的CRISPR/Cas9系统，导引侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区和侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区二者。例如，但不限于，CRISPR/Cas9系统包含Cas9分子、靶向侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区的gRNA和靶向侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区的gRNA，例如，以生成已经使PKM-1敲减或敲除的细胞。在某些实施方案中，靶向侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区的gRNA包含SEQ ID NO:33中所述的序列。在某些实施方案中，靶向侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区的gRNA包含SEQ IDNO:34中所述的序列。
在某些实施方案中，靶序列可以是侧置于外显子1的5’区域、外显子1内部的区域、侧置于外显子2的5’区域、外显子2内部的区域、外显子12内部的区域、侧置于外显子12的3’区域或其组合。例如，并且但不限于，本公开的CRISPR/Cas9系统可以包含Cas9分子、靶向PKM基因外显子1内部某区域的gRNA和靶向PKM基因外显子12内部某区域的gRNA，例如，以生成已经使PKM-1和PKM-2二者敲减或敲除的细胞。在某些实施方案中，本公开的CRISPR/Cas9系统可以包含Cas9分子、靶向PKM基因外显子2内部某区域的gRNA和靶向PKM基因外显子12内部某区域的gRNA，例如，以生成已经使PKM-1和PKM-2二者敲减或敲除的细胞。在某些实施方案中，靶向PKM基因外显子2内部的区域的gRNA包含SEQ ID NO:42中所述的序列。在某些实施方案中，靶向PKM基因外显子12内部的区域的gRNA包含SEQ ID NO:43中所述的序列。
在某些实施方案中，将gRNA在单个载体中施用至细胞并且将Cas9分子在第二载体中施用至细胞。在某些实施方案中，将gRNAs和Cas9分子在单个载体中施用至细胞。备选地，可以将gRNA分子和Cas9分子各自通过独立载体施用。在某些实施方案中，CRISPR/Cas9系统可以作为核糖核蛋白复合体(RNP)递送至细胞，所述核糖核蛋白复合体包含与一种或多种gRNA复合的Cas9蛋白，例如，通过电穿孔法递送(关于递送RNP至细胞的额外方法，参见，例如，DeWitt等人,Methods 121-122:9-15(2017))。在某些实施方案中，施用CRISPR/Cas9系统至细胞导致敲除或敲减PKM-1多肽的表达。在某些实施方案中，施用CRISPR/Cas9系统至细胞导致敲除或敲减PKM-1多肽和PKM-2多肽二者的表达。
在某些实施方案中，基因工程系统是在哺乳动物细胞中调节PKM多肽表达的ZFN系统。ZFN可以充当限制性酶，其通过使锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域组合而产生。锌指结构域可以经工程化以靶向允许锌指核酸酶靶向基因组内部所需序列的特定DNA序列。各个ZFN的DNA结合结构域一般含有多个独立锌指重复序列并且可以各自识别多个碱基对。产生新锌指结构域的最常见方法是组合具有已知特异性的较小锌指“模块”。ZFN中的最常见切割结构域是来自IIs型限制性核酸内切酶FokI的非特异性切割结构域。ZFN通过靶DNA序列中产生双链断口(DSBs)，调节蛋白质表达，其中在同源模板不存在的情况下，所述双链断口将借助非同源末端接合(NHEJ)修复。这类修复可以导致缺失或插入碱基配对，产生移码并阻止有害蛋白质产生(Durai等人,Nucleic Acids Res.；33(18):5978–90(2005))。也可以使用多对ZFN来彻底移除基因组序列的整个庞大区段(Lee等人,Genome Res.；20(1):81–9(2010))。在某些实施方案中，靶基因是PKM基因的部分。在某些实施方案中，靶序列是PKM基因的外显子9。在某些实施方案中，靶序列是PKM基因的外显子9和外显子10。
在某些实施方案中，基因工程系统是在哺乳动物细胞中调节PKM多肽表达的TALEN系统。TALEN是可以工程化以切割特定DNA序列的限制性酶。TALEN系统依照与ZFN相似的原理运行。通过转录激活物样效应DNA结合结构域与DNA切割结构域组合，产生TALEN。转录激活物样效应(TALE)由具有两个可变位置的33-34个氨基酸重复基序组成，所述可变位置对特定核苷酸具有强烈识别作用。通过装配这些TALE系列，TALEDNA结合结构域可以工程化以结合所需的DNA序列，并且因而导引核酸酶在基因组中的特定位置切割(Boch等人,NatureBiotechnology；29(2):135-6(2011))。在某些实施方案中，靶基因是PKM基因的部分。在某些实施方案中，靶序列是PKM基因的外显子9。在某些实施方案中，靶序列是PKM基因的外显子9和外显子10。
在某些实施方案中，可以使用与PKM核酸具有互补序列的寡核苷酸(例如，PKMmRNA、PKM-1 mRNA或PKM-2mRNA)，敲减PKM多肽的表达。这类寡核苷酸的非限制性实例包括小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)和微RNA(miRNA)。在某些实施方案中，这类寡核苷酸可以与PKM核酸序列(例如，PKM、PKM-1或PKM-2核酸序列)的至少一部分同源，其中同源性部分相对于PKM核酸序列是至少约75％或至少约80％或至少约85％或至少约90％或至少约95％或至少约98％。在某些非限制性实施方案中，互补性部分可以构成至少10个核苷酸或至少15个核苷酸或至少20个核苷酸或至少25个核苷酸或至少30个核苷酸，并且反义核酸、shRNA、mRNA或siRNA分子可以长多达15个或多达20个或多达25个或多达30个或多达35个或多达40个或多达45个或多达50个或多达75个或多达100个核苷酸。反义核酸、shRNA、mRNA或siRNA分子可以包含DNA或非典型或非天然存在的残基，例如，但不限于，硫代磷酸酯残基。
可以使用病毒载体，例如，逆转录病毒载体如γ-逆转录病毒载体和慢病毒载体，将本文公开的基因工程系统递送至哺乳动物细胞中。逆转录病毒载体和适宜的包装细胞系的组合是合适的，其中衣壳蛋白将起到感染人细胞的作用。已知多种产生兼嗜性病毒的细胞系，包括但不限于PA12(Miller等人(1985)Mol.Cell.Biol.5:431-437)；PA317(Miller等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:2895-2902)；和CRIP(Danos等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6460-6464)。非兼嗜性粒子也是合适的，例如，用VSVG、RD114或GALV包膜蛋白和本领域已知的任何其他包膜蛋白假型化的粒子。可能的转导方法还包括将细胞与生产细胞直接共培养，例如，通过Bregni等人(1992)Blood 80:1418-1422的方法共培养，或与病毒上清液单独培养或与浓缩的载体母液在具有或没有适宜的生长因子和聚阳离子的情况下培养，例如，通过Xu等人(1994)Exp.Hemat.22:223-230；和Hughes等人(1992)J.Clin.Invest.89:1817的方法培养。
其他转导病毒载体可以用来修饰本文公开的哺乳动物细胞。在某些实施方案中，选择的载体显示出高效率的感染和稳定的整合和表达(参见，例如，Cayouette等人,HumanGene Therapy 8:423-430,1997；Kido等人,Current Eye Research 15:833-844,1996；Bloomer等人,Journal of Virology 71:6641-6649,1997；Naldini等人,Science 272:263-267,1996；和Miyoshi等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:10319,1997)。可以使用的其他病毒载体例如包括腺病毒、慢病毒和腺联病毒载体、痘苗病毒、牛乳头瘤病毒、或疱疹病毒，如Epstein-Barr病毒(还参见，例如，Miller,Human Gene Therapy 15-14,1990；Friedman,Science 244:1275-1281,1989；Eglitis等人,BioTechniques 6:608-614,1988；Tolstoshev等人,Current Opinion in Biotechnology 1:55-61,1990；Sharp,The Lancet337:1277-1278,1991；Cornetta等人,Nucleic Acid Research and Molecular Biology36:311-322,1987；Anderson,Science 226:401-409,1984；Moen,Blood Cells 17:407-416,1991；Miller等人,Biotechnology 7:980-990,1989；LeGal La Salle等人,Science259:988-990,1993；和Johnson,Chest 107:77S-83S,1995的载体)。逆转录病毒载体得以特别充分地开发并且已经用于临床环境中(Rosenberg等人,N.Engl.J.Med 323:370,1990；Anderson等人,美国专利号5,399,346)。
非病毒方案也可以用于本文公开的哺乳动物细胞的基因工程。例如，可以通过在脂质体转染存在下施用核酸(Feigner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:7413,1987；Ono等人,Neuroscience Letters 17:259,1990；Brigham等人,Am.J.Med.Sci.298:278,1989；Staubinger等人,Methods in Enzymology 101:512,1983)、脱唾液酸血清类粘蛋白-聚赖氨酸缀合(Wu等人,Journal of Biological Chemistry 263:14621,1988；Wu等人,Journal of Biological Chemistry 264:16985,1989)、或通过外科条件下显微注射(Wolff等人,Science 247:1465,1990)，将核酸分子引入哺乳动物细胞。用于基因转移的其他非病毒手段包括使用磷酸钙、DEAE葡聚糖、电穿孔和原生质体融合的体外转染。脂质体也可以潜在地有益于递送核酸分子进入细胞。也可以通过以下方式实现向受试者的受累组织植入正常基因：将正常核酸转移入离体的可培养细胞类型(例如，自体或异源原代细胞或其后代)，此后，将细胞(或其后代)注入靶向的组织或全身注射。
5.3具有降低或消除的生乳活性的细胞
在一个方面，本公开涉及细胞或包含一个或多个细胞(例如，哺乳动物细胞)的组合物，所述细胞具有降低或消除的生乳活性，和使用前者的方法。敲减或敲除细胞中的PKM多肽表达(例如，PKM-1表达)，这导致细胞的生乳活性降低或消除。细胞的非限制性例子包括CHO细胞(例如，DHFR CHO细胞)、dp12.CHO细胞，CHO-K1(ATCC，CCL-61)、由SV40转化的猴肾CV1系(例如，COS-7ATCC CRL-1651)、人胚肾系(例如，经亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞)、幼仓鼠肾细胞(例如，BHK，ATCC CCL 10)、小鼠支持细胞(例如TM4)、猴肾细胞(例如，CV1 ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(例如，VERO-76，ATCC CRL-1587)、人宫颈癌细胞(例如，HELA，ATCC CCL 2)、犬肾细胞(例如，MDCK，ATCC CCL 34)、布法罗大鼠肝细胞(例如，BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人肺细胞(例如，W138，ATCC CCL 75)、人肝细胞(例如，HepG2、HB 8065)、小鼠乳腺瘤(例如，MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞、人肝瘤系(例如，Hep G2)、骨髓瘤细胞系(例如，Y0、NS0和Sp2/0)。在某些实施方案中，细胞是CHO细胞。CHO宿主细胞的额外非限制性实例包括CHO K1SV细胞、CHO DG44细胞、CHODUKXB-11细胞、CHOK1S细胞和CHO K1M细胞。在某些实施方案中，PKM基因的仅一个等位基因在本公开的细胞中经修饰。在某些实施方案中，PKM基因的两个等位基因经修饰。在某些实施方案中，本公开的细胞包含PKM基因的至少一个等位基因，所述等位基因包含选自SEQ IDNOs:39-41的序列或包含在SEQ ID NOs:37和38中所述的核苷酸序列(参见图4C)。例如，但不限于，本公开的细胞包含PKM基因的等位基因，所述等位基因包含选自SEQ ID NOs:39-41的核苷酸序列或包含在SEQ ID NOs:37和38中所述的核苷酸序列。在某些实施方案中，本公开的细胞包含PKM基因的至少一个等位基因，所述等位基因包含选自SEQ ID NOs:39-41的序列。在某些实施方案中，细胞是CHO细胞。具有降低或消除的生乳活性的细胞的非限制性实例包括本文公开的HET-3、HET-18、KO-2和KO-15。
在某些实施方案中，敲除PKM多肽(例如，PKM-1和/或PKM-2)的表达，如与参考细胞相比，这导致细胞的生乳活性消除。在某些实施方案中，敲减细胞中PKM多肽的表达，如与参考细胞相比，这导致细胞的生乳活性降低。在某些实施方案中，参考细胞是其中未调节PKM多肽表达的细胞。在某些实施方案中，参考细胞是具有至少一个野生型PKM等位基因的细胞。在某些实施方案中，参考细胞是具有两个野生型PKM等位基因的细胞。在某些实施方案中，参考细胞是WT CHO细胞。
在某些实施方案中，细胞的生乳活性由细胞的培养时间期间细胞培养基中的乳酸盐浓度指示。在某些实施方案中，细胞的生乳活性由培养时间为第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天、第20天、第25天、第30天、第35天、第40天、第45天、第50天、第55天、第60天、第65天、第70天或第80天时细胞培养基中的乳酸盐浓度指示。在某些实施方案中，细胞的生乳活性由开始培养后超过80天的细胞培养基中乳酸盐浓度指示。在某些实施方案中，本发明公开的细胞的生乳活性由生产阶段期间(例如，在细胞培养过程的生产阶段的第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天)细胞培养基中的乳酸盐浓度指示。在某些实施方案中，在生产阶段的第6天、第7天、第10天、第11天、第14天和/或第15天测定乳酸盐浓度。在某些实施方案中，在生产阶段的第7天、第10天和/或第14天测定乳酸盐浓度。
可以配合本文公开的主题使用本领域已知的测量细胞生乳活性和/或测量培养物中细胞的乳酸盐产量的任何方法。非限制性示例方法包括在TeSlaa和Teitell,MethodsEnzymol(2014)542:91–114中及在Lehman等人,Med Sci Sports Exerc.(1991)23(8):935-8中公开的那些方法，所述文献通过引用的方式完整并入本文。例如，但不限于，这类技术包括使用商业胞外乳酸盐试剂盒、使用胞外生物分析仪、测量胞外酸化速(ECAR)(例如，通过使用Seahorse XF分析仪测量)、测量限速性糖酵解酶的活性和使用示踪剂测量乳酸盐产量。
在某些实施方案中，具有降低的生乳活性的细胞(例如，因为调节细胞中PKM基因以敲减或敲除PKM多肽)的生乳活性是参考细胞的生乳活性的约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。在某些实施方案中，具有降低的生乳活性的细胞(例如，因为调节细胞中PKM基因以敲减或敲除PKM多肽)的生乳活性少于参考细胞的生乳活性的约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％。在某些实施方案中，细胞的生乳活性小于参考细胞的生乳活性的约50％，例如，如在细胞培养的生产期第14天或第15天所观察的。在某些实施方案中，细胞的生乳活性小于参考细胞的生乳活性的约20％，例如，如在细胞培养的生产期第14天或第15天观察。在某些实施方案中，细胞的生乳活性小于参考细胞的约10％生乳活性，例如，如在细胞培养的生产期第14天或第15天观察的。在某些实施方案中，参考细胞是包含PKM基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞。
在某些实施方案中，例如，在细胞培养的生产阶段(例如，在生产阶段第2天、第3天、第4天、第5天、第6天、第7天、第8天、第9天、第10天、第11天、第12天、第13天、第14天、第15天、第16天、第17天、第18天、第19天或第20天)，本公开的细胞产生的细胞培养基中的乳酸盐浓度小于约15g/L、小于约14g/L、小于约13g/L、小于约12g/L、小于约101g/L、小于约10g/L、小于约9g/L、小于约8g/L、小于约7g/L、小于约6g/L、小于约5g/L、小于约4g/L、小于约3g/L、小于约2g/L、小于约1g/L或约小于约0.5g/L。在某些实施方案中，本公开的细胞产生的细胞培养基中的乳酸盐浓度是小于约5g/L、小于约2g/L或小于约1g/L。在某些实施方案中，本公开的细胞产生的细胞培养基中的乳酸盐浓度在细胞培养的生产阶段的第7天、第10天、第14天或第15天小于约5g/L、小于约2g/L、或小于约1g/L。在某些实施方案中，本公开的细胞产生的细胞培养基中的乳酸盐浓度在摇瓶培养的生产阶段期间小于约1g/L、或小于约2g/L。在某些实施方案中，本公开的细胞产生的细胞培养基中的乳酸盐浓度在细胞培养的生产阶段期间在生物反应器中小于约2g/L。
在某些实施方案中，如本文中公开的生乳活性降低或消除的细胞(例如，通过敲除或敲减PKM多肽表达产生的细胞)具有与具备常规生乳活性的细胞(例如野生型细胞)相当的滴度和/或比生产率。在某些实施方案中，生乳活性降低或消除的细胞和具有常规生乳活性的细胞(例如，参考细胞)之间滴度和/或比生产率的差异小于约1％、小于约5％、小于约10％、小于约15％、小于约20％、小于约25％、或小于约30％。在某些实施方案中，生乳活性降低或消除的细胞具有比具备常规生乳活性的细胞更高的滴度和/或比生产率。在某些实施方案中，生乳活性降低或消除的细胞的滴度高于具有常规生乳活性的细胞的滴度约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％或约50％。在某些实施方案中，生乳活性降低或消除的细胞的滴度高于具有常规生乳活性的细胞的滴度超过约50％。在某些实施方案中，生乳活性降低或消除的细胞的比生产率(Qp)高于具有常规生乳活性的细胞的比生产率约1％、约5％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、或约90％。在某些实施方案中，生乳活性降低或消除的细胞的比生产率高于具有常规生乳活性的细胞的比生产率超过约90％。
可以通过化学分析仪或乳酸盐分析试剂盒测量细胞培养基中的乳酸盐浓度。化学分析仪的非限制性实例包括Bioprofile 400(Nova Biomedical)、Piccolo Xpress化学分析仪、Excel–半自动化学分析仪、Indiko Clinical and Specialty Chemistry System和ACE
Figure BDA0002706139770000301
Clinical Chemistry System。乳酸盐分析试剂盒的非限制性实例包括L-乳酸盐分析试剂盒(Colorimetric)(ab65331,Abcam)、BioVision乳酸盐比色/荧光测量分析试剂盒，PicoProbeTM乳酸盐荧光测量分析试剂盒、乳酸盐比色分析试剂盒II、Cell Biolabs乳酸盐分析试剂盒。
在某些实施方案中，本文公开的细胞表达目的产物。在某些实施方案中，目的产物是重组蛋白。在某些实施方案中，目的产物是单克隆抗体。第5.5部分中提供目的产物的额外非限制性实例。在某些实施方案中，本文公开的细胞可以用于生产商业可用量的目的产物。
在某些实施方案中，本文公开的细胞可以包含编码目的产物的核酸。在某些实施方案中，核酸可以存在于一个或多个载体(例如，表达载体)中。一个类型的载体是“质粒”，其指可以向其中连接额外DNA区段的环状双链DNA环。另一个类型载体是病毒载体，其中额外的DNA区段可以连入病毒基因组中。某些载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加体型哺乳动物载体)。其他载体(例如非附加体型哺乳动物载体)在引入宿主细胞时整合到该宿主细胞的基因组中，并因而随宿主基因组一起复制。另外，某些载体，表达载体，能够指导与它们有效连接的基因表达。通常，重组DNA技术中使用的表达载体经常处于质粒(载体)形式。用于本公开的表达载体的额外非限制性实例包括起到同等功能的病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
在某些实施方案中，可以将编码目的产物的核酸引入本文公开的宿主细胞。在某些实施方案中，可以通过本领域已知的任何方法实施向细胞引入核酸，所述方法包括但不限于，转染，电穿孔，微量注射，用含有核酸序列的病毒载体或噬菌体载体感染、细胞融合、染色体介导的基因转移、微囊介导的基因转移、球状质体融合等。在某些实施方案中，宿主细胞是真核的，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或淋巴样细胞(例如，Y0、NS0、Sp20细胞)。
在某些实施方案中，编码目的产物的核酸可以随机整合入宿主细胞基因组(“随机整合”或“RI”)。例如，但不限于，编码目的产物的核酸可以随机地整合入细胞的基因组中，其中所述细胞已经受调节以具有敲减或敲除的PKM多肽(例如，PKM-1)表达。
在某些实施方案中，编码目的产物的核酸可以按定向方式整合入宿主细胞基因组(“定向整合”或“TI”)。例如，但不限于，编码目的产物的核酸可以按定向方式整合入细胞的基因组中，其中所述细胞已经受调节以具有敲减或敲除的PKM多肽(例如，PKM-1)表达。“整合位点”包含向其中插入外源核苷酸序列的宿主细胞基因组内部核酸序列。在某些实施方案中，整合位点介于宿主细胞基因组上两个相邻核酸之间。在某些实施方案中，整合位点包含一段核苷酸序列。在某些实施方案中，整合位点位于TI宿主细胞的基因组的特定基因座内部。在某些实施方案中，整合位点在TI宿主细胞的内源性基因内部。可以借助本文公开的主题调节和使用本领域已知的任何整合位点。定向整合可以由本领域已知的方法和系统介导。例如，但不限于，2018年12月21日提交的国际申请号PCT/US18/067070中公开的方法和系统可以用于定向整合，其中所述文献的内容通过引用的方式完整并入本文。
在某些实施方案中，可以使用基于转座酶的整合，将编码目的产物的核酸整合入宿主细胞基因组。基于转座酶的整合技术例如在Trubitsyna等人,Nucleic Acids Res.45(10):e89(2017)；Li等人,PNAS 110(25):E2279-E2287(2013)和WO 2004/009792中公开，所述文献通过引用的方式完整并入本文。
在某些实施方案中，编码目的产物的核酸可以随机整合入宿主细胞基因组(“随机整合”或“RI”)。在某些实施方案中，随机整合可以由本领域已知的任何方法或系统介导。在某些实施方案中，随机整合由MaxCyte
Figure BDA0002706139770000311
电穿孔系统介导。
在某些实施方案中，随机整合可以与定向整合组合。在某些实施方案中，定向整合可以后接随机整合。在某些实施方案中，随机整合可以后接定向整合。例如，但不限于，编码目的产物的核酸可以随机地整合入细胞的基因组中，其中所述细胞已经受调节以具有敲减或敲除的PKM多肽(例如，PKM-1)表达，并且编码相同目的产物的核酸可以按定向方式整合在细胞的基因组中。
在某些实施方案中，宿主细胞是RI宿主细胞。在某些实施方案中，宿主细胞是TI宿主细胞。
5.4.细胞培养方法
在一个方面，本公开提供一种用于产生目的产物的方法，所述方法包括培养本文公开的细胞。用于本领域已知哺乳动物细胞的合适培养条件可以用于培养本文的细胞(J.Immunol.Methods(1983)56:221-234)或可以由技术人员轻易确定(参见，例如，AnimalCell Culture:A Practical Approach第2版,编者Rickwood,D.和Hames,B.D.OxfordUniversity Press,New York(1992))。
可以在适于正在培养的特定细胞的培养基中制备哺乳动物细胞培养物。市售培养基如Ham's F10(Sigma)、极限基本培养基(MEM，Sigma)，RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM，Sigma)是示例性营养液。此外，在Ham和Wallace,(1979)Meth.Enz.,58:44；Barnes和Sato,(1980)Anal.Biochem.102:255；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；5,122,469或美国专利号4,560,655；国际公开号WO 90/03430和WO 87/00195中描述的任何培养基可以用作培养基使用，所述全部文献的公开内容均通过引用方式并入本文。这些培养基中任一者可以根据需要补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷(如腺苷和胸苷)、抗生素(如庆大霉素(gentamycin)(庆大霉素(gentamicin)))、微量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、脂质(如亚油酸或其他脂肪酸)及其合适载体、和葡萄糖或等同能量源。也可以按本领域技术人员已知的适宜浓度包括任何其他的必需补充物。
在某些实施方案中，已经过修饰以减少和/或消除PKM多肽表达的哺乳动物细胞是CHO细胞。任何合适的培养基可以用来培养CHO细胞。在某些实施方案中，培养CHO细胞的合适培养基可以含有基础培养基组分，如基于DMEM/HAM F-12的制剂(关于DMEM和HAM F12培养基的组成，参见美国典型培养物保藏中心细胞系和杂交瘤目录中的培养基配方，第六版，1988，第346-349页)(如美国专利号5,122,469中所述的培养基制剂是特别适宜的)，同时修改某些组分(如氨基酸、盐、糖和维生素)的浓度，并且任选地含有甘氨酸、次黄嘌呤、和胸苷；重组人胰岛素、水解蛋白胨，如Primatone HS或Primatone RL(Sheffield，England)或等同物；细胞保护剂，如Pluronic F68或等同的多聚醇；庆大霉素；和微量元素。
在某些实施方案中，已经过修饰以减少和/或消除PKM多肽表达的哺乳动物细胞是表达重组蛋白的细胞。可以通过在多种细胞培养条件下培育表达目的产物的细胞，产生重组蛋白。例如，大规模或小规模生产蛋白质的细胞培养方法可能在本公开的背景范围内可用。可以使用诸多方法，包括，但不限于流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、转瓶培养、摇瓶培养或搅拌罐生物反应器系统，在后两个系统中，伴以或不伴以微载体并且可选地以分批、补料分批或连续方式操作。
在某些实施方案中，在搅拌罐生物反应器系统中进行本公开的细胞培养，并且使用补料分批培养方法。在补料分批培养中，将哺乳动物宿主细胞和培养基最初供应至培养容器并且将额外的培养养分在培养期间连续地或以离散的增量送入培养物，在终止培养之前定期收获或不收获细胞和/或产物。补料分批培养可以包括例如半连续补料分批培养，其中定期将整个培养物(包括细胞和培养基)取出并由新鲜培养基替换。补料分批培养不同于其中将用于细胞培养的全部组分(包括细胞和全部培养养分)在培养过程开始时供应至培养容器的简单分批培养。补料分批培养还可以不同于灌注培养，在于这个过程期间不从培养容器移除上清液(在灌注培养中，细胞通过例如过滤、胶囊化、锚定于微载体等固定于培养物中，并且将培养基连续地或间歇地引入培养容器并从中移除)。
在某些实施方案中，培养物的细胞可以根据可以适用于所构思的特定宿主细胞和特定生产计划的任何方案或惯例增殖。因此，本公开构思了单步骤或多步骤培养方法。在单步骤培养中，将宿主细胞接种至培养环境中并且在细胞培养的单个生产阶段期间使用本发明的方法。备选地，构想了多级培养。在多级培养中，可以在多个步骤或阶段培养细胞。例如，可以在第一步骤或生长阶段培养中培育细胞，其中将细胞(可能从储备取出)接种至适于促进生长和高活力的培养基中。可以通过添加新鲜培养基至宿主细胞培养物，将细胞维持在生长阶段持续合适的时间段。
在某些实施方案中，构想了补料分批或连续细胞培养条以增强处于细胞培养生长阶段的哺乳动物细胞的生长。在生长阶段，在使生长最大化的条件和时间段培育细胞。培养条件如温度、pH、溶解氧(dO2)等是随特定宿主所用的那些培养条件，并且将是普通技术人员显而易见的。通常，使用酸(例如，CO2)或碱(例如，Na2CO3或NaOH)，将pH调整至约6.5和7.5之间的水平。用于培养哺乳动物细胞如CHO细胞的合适温度范围是介于约30°至38℃之间，并且合适的dO2是介于5-90％空气饱和度之间。
在特定阶段，细胞可以用来接种细胞培养的生产阶段或步骤。备选地，如上文所述，生产阶段或步骤可以与接种或生长阶段或步骤无间断。
在某些实施方案中，本公开中描述的培养方法还可以包括从细胞培养物(例如，从生产阶段细胞培养物)收获产物。在某些实施方案中，通过本公开的细胞培养物方法产生的产物可以收获自第三生物反应器，例如，生产生物反应器。例如，但不限于，所公开的方法可以包括在细胞培养生产阶段完成收获产物。备选地或额外地，可以在生产阶段完成之前收获产物。在某些实施方案中，一旦已经实现特定细胞密度即可以从细胞培养物收获产物。例如，但不限于，在收获之前细胞密度可以是约2.0x 107个细胞/mL至约5.0x 107个细胞/mL。
在某些实施方案中，从细胞培养物收获产物可以包括以下一者或多者：离心、过滤、声波分离、絮凝和细胞移除技术。
在某些实施方案中，目的产物可以从宿主细胞分泌或可以是膜结合、胞质或胞核蛋白。在某些实施方案中，可以从条件化细胞培养基纯化可溶性形式的多肽并且可以通过以下方式纯化膜结合形式的多肽：从正在表达的细胞制备总膜级分并用非离子去垢剂如
Figure BDA0002706139770000341
X-100(EMD Biosciences,San Diego,Calif.)提取膜。在某些实施方案中，可以通过裂解宿主细胞(例如，借助机械力、超声处理和/或去垢剂)、通过离心移除细胞膜级分并且保留上清液，制备胞质或胞核蛋白。
5.5产物
本公开的细胞和/或方法可以用来产生可以由本文公开的细胞表达的任何目的产物。在某些实施方案中，本公开的细胞和/或方法可以用于产生多肽，例如，哺乳动物多肽。这类多肽的非限制性实例包括激素、受体、融合蛋白、调节因子、生长因子、补体系统因子、酶、凝血因子、抗凝血因子、激酶、细胞因子、CD蛋白质、白介素、治疗用蛋白、诊断用蛋白和抗体。本公开的细胞和/或方法不专用于正在产生的分子，例如，抗体。
在某些实施方案中，本公开的方法可以用于产生抗体，包括治疗用和诊断用抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，通过本公开的细胞和方法所产生的抗体可以是但不限于单特异性抗体(例如，由单个重链序列和单个轻链序列组成的抗体，包括这类配对的多聚体)、多特异性抗体及其抗原结合片段。例如，但不限于，多特异性抗体可以是双特异性抗体、双表位抗体，T细胞依赖性双特异性抗体(TDB)、双重功能FAb(DAF)或其抗原结合片段。
5.5.1多特异性抗体
在某些方面，通过本文提供的细胞和方法所产生的抗体是多特异性抗体，例如，双特异性抗体。多特异性抗体是对至少两个不同位点即不同抗原上的不同表位(即，双特异性)或相同抗原上的不同表位在(即，双表位)具有结合特异性的单克隆抗体。在某些方面，多特异性抗体具有三种或更多种结合特异性。多特异性抗体可以如本文所述那样制备为全长抗体或抗体片段。
用于产生多特异性抗体的技术包括但不限于重组共表达具有不同特异性的两个免疫球蛋白重链-轻链对(参见Milstein和Cuello,Nature 305:537(1983))和“结-扣”工程化(例如，参见美国专利号5,731,168和Atwell等人,J.Mol.Biol.270:26(1997))。也可以通过以下方式产生多特异性抗体：工程化静电转向效应用于产生抗体Fc-异二聚体分子(参见，例如，WO 2009/089004)；交联两个或更多个抗体或片段(例如，参见美国专利号4,676,980，和Brennan等人,Science,229:81(1985))；使用亮氨酸拉链以产生双特异性抗体(例如，参见J.Immunol.,148(5):1547-1553(1992)和WO 2011/034605)；使用共同轻链技术以规避轻链错配对问题(参见，例如，WO 98/50431)；使用“双体抗体(diabody)”技术以产生双特异性抗体片段(例如，参见Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993))；和使用单链Fv(sFv)二聚体(例如，参见Gruber等人,J.Immunol.,152:5368(1994))；以及制备三特异性抗体，如在例如Tutt等人,J.Immunol.147:60(1991)中所述那样。
本文中还包括具有三个或更多个抗原结合位点的工程化抗体，例如包括“八抗体(Octopus antibody)”或DVD-Ig(参见，例如WO 2001/77342和WO 2008/024715)。具有三个或更多个抗原结合位点的多特异性抗体的其他非限制性实例可以见于WO 2010/115589、WO2010/112193、WO 2010/136172、WO 2010/145792和WO 2013/026831中。双特异性抗体或其抗原结合片段还包括“双重功能FAb”或“DAF”(参见，例如，US 2008/0069820和WO 2015/095539)。
多特异性抗体也可以按不对称形式提供，所述不对称形式具有一个或多个具有相同抗原特异性的结合臂的结构域互换，即，通过交换VH/VL结构域(参见，例如，WO 2009/080252和WO 2015/150447)、CH1/CL结构域(参见，例如，WO 2009/080253)或完整Fab臂(参见，例如，WO 2009/080251、WO 2016/016299，还参见Schaefer等人,PNAS,108(2011)1187-1191和Klein等人,MAbs 8(2016)1010-20)。在某些实施方案中，多特异性抗体包含交叉Fab片段。术语“交换-Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”指一种Fab片段，其中重链和轻链的可变区或恒定区交换。交换-Fab片段包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区1(CH1)组成的多肽链，和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)组成的多肽链。也可以通过向结构域界面引入带电荷或不带电荷的氨基酸突变以指导正确Fab配对，对不对称Fab臂工程化。参见，例如，WO 2016/172485。
多特异性抗体的多种其他分子样式是本领域已知的并且包含于本文中(参见，例如，Spiess等人,Mol.Immunol.67(2015)95-106)。
在某些实施方案中，还纳入本文的具体类型的多特异性抗体是双特异性抗体，其中将所述双特异性抗体设计成与靶细胞(例如，肿瘤细胞)上的表面抗原并且与T细胞受体(TCR)复合体的活化性不变组分(如CD3)同时结合用于再靶向T细胞以杀伤靶细胞。
可以用于这种目的双特异性抗体样式的额外非限制性实例包括但不限于所谓的“BiTE”(双特异性T细胞衔接体)分子，其中两个scFv分子由柔性接头融合(参见，例如，WO2004/106381、WO 2005/061547、WO 2007/042261和WO 2008/119567，Nagorsen和
Figure BDA0002706139770000361
Exp Cell Res 317,1255-1260(2011))；双体抗体(Holliger等人,Prot.Eng.9,299-305(1996))及其衍生物，如串联双体抗体(“TandAb”；Kipriyanov等人,J Mol Biol 293,41-56(1999))；“DART”(双亲和力再指向)分子，所述分子基于双体抗体(diabody)样式，但是以用于额外稳定作用的C末端二硫键为特征(Johnson等人,J Mol Biol 399,436-449(2010))；和所谓的三体瘤，其为完整杂合小鼠/大鼠IgG分子(在Seimetz等人,CancerTreat.Rev.36,458-467(2010)中综述)。本文纳入的具体T细胞双特异性抗体样式在WO2013/026833、WO 2013/026839、WO 2016/020309；Bacac等人,Oncoimmunology 5(8)(2016)e1203498中描述。
5.5.2抗体片段
在某些方面，通过本文提供的细胞和方法所产生的抗体是抗体片段。例如，但不限于，抗体片段是Fab、Fab’、Fab’-SH或F(ab’)2片段、尤其Fab片段。木瓜蛋白酶消化完整抗体产生了两个相同的抗原结合片段，称作“Fab”片段，其各自包含重链可变结构域和轻链可变结构域(分别是VH和VL)并且还包含轻链的恒定结构域(CL)和重链的第一恒定结构域(CH1)。术语“Fab片段”因此指包含轻链和重链片段的抗体片段，所述轻链包含VL结构域和CL结构域，所述重链片段包含VH结构域和CH1结构域。Fab’片段因在CH1结构域的羧基端处加入残基(包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸)而异于Fab片段。Fab’-SH是这样的Fab’片段，其中恒定结构域的半胱氨酸残基携带游离巯基。胃蛋白酶处理产生了具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区一部分的F(ab’)2片段。关于包含救援受体(salvagereceptor)结合表位残基和具有增加的体内半衰期的Fab片段和F(ab’)2片段的讨论，参见美国专利号5,869,046。
在某些实施方案中，抗体片段是双体抗体、三体抗体或四体抗体。“双体抗体”是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述抗原结合位点可以是双价或双特异的。参见例如，EP404,097；WO 1993/01161；Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)；和Hollinger等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)。三体抗体和四体抗体还在Hudson等人,Nat.Med.9:129-134(2003)中描述。
在又一个方面，抗体片段是单链Fab片段。“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变结构域(VH)、抗体重链恒定结构域1(CH1)、抗体轻链可变结构域(VL)、抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头按N末端至C端方向具有以下顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL、b)VL-CL-接头-VH-CH1、c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。特别地，所述接头是至少30个氨基酸、优选地32个氨基酸和50个氨基酸之间的多肽。所述单链Fab片段借助CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定化。此外，这些单链Fab片段可能通过插入半胱氨酸残基(根据Kabat编号，例如可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)产生链间二硫键进一步稳定化。
在另一个方面，抗体片段是单链可变片段(scFv)。“单链可变片段”或“scFv”是由接头接的抗体重链(VH)和轻链(VL)的可变结构域的融合蛋白。特别地，接头是10至25个氨基酸的短多肽并且通常富含用于灵活性的甘氨酸，以及用于溶解度的丝氨酸或苏氨酸，并且可以使VH的N末端与VL的C末端连接，或反之亦然。即便移除恒定区和引入接头，这种蛋白质保留原始抗体的特异性。关于scFv片段的综述，参见例如Plückthun,引自Pharmacologyof Monoclonal Antibodies(单克隆抗体药理学),第113卷,Rosenburg和Moore编著,(Springer-Verlag,New York),第269-315页(1994)；还参见WO 93/16185；和美国专利号5,571,894和5,587,458。
在另一个方面，抗体片段是单一结构域抗体。“单结构域抗体”是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些方面，单一结构域抗体是人单一结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如美国专利号6,248,516B1)。
可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体。
5.5.3嵌合抗体和人源化抗体
在某些方面，通过本文提供的细胞和方法所产生的抗体是嵌合抗体。某些嵌合抗体例如在美国专利号4,816,567；和Morrison等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984))中描述。在一个例子中，嵌合抗体包含非人类可变区(例如，源自小鼠、大鼠、仓鼠、兔或非人灵长类如猴的可变区)和人类恒定区。在又一个例子中，嵌合抗体是“类转换”抗体，其中类或亚类已经相对亲本抗体发生改变。嵌合抗体包括其抗原结合片段。
在某些方面，嵌合抗体是人源化抗体。一般，将非人抗体人源化以降低对人的免疫原性，同时保留亲本非人抗体的特异性和亲和力。通常，人源化抗体包含其中CDR(或其部分)衍生自非人类抗体并且FR(或其部分)衍生自人抗体序列的一个或多个可变结构域。人源化抗体任选地也将包含人恒定区的至少一部分。在某些实施方案中，将人源化抗体中的一些FR残基置换为来自非人类抗体(例如，从中衍生CDR残基的抗体)的相应残基，例如，以恢复或改善抗体特异性或亲和力。
人源化抗体和制造它们的方法在例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008)中，并且例如还在Riechmann等人,Nature 332:323-329(1988)；Queen等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86:10029-10033(1989)；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等人,Methods 36:25-34(2005)(描述特异性决定区(SDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28:489-498(1991)(描述“表面重塑”)；Dall'Acqua等人,Methods 36:43-60(2005)(描述“FR改组”)；和Osbourn等人,Methods 36:61-68(2005)和Klimka等人,Br.J.Cancer,83:252-260(2000)(描述针对FR改组的“导向选择”方案)中综述。
可以用于人源化的人构架区包括但不限于：使用“最佳配合”法选择的构架区(参见，例如，Sims等人,J.Immunol.151:2296(1993))；从具有特定亚组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列衍生的构架区(参见，例如，Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89:4285(1992)；和Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993))；人成熟(体细胞突变)构架区或人种系构架区(参见，例如，Almagro和Fransson,Front.Biosci.13:1619-1633(2008))；和从筛选FR文库衍生的构架区(参见，例如，Baca等人,J.Biol.Chem.272:10678-10684(1997)和Rosok等人,J.Biol.Chem.271:22611-22618(1996))。
5.5.4人抗体
在某些方面，通过本文提供的细胞和方法所产生的抗体是人抗体。可以使用本领域已知的多种技术产生人抗体。人抗体总体上在van Dijk和van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5:368-74(2001)和Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20:450-459(2008)中描述。
可以通过施用免疫原至转基因动物制备人抗体，其中所述转基因动物已经被修饰成响应于抗原攻击而产生完整人抗体或具有人可变区的完整抗体。这类动物一般含有替换内源免疫球蛋白基因座或在染色体外存在或随机整合入动物染色体的全部或部分人免疫球蛋白基因座。在这类转基因小鼠中，内源免疫球蛋白基因座通常已经失活。关于从转基因动物获得人抗体的方法的综述，参见Lonberg,Nat.Biotech.23:1117-1125(2005)。还参见，例如，描述XENOMOUSETM技术的美国专利号6,075,181和6,150,584；描述
Figure BDA0002706139770000391
技术的美国专利号5,770,429；描述K-M
Figure BDA0002706139770000392
技术的美国专利号7,041,870，和描述
Figure BDA0002706139770000393
技术的美国专利申请公开号US 2007/0061900。可以进一步修饰来自这类动物产生的完整抗体的人可变区，例如，通过与不同的人类恒定区组合。
也可以通过基于杂交瘤的方法产生人抗体。已经描述了用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤细胞系和小鼠-人杂合骨髓瘤细胞系。(参见，例如，Kozbor J.Immunol.,133:3001(1984)；Brodeur等人,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications(单克隆抗体生产技术及应用),第51-63页(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；和Boerner等人,J.Immunol.,147:86(1991))。Li等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)中还描述了借助人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。额外的方法包括例如在美国专利号7,189,826(描述从杂交瘤细胞系产生单克隆人IgM抗体)和Ni,XiandaiMianyixue,26(4):265-268(2006)(描述人-人杂交瘤)中描述的那些。人杂交瘤技术(三体瘤技术)还在Vollmers和Brandlein,Histology and Histopathology,20(3):927-937(2005)以及Vollmers和Brandlein,Methods and Findings in Experimental andClinical Pharmacology,27(3):185-91(2005)中描述。
5.5.5靶分子
可以被通过本文所公开的细胞和方法产生的抗体靶向的分子的非限制性例子包括可溶性血清蛋白与它们的受体及其他膜结合型蛋白质(例如，黏附蛋白)。在某些实施方案中，通过本文公开的细胞和方法所产生的抗体能够与一种、两种或更多种选自以下的细胞因子、细胞因子相关蛋白和细胞因子受体结合：8MPI，8MP2，8MP38(GDFIO)，8MP4，8MP6，8MP8，CSFI(M-CSF)，CSF2(GM-CSF)，CSF3(G-CSF)，EPO，FGF1(αFGF)，FGF2(βFGF)，FGF3(int-2)，FGF4(HST)，FGF5，FGF6(HST-2)，FGF7(KGF)，FGF9，FGF1 0，FGF11，FGF12，FGF12B，FGF14，FGF16，FGF17，FGF19，FGF20，FGF21，FGF23，IGF1，IGF2，IFNA1，IFNA2，IFNA4，IFNA5，IFNA6，IFNA7，IFN81，IFNG，IFNWI，FEL1，FEL1(EPSELON)，FEL1(ZETA)，IL 1A，IL 1B，IL2，IL3，IL4，IL5，IL6，IL7，IL8，IL9，IL1 0，IL 11，IL 12A，IL 12B，IL 13，IL 14，IL 15，IL 16，IL 17，IL 17B，IL 18，IL 19，IL20，IL22，IL23，IL24，IL25，IL26，IL27，IL28A，IL28B，IL29，IL30，PDGFA，PDGFB，TGFA，TGFB1，TGFB2，TGFBb3，LTA(TNF-β)，LTB，TNF(TNF-α)，TNFSF4(OX40配体)，TNFSF5(CD40配体)，TNFSF6(FasL)，TNFSF7(CD27配体)，TNFSF8(CD30配体)，TNFSF9(4-1BB配体)，TNFSF10(TRAIL)，TNFSF11(TRANCE)，TNFSF12，(APO3L)，TNFSF13(April)，TNFSF13B，TNFSF14(HVEM-L)，TNFSF15(VEGI)，TNFSF18，HGF(VEGFD)，VEGF，VEGFB，VEGFC，IL1R1，IL1R2，IL1RL1，IL1RL2，IL2RA，IL2RB，IL2RG，IL3RA，IL4R，IL5RA，IL6R，IL7R，IL8RA，IL8RB，IL9R，IL10RA，IL10RB，IL 11RA，IL12RB1，IL12RB2，IL13RA1，IL13RA2，IL15RA，IL17R，IL18R1，IL20RA，IL21R，IL22R，IL1HY1，IL1RAP，IL1RAPL1，IL1RAPL2，IL1RN，IL6ST，IL18BP，IL18RAP，IL22RA2，AIF1，HGF，LEP(瘦蛋白)，PTN和THPO.k。
在某些实施方案中，通过本文所公开的细胞和方法产生的抗体能够与选自以下的趋化因子、趋化因子受体或趋化因子相关蛋白结合：CCLI(1-309)、CCL2(MCP-1/MCAF)、CCL3(MIP-Iα)、CCL4(MIP-Iβ)、CCL5(RANTES)、CCL7(MCP-3)、CCL8(mcp-2)、CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)、CCL 13(MCP-4)、CCL 15(MIP-Iδ)、CCL 16(HCC-4)、CCL 17(TARC)、CCL 18(PARC)、CCL 19(MDP-3b)、CCL20(MIP-3α)、CCL21(SLC/次级非淋巴组织趋化因子蛋白-2)、CCL22(MDC/STC-1)、CCL23(MPIF-1)、CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)、CCL25(TECK)、CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)、CCL27(CTACK/ILC)、CCL28、CXCLI(GROI)、CXCL2(GR02)、CXCL3(GR03)、CXCL5(ENA-78)、CXCL6(GCP-2)、CXCL9(MIG)、CXCL 10(IP 10)、CXCL11(1-TAC)、CXCL 12(SDFI)、CXCL 13、CXCL 14、CXCL 16、PF4(CXCL4)、PPBP(CXCL7)、CX3CL1(SCYDI)、SCYEI、XCLI(淋巴细胞趋化因子)、XCL2(SCM-Iβ)、BLRI(MDR15)、CCBP2(D6/JAB61)、CCRI(CKRI/HM145)、CCR2(mcp-IRB IRA)、CCR3(CKR3/CMKBR3)、CCR4、CCR5(CMKBR5/ChemR13)、CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)、CCR7(CKR7/EBII)、CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)、CCR9(GPR-9-6)、CCRL1(VSHK1)、CCRL2(L-CCR)、XCR1(GPR5/CCXCR1)、CMKLR1、CMKOR1(RDC1)、CX3CR1(V28)、CXCR4、GPR2(CCR10)、GPR31、GPR81(FKSG80)、CXCR3(GPR9/CKR-L2)、CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)、HM74、IL8RA(IL8Rα)、IL8RB(IL8Rβ)、LTB4R(GPR16)、TCP10、CKLFSF2、CKLFSF3、CKLFSF4、CKLFSF5、CKLFSF6、CKLFSF7、CKLFSF8、BDNF、C5、C5R1、CSF3、GRCC10(C10)、EPO、FY(DARC)、GDF5、HDF1、HDF1α、DL8、PRL、RGS3、RGS13、SDF2、SLIT2、TLR2、TLR4、TREM1、TREM2和VHL。
在某些实施方案中，通过本文所公开的方法产生的抗体(例如，多特异性抗体，如双特异性抗体)能够与一种或多种选自以下的靶分子结合：0772P(CA125、MUC16)(即，卵巢癌抗原)、ABCF1；ACVR1；ACVR1B；ACVR2；ACVR2B；ACVRL1；ADORA2A；聚集蛋白聚糖；AGR2；AICDA；AIF1；AIG1；AKAP1；AKAP2；AMH；AMHR2；淀粉样蛋白β；ANGPTL；ANGPT2；ANGPTL3；ANGPTL4；ANPEP；APC；APOC1；AR；ASLG659；ASPHD1(天冬氨酸β-羟化酶结构域含有1；LOC253982)；AZGP1(锌-a-糖蛋白)；B7.1；B7.2；BAD；BAFF-R(B细胞-活化因子受体，BLyS受体3、BR3；BAG1；BAI1；BCL2；BCL6；BDNF；BLNK；BLRI(MDR15)；BMP1；BMP2；BMP3B(GDF10)；BMP4；BMP6；BMP8；BMPR1A；BMPR1B(骨形态发生蛋白受体型IB)；BMPR2；BPAG1(网蛋白)；BRCA1；Brevican；C19orf10(IL27w)；C3；C4A；C5；C5R1；CANT1；CASP1；CASP4；CAV1；CCBP2(D6/JAB61)；CCL1(1-309)；CCL11(嗜酸性粒细胞趋化因子)；CCL13(MCP-4)；CCL15(MIP1δ)；CCL16(HCC-4)；CCL17(TARC)；CCL18(PARC)；CCL19(MIP-3β)；CCL2(MCP-1)；MCAF；CCL20(MIP-3α)；CCL21(MTP-2)；SLC；次级非淋巴组织趋化因子-2；CCL22(MDC/STC-1)；CCL23(MPIF-1)；CCL24(MPIF-2/嗜酸性粒细胞趋化因子-2)；CCL25(TECK)；CCL26(嗜酸性粒细胞趋化因子-3)；CCL27(CTACK/ILC)；CCL28；CCL3(MTP-Iα)；CCL4(MDP-Iβ)；CCL5(RANTES)；CCL7(MCP-3)；CCL8(mcp-2)；CCNA1；CCNA2；CCND1；CCNE1；CCNE2；CCR1(CKRI/HM145)；CCR2(mcp-IRβ/RA)；CCR3(CKR/CMKBR3)；CCR4；CCR5(CMKBR5/ChemR13)；CCR6(CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6)；CCR7(CKBR7/EBI1)；CCR8(CMKBR8/TER1/CKR-L1)；CCR9(GPR-9-6)；CCRL1(VSHK1)；CCRL2(L-CCR)；CD164；CD19；CD1C；CD20；CD200；CD22(B细胞受体CD22-B同工型)；CD24；CD28；CD3；CD37；CD38；CD3E；CD3G；CD3Z；CD4；CD40；CD40L；CD44；CD45RB；CD52；CD69；CD72；CD74；CD79A(CD79α、免疫球蛋白-相关α、B细胞特异性蛋白)；CD79B；CDS；CD80；CD81；CD83；CD86；CDH1(E-钙黏着蛋白)；CDH10；CDH12；CDH13；CDH18；CDH19；CDH20；CDH5；CDH7；CDH8；CDH9；CDK2；CDK3；CDK4；CDK5；CDK6；CDK7；CDK9；CDKN1A(p21/WAF1/Cip1)；CDKN1B(p27/Kip1)；CDKN1C；CDKN2A(P16INK4a)；CDKN2B；CDKN2C；CDKN3；CEBPB；CER1；CHGA；CHGB；几丁质酶；CHST10；CKLFSF2；CKLFSF3；CKLFSF4；CKLFSF5；CKLFSF6；CKLFSF7；CKLFSF8；CLDN3；CLDN7(紧密连接蛋白-7)；CLL-1(CLEC12A、MICL和DCAL2)；CLN3；CLU(簇集蛋白)；CMKLR1；CMKOR1(RDC1)；CNR1；COL18A1；COL1A1；COL4A3；COL6A1；补体因子D；CR2；CRP；CRIPTO(CR、CR1、CRGF、CRIPTO、TDGF1、畸胎癌肉瘤衍生的生长因子)；CSFI(M-CSF)；CSF2(GM-CSF)；CSF3(GCSF)；CTLA4；CTNNB1(b-联蛋白)；CTSB(组织蛋白酶B)；CX3CL1(SCYDI)；CX3CR1(V28)；CXCL1(GRO1)；CXCL10(IP-10)；CXCL11(I-TAC/IP-9)；CXCL12(SDF1)；CXCL13；CXCL14；CXCL16；CXCL2(GRO2)；CXCL3(GRO3)；CXCL5(ENA-78/LIX)；CXCL6(GCP-2)；CXCL9(MIG)；CXCR3(GPR9/CKR-L2)；CXCR4；CXCR5(Burkitt淋巴瘤受体1、G蛋白偶联受体)；CXCR6(TYMSTR/STRL33/Bonzo)；CYB5；CYC1；CYSLTR1；DAB2IP；DES；DKFZp451J0118；DNCLI；DPP4；E16(LAT1、SLC7A5)；E2F1；ECGF1；EDG1；EFNA1；EFNA3；EFNB2；EGF；EGFR；ELAC2；ENG；ENO1；ENO2；ENO3；EPHB4；EphB2R；EPO；ERBB2(Her-2)；EREG；ERK8；ESR1；ESR2；ETBR(B型内皮素受体)；F3(TF)；FADD；FasL；FASN；FCER1A；FCER2；FCGR3A；FcRH1(Fc受体样蛋白1)；FcRH2(IFGP4、IRTA4、SPAP1A(含有SH2结构域的磷酸酶锚定蛋白1a)、SPAP1B、SPAP1C)；FGF；FGF1(αFGF)；FGF10；FGF11；FGF12；FGF12B；FGF13；FGF14；FGF16；FGF17；FGF18；FGF19；FGF2(bFGF)；FGF20；FGF21；FGF22；FGF23；FGF3(int-2)；FGF4(HST)；FGF5；FGF6(HST-2)；FGF7(KGF)；FGF8；FGF9；FGFR；FGFR3；FIGF(VEGFD)；FELl(EPSILON)；FILl(ZETA)；FLJ12584；FLJ25530；FLRTI(纤连蛋白)；FLT1；FOS；FOSL1(FRA-1)；FY(DARC)；GABRP(GABAa)；GAGEB1；GAGEC1；GALNAC4S-6ST；GATA3；GDF5；GDNF-Ra1(GDNF家族受体α1；GFRA1；GDNFR；GDNFRA；RETL1；TRNR1；RET1L；GDNFR-α1；GFR-ALPHA-1)；GEDA；GFI1；GGT1；GM-CSF；GNASI；GNRHI；GPR2(CCR10)；GPR19(G蛋白偶联受体19；Mm.4787)；GPR31；GPR44；GPR54(KISS1受体；KISS1R；GPR54；HOT7T175；AXOR12)；GPR81(FKSG80)；GPR172A(G蛋白偶联受体172A；GPCR41；FLJ11856；D15Ertd747e)；GRCCIO(C10)；GRP；GSN(凝溶胶蛋白)；GSTP1；HAVCR2；HDAC4；HDAC5；HDAC7A；HDAC9；HGF；HIF1A；HOP1；组胺和组胺受体；HLA-A；HLA-DOB(MHC II类分子的Β亚基(Ia抗原)；HLA-DRA；HM74；HMOXI；HUMCYT2A；ICEBERG；ICOSL；1D2；IFN-a；IFNA1；IFNA2；IFNA4；IFNA5；IFNA6；IFNA7；IFNB1；IFNγ；DFNW1；IGBP1；IGF1；IGF1R；IGF2；IGFBP2；IGFBP3；IGFBP6；IL-l；IL10；IL10RA；IL10RB；IL11；IL11RA；IL-12；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL13RA1；IL13RA2；IL14；IL15；IL15RA；IL16；IL17；IL17B；IL17C；IL17R；IL18；IL18BP；IL18R1；IL18RAP；IL19；IL1A；IL1B；ILIF10；IL1F5；IL1F6；IL1F7；IL1F8；IL1F9；IL1HY1；IL1R1；IL1R2；IL1RAP；IL1RAPL1；IL1RAPL2；IL1RL1；IL1RL2、ILIRN；IL2；IL20；IL20Rα；IL21R；IL22；IL-22c；IL22R；IL22RA2；IL23；IL24；IL25；IL26；IL27；IL28A；IL28B；IL29；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL3；IL30；IL3RA；IL4；IL4R；IL5；IL5RA；IL6；IL6R；IL6ST(糖蛋白130)；甲型流感；乙型流感；EL7；EL7R；EL8；IL8RA；DL8RB；IL8RB；DL9；DL9R；DLK；INHA；INHBA；INSL3；INSL4；IRAK1；IRTA2(免疫球蛋白超家族受体转运相关2)；ERAK2；ITGA1；ITGA2；ITGA3；ITGA6(a6整联蛋白)；ITGAV；ITGB3；ITGB4(b4整联蛋白)；α4β7和αEβ7整联蛋白异二聚体；JAG1；JAK1；JAK3；JUN；K6HF；KAI1；KDR；KITLG；KLF5(GC Box BP)；KLF6；KLKIO；KLK12；KLK13；KLK14；KLK15；KLK3；KLK4；KLK5；KLK6；KLK9；KRT1；KRT19(角蛋白19)；KRT2A；KHTHB6(毛发特异性类型H角蛋白)；LAMAS；LEP(瘦蛋白)；LGR5(含有亮氨酸丰富重复序列的G蛋白偶联受体5；GPR49、GPR67)；Lingo-p75；Lingo-Troy；LPS；LTA(TNF-b)；LTB；LTB4R(GPR16)；LTB4R2；LTBR；LY64(淋巴细胞抗原64(RP105)、亮氨酸丰富重复序列(LRR)家族I型膜蛋白)；Ly6E(淋巴细胞抗原6复合物，基因座E；Ly67、RIG-E、SCA-2、TSA-1)；Ly6G6D(淋巴细胞抗原6复合物，基因座G6D；Ly6-D、MEGT1)；LY6K(淋巴细胞抗原6复合物，基因座K；LY6K；HSJ001348；FLJ35226)；MACMARCKS；MAG或OMgp；MAP2K7(c-Jun)；MDK；MDP；MIB1；中期因子；MEF；MIP-2；MKI67；(Ki-67)；MMP2；MMP9；MPF(MPF、MSLN、SMR、巨核细胞激活因子，间皮素)；MS4A1；MSG783(RNF124、假定蛋白FLJ20315)；MSMB；MT3(金属硫蛋白-111)；MTSS1；MUC1(黏蛋白)；MYC；MY088；Napi3b(也称作NaPi2b)(NAPI-3B、NPTIIb、SLC34A2、溶质载体家族34(磷酸钠)，成员2，II型钠-依赖性磷酸盐转运蛋白3b)；NCA；NCK2；神经蛋白聚糖；NFKB1；NFKB2；NGFB(NGF)；NGFR；NgR-Lingo；NgR-Nogo66(Nogo)；NgR-p75；NgR-Troy；NME1(NM23A)；NOX5；NPPB；NR0B1；NR0B2；NR1D1；NR1D2；NR1H2；NR1H3；NR1H4；NR112；NR113；NR2C1；NR2C2；NR2E1；NR2E3；NR2F1；NR2F2；NR2F6；NR3C1；NR3C2；NR4A1；NR4A2；NR4A3；NR5A1；NR5A2；NR6A1；NRP1；NRP2；NT5E；NTN4；ODZI；OPRD1；OX40；P2RX7；P2X5(嘌呤能受体P2X受体配体门控离子通道5)；PAP；PART1；PATE；PAWR；PCA3；PCNA；PD-L1；PD-L2；PD-1；POGFA；POGFB；PECAM1；PF4(CXCL4)；PGF；PGR；磷酸蛋白聚糖(phosphacan)；PIAS2；PIK3CG；PLAU(uPA)；PLG；PLXDC1；PMEL17(银同源物；SILV；D12S53E；PMEL17；SI；SIL)；PPBP(CXCL7)；PPID；PRI；PRKCQ；PRKDI；PRL；PROC；PROK2；PSAP；PSCA hlg(2700050C12Rik、C530008O16Rik、RIKENcDNA 2700050C12、RIKEN cDNA 2700050C12基因；PTAFR；PTEN；PTGS2(COX-2)；PTN；RAC2(p21Rac2)；RARB；RET(ret原癌基因；MEN2A；HSCR1；MEN2B；MTC1；PTC；CDHF12；Hs.168114；RET51；RET-ELE1)；RGSI；RGS13；RGS3；RNF110(ZNF144)；ROBO2；S100A2；SCGB1D2(亲脂素B)；SCGB2A1(乳腺珠蛋白2)；SCGB2A2(乳腺珠蛋白1)；SCYEI(内皮单核细胞活化细胞因子)；SDF2；Sema 5b(FLJ10372、KIAA1445、Mm.42015、SEMA5B、SEMAG、脑信号蛋白(semaphorin)5bHlog、sema结构域，七血小板应答蛋白重复序列(1型和1型样)、跨膜结构域(TM)和短胞质结构域，(脑信号蛋白)5B)；SERPINA1；SERPINA3；SERP1NB5(乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物)；SERPINE1(PAI-1)；SERPDMF1；SHBG；SLA2；SLC2A2；SLC33A1；SLC43A1；SLIT2；SPPI；SPRR1B(Sprl)；ST6GAL1；STABI；STAT6；STEAP(前列腺六次跨膜上皮抗原)；STEAP2(HGNC_8639、IPCA-1、PCANAP1、STAMP1、STEAP2、STMP、前列腺癌相关基因1、前列腺癌相关蛋白1、前列腺六次跨膜上皮抗原2、前列腺六次跨膜蛋白)；TB4R2；TBX21；TCPIO；TOGFI；TEK；TENB2(推定性跨膜蛋白聚糖)；TGFA；TGFBI；TGFB1II；TGFB2；TGFB3；TGFBI；TGFBRI；TGFBR2；TGFBR3；THIL；THBSI(血小板应答蛋白-1)；THBS2；THBS4；THPO；TIE(Tie-1)；TMP3；组织因子；TLR1；TLR2；TLR3；TLR4；TLR5；TLR6；TLR7；TLR8；TLR9；TLR10；TMEFF1(具有EGF样结构域和二个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白1；Tomoregulin-1)；TMEM46(shisa同源物2)；TNF；TNF-a；TNFAEP2(B94)；TNFAIP3；TNFRSFIIA；TNFRSF1A；TNFRSF1B；TNFRSF21；TNFRSF5；TNFRSF6(Fas)；TNFRSF7；TNFRSF8；TNFRSF9；TNFSF10(TRAIL)；TNFSF11(TRANCE)；TNFSF12(AP03L)；TNFSF13(April)；TNFSF13B；TNFSF14(HVEM-L)；TNFSF15(VEGI)；TNFSF18；TNFSF4(OX40配体)；TNFSF5(CD40配体)；TNFSF6(FasL)；TNFSF7(CD27配体)；TNFSFS(CD30配体)；TNFSF9(4-1BB配体)；TOLLIP；Toll样受体；TOP2A(拓扑异构酶Ea)；TP53；TPM1；TPM2；TRADD；TMEM118(跨膜环指蛋白2；RNFT2；FLJ14627)；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TRAF4；TRAF5；TRAF6；TREM1；TREM2；TrpM4(BR22450、FLJ20041、TRPM4、TRPM4B、瞬时受体电位阳离子通道亚家族M成员4)；TRPC6；TSLP；TWEAK；酪氨酸酶(TYR；OCAIA；OCA1A；酪氨酸酶；SHEP3)；VEGF；VEGFB；VEGFC；多功能蛋白聚糖；VHLC5；VLA-4；XCL1(淋巴细胞趋化因子)；XCL2(SCM-1b)；XCRI(GPR5/CCXCRI)；YY1；和ZFPM2。
在某些实施方案中，通过本文公开的细胞和方法所产生的抗体能够结合于CD蛋白质，如CD3、CD4、CD5、CD16、CD19、CD20、CD21(CR2(补体受体2)或C3DR(C3d/EpsteinBarr病毒受体)或Hs.73792)；CD33；CD34；CD64；CD72(B细胞分化抗原CD72、Lyb-2)；CD79b(CD79B、CD79β、IGb(免疫球蛋白相关β)、B29)；ErbB受体家族的CD200成员如EGF受体、HER2、HER3或HER4受体；细胞黏附分子如LFA-1、Mac1、p150.95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、α4/β7整联蛋白和包含其α或β亚基的αv/β3整联蛋白单位(例如，抗-CD11a、抗-CD18或抗-CD11b抗体)；生长因子如VEGF-A、VEGF-C；组织因子(TF)；α干扰素(α)；TNFα、白介素如IL-1β、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-9、IL-13、IL17AF、IL-1S、IL-13Rα1、IL13Rα2、IL-4R、IL-5R、IL-9R、IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；RANKL、RANK，RSV F蛋白，C蛋白等。
在某些实施方案中，本文提供的细胞和方法可以用来产生与补体蛋白C5特异性结合的抗体(或多特异性抗体，如双特异性抗体)(例如，与人C5特异性结合的抗C5激动剂抗体)。在某些实施方案中，抗C5抗体包含1、2、3、4、5或6个CDR，所述CDR选自(a)包含氨基酸序列SSYYMA(SEQ ID NO:1)的重链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列AIFTGSGAEYKAEWAKG(SEQID NO:26)的重链可变区CDR2；(c)包含氨基酸序列DAGYDYPTHAMHY(SEQ ID NO:27)的重链可变区CDR3；(d)包含氨基酸序列RASQGISSSLA(SEQ ID NO:28)的轻链可变区CDR1；(e)包含氨基酸序列GASETES(SEQ ID NO:29)的轻链可变区CDR2；和(f)包含氨基酸序列QNTKVGSSYGNT(SEQ ID NO:30)的轻链可变区CDR3。例如，在某些实施方案中，抗C5抗体包含这样的重链可变结构域(VH)序列，其包含一个、二或三个选自以下的CDR：(a)包含氨基酸序列SSYYMA(SEQ ID NO:1)的重链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列AIFTGSGAEYKAEWAKG(SEQID NO:26)的重链可变区CDR2；(c)包含氨基酸序列DAGYDYPTHAMHY(SEQ ID NO:27)的重链可变区CDR3；和/或这样的轻链可变结构域(VL)序列，其包含一个、二或三个选自以下的CDR：(d)包含氨基酸序列RASQGISSSLA(SEQ ID NO:28)的轻链可变区CDR1；(e)包含氨基酸序列GASETES(SEQ ID NO:29)的轻链可变区CDR2；和(f)包含氨基酸序列QNTKVGSSYGNT(SEQID NO:30的轻链可变区CDR3。以上重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的序列和轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的序列在US 2016/0176954中分别作为SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:122、SEQ ID NO:123和SEQ ID NO:125公开。(参见US 2016/0176954中参见表7和表8)
在某些实施方案中，抗C5抗体分别包含VH和VL序列
Figure BDA0002706139770000461
和
Figure BDA0002706139770000462
包括这些序列的翻译后修饰。上述VH序列和VL序列在US 2016/0176954中分别作为SEQ IDNO:106和SEQ ID NO:111公开。(参见US 2016/0176954中参见表7和表8)。在某些实施方案中，抗C5抗体是305L015(参见US 2016/0176954)。
在某些实施方案中，通过本文公开的方法所产生的抗体能够与OX40结合(例如，与人OX40特异性结合的抗OX40激动剂抗体)。在某些实施方案中，抗OX40抗体包含1、2、3、4、5或6个CDR，所述CDR选自(a)包含氨基酸序列DSYMS(SEQ ID NO:2)的重链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列DMYPDNGDSSYNQKFRE(SEQ ID NO:3)的重链可变区CDR2；(c)包含氨基酸序列APRWYFSV(SEQ ID NO:4)的重链可变区CDR3；(d)包含氨基酸序列RASQDISNYLN(SEQ ID NO:5)的轻链可变区CDR1；(e)包含氨基酸序列YTSRLRS(SEQ ID NO:6)的轻链可变区CDR2；和(f)包含氨基酸序列QQGHTLPPT(SEQ ID NO:7)的轻链可变区CDR3。例如，在某些实施方案中，抗OX40抗体包含这样的重链可变结构域(VH)序列，其包含一个、二或三个选自以下的CDR：(a)包含氨基酸序列DSYMS(SEQ ID NO:2)的重链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列DMYPDNGDSSYNQKFRE(SEQ ID NO:3)的重链可变区CDR2；和(c)包含氨基酸序列APRWYFSV(SEQ ID NO:4)的重链可变区CDR3和/或这样的轻链可变结构域(VL)序列，其包含一个、二或三个选自以下的CDR：(a)包含氨基酸序列RASODISNYLN(SEQ ID NO:5)的轻链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列YTSRLRS(SEQ ID NO:6)的轻链可变区CDR2；和(c)包含的氨基酸序列QQGHTLPPT(SEQ ID NO:7)的轻链可变区CDR3。在某些实施方案中，抗OX40抗体分别包含VH和VL序列
Figure BDA0002706139770000471
和
Figure BDA0002706139770000472
Figure BDA0002706139770000473
包括这些序列的翻译后修饰。
在某些实施方案中，抗OX40抗体包含1、2、3、4、5或6个CDR，所述CDR选自(a)包含氨基酸序列NYLIE(SEQ ID NO:10)的重链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列VINPGSGDTYYSEKFKG(SEQ ID NO：11)的重链可变区CDR2；(c)包含氨基酸序列DRLDY(SEQ IDNO:12)的重链可变区CDR3；(d)包含氨基酸序列HASQDISSYIV(SEQ ID NO:13)的轻链可变区CDR1；(e)包含氨基酸序列HGTNLED(SEQ ID NO:14)的轻链可变区CDR2；和(f)包含氨基酸序列VHYAQFPYT(SEQ ID NO:15)的轻链可变区CDR3。例如，在某些实施方案中，抗OX40抗体包含这样的重链可变结构域(VH)序列，其包含一个、二或三个选自以下的CDR：(a)包含氨基酸序列NYLIE(SEQ ID NO:10)的重链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列VINPGSGDTYYSEKFKG(SEQ ID NO:11)的重链可变区CDR2；和(c)包含氨基酸序列DRLDY(SEQ ID NO:12)的重链可变区CDR3和/或这样的轻链可变结构域(VL)序列，其包含一个、二或三个选自以下的CDR：(a)包含氨基酸序列HASQDISSYIV(SEQ ID NO:13)的的轻链可变区CDR1；(b)包含氨基酸序列HGTNLED(SEQ ID NO:14)的轻链可变区CDR2；和(c)包含氨基酸序列VHYAQFPYT(SEQ IDNO:15)的轻链可变区CDR3。在某些实施方案中，抗OX40抗体分别包含VH和VL序列
Figure BDA0002706139770000481
和
Figure BDA0002706139770000482
Figure BDA0002706139770000483
包括这些序列的翻译后修饰。
WO 2015/153513中提供关于抗OX40抗体的更多细节，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在某些实施方案中，通过本文公开的细胞和方法所产生的抗体能够与流感病毒B血凝素(即，“fluB”)结合(例如，在体外和/或体内结合来自乙型流感病毒Yamagata系的血凝素、结合来自乙型流感病毒维多利亚系的血凝素、结合来自乙型流感病毒祖先系的血凝素或结合来自乙型流感病毒Yamagata系、维多利亚系和祖先系的血凝素的抗体)。WO 2015/148806中描述了关于抗FluB抗体的进一步详情，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在某些实施方案中，通过本文公开的细胞和方法所产生的抗体能够与低密度脂蛋白受体相关蛋白(LRP)-1或LRP-8或转铁蛋白受体和至少一种选自β-分泌酶(BACE1或BACE2)、α-分泌酶、γ-分泌酶、τ-分泌酶、淀粉样蛋白前体蛋白(APP)、死亡受体6(DR6)、淀粉样蛋白β肽、α-突触核蛋白、Parkin、亨廷顿蛋白、p75 NTR、CD40和胱天蛋白酶-6的靶结合。
在某些实施方案中，通过本文公开的细胞和方法所产生的抗体是针对CD40的人IgG2抗体。在某些实施方案中，抗CD40抗体是RG7876。
在某些实施方案中，本公开的细胞和方法可以用来产生多肽。例如，但不限于，多肽是靶向的免疫细胞因子。在某些实施方案中，靶向的免疫细胞因子是CEA-IL2v免疫细胞因子。在某些实施方案中，CEA-IL2v免疫细胞因子是RG7813。在某些实施方案中，靶向的免疫细胞因子是FAP-IL2v免疫细胞因子。在某些实施方案中，FAP-IL2v免疫细胞因子是RG7461。
在某些实施方案中，通过本文提供的细胞或方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)能够与CEA和至少一种额外的靶分子结合。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)能够与靶向肿瘤的细胞因子和至少一种额外的靶分子结合。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)与IL2v(即，白介素2变体)融合并且结合基于IL1的免疫细胞因子和至少一种额外的靶分子。在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)是T细胞双特异性抗体(即，双特异性T细胞衔接体或BiTE)。
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)能够与至少两种选自以下的靶分子结合：IL-1α和IL-1β、IL-12和IL-1S；IL-13和IL-9；IL-13和IL-4；IL-13和IL-5；IL-5和IL-4；IL-13和IL-1β；IL-13和IL-25；IL-13和TARC；IL-13和MDC；IL-13和MEF；IL-13和TGF-～；IL-13和LHR激动剂；IL-12和TWEAK、IL-13和CL25；IL-13和SPRR2a；IL-13和SPRR2b；IL-13和ADAMS、IL-13和PED2、IL17A和IL17F、CEA和CD3、CD3和CD19、CD138和CD20；CD138和CD40；CD19和CD20；CD20和CD3；CD3S和CD13S；CD3S和CD20；CD3S和CD40；CD40和CD20；CD-S和IL-6；CD20和BR3、TNFα和TGF-β、TNFα和IL-1β；TNFα和IL-2、TNFα和IL-3、TNFα和IL-4、TNFα和IL-5、TNFα和IL6、TNFα和IL8、TNFα和IL-9、TNFα和IL-10、TNFα和IL-11、TNFα和IL-12、TNFα和IL-13、TNFα和IL-14、TNFα和IL-15、TNFα和IL-16、TNFα和IL-17、TNFα和IL-18、TNFα和IL-19、TNFα和IL-20、TNFα和IL-23、TNFα和IFNα、TNFα和CD4、TNFα和VEGF、TNFα和MIF、TNFα和ICAM-1、TNFα和PGE4、TNFα和PEG2、TNFα和RANK配体，TNFα和Te38、TNFα和BAFF、TNFα和CD22、TNFα和CTLA-4、TNFα和GP130、TNF a和IL-12p40、VEGF和血管生成素，VEGF和HER2、VEGF-A和HER2、VEGF-A和PDGF、HER1和HER2、VEGFA和ANG2、VEGF-A和VEGF-C、VEGF-C和VEGF-D、HER2和DR5、VEGF和IL-8、VEGF和MET、VEGFR和MET受体，EGFR和MET、VEGFR和EGFR、HER2和CD64、HER2和CD3、HER2和CD16、HER2和HER3；EGFR(HER1)和HER2、EGFR和HER3、EGFR和HER4、IL-14和IL-13、IL-13和CD40L、IL4和CD40L、TNFR1和IL-1R、TNFR1和IL-6R和TNFR1和IL-18R、EpCAM和CD3、MAPG和CD28、EGFR和CD64、CSPGs和RGM A；CTLA-4和BTN02；IGF1和IGF2；IGF1/2和Erb2B；MAG和RGM A；NgR和RGM A；NogoA和RGM A；OMGp和RGMA；POL-l和CTLA-4；和RGM A和RGM B。
在某些实施方案中，根据本文提供的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)是抗CEA/抗CD3双特异性抗体。在某些实施方案中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体是RG7802。在某些实施方案中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含在下文提供的SEQ ID NOs:18-21中所述的氨基酸序列：
Figure BDA0002706139770000501
Figure BDA0002706139770000502
Figure BDA0002706139770000503
Figure BDA0002706139770000511
WO 2014/121712中提供关于抗CEA/抗CD3双特异性抗体的更多细节，所述文献通过引用方式完整并入本文。
在某些实施方案中，通过本文所公开的细胞和方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)是抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体。在某些实施方案中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体是Crossmab。在某些实施方案中，抗VEGF/抗血管生成素双特异性抗体是RG7716。在某些实施方案中，抗CEA/抗CD3双特异性抗体包含在下文提供的SEQ ID NOs:22-25中所述的氨基酸序列：
Figure BDA0002706139770000512
Figure BDA0002706139770000513
Figure BDA0002706139770000521
Figure BDA0002706139770000522
在某些实施方案中，通过本文所公开的方法产生的多特异性抗体(如双特异性抗体)是抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体。在某些实施方案中，抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体是RG7221。在某些实施方案中，抗Ang2/抗VEGF双特异性抗体是CAS编号1448221-05-3。
其可溶性抗原或片段，任选地与其他分子缀合，可以用作产生抗体的免疫原。对于跨膜分子如受体，这些分子的片段(例如受体的胞外结构域)可以用作免疫原。备选地，表达该跨膜分子的细胞可以用作免疫原。此类细胞可以源自天然来源(例如癌细胞系)或可以是已经通过重组技术转化以表达所述跨膜分子的细胞。其他抗原及其用于制备抗体的形式将是本领域技术人员显而易见的。
在某些实施方案中，通过本文所公开的细胞和方法产生的多肽(例如，抗体)能够结合于可以进一步缀合于化学分子如染料或细胞毒活性剂如化疗药、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即，放射缀合物)。包含使用本文所述方法产生的抗体或双特异性抗体的免疫缀合物可以含有与仅一条重链或仅一条轻链的恒定区缀合的细胞毒活性剂。
5.5.6抗体变体
在某些方面，构思了本文提供的抗体的氨基酸序列变体，例如，第5.5.5部分中提供的抗体。例如，可能想要改变该抗体的结合亲和力和/或其他生物学特性。可以通过向编码抗体的核苷酸序列引入适宜修饰或通过肽合成制备该抗体的氨基酸序列变体。此类修饰包括例如，从抗体的氨基酸序列内部缺失残基和/或将残基插入所述氨基酸序列中和/或置换所述氨基酸序列中的残基。可以产生缺失、插入和置换的任意组合以获得最终构建体，只要所述最终构建体拥有想要的特征，例如抗原结合作用。
5.5.6.1置换变体、插入变体和缺失变体
在某些方面，提供具有一个或多个氨基酸置换的抗体变体。用于置换诱变的目的位点包括CDR和FR。表1中在“优选置换”的标题下显示保守性置换。表1中在“示例性置换”标题下显示并且参考氨基酸侧链类别如下文进一步描述更明显的变化。可以将氨基酸置换引入目的抗体并且筛选产物的所需活性，例如，保留/改善的抗原结合、降低的免疫原性或改善的ADCC或CDC。
表1
Figure BDA0002706139770000531
Figure BDA0002706139770000541
氨基酸可以根据常见的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性的亲水的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链方向的残基：Gly、Pro
(6)芳香族：Trp、Tyr、Phe。
非保守性置换将使这些类别之一的成员交换为另一个类别的成员。
一个置换变体类型涉及置换亲本抗体(例如，人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基。通常，经选择用于进一步研究的所得变体将相对于亲本抗体在某些生物学特性方面(例如，增加的亲和力、降低的免疫原性)具有修饰(例如，改善)和/或将具有亲本抗体的基本上保留的某些生物学特性。示例性置换变体是亲和力成熟抗体，所述抗体可以例如，使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术如本文所述的那些技术便利地产生。简而言之，将一个或多个CDR残基突变并且将变体抗体在噬菌体上展示并筛选特定生物学活性(例如，结合亲和力)。
可以在CDR中做出改变(例如，置换)，例如以改善抗体亲和力。这类改变可以在CDR“热点”，即，在体细胞成熟过程期间以高频率经历突变的密码子所编码的残基(参见，例如，Chowdhury,Methods Mol.Biol.207:179-196,2008)和/或接触抗原的残基中做出，同时对所产生的变体VH或VL测试结合亲和力。已经例如在Hoogenboom等人,引自Methods inMolecular Biology 178:1-37(O'Brien等人编著,Human Press,Totowa,NJ,2001)中描述了通过构建次级文库并从中重新选择实现亲和力成熟。在亲和力成熟的一些方面，通过多种方法(例如，易错PCR、链改组或寡核苷酸定向诱变)的任一种，将多样性引入所选择用于成熟的可变基因中。随后产生次级文库。随后筛选该文库以鉴定具有所需亲和力的任何抗体变体。另一种引入多样性的方法涉及CDR指导的方案，其中将几个CDR残基(例如，一次4-6个残基)随机分组。可以特别地鉴定参与抗原结合的CDR残基，例如，使用丙氨酸扫描法诱变或建模。特别地经常靶向CDR-H3和CDR-L3。
在某些方面，置换、插入或缺失可以在一个或多个CDR内部出现，只要这类改变并不实质降低抗体结合抗原的能力。例如，可以在CDR中做出不实质降低结合亲和力的保守性改变(例如，如本文中提供的保守性置换)。这类改变可以例如是在CDR中的抗原接触残基外部。在上文提供的某些变体VH序列和VL序列中，每个CDR或者不予改变或含有不多于一个、两个或三个氨基酸置换。
一种用于鉴定可以被靶向以便诱变的抗体残基或区域的有用方法称作“丙氨酸扫描法诱变法”，如Cunningham和Wells(1989)Science,244:1081-1085所述。在这种方法中，鉴定一个残基或靶残基组(例如，带电荷残基如arg、asp、his、lys和glu)并且用中性或带负电荷的氨基酸(例如，丙氨酸或聚丙氨酸)替换以确定该抗体与抗原的相互作用是否受影响。可以在对于初始置换显示功能敏感的氨基酸位置处引入其他置换。备选地或额外地，抗原-抗体复合物的晶体结构可以用来鉴定抗体和抗原之间的接触点。可以将这类接触残基和邻近残基作为置换候选物打靶或消除。可以筛选变体以确定它们是否含有所需的特性。
氨基酸序列插入包括长度从一个残基至含有成百个或更多个残基的多肽间变动的氨基端和/或羧基端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N末端甲硫氨酰基残基的抗体。抗体分子的其他插入性变体包括抗体的N末端或C末端与酶(例如，用于ADEPT(抗体指导的酶前药疗法))或增加该抗体的血清半衰期的多肽融合。
5.5.6.2糖基化变体
在某些方面，改变本文提供的抗体以增加或减少抗体发生糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列从而创造或移除一个或多个糖基化位点，便利地实现对抗体添加或删除糖基化位点。
在抗体包含Fc区的情况下，可以改变与之连接的寡糖。哺乳动物细胞产生的天然抗体一般包含分枝的双天线状寡糖，所述寡糖通常借助N联连接至Fc区的CH2结构域的Asn297。例如参见，Wright等人,TIBTECH 15:26-32(1997)。寡糖可以包括各种糖，例如，甘露糖、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖和唾液酸，以及与双天线状寡糖结构的“茎部”中GlcNAc连接的岩藻糖。在一些方面，可以修饰本公开抗体中的寡糖以产生某些特性改善的抗体变体。
在一个方面，提供具有非岩藻糖化寡糖(即，缺少与Fc区(直接或间接)连接的岩藻糖的寡糖结构)的抗体变体。这类非岩藻糖化寡糖(也称作“非岩藻糖化”寡糖)特别地是N联寡糖，其缺少在双天线状寡糖结构的茎部与第一GlcNAc结合的岩藻糖残基。在一个方面，提供如与先天或亲本抗体相比，在Fc区内具有升高比例的非岩藻糖化寡糖的抗体变体。例如，非岩藻糖化寡糖的比例可以是至少约20％、至少约40％、至少约60％、至少约80％、或甚至约100％(即，不存在岩藻糖基化寡糖)。相对于通过如(例如，如WO 2006/082515中所述的)MALDI-TOF质谱法所测量的与Asn297结合的全部寡糖(例如，复杂结构、杂合结构和高甘露糖结构)的总和，非岩藻糖化寡糖的百分数是缺少岩藻糖残基的寡糖的(平均)量。Asn297指位于Fc区内约位置297处的天冬酰胺残基(Fc区残基的EU编号)；然而，Asn297也可以位于位置297的上游或下游±3个氨基酸附近，即，位置294和位置300之间，原因在于抗体中的微小序列变异。这类在Fc区内具有升高比例的非岩藻糖化寡糖的抗体可以具有改善的FcγRIIIa受体结合和/或改善的效应子功能，尤其改善的ADCC功能。参见，例如，US 2003/0157108；US 2004/0093621。
能够产生岩藻糖化减少的抗体的细胞系的实例包括有蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249:533-545,(1986)；US 2003/0157108；和WO 2004/056312、尤其在实施例11)中，和敲除细胞系，如α-1,6-岩藻糖基转移酶基因FUT8敲除CHO细胞(参见，例如，Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87:614-622(2004)；Kanda,Y.等人,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006)；和WO 2003/085107)、或GDP岩藻糖合成或转运蛋白活性降低或消除的细胞(参见，例如，US2004259150、US2005031613、US2004132140、US2004110282)。
在又一个方面，可以为抗体变体提供双分寡糖，例如，其中与抗体Fc区连接的双天线状寡糖由GlcNAc对分。如上文所述，这类抗体变体可以具有减少的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。这类抗体变体的实例例如在Umana等人,Nat Biotechnol 17,176-180(1999)；Ferrara等人,Biotechn Bioeng 93,851-861(2006)；WO 99/54342；WO 2004/065540、WO2003/011878中描述。
也提供寡糖中至少一个半乳糖残基与Fc区连接的抗体变体。这类抗体变体可以具有改善的CDC功能。这类抗体变体例如在WO 1997/30087；WO 1998/58964和WO1999/22764中描述。
5.5.6.3 Fc区变体
在某些方面，可以将一个或多个氨基酸修饰引入本文提供的抗体的Fc区中，因而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置处包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些方面，本公开构思了拥有一些但非全部效应子功能的抗体变体，这使所述抗体变体成为下述应用的有利候选物，其中抗体的体内半衰期重要，而某些效应子功能(如补体依赖的细胞毒性(CDC)和抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC))是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性分析以证实CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合分析以确保抗体缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞-NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991)的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。评估目的分子的ADCC活性的体外分析的非限制性例子在美国专利号5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83:7059-7063(1986))和Hellstrom,I等人,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82:1499-1502(1985)；5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))中描述。备选地，可以使用非放射性分析方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0002706139770000571
非放射性细胞毒性分析(Promega,Madison,WI)。用于此类分析的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或另外，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes等人,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95:652-656(1998)公开中的那种动物模型中，评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合分析以证实抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性。参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体激活，可以进行CDC分析(参见，例如，Gazzano-Santoro等人,J.Immunol.Methods 202:163(1996)；Cragg,M.S.等人,Blood 101:1045-1052(2003)；和Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103:2738-2743(2004))。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半寿期(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006)；WO 2013/120929 A1)。
效应子功能减少的抗体包括置换了一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(美国专利号6,737,056)的那些。这类Fc突变体包括在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc突变体(美国专利号7,332,581)。
描述了具有FcR结合作用改善或削弱的某些抗体变体。(参见，例如，美国专利号6,737,056；WO 2004/056312，和Shields等人,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001))。
在某些方面，抗体变体包含具有改善ADCC的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置298、333和/或334处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。
在某些方面，抗体变体包含具有削弱FcγR结合作用的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置234和235处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。在一个方面，置换是L234A和L235A(LALA)。在某些方面，抗体变体还在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中包含D265A和/或P329G。在一个方面，置换是在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的L234A、L235A和P329G(LALA-PG)。(参见，例如，WO 2012/130831)。在另一个方面，置换是在衍生自人IgG1 Fc区的Fc区中的L234A、L235A和D265A(LALA-DA)。
在一些方面，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如美国专利号6,194,551、WO 99/51642和Idusogie等人,J.Immunol.164:4178-4184(2000)中所述。
在US2005/0014934(Hinton等人)中描述了半寿期增加和新生Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿(Guyer等人,J.Immunol.117:587(1976)和Kim等人,J.Immunol.24:249(1994))。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc变体包括在一个或多个Fc区残基：238、252、254、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434置换)的那些(参见，例如，美国专利号7,371,826；Dall’Acqua,W.F.等人J.Biol.Chem.281(2006)23514-23524)。
已经通过位点定向诱变鉴定了对小鼠Fc-小鼠FcRn相互作用至关重要的Fc区残基(参见例如Dall’Acqua,W.F.等人,J.Immunol 169(2002)5171-5180)。残基I253、H310、H433、N434和H435(EU索引编号)参与相互作用(Medesan,C.等人,Eur.J.Immunol.26(1996)2533；Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993；Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.24(1994)542)。发现残基I253、H310和H435对人Fc与鼠FcRn的相互作用至关重要(Kim,J.K.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2819)。对人Fc-人FcRn复合物的研究已经显示残基I253、S254、H435和Y436对这种相互作用至关重要(Firan,M.等人,Int.Immunol.13(2001)993；Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。在Yeung,Y.A.等人(J.Immunol.182(2009)7667-7671)中，已经报道并研究了残基248至259和301至317和376至382和424至437的各种突变体。
在某些方面，抗体变体包含具有减少FcRn结合的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置253和/或310和/或435处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。在某些方面，抗体变体包含在位置253、310和435具有氨基酸置换的Fc区。在一个方面，置换是在衍生自人IgG1Fc区的Fc区中的I253A、H310A和H435A。参见，例如，Grevys,A.等人,J.Immunol.194(2015)5497-5508。
在某些方面，抗体变体包含具有减少FcRn结合的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置310、和/或433和/或436处的置换)(残基的EU编号)的Fc区。在某些方面，抗体变体包含在位置310、433和436具有氨基酸置换的Fc区。在一个方面，置换是在衍生自人IgG1Fc区的Fc区中的H310A、H433A和Y436A。(参见，例如，WO 2014/177460A1)。
在某些方面，抗体变体包含具有增加FcRn结合的一个或多个氨基酸置换(例如，在Fc区的位置252、和/或254、和/或256的置换)(残基的EU编号)的Fc区。在某些方面，抗体变体包含在位置252、254、和256具有氨基酸置换的Fc区。在一个方面，置换是在衍生自人IgG1Fc区的Fc区中的M252Y、S254T和T256E。还参见涉及Fc区变体其他例子的Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988)；美国专利号5,648,260；美国专利号5,624,821；和WO 94/29351。
如本文报告的抗体的重链C末端可以是以氨基酸残基PGK结尾的完整C末端。重链的C末端可以是其中已经移除一个或两个C端氨基酸残基的缩短的C末端。在一个优选的方面，重链的C末端是PG结尾的缩短的C末端。在如本文报道的全部方面的一个方面，包含重链的抗体包含C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，氨基酸位置的EU索引编号)，其中所述重链包含如本文具体说明的C末端CH3结构域。在如本文报道的全部方面的一个方面，包含重链的抗体包含C末端甘氨酸残基(G446，氨基酸位置的EU索引编号)，其中所述重链包含如本文具体说明的C末端CH3结构域。
5.5.6.4半胱氨酸工程化抗体变体
在某些方面，可能想要产生半胱氨酸工程化的抗体，例如，THIOMABTM抗体，其中所述抗体的一个或多个残基用半胱氨酸残基置换。在特定方面，置换的残基出现在抗体的可及位点处。通过用半胱氨酸置换这些残基，因而将反应性巯基安置在抗体的可及位点处并且可以用来使抗体缀合至其他部分，如药物部分或接头-药物部分以产生免疫缀合物，如本文中进一步所述。可以例如美国专利号7,521,541、8,30,930、7,855,275、9,000,130、或WO2016040856中所述那样产生半胱氨酸工程化的抗体。
5.5.6.5抗体衍生物
在某些方面，可以进一步修饰本文提供的抗体以含有本领域已知并轻易可获得的额外的非蛋白质部分。适于抗体衍生化的部分包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚1,3-二氧戊环、聚1,3,6-三噁烷、亚乙基/马来酐共聚物、聚氨基酸(均聚物或无规共聚物)和葡聚糖或聚(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷(prolypropylene oxide)/环氧乙烷共聚物、聚氧乙基化多元醇(例如，丙三醇)、聚乙烯醇和它们的混合物。聚乙二醇丙醛可以具有制造方面的优点，原因在于其在水中的稳定性。这种聚合物可以具有任何分子量，并可以是分枝或不分枝的。与抗体连接的聚合物的数目可以变动，并且如果连接多于一个聚合物，它们可以是相同或不同的分子。通常，用于衍生化的聚合物的数目和/或类型可以基于以下考虑事项确定，包括但不限于待改善的抗体特定特性或功能、抗体衍生物是否将用于限定情况下的疗法中等。
5.5.7免疫缀合物
本公开还提供免疫缀合物，所述免疫缀合物包含本文公开的抗体，所述抗体与一种或多种治疗剂如细胞毒药物、化疗药、药物、生长抑制剂、毒素(例如，细菌源、真菌源、植物源或动物源的蛋白质毒素、酶活性毒素)或放射性同位素缀合(化学键合)。
在一个方面，免疫缀合物是抗体-药物缀合物(ADC)，其中抗体与上文提到的一种或多种治疗剂缀合。通常使用接头使抗体与一种或多种治疗剂连接。Pharmacol Review68:3-19(2016)中阐述ADC技术概览，包括治疗剂和药物和接头的实例。
在另一个方面，免疫缀合物包含与酶活性毒素或其片段缀合的如本文所述的抗体，所述酶活性毒素或其片段包括但不限于白喉毒素A链、白喉毒素的无结合活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白A链、相思豆毒蛋白A链、蒴莲根毒蛋白A链、α-帚曲菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白、垂序商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-5)、苦瓜(momordica charantia)抑制蛋白、麻疯树毒蛋白、巴豆毒蛋白、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制蛋白、多花白树毒蛋白、丝林霉素(丝林霉素(mitogellin))、局限曲菌素、酚霉素、伊诺霉素和单端孢霉烯类。
在另一个方面，免疫缀合物包含与放射性原子缀合以形成放射缀合物的如本文所述的抗体。多种放射性同位素可用于产生放射缀合物。例子包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212和Lu的放射性同位素。当放射缀合物用于检测时，它可以包含用于闪烁研究的放射性原子，例如TC99m或I123，或核磁共振(NMR)成像的自旋标记物(也称作磁共振成像，mri)，再次如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。
可以使用多种双官能蛋白质偶联剂产生抗体和细胞毒性剂的缀合物，所述双官能蛋白质偶联剂如N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酯的双官能衍生物(如己二亚氨盐酸二甲酯)、活性酯(如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)、醛(如戊二醛)、双-叠氮化合物(如双(对-重氮盐苯甲酰基)己二胺)、双-重氮盐衍生物(如双-(对-重氮盐苯甲酰基)-乙二胺)、二异氰酸酯(如2,6-二异氰酸甲苯酯)和双活性氟化合物(如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。例如，可以如Vitetta等人,Science 238:1098(1987)中所述那样制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14-标记的1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二乙三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于放射性核素与抗体缀合的示例性螯合剂。参见WO 94/11026。接头可以是促进细胞毒药物在细胞中释放的“可切割接头”。例如，可以使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含有二硫键的接头(Chari等人,Cancer Res.52:127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。
免疫缀合物或ADC在本文中明确地构思，但不限于采用交联剂试剂制备的这类缀合物，所述交联剂试剂包括但不限于BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC、和磺基-SMPB、和可商业获得的SVSB(琥珀酰亚胺基-(4-乙烯砜)苯甲酸酯)(例如，来自Pierce Biotechnology,Inc.,Rockford,IL.,U.S.A)。
5.6示例性实施方案
A.在某些非限制性实施方案中，本发明公开的主题提供一种具有降低或消除的生乳活性的哺乳动物细胞，其中敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型的表达，并且其中PKM多肽同工型包括PKM-1多肽同工型。
A1.A的前述哺乳动物细胞，其中敲减或敲除PKM-2多肽同工型的表达。
A2.A或A1的前述哺乳动物细胞，其中细胞是CHO细胞。
A3.A-A2中任一者的前述哺乳动物细胞，包含编码目的产物的核酸序列。
A4.A3的前述哺乳动物细胞，其中目的产物包括蛋白质。
A5.A3或A4的前述哺乳动物细胞，其中目的产物包括重组蛋白。
A6.A3-A5中任一者的前述哺乳动物细胞，其中目的产物包括抗体或其抗原结合片段。
A7.A6的前述哺乳动物细胞，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
A8.A6的前述哺乳动物细胞，其中抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
A9.A6-A8中任一者的前述哺乳动物细胞，其中抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
A10.A6-A9中任一者的前述哺乳动物细胞，其中抗体包括单克隆抗体。
A11.A3-A10中任一者的前述哺乳动物细胞，其中核酸序列在靶向的位置整合在哺乳动物细胞的细胞基因组中。
A12.A11的前述哺乳动物细胞，还包含随机整合在哺乳动物细胞的细胞基因组成中的编码目的产物的核酸。
A13.A-A12中任一者的前述哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约50％生乳活性。
A14.A13的前述哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约20％生乳活性。
A15.A13或A14的前述哺乳动物细胞，其中参考细胞是包含PKM基因的野生型等位基因的细胞。
A16.A-A15中任一者的前述哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。
A17.A-A16中任一者的前述哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间产生小于约2.0g/L乳酸盐。
A18.A-A16中任一者的前述哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
A19.A-A16中任一者的前述哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
B.在某些非限制性实施方案中，本发明公开的主题提供一种哺乳动物细胞，其包含PKM基因的等位基因，所述等位基因包含选自SEQ ID NOs:39-41的核苷酸序列或在SEQID NOs:37和38中所述的核苷酸序列。
C.在某些非限制性实施方案中，本发明公开的主题提供一种组合物，其包含A-A19的前述任一哺乳动物细胞。
D.在某些非限制性实施方案中，本发明公开的主题提供一种用于减少或消除细胞中生乳活性的方法，所述方法包括敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型的表达。
E.在某些非限制性实施方案中，本发明公开的主题提供一种用于减少或消除细胞中生乳活性的方法，所述方法向细胞施用基因工程系统，其中基因工程系统敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型的表达。
E1.E的前述方法，其中基因工程系统选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统及其组合。
E2.E或E1的前述方法，其中基因工程系统是CRISPR/Cas9系统。
E3.E2的前述方法，其中CRISPR/Cas9系统包含：
(a)Cas9分子，和
(b)一种或多种向导RNA(gRNAs)，其包含与PKM基因中靶序列互补的导引序列。
E4.E3的前述方法，其中靶序列选自：PKM基因的一部分、外显子1内部的区域、侧置于外显子2的5’区域、外显子2内部的区域、侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区、侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区、侧置于PKM基因外显子10的3’内含子区、PKM基因外显子1内部的区域、PKM基因外显子12内部的区域及其组合。
E5.E3-E4中任一者的前述方法，其中一种或多种gRNA包含选自SEQ ID NOs:33-34和42-43及其组合的序列。
E6.E3或E4的前述方法，其中一种或多种gRNA包含(1)第一gRNA，其包含与侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区互补的靶序列；和(2)第二gRNA，其包含与侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区互补的靶序列。
E7.E3-E6中任一者的前述方法，其中一种或多种gRNA包含选自SEQ ID NOs:33-34及其组合的序列。
E8.E3或E4的前述方法，其中一种或多种gRNA包含(1)第一gRNA，其包含与PKM基因外显子2内部的区域互补的靶序列；和(2)第二gRNA，其包含与PKM基因外显子12内部的区域互补的靶结构域。
E9.E3-E5和E8中任一者的前述方法，其中一种或多种gRNA包含选自SEQ ID NOs:42-43及其组合的序列。
E10.D和E-E9中任一者的前述方法，其中敲除PKM多肽同工型的表达，并且与参考细胞的生乳活性相比，细胞中的生乳活性消除或降低。
E11.D和E-E9中任一者的前述方法，其中敲减PKM多肽同工型的表达，并且与参考细胞的生乳活性相比，细胞中的生乳活性降低。
E12.E10或E11的前述方法，其中细胞的生乳活性小于约50％的参考细胞生乳活性。
E13.E10或E11的前述方法，其中细胞的生乳活性小于约20％的参考细胞生乳活性。
E14.D和E-E13中任一者的前述方法，其中细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。
E15.D和E-E14中任一者的前述方法，其中细胞在生产阶段期间产生小于约2.0g/L乳酸盐。
E16.D和E-E14中任一者的前述方法，其中细胞在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
E17.D和E-E14中任一者的前述方法，其中细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
E18.E11-E17中任一者的前述方法，其中参考细胞是包含PKM基因的野生型等位基因的细胞。
E19.D和E-E18中任一者的前述方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型。
E20.D和E-E19中任一者的前述方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型和PKM-2多肽同工型。
E21.E的前述方法，其中基因工程系统包含选自短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)的RNA，其中RNA与PKM基因表达的mRNA的一部分互补。
E22.E21的前述方法，其中PKM基因表达的mRNA编码PKM-1多肽同工型。
E23.E22的前述方法，其中敲除或敲减PKM-1多肽同工型的表达，并且如与参考细胞的生乳活性相比，细胞的生乳活性降低。
E24.E21-E23中任一者的前述方法，其中基因工程系统还包含选自shRNA、siRNA和微RNA miRNA的第二RNA，其中第二RNA与PKM基因表达的编码PKM-2多肽同工型的mRNA的一部分互补。
E25.E24的前述方法，其中敲除或敲减PKM-1和PKM-2多肽同工型的表达，并且细胞的生乳活性降低。
E26.E的前述方法，其中基因工程系统是锌指核酸酶(ZFN)系统或转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统。
E27.D和E-E26的前述方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
E28.E27的前述方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
E29.D和E-E28的前述方法，其中细胞表达目的产物。
E30.E29的前述方法，其中细胞表达的目的产物由核酸序列编码。
E31.E30的前述方法，其中核酸序列在靶向的位置整合在细胞的细胞基因组中。
E32.E26-E31中任一者的前述方法，其中细胞表达的目的产物进一步由随机整合在哺乳动物细胞的细胞基因组成中的核酸序列编码。
E33.E26-E31的前述方法，其中目的产物包括蛋白质。
E34.E33的前述方法，其中目的产物包括重组蛋白。
E35.E26-E33中任一者的前述方法，其中目的产物包括抗体或其抗原结合片段。
E36.E35的前述方法，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
E37.E35的前述方法，其中抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
E38.E35-E37中任一者的前述方法，其中抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
E39.E35-E38中任一者的前述方法，其中抗体是单克隆抗体。
F.在某些非限制性实施方案中，本发明公开的主题提供一种产生目的产物的方法，所述方法包括培养表达目的产物的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞表达目的产物并且具有降低或消除的生乳活性。
G.在某些非限制性实施方案中，本发明公开的主题提供一种培养表达目的产物的哺乳动物细胞群体的方法，其中哺乳动物细胞具有降低或消除的生乳活性。
G1.F或G的前述方法，其中生乳活性降低或消除因敲除或敲减哺乳动物细胞中丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型表达所致。
G2.G1的前述方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型。
G3.G1的前述方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型和PKM-2多肽同工型。
G4.F和G-G3中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约50％生乳活性。
G5.F和G-G3中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约20％生乳活性。
G6.F和G-G5中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。
G7.F和G-G6中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间产生小于约2.0g/L乳酸盐。
G8.F和G-G6中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
G9.F和G-G6中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
G10.F和G-G9中任一者的前述方法，其中参考细胞是包含PKM基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞。
G11.F和G-10中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
G12.F和G-G11中任一者的前述方法，其中哺乳动物细胞表达的目的产物由核酸序列编码。
G13.G12的前述方法，其中核酸序列在靶向的位置整合在哺乳动物细胞的细胞基因组中。
G14.F和G-G13中任一者的前述方法，其中细胞表达的目的产物进一步由随机整合在哺乳动物细胞的细胞基因组成中的核酸序列编码。
G15.F和G-G14中任一者的前述方法，其中目的产物包括蛋白质。
G16.F和G-G15中任一者的前述方法，其中目的产物包括重组蛋白。
G17.F和G-G16中任一者的前述方法，其中目的产物包括抗体或其抗原结合片段。
G18.G17的前述方法，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
G19.G17的前述方法，其中抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
G20.G17-G19中任一者的前述方法，其中抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
G21.G17-G20中任一者的前述方法，其中抗体是单克隆抗体。
G22.F和G-G21中任一者的前述方法，还包含收获目的产物。
实施例
以下实施例仅对本发明已公开主题的说明并且不应当以任何方式视为限制。
实施例1：PKM-1表达驱动CHO细胞系中的生乳行为，触发较低活力和生产率
在细胞系开发(CLD)过程中，鉴定到两个表达不同抗体分子的生乳细胞系。根据细胞系，可以通过优化营养补料或培养pH，差异性地减轻这些细胞系的生乳行为。对涉及糖酵解途径的多种蛋白质的分析揭示丙酮酸激酶肌肉-1(PKM-1)同工型水平和生乳行为之间的直接相关性。
CRISPR/Cas9用于定向缺失外显子-9以敲除PKM-1表达。敲除PKM-1表达在选择的二个细胞系中彻底地消除生乳行为，从而消除对减轻策略的需要。鉴定到单个细胞系，其中PKM-1基因和PKM-2基因的表达遭完全破坏，对生长和活力无任何不良影响。进一步分析亲本细胞系和CHO细胞系，揭示它们全部表达PKL和PKR形式的丙酮酸激酶，在不受理论约束的情况下，这可能使得它们忍受完全缺少PKM表达。用来控制这些细胞系的生乳行为的独有减轻策略变动它们的代谢途径、改变PKM-1转录和表达样式、阻止或延迟生乳行为。完全敲除PKM基因，旨在分析所得细胞系在培养时和在生物反应器中的行为。
总之，本公开阐明了生产培养物中生乳行为和高PKM-1水平之间的直接相关性。另外，PKM-1表达的消除在选择的CHO细胞系中被耐受并逆转生乳行为。因此，在CHO细胞中永久性缺失PKM-1或同样永久性缺失完整PKM基因可能有益于减少生物反应器中生产期间生乳行为的出现。
材料和方法
细胞系
利用谷氨酰胺合成酶(GS)选择标记，从CHO-K1宿主衍生分泌重组单克隆抗体mAb-1或mAb-2的细胞系。在含有氨基亚砜蛋氨酸(methionine sulfoximine)(MSX)作为选择剂的基于DMEM/F12的专有培养基中在振摇速度150转/分钟，37℃和5％CO2维持种子库。将细胞每3或4天传代。
2-L生物反应器生产
在有Finesse控制器(Applikon,Foster City,CA)的玻璃搅拌罐生物反应器(Applikon,Foster City,CA)中进行2-L生物反应器生产。在接种持续14天的生产阶段(N)之前，全部生产培养均在生物反应器利用单一接种物库(inoculum train)阶段(N-1)持续3天。将N-1接种培养物接种在1.5和1.7L工作体积之间至目标填充细胞体积(PCV)0.17％。它们在37℃、pH设定点7.0、溶解氧(DO)设定点30％和搅拌275转/分钟运行。三天后，将细胞按0.25％目标PCV转移以接种1.4和1.7L之间体积的生产(N)生物反应器。全部生物反应器均在37℃运行，同时在72小时温度变动至35℃。培养在pH 7.00，死区为0.03情况下运行，使用CO2作为酸控制并使用1M碳酸钠作为碱控制。这个pH操作的唯一例外是mAb-2pH水平，后者在恒定pH 6.80，相同死区0.03的情况下运行。设定全部培养在350转/分钟和DO 30％运行，利用空气流和氧气流的组合保持DO恒定。对于mAb-1的对照工艺培养，补料在生产第3天(72小时)进行并且是那时培养物总体积的20％。对于增强补料工艺，针对每种补料，在第3天(72小时)和在第6天(144小时)按15％培养物总体积进行补料。
AMBR15运行
AMBR15系统(Sartorius,Goettingen德国)中的生产培养物在温度设定点37℃、DO设定点30％、pH设定点7.0和搅拌速率设定点1400转/分钟运行。N-1接种库运行4天并且随后将生产(N)阶段按1百万个细胞/mL接种，总体积为13mL，温度为37℃，DO为30％、pH为7.0和搅拌速率为1400转/分钟。对于这些培养物，进行2-L生物反应器的按比例缩减工艺。
离线样品分析
采集上清液样品和细胞沉淀物样品以用于测定法或蛋白质印迹分析。使用Vi-Cell XR(Beckman Coulter)分析样品的活细胞浓度(VCC)和活力，并且使用Bioprofile400(Nova Biomedical)分析其pO2、pH、pCO2、Na+、葡萄糖和乳酸盐。在BioProfile 400上采样后数分钟内分析来自2-L和AMBR生物反应器的全部样品，以最大限度减少脱气。相同的Vi-Cell XR、BioProfile 400和渗透计(型号2020，Advanced Instruments)用于全部样品以消除仪器间变异性。使用带蛋白A柱的高压液相色谱(HPLC)，测量抗体滴度。使用通过PhyTip(PhyNexus,San Jose,CA)蛋白A柱纯化的细胞培养上清液样品，实施抗体产物质量分析。通过大小排阻色谱(SEC)分析抗体分子大小分布。使用成像毛细管等电聚焦(icIEF)，测量蛋白质电荷异质性，并且全部电荷异质性样品均用羧肽酶B预处理。全部蛋白质产物质量分析法均自行开发并且详细方案已经公开(Hopp等人,2009,Biotechnol.Prog.25(5):1427-32)。
免疫印迹
将细胞沉淀在裂解缓冲液(10mM Tris pH 8.0、0.5％NP40、150mM NaCl、5mMMgCl2，含蛋白酶抑制剂)中裂解并且在冰上温育20分钟。随后将样品在13,000转/分钟离心10分钟并且将上清液转移至一支新管以使用Nanodrop 2000(Thermo Scientific,Wilmington DE)，使用280nm处的吸光度，测定蛋白质浓度。将15μL裂解物与5μL 4x运行缓冲液(400μL 2x Invitrogen上样缓冲液+400μL 50％甘油+200μL 20％SDS+100μLβ-巯基乙醇)合并并且在90℃加热5分钟。随后将等同量的蛋白质加载于一块12孔4-20％Tris-甘氨酸凝胶上并且使用SDS运行缓冲液，在150V运行1.5小时。此后，使用来自Thermo Fisher的iBlot2，将蛋白质转移至硝酸纤维素膜。用1x TBST缓冲液洗涤后，将印迹物在5％乳溶液中封闭最少1小时，随后与第一抗体温育过夜。随后将印迹物洗涤并在第二抗体中温育最少一小时并再次用TBST缓冲剂洗涤。使用ECL试剂，随后使用Bio-Rad成像仪(Bio-Rad,Hercules,CA)，对印迹物成像。
PKM-1敲除
为了敲除PKM-1，将靶向侧置于PKM基因外显子9的5’和3’内含子区的向导RNA(gRNAs)克隆入Genentech gRNA-表达载体。随后将这种构建体与Cas9表达质粒一起共转染入表达mAb-2的细胞。转染的细胞是单一细胞克隆并且通过基因组DNA PCR确认外显子9的缺失。以下gRNA寡聚物最有效地缺失外显子-9(PKM-1)，并且以这些寡聚物靶向的汇集物用来分离敲除PKM-1的mAb-2细胞系：
5’gRNA：GTCCTTTGGGCAGAGACAG(SEQ ID NO：33)
3’gRNA：GACCAGAGTACTCCCTCGT(SEQ ID NO：34)
基因组DNA PCR引物的序列：
5’-primer：CCAGATTTGGTGAGGACGAT(SEQ ID NO：35)
3’-primer：AGCTGTGTTGTGAGGCATTG(SEQ ID NO：36)
结果
生产期间PKM-1水平升高与CHO细胞生乳行为相关
使用标准或增强补料策略，将表达mAb-1的细胞系的已培养种子库用于生物反应器中的源生产培养。标准补料触发mAb-1细胞系中的生乳行为，同时增强补料策略减轻生乳行为。高乳酸盐条件在生产培养下第10天后触发细胞活力降低(图1A)，导致与低乳酸盐条件(图1B)相比第14天滴度较低。尽管两种培养条件具有相当的乳酸盐水平直至第7天，但高乳酸盐条件显示在生产培养中从第7天起乳酸盐积累急剧增加，在第14天增加达15g/L。对于低乳酸盐条件，在乳酸盐水平开始趋向更高(在第12天至第14天之间)之前观察到3-4天延迟，截止第14天乳酸盐仅抵达8g/L(图1C)。
为了鉴定可能与观测的生乳行为相关的酶，对涉及细胞生长信号传导和糖酵解途径的多种蛋白质进行蛋白质印迹分析。由于高乳酸盐条件下细胞活力在第10天后急剧降低，来自这个组的第0、第2、第7和第10天的样品与来自低乳酸盐条件的第0、第7、第10和第14天的样品比较(图1D-图1F)。在分析的全部不同蛋白质(数据未显示)当中，仅PKM-1水平显示与表达mAb-1的细胞系的生乳行为直接相关。图1D-图1F显示细胞沉淀物中的PKM-1和PKM-2蛋白水平。相对于低乳酸盐样品，高乳酸盐样品中的PKM-1表达水平在生产培养时第7天后开始趋异地升高。有趣地，PKM-1水平升高紧密趋近于乳酸盐积累增加，因为即便在低乳酸盐条件下，接近生产培养结束时PKM-1水平升高(图1E，在第10天和第14天之间)趋近于培养物中的较高乳酸盐水平(图1C)。然而，PKM-2水平与表达mAb-1的细胞系中的生乳行为反相关(图1F)。
对表达mAb-2的细胞系实施了相似的生物反应器实验。将这类细胞系在促进生乳或非生乳行为的条件的生产培养基中培养。mAb-2细胞系的细胞活力在高乳酸盐和低乳酸盐条件之间相当，直至生产培养的第13天和第14天(图2A)。与低乳酸盐条件相比，这导致对于高乳酸盐条件而言滴度降低大约25％(图2B)。在整个生产过程期间，mAb-2细胞系实验的低乳酸盐对照组的培养基中乳酸盐积累低。但是，在高乳酸盐条件下，乳酸盐水平从第7天开始趋异，截止生产培养第14天向上抵达15g/L(图2C)。蛋白质印迹分析揭示，相对于低乳酸盐样品，PKM-1蛋白水平在生产时约第7天在高乳酸盐样品中开始升高，并且线性升高，直至生产培养结束为止(图2D和图2E)。这种PKM-1水平升高与乳酸盐积累增加紧密相关(图2C和图2E)。类似于mAb-1，低乳酸盐mAb-2样品中PKM-2的总水平高于高乳酸盐样品的那些总水平，如图2D(下半小图)和图2F中所示。综上，这些数据显示在表达mAb-1和表达mAb-2的细胞中的生乳行为和这些细胞中PKM-1水平之间的直接相关性。
PKL/R蛋白在CHO细胞中表达，但与生乳行为不相关
为了评价其他形式的PK(除PKM之外)是否在专有性CHO宿主细胞中表达，对两个不同CHO宿主细胞系(CHO-K1和DHFR-/-)和人(HEK 293)细胞系分析PKL蛋白和PKR(PKL/R)蛋白表达。两个CHO细胞系以及对照HEK 293细胞系显示表达PKL/R酶(图3A)，这表明PK基因的全部同工型(包括PKM-1、PKM-2和PKL/R)均在选择的CHO宿主中表达。接着评估表达mAb-1和/或表达mAb-2的细胞系中比较高乳酸盐条件与低乳酸盐条件时是否差异性调节PKL/R表达。mAb-1细胞系和mAb-2细胞系中高乳酸盐条件和低乳酸盐条件之间PKL/R表达水平相当(一旦蛋白质水平对作为内对照的肌动蛋白归一化时)，显示与这些细胞系中的生乳行为无相关性(图3B-图3D)。图3C中第7天和第10天的mAb-2高乳酸盐样品中的较低PKL/R水平归因于如相同泳道中肌动蛋白(作为内参对照)的较低水平所反映的蛋白质总体载量较低。除PK同工型之外，还分析了涉及细胞生长信号传导和糖酵解途径的几种不同蛋白质的表达。但是，没有在这些蛋白质的表达和表达mAb-1或表达mAb-2的细胞系中观察到的生乳行为之间观察到明确相关性(数据未显示)。选定CHO宿主细胞中表达不同PK同工型的事实表明，这些细胞系可能能够忍受定向缺失一个或多个PK同工型。生长阶段期间mAb-1和mAb-2细胞系的生乳行为与PKM-1水平之间观察到的直接相关性使这种酶成为定向缺失的良好候选。
CRISPR/Cas9介导的PKM基因中外显子-9定向缺失
PKM基因负责表达PKM-1酶和PKM-2酶，所述酶差异仅在于分别可变地纳入外显子9或外显子10。由于选定的CHO细胞系未测序及注释，故不可获得关于PKM等位基因类型、基因拷贝数或序列的信息。因此，为了破坏PKM-1基因表达，使用公共数据库中可获得的CHO序列，设计了靶向侧置于外显子9的内含子区的向导RNA构建体(Kent等人2002,GenomeRes.12(6):996-1006)。5’筛选PCR引物设计成匹配外显子8和9之间的内含子区并且3’筛选PCR引物设计成匹配外显子10(图4A)。基于从选择的CHO宿主的mRNA扩增PKM cDNA并对其测序，获得外显子序列信息。用Cas9和多种gRNA构建体转染表达mAb-2的细胞系。在初始筛选后，显示最有效外显子9打靶的汇集物进行单细胞克隆。针对外显子-9定向缺失筛选来自这种汇集物的二十个细胞系筛选，并且鉴定到两个杂合细胞系(HET-3和HET-18)和两个敲除细胞系(KO-2和KO-15)，其中通过PCR和测序充分确认所述细胞系的已靶向等位基因缺失(图4B和图4C)。随后在生物反应器中扩充这些细胞系的培养物以进一步评估。已靶向等位基因的测序证实全部选择的细胞系中均缺失外显子9(图4C)。三个细胞系(KO-2、HET-3、和HET-18)恰好在5’和3’gRNA导引位点具有外显子9缺失(图4C)。对于KO-15细胞系，已靶向等位基因的PCR尺寸小于对其他细胞系观测到的那些尺寸(图4B)。测序分析确认，5’gRNA上游的122个碱基对(bp)在KO-15细胞系中缺失并且部分地替换为不相关的插入(图4C且数据未显示)。这个区域内的缺失可能影响外显子8和9之间内含子的完整性。无论何种情况，根据测序分析，外显子9在全部选择的细胞系中完全缺失。
阻断或减少PKM-1表达分别避免或降低mAb-2细胞系中的生乳行为。
获得在一些(HET)或全部(KO)等位基因中外显子-9缺失的四个mAb-2细胞系和WTmAb-2细胞系，以在AMBR生物反应器中建立一个14天生产培养。图5A和图5B中显示PKM-1KO、HET和WT细胞系的生长和活力。PKM-1 HET或KO mAb-2细胞系具有与WT mAb-2细胞系相对类似的滴度和比生产率(图5C和图5D)。在对照(生乳)条件下培养时，与WT mAb-2细胞系相比，PKM-1 KO(KO-2和KO-15)和HET mAB-2细胞系之一(HET-3)具有非常低的乳酸盐水平(图5E)。在另一方面，与WT mAb-2相比，HET-18细胞系展示相似的生乳行为直至第10天。第10天后，WT mAb-2细胞系中乳酸盐积累的速率增加，截止第14天相对于HET-18细胞系大约加倍(图5E)。
对这些细胞系的蛋白质印迹分析显示，KO-2和KO-15细胞系完全缺少表达PKM-1，与HET-18细胞系相比，HET-3细胞系具有较低的PKM-1表达(图5F)。PKM-1 HET和KO细胞系的生乳行为与几个细胞系中PKM-1蛋白质表达直接相关的事实表明，观察到的生乳行为变化不仅仅归因于其他克隆性差异。由于可以从HET细胞系的基因组DNA扩增对应于全长WT等位基因的条带(图4B)，对这些观察结果的可能解释可能包括，但不限于：来自不同CHO PKM等位基因的PKM-1差异性表达；用仅一个gRNA构建体靶向WT PKM等位基因，导致破坏正确的外显子剪接；靶向的gRNA区域倒位，或由等位基因重组介导的4-同质化。
WT mAb-2细胞系的PKM-2水平低(考虑相对差异，同时提醒这个样品的肌动蛋白内参对照也较低)，而对于HET-3、HET-18和KO-2细胞系，它是较高的(图5F)。有趣地，除PKM-1之外，KO-15 mAb-2细胞系彻底缺少表达PKM-2(图5F)。这多半归因于PKM等位基因的5’gRNA靶向区域上游所观察到的较大缺失，可能影响外显子8和9之间内含子区的功能(图4C)。这表明，选择的CHO细胞可以忍受完全缺少PKM-1酶和PKM-2酶，原因可能在于它们能够表达PKL/R酶(图3A)。
研究了WT和PKM-1 KO和HET表达mAb2的细胞系之间的产物质量属性如高分子量(聚集物)和电荷变体种类。尽管在WT和PKM-1 KO和HET细胞系之间未观察到产物聚合水平的显著差异(图5G)，但观察到mAb-2产物电荷变体特征的一些变异(图5H)。由于乳酸盐水平和产物质量属性之间不存在明确的趋势或相关性(图5G和图5H)，观察到的差异可以归因于细胞系衍生期间可能发生的正常变异。另外，这些实验中所用的培养基和补料针对WT mAb-2细胞系优化，未针对PKM-1 KO或HET细胞系优化。由于改变PKM水平可能影响这些细胞系的总体代谢特征，可能需要精细调整培养基和补料，以探索它们对产物质量属性的全面作用和影响。
由于分析细胞建库和解冻后任何细胞系的行为至关重要，故将PKM-1 KO和HETmAb-2细胞系连同作为对照的WT细胞系入库并且随后解冻并且维持培养2.5周。随后获得这些细胞以建立生产培养物，每个细胞系一式四份，以评价其解冻后性能。数据显示，PKM-1KO和HET细胞系的生长、活力、滴度、比生产率和生乳特征在细胞建库之前和之后相当(图5A-图5D和图6A-图6D)。如先前观察到(数据未显示)，新鲜解冻的WT mAb-2细胞相对于较老细胞(15g/L，图5E)生乳较少(10g/L，图6E)。但是，这种行为是WT mAb-2细胞系独有，因为细胞年龄对mAb-2 PKM-1 KO和HET细胞系的生乳行为没有明显影响(图5E和图6E)。注意，对于全部细胞系，截止生产培养第7天观察到培养基中乳酸盐逐渐积累，此后，PKM-1 KO和HET-3细胞系消耗乳酸盐，而观察到WT和HET-18细胞系二者的乳酸盐散逸(run-away)特征(图6E)。尽管与较老细胞系(图5G)相比，观察到全部较低龄细胞系(解冻后)均具有相对较低的％酸性峰(图6G)，一个可能与细胞年龄有关的性状，但就生乳性细胞系(WT或PKM-1 HET-18)和非生乳性细胞系(PKM-1 KO或HET-3)之间的产物质量而言不存在重大差异(图6F-图6G)。
讨论
CHO细胞培养物中的生乳行为可能触发培养酸化及作为加碱以控制培养物pH结果的高克分子渗透压浓度，不利地影响活力、VCC并且最终不利影响生产滴度(Li等人,2010,MAbs 2(5):466-79)。乳酸盐生成源于有氧糖酵解，一种通称为Warbur效应的行为(Warburg,1956,Science 123(3191):309-14)，并且这在许多培养的细胞和癌细胞中观察到。这些细胞利用糖酵解过程产生能量，并且响应于多种能量通量和代谢通量调节这个过程(Mulukutla等人,2014,PLoS One 9(6):e98756；Mulukutla等人2010,TrendsBiotechnol.28(9):476-84；Luo等人,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56；Ahn和Antoniewicz,2012,Biotechnol.J.7(1):61-74)。尽管可以通过工艺工程化控制一些生乳行为(Luo等人,2012,Biotechnol.Bioeng.109(1):146-56；Gagnon等人,2011,Biotechnol.Bioeng.108(6):1328-37)，但这些方案没有揭示已观察到的行为的根本原因。为了更好地理解CHO宿主中的生乳行为，鉴定了两个表达mAb-1或mAb-2的生乳细胞系，可以通过修改进料策略或培养物pH控制所述细胞系的生乳行为。利用这些独立衍生的细胞系作为工具，我们分析了一组涉及细胞生长信号传导或糖酵解途径的蛋白质和酶，旨在阐明它们与生乳行为的可能相关性。这些结果揭示了mAb-1细胞系和mAb-2细胞系二者中PKM-1表达和生乳行为之间的直接相关性(图1D-图1F和图2D-图2F)。
在mAb-1生产培养物和mAb-2生产培养物中检出的PKM-1水平在生产期间的早期时间点低并且按照与培养物中乳酸盐水平升高相关的方式升高。PKM-2水平与这些细胞系中的生乳行为反向相关(图1D-图1F和图2D-图2F)。这可以归因于涉及来自PKM基因的PKM-1或PKM-2转录物可变剪接的蛋白质的功能(Chaneton和Gottlieb,2012,TrendsBiochem.Sci.37(8):309-16；Israelsen和Vander Heiden,2015,Semin.CellDev.Biol.43:43-51；Mazurek,2011,Int.J.Biochem.Cell Biol.43(7):969-80；Harada等人,1978,Biochim.Biophys.Acta.524(2):327-39；Noguchi等人,1986,J.Biol.Chem.261(29):13807-12；Noguchi等人,1987,J.Biol.Chem.262(29):14366-71)。PKM基因的两个同工型当中，PKM-2据报道充当改变代谢途径的中心开关，从而允许癌细胞在生理学不利条件下如在肿瘤环境内部存活并兴盛(Christofk等人,2008,Nature 452(7184):230-3；Chaneton和Gottlieb,2012,Trends Biochem.Sci.37(8):309-16；Israelsen和VanderHeiden,2015,Semin.Cell Dev.Biol.43:43-51)。在另一方面，一旦表达，PKM-1同工型即有组成型活性。不希望受理论约束，在生产培养晚期PKM-1水平与生乳行为的相关性可以归因于PEP通过这种酶不可控制地转化成丙酮酸，随后是LDH介导的丙酮酸转化成乳酸盐。
在表达mAb-2的细胞系中CRISPR介导的外显子-9缺失和因此PKM-1缺失导致在其中表达mAb-2的WT细胞展示生乳行为的条件下PKM-1 KO细胞中的生乳行为完全逆转(图5E)。两个PKM-1 HET mAb-2细胞系展示了不同行为。尽管HET-3KO细胞系产生非常少的乳酸盐(仅略多于其PKM-1 KO对应物)，但HET-18细胞系是生乳的并且生成如WT mAb-2细胞大约2/3之多的乳酸盐(图5E)。还在这些PKM-1 HET细胞系的生乳行为和这些细胞中的较高PKM-1水平之间观察到直接相关性(图5F)。与HET-3细胞系相比，HET-18中观察到的PKM-1水平差异可以归因于：PKM-1从不同PKM等位基因的差异性表达，或HET-3细胞系中PKM等位基因部分地受gRNA构建体靶向，或靶向的PKM等位基因内部已靶向区域的倒转。
鉴定了不能表达PKM-2蛋白的PKM-1敲除细胞系(KO-15)(图5F)。该细胞系在5’gRNA导引区域上游的内含子具有一个122-bp缺失和随机碱基插入(图3C)。KO-15细胞系可以忍受PKM-1酶和PKM-2酶皆丢失，因为这些CHO细胞系还表达PKL/R(图3A)，这可以代偿缺少PKM表达。通过蛋白质印迹分析确认PKL/R蛋白在WT和全部PKM-1 HET和KO细胞系中均表达(数据未显示)。然而，PKM-1表达的缺少或降低在全部PKM-1 KO或HET细胞系中分别导致乳酸盐生成较少，对滴度或比生产率无影响(图5C-图5D和图6C-图6D)。这些细胞系中生乳行为的缺少或衰减在解冻后的更低幼细胞系中及全部重复样本当中可重复和始终如一(图5A-图5E和图6A-图6E)。
生产培养期间控制生乳行为对于从生产运行获得最佳滴度和产品质量重要，因此，从宿主敲除PKM-1表达可能在处理CHO细胞的生乳行为时有利。重要的是在导引PKM-1或完整PKM基因以缺失之前确认并监测CHO细胞中其他PK酶的表达，因为PKL/R酶可能代偿PKM消除。CHO宿主中可能耐受完整PKM基因敲除，并且PKM KO CHO宿主能够以与WT宿主相当的滴度和产物质量表达目的抗体或产物。这些PKM KO宿主可以减少生乳行为并且具有比WT宿主更好的生长曲线，如KO-2和KO-15细胞系中观察到(图5A和图6A)。
实施例2：PKM敲除和PKM-1敲除CHO细胞系中生产mAb-3
在CHO-K1M细胞系中敲除PKM基因或PKM-1基因，生成一个PKM KO宿主细胞系和四个PKM-1 KO宿主细胞系。通过定向整合，将编码mAb-3的转基因引入WT CHO-K1M、PKM KO和PKM-1 KO宿主细胞系，从相同的宿主细胞系生成三个表达mAb-3的WT汇集物，从相同宿主的细胞系生成三个表达mAb-3的PKM KO汇集物并且从四个不同的宿主细胞系生成四个表达mAb-3的PKM-1 KO汇集物。
以下实验如实施例1中公开那样进行，例外是生成PKM KO宿主的gRNA不同并在下文提供。用来产生PKM-1 KO宿主细胞的gRNA与实施例1中所用相同。
生成PKM KO宿主的gRNA具有以下序列：
5’-gRNA：CCCATCACGGCCCGCAACAC(SEQ ID NO:42，靶向PKM基因外显子2内部的区域)
3’-gRNA：CTTCTTCAAGACGGGGGATG(SEQ ID NO:43，靶向PKM基因外显子12内部的区域)
在摇瓶生产中，从PKM和PKM-1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物具有与WT汇集物相当或比WT汇集物更高的Qp和滴度，但生长较低(由积分活细胞浓度(IVCC)代表)(图7)。在摇瓶生产中，从PKM和PKM1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物也生成比WT宿主细胞系更低的乳酸盐(图8A)，但消耗更多的葡萄糖(图8B)。如图8A中所示，截止摇瓶中生产第15天，WT宿主细胞产生约1.0g/L乳酸盐。在摇瓶生产期间，1-2.5g/L之间的乳酸盐浓度视为高。相反，截止第15天，PKM-1 KO宿主细胞产生非常少的乳酸盐并且PKM KO宿主细胞产生小于0.2g/L的乳酸盐，导致当敲除PKM-1或敲除PKM-1和PKM-2二者时乳酸盐产量减少大于80％。
在摇瓶生产中，从PKM/PKM-1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物具有不同的氨基酸合成/消耗率(图9A和图10)。例如，PKM KO宿主细胞系积累3-磷酸甘油酸，这导致如与WT和PKM-1宿主细胞相比丝氨酸和甘氨酸的产生增加(图9B)。与PKM KO和PKM-1宿主细胞相比，WT宿主细胞系积累丙酮酸(图9C)。不限于具体理论，丙酮酸在WT宿主细胞中的积累可以导致乳酸盐积累和丙氨酸的产生增加(图10)。PKM-1 KO宿主细胞系积累TCA循环产物如草酰乙酸盐，这导致天冬氨酸和天冬酰胺积累(图9D)，并积累α-酮戊二酸(a-KG)，这导致谷氨酸、精氨酸和谷氨酰胺积累(图9E)。不限于具体理论，这些结果表明PKM-1和PKM-2可以发挥调节丙酮酸产生水平，从而丙酮酸优先进入TCA循环的作用。图10中显示上述结果的总结。基于这些数据，可以调节用来培养PKM-1和PKM KO细胞的细胞培养基和条件以代偿消耗的葡萄糖的量和/或消耗或合成的氨基酸的量。
在摇瓶生产中，从PKM/PKM1 KO宿主细胞系衍生的产生MAb-3的汇集物具有不同的糖基化特征。PKM KO宿主具有减少的半乳糖基化，并且PKM KO和PKM-1 KO宿主细胞系具有略微地减少的岩藻糖基化(图11)。不限于具体理论，糖基化的这些变更将多半不影响生成的抗体的活性。
本申请通篇范围内引用的全部附图和全部参考文献、专利和已公布专利申请及登录号的内容均通过引用的方式明确并入本文。
Figure IDA0002706139850000011
Figure IDA0002706139850000021
Figure IDA0002706139850000031
Figure IDA0002706139850000041
Figure IDA0002706139850000051
Figure IDA0002706139850000061
Figure IDA0002706139850000071
Figure IDA0002706139850000081
Figure IDA0002706139850000091
Figure IDA0002706139850000101
Figure IDA0002706139850000111
Figure IDA0002706139850000121
Figure IDA0002706139850000131
Figure IDA0002706139850000141
Figure IDA0002706139850000151
Figure IDA0002706139850000161
Figure IDA0002706139850000171
Figure IDA0002706139850000181
Figure IDA0002706139850000191
Figure IDA0002706139850000201
Figure IDA0002706139850000211
Figure IDA0002706139850000221
Figure IDA0002706139850000231
Figure IDA0002706139850000241
Figure IDA0002706139850000251
Figure IDA0002706139850000261
Figure IDA0002706139850000271
Figure IDA0002706139850000281
Figure IDA0002706139850000291
Figure IDA0002706139850000301
Figure IDA0002706139850000311
Figure IDA0002706139850000321
Figure IDA0002706139850000331
Figure IDA0002706139850000341
Figure IDA0002706139850000351
Figure IDA0002706139850000361
Figure IDA0002706139850000371
Figure IDA0002706139850000381
Figure IDA0002706139850000391
Figure IDA0002706139850000401
Figure IDA0002706139850000411
Figure IDA0002706139850000421
Figure IDA0002706139850000431
Figure IDA0002706139850000441
Figure IDA0002706139850000451
Figure IDA0002706139850000461
Figure IDA0002706139850000471
Figure IDA0002706139850000481
Figure IDA0002706139850000491
Figure IDA0002706139850000501
Figure IDA0002706139850000511
Figure IDA0002706139850000521
Figure IDA0002706139850000531
Figure IDA0002706139850000541
Figure IDA0002706139850000551
Figure IDA0002706139850000561
Figure IDA0002706139850000571
Figure IDA0002706139850000581
Figure IDA0002706139850000591
Figure IDA0002706139850000601
Figure IDA0002706139850000611
Figure IDA0002706139850000621
Figure IDA0002706139850000631
Figure IDA0002706139850000641
Figure IDA0002706139850000651
Figure IDA0002706139850000661
Figure IDA0002706139850000671
Figure IDA0002706139850000681
Figure IDA0002706139850000691
Figure IDA0002706139850000701
Figure IDA0002706139850000711
Figure IDA0002706139850000721
Figure IDA0002706139850000731
Figure IDA0002706139850000741
Figure IDA0002706139850000751
Figure IDA0002706139850000761
Figure IDA0002706139850000771
Figure IDA0002706139850000781
Figure IDA0002706139850000791
Figure IDA0002706139850000801
Figure IDA0002706139850000811
Figure IDA0002706139850000821
Figure IDA0002706139850000831
Figure IDA0002706139850000841
Figure IDA0002706139850000851
Figure IDA0002706139850000861
Figure IDA0002706139850000871
Figure IDA0002706139850000881
Figure IDA0002706139850000891
Figure IDA0002706139850000901
Figure IDA0002706139850000911
Figure IDA0002706139850000921
Figure IDA0002706139850000931
Figure IDA0002706139850000941
Figure IDA0002706139850000951
Figure IDA0002706139850000961
Figure IDA0002706139850000971
Figure IDA0002706139850000981
Figure IDA0002706139850000991
Figure IDA0002706139850001001
Figure IDA0002706139850001011
Figure IDA0002706139850001021
Figure IDA0002706139850001031
Figure IDA0002706139850001041
Figure IDA0002706139850001051
Figure IDA0002706139850001061
Figure IDA0002706139850001071
Figure IDA0002706139850001081
Figure IDA0002706139850001091
Figure IDA0002706139850001101
Figure IDA0002706139850001111
Figure IDA0002706139850001121
Figure IDA0002706139850001131
Figure IDA0002706139850001141
Figure IDA0002706139850001151
Figure IDA0002706139850001161
Figure IDA0002706139850001171
Figure IDA0002706139850001181
Figure IDA0002706139850001191
Figure IDA0002706139850001201
Figure IDA0002706139850001211
Figure IDA0002706139850001221
Figure IDA0002706139850001231
Figure IDA0002706139850001241
Figure IDA0002706139850001251
Figure IDA0002706139850001261
Figure IDA0002706139850001271
Figure IDA0002706139850001281
Figure IDA0002706139850001291
Figure IDA0002706139850001301
Figure IDA0002706139850001311
Figure IDA0002706139850001321
Figure IDA0002706139850001331
Figure IDA0002706139850001341
Figure IDA0002706139850001351
Figure IDA0002706139850001361
Figure IDA0002706139850001371
Figure IDA0002706139850001381
Figure IDA0002706139850001391
Figure IDA0002706139850001401
Figure IDA0002706139850001411
Figure IDA0002706139850001421
Figure IDA0002706139850001431
Figure IDA0002706139850001441
Figure IDA0002706139850001451
Figure IDA0002706139850001461
Figure IDA0002706139850001471
Figure IDA0002706139850001481
Figure IDA0002706139850001491
Figure IDA0002706139850001501
Figure IDA0002706139850001511
Figure IDA0002706139850001521
Figure IDA0002706139850001531
Figure IDA0002706139850001541
Figure IDA0002706139850001551
Figure IDA0002706139850001561
Figure IDA0002706139850001571
Figure IDA0002706139850001581
Figure IDA0002706139850001591
Figure IDA0002706139850001601
Figure IDA0002706139850001611
Figure IDA0002706139850001621
Figure IDA0002706139850001631
Figure IDA0002706139850001641
Figure IDA0002706139850001651
Figure IDA0002706139850001661
Figure IDA0002706139850001671
Figure IDA0002706139850001681
Figure IDA0002706139850001691
Figure IDA0002706139850001701
Figure IDA0002706139850001711
Figure IDA0002706139850001721
Figure IDA0002706139850001731
Figure IDA0002706139850001741
Figure IDA0002706139850001751
Figure IDA0002706139850001761
Figure IDA0002706139850001771
Figure IDA0002706139850001781
Figure IDA0002706139850001791
Figure IDA0002706139850001801
Figure IDA0002706139850001811
Figure IDA0002706139850001821
Figure IDA0002706139850001831
Figure IDA0002706139850001841
Figure IDA0002706139850001851
Figure IDA0002706139850001861
Figure IDA0002706139850001871
Figure IDA0002706139850001881
Figure IDA0002706139850001891
Figure IDA0002706139850001901
Figure IDA0002706139850001911
Figure IDA0002706139850001921
Figure IDA0002706139850001931
Figure IDA0002706139850001941
Figure IDA0002706139850001951
Figure IDA0002706139850001961
Figure IDA0002706139850001971
Figure IDA0002706139850001981

Claims (84)

1.一种具有降低或消除的生乳活性的哺乳动物细胞，其中敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型的表达，并且其中PKM多肽同工型包括PKM-1多肽同工型。
2.根据权利要求2所述的哺乳动物细胞，其中敲减或敲除PKM-2多肽同工型的表达。
3.根据权利要求1或2所述的哺乳动物细胞，其中细胞是CHO细胞。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的哺乳动物细胞，包含编码目的产物的核酸序列。
5.根据权利要求4所述的哺乳动物细胞，其中目的产物包括蛋白质。
6.根据权利要求4或5所述的哺乳动物细胞，其中目的产物包括重组蛋白。
7.根据权利要求4-6中任一项所述的哺乳动物细胞，其中目的产物包括抗体或其抗原结合片段。
8.根据权利要求7所述的哺乳动物细胞，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求7所述的哺乳动物细胞，其中抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的哺乳动物细胞，其中抗体包括嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
11.根据权利要求7-10中任一项所述的哺乳动物细胞，其中抗体包括单克隆抗体。
12.根据权利要求4-11中任一项所述的哺乳动物细胞，其中核酸序列在靶向的位置整合在哺乳动物细胞的细胞基因组中。
13.根据权利要求12所述的哺乳动物细胞，还包含随机整合在哺乳动物细胞的细胞基因组成中的编码目的产物的核酸。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约50％生乳活性。
15.根据权利要求14所述的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约20％生乳活性。
16.根据权利要求14或15所述的哺乳动物细胞，其中参考细胞是包含PKM基因的野生型等位基因的细胞。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间产生小于约2.0g/L乳酸盐。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
21.哺乳动物细胞，包含PKM基因的等位基因，所述等位基因包含选自SEQ ID NOs:39-41的核苷酸序列或在SEQ ID NOs:37和38中所述的核苷酸序列。
22.组合物，其包含根据权利要求1-21中任一项所述的哺乳动物细胞。
23.用于减少或消除细胞中生乳活性的方法在，包括敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型的表达。
24.用于减少或消除细胞中生乳活性的方法在，包括向细胞施用基因工程系统，其中基因工程系统敲减或敲除丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型的表达。
25.根据权利要求24所述的方法，其中基因工程系统选自CRISPR/Cas系统、锌指核酸酶(ZFN)系统、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统及其组合。
26.根据权利要求24或25所述的方法，其中基因工程系统是CRISPR/Cas9系统。
27.根据权利要求26所述的方法，其中CRISPR/Cas9系统包含：
(a)Cas9分子，和
(b)一种或多种向导RNA(gRNAs)，其包含与PKM基因中靶序列互补的导引序列。
28.根据权利要求27所述的方法，其中靶序列选自：PKM基因的一部分、侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区、侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区、侧置于PKM基因外显子10的3’内含子区、PKM基因外显子1内部的区域、PKM基因外显子2内部的区域、PKM基因外显子12内部的区域及其组合。
29.根据权利要求27所述的方法或28，其中一种或多种gRNA包含：
(i)(1)第一gRNA，其包含与侧置于PKM基因外显子9的5’内含子区互补的靶序列；和(2)第二gRNA，其包含与侧置于PKM基因外显子9的3’内含子区互补的靶结构域；或
(ii)(1)第一gRNA，其包含与PKM基因外显子2内部的区域互补的靶序列；和(2)第二gRNA，其包含与PKM基因外显子12内部的区域互补的靶结构域。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的方法，其中一种或多种gRNA包含选自SEQ IDNOs:33-34和42-43及其组合的序列。
31.根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中敲除PKM多肽同工型的表达，并且与参考细胞的生乳活性相比，细胞中的生乳活性消除或降低。
32.根据权利要求23-30中任一项所述的方法，其中敲减PKM多肽同工型的表达，并且与参考细胞的生乳活性相比，细胞中的生乳活性降低。
33.根据权利要求31或32所述的方法，其中细胞的生乳活性小于约50％的参考细胞生乳活性。
34.根据权利要求31或32所述的方法，其中细胞的生乳活性小于约20％的参考细胞生乳活性。
35.根据权利要求23-34中任一项所述的方法，其中细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。
36.根据权利要求23-35中任一项所述的方法，其中细胞在生产阶段期间产生小于约2.0g/L乳酸盐。
37.根据权利要求23-35中任一项所述的方法，其中细胞在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
38.根据权利要求23-35中任一项所述的方法，其中细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
39.根据权利要求31-38中任一项所述的方法，其中参考细胞是包含PKM基因的野生型等位基因的细胞。
40.根据权利要求23-39中任一项所述的方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型。
41.根据权利要求23-39中任一项所述的方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型和PKM-2多肽同工型。
42.根据权利要求24所述的方法，其中基因工程系统包含选自短发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)和微RNA(miRNA)的RNA，其中RNA与PKM基因表达的mRNA的一部分互补。
43.根据权利要求42所述的方法，其中PKM基因表达的mRNA编码PKM-1多肽同工型。
44.根据权利要求43所述的方法，其中敲除或敲减PKM-1多肽同工型的表达，并且与参考细胞的生乳活性相比，细胞的生乳活性降低。
45.根据权利要求42-44中任一项所述的方法，其中基因工程系统还包含选自shRNA、siRNA和微RNA miRNA的第二RNA，其中第二RNA与PKM基因表达的编码PKM-2多肽同工型的mRNA的一部分互补。
46.根据权利要求45所述的方法，其中敲除或敲减PKM-1和PKM-2多肽同工型的表达，并且细胞的生乳活性降低。
47.根据权利要求24所述的方法，其中基因工程系统是锌指核酸酶(ZFN)系统或转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)系统。
48.根据权利要求23-47中任一项所述的方法，其中细胞是哺乳动物细胞。
49.根据权利要求49所述的方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
50.根据权利要求23-49中任一项所述的方法，其中细胞表达目的产物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中细胞表达的目的产物由核酸序列编码。
52.根据权利要求51所述的方法，其中核酸序列在靶向的位置整合在细胞的细胞基因组中。
53.根据权利要求50-52中任一项所述的方法，其中细胞表达的目的产物进一步由随机整合在哺乳动物细胞的细胞基因组成中的核酸序列编码。
54.根据权利要求50-53中任一项所述的方法，其中目的产物包括蛋白质。
55.根据权利要求54所述的方法，其中目的产物包括重组蛋白。
56.根据权利要求50-55中任一项所述的方法，其中目的产物包括抗体或其抗原结合片段。
57.根据权利要求56所述的方法，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
58.根据权利要求56所述的方法，其中抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的方法，其中抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
61.产生目的产物的方法，包括培养表达目的产物的哺乳动物细胞，其中哺乳动物细胞表达目的产物并且具有降低或消除的生乳活性。
62.培养表达目的产物的哺乳动物细胞群体的方法，其中哺乳动物细胞具有降低或消除的生乳活性。
63.根据权利要求61或62所述的方法，其中生乳活性降低或消除因敲除或敲减哺乳动物细胞中丙酮酸激酶肌肉(PKM)多肽同工型表达所致。
64.根据权利要求63所述的方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型。
65.根据权利要求63所述的方法，其中PKM多肽同工型是PKM-1多肽同工型和PKM-2多肽同工型。
66.根据权利要求61-65中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约50％生乳活性。
67.根据权利要求61-65中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞的生乳活性小于参考细胞的约20％生乳活性。
68.根据权利要求61-67中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞的生乳活性在生产阶段第14天或第15天测定。
69.根据权利要求61-68中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间产生小于约2.0g/L乳酸盐。
70.根据权利要求61-68中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在摇瓶中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
71.根据权利要求61-68中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞在生产阶段期间在生物反应器中产生小于约2.0g/L乳酸盐。
72.根据权利要求66-71中任一项所述的方法，其中参考细胞是包含PKM基因的至少一个或两个野生型等位基因的细胞。
73.根据权利要求61-72中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。
74.根据权利要求61-73中任一项所述的方法，其中哺乳动物细胞表达的目的产物由核酸序列编码。
75.根据权利要求74所述的方法，其中核酸序列在靶向的位置整合在哺乳动物细胞的细胞基因组中。
76.根据权利要求61-75中任一项所述的方法，其中细胞表达的目的产物进一步由随机整合在哺乳动物细胞的细胞基因组成中的核酸序列编码。
77.根据权利要求61-76中任一项所述的方法，其中目的产物包括蛋白质。
78.根据权利要求61-77中任一项所述的方法，其中目的产物包括重组蛋白。
79.根据权利要求61-79中任一项所述的方法，其中目的产物包括抗体或其抗原结合片段。
80.根据权利要求79所述的方法，其中抗体是多特异性抗体或其抗原结合片段。
81.根据权利要求79所述的方法，其中抗体由单个重链序列和单个轻链序列或其抗原结合片段组成。
82.根据权利要求79-81中任一项所述的方法，其中抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。
83.根据权利要求79-82中任一项所述的方法，其中抗体是单克隆抗体。
84.根据权利要求61-83中任一项所述的方法，还包括收获目的产物。
CN201980023064.4A 2018-03-29 2019-03-29 调节哺乳动物细胞中的生乳活性 Pending CN111936625A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862649963P 2018-03-29 2018-03-29
US62/649,963 2018-03-29
PCT/US2019/024774 WO2019191552A1 (en) 2018-03-29 2019-03-29 Modulating lactogenic activity in mammalian cells

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111936625A true CN111936625A (zh) 2020-11-13

Family

ID=66448608

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201980023064.4A Pending CN111936625A (zh) 2018-03-29 2019-03-29 调节哺乳动物细胞中的生乳活性

Country Status (13)

Country Link
US (1) US20210009988A1 (zh)
EP (1) EP3775184A1 (zh)
JP (2) JP2021519073A (zh)
KR (2) KR20230042407A (zh)
CN (1) CN111936625A (zh)
AR (1) AR115318A1 (zh)
AU (1) AU2019245243A1 (zh)
BR (1) BR112020019726A2 (zh)
CA (1) CA3091231A1 (zh)
IL (1) IL277591A (zh)
MX (1) MX2020010028A (zh)
SG (1) SG11202009542PA (zh)
WO (1) WO2019191552A1 (zh)

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004016646A2 (en) * 2002-08-12 2004-02-26 Amynon Bio Tech Gmbh Peptide modulators of tumour specific pyruvate kinase subtype m2 (m2-pk)
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
CN102985437A (zh) * 2010-05-28 2013-03-20 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 通过下调ldh和pdhk表达降低乳酸水平和增加多肽生产
JP2017075124A (ja) * 2015-10-15 2017-04-20 シーシーアイ株式会社 がん細胞の薬物感受性増強剤、薬物感受性を予測する方法、および薬物感受性バイオマーカー
CN106661569A (zh) * 2014-03-04 2017-05-10 西格马—奥尔德里奇有限责任公司 抗病毒细胞及其用途
WO2017098051A2 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Combined preparations of pkm2 modulators and hmgb1
WO2017192437A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 The Regents Of The University Of California Mammalian cells devoid of lactate dehydrogenase activity

Family Cites Families (96)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US830930A (en) 1905-11-22 1906-09-11 E & T Fairbanks & Co Weighing-scale.
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
EP0307434B2 (en) 1987-03-18 1998-07-29 Scotgen Biopharmaceuticals, Inc. Altered antibodies
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
DE68925971T2 (de) 1988-09-23 1996-09-05 Cetus Oncology Corp Zellenzuchtmedium für erhöhtes zellenwachstum, zur erhöhung der langlebigkeit und expression der produkte
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5399346A (en) 1989-06-14 1995-03-21 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Gene therapy
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
EP0590058B1 (en) 1991-06-14 2003-11-26 Genentech, Inc. HUMANIZED Heregulin ANTIBODy
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
EP1997894B1 (en) 1992-02-06 2011-03-30 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Biosynthetic binding protein for cancer marker
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
WO1998050431A2 (en) 1997-05-02 1998-11-12 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
ES2244066T3 (es) 1997-06-24 2005-12-01 Genentech, Inc. Procedimiento y composiciones de glicoproteinas galactosiladas.
DE69840412D1 (de) 1997-10-31 2009-02-12 Genentech Inc Methoden und zusammensetzungen bestehend aus glykoprotein-glykoformen
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
PT1034298E (pt) 1997-12-05 2012-02-03 Scripps Research Inst Humanização de anticorpo murino
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ATE375365T1 (de) 1998-04-02 2007-10-15 Genentech Inc Antikörper varianten und fragmente davon
DE69942021D1 (de) 1998-04-20 2010-04-01 Glycart Biotechnology Ag Glykosylierungs-engineering von antikörpern zur verbesserung der antikörperabhängigen zellvermittelten zytotoxizität
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
KR20060067983A (ko) 1999-01-15 2006-06-20 제넨테크, 인크. 효과기 기능이 변화된 폴리펩티드 변이체
WO2001077342A1 (en) 2000-04-11 2001-10-18 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
ES2405944T3 (es) 2000-11-30 2013-06-04 Medarex, Inc. Ácidos nucleicos que codifican las secuencias de inmunoglobulina humana reorganizadas a partir de ratones transcromoscómicos transgénicos zadas
KR20100018071A (ko) 2001-08-03 2010-02-16 글리카트 바이오테크놀로지 아게 항체 의존적 세포 독성이 증가된 항체 글리코실화 변이체
EP1443961B1 (en) 2001-10-25 2009-05-06 Genentech, Inc. Glycoprotein compositions
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
CA2481657A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Cells of which genome is modified
US7749753B2 (en) 2002-04-09 2010-07-06 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Cells in which activity of the protein involved in transportation of GDP-fucose is reduced or lost
AU2003236015A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition
CA2481925A1 (en) 2002-04-09 2003-10-16 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Therapeutic agent for patients having human fc.gamma.riiia
JPWO2003085119A1 (ja) 2002-04-09 2005-08-11 協和醗酵工業株式会社 抗体組成物のＦｃγ受容体ＩＩＩａに対する結合活性を高める方法
EP1546322B1 (en) 2002-07-24 2011-01-05 Manoa Biosciences Inc. Transposon-based vectors and methods of nucleic acid integration
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
DE60332957D1 (de) 2002-12-16 2010-07-22 Genentech Inc Immunoglobulinvarianten und deren verwendungen
NZ591970A (en) 2003-01-22 2012-11-30 Roche Glycart Ag Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased fc receptor binding affinity and effector function
US7635472B2 (en) 2003-05-31 2009-12-22 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-cd3, anti-cd19 antibody constructs for the treatment of b-cell related disorders
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
NZ549872A (en) 2004-04-13 2009-09-25 Hoffmann La Roche Anti-P-selectin antibodies
TWI380996B (zh) 2004-09-17 2013-01-01 Hoffmann La Roche 抗ｏｘ４０ｌ抗體
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
CN101115773B (zh) 2005-02-07 2015-06-10 罗氏格黎卡特股份公司 结合egfr的抗原结合分子,编码它的载体,及其应用
EP3178850B1 (en) 2005-10-11 2021-01-13 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
US20080044455A1 (en) 2006-08-21 2008-02-21 Chaim Welczer Tonsillitus Treatment
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
SG10201808730VA (en) 2007-04-03 2018-11-29 Amgen Res Munich Gmbh Cross-species-specific binding domain
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
DK2235064T3 (en) 2008-01-07 2016-01-11 Amgen Inc A process for the preparation of heterodimeric Fc molecules using electrostatic control effects
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
AU2010252284A1 (en) 2009-05-27 2011-11-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Tri- or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
RU2015153109A (ru) 2009-09-16 2019-01-15 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применения
SG185428A1 (en) 2010-06-08 2012-12-28 Genentech Inc Cysteine engineered antibodies and conjugates
HUE041335T2 (hu) 2011-03-29 2019-05-28 Roche Glycart Ag Antitest FC-variánsok
LT2748202T (lt) 2011-08-23 2018-09-25 Roche Glycart Ag Bispecifinės antigeną surišančios molekulės
US20130058936A1 (en) 2011-08-23 2013-03-07 Peter Bruenker Bispecific antibodies specific for t-cell activating antigens and a tumor antigen and methods of use
JP6339015B2 (ja) 2011-08-23 2018-06-06 ロシュ グリクアート アーゲー 二重特異性ｔ細胞活性化抗原結合分子
ES2676031T3 (es) 2012-02-15 2018-07-16 F. Hoffmann-La Roche Ag Cromatografía de afinidad basada en el receptor Fc
CN103152739A (zh) 2013-02-06 2013-06-12 北京奇虎科技有限公司 一种移动终端通话请求信息处理的方法、装置及系统
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
BR112016011027A2 (pt) 2013-12-20 2017-12-05 Genentech Inc método de produção de um anticorpo, anticorpos, composição farmacêutica, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de tratamento de asma e método de tratamento de um distúrbio
AU2015235983A1 (en) 2014-03-27 2016-10-06 Genentech, Inc. Anti-influenza B virus hemagglutinin antibodies and methods of use
RS59738B1 (sr) 2014-03-31 2020-02-28 Hoffmann La Roche Anti-ox40 antitela i postupci primene
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
JP6744292B2 (ja) 2014-07-29 2020-08-19 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 多重特異性抗体
PL3608337T3 (pl) 2014-08-04 2024-07-22 F. Hoffmann-La Roche Ag Dwuswoiste cząsteczki wiążące antygen aktywujący limfocyty T
BR112017003236A2 (pt) 2014-09-12 2017-11-28 Genentech Inc anticorpos elaborados com cisteína, conjugados de droga e anticorpos, método de preparação de conjugado de droga e anticorpo e composição farmacêutica
EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2021-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
CA2980189A1 (en) 2015-04-24 2016-10-27 Genentech, Inc. Multispecific antigen-binding proteins
IL284808B (en) * 2015-06-18 2022-07-01 Broad Inst Inc Mutations in the crispr enzyme that reduce unintended effects
US11883470B2 (en) * 2016-07-25 2024-01-30 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions comprising a lecithin cholesterol acyltransferase variant and uses thereof

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004016646A2 (en) * 2002-08-12 2004-02-26 Amynon Bio Tech Gmbh Peptide modulators of tumour specific pyruvate kinase subtype m2 (m2-pk)
CN102858985A (zh) * 2009-07-24 2013-01-02 西格马-奥尔德里奇有限责任公司 基因组编辑方法
CN102985437A (zh) * 2010-05-28 2013-03-20 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 通过下调ldh和pdhk表达降低乳酸水平和增加多肽生产
CN106661569A (zh) * 2014-03-04 2017-05-10 西格马—奥尔德里奇有限责任公司 抗病毒细胞及其用途
JP2017075124A (ja) * 2015-10-15 2017-04-20 シーシーアイ株式会社 がん細胞の薬物感受性増強剤、薬物感受性を予測する方法、および薬物感受性バイオマーカー
WO2017098051A2 (en) * 2015-12-11 2017-06-15 Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Combined preparations of pkm2 modulators and hmgb1
WO2017192437A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 The Regents Of The University Of California Mammalian cells devoid of lactate dehydrogenase activity

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JUN LUO等: "Comparative Metabolite Analysis to Understand Lactate Metabolism Shift in Chinese Hamster Ovary Cell Culture Process", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》, vol. 109, no. 1, pages 146 - 156, XP055135701, DOI: 10.1002/bit.23291 *
MATTHEW GAGNON等: "High-End pH-Controlled Delivery of Glucose Effectively Suppresses Lactate Accumulation in CHO Fed-Batch Cultures", 《BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING》, vol. 108, no. 6, pages 1328 - 1337, XP055187906, DOI: 10.1002/bit.23072 *
汤其群: "《生物化学与分子生物学》", 30 September 2015, 复旦大学出版社, pages: 43 - 44 *
王佳贤;赵梦琳;丁凯;路慧丽;朱建伟;: "Crispr/Cas9技术在CHO细胞中进行基因定点敲入的应用", 中国医药工业杂志, no. 01, pages 42 - 46 *

Also Published As

Publication number Publication date
MX2020010028A (es) 2020-10-14
KR20230042407A (ko) 2023-03-28
KR20200135510A (ko) 2020-12-02
BR112020019726A2 (pt) 2021-01-26
WO2019191552A1 (en) 2019-10-03
IL277591A (en) 2020-11-30
CA3091231A1 (en) 2019-10-03
TW202003839A (zh) 2020-01-16
AR115318A1 (es) 2020-12-23
JP2021519073A (ja) 2021-08-10
US20210009988A1 (en) 2021-01-14
EP3775184A1 (en) 2021-02-17
JP2023040016A (ja) 2023-03-22
SG11202009542PA (en) 2020-10-29
AU2019245243A1 (en) 2020-09-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20210324085A1 (en) Aspgr antibodies and uses thereof
US12098365B2 (en) Modified mammalian cells
US20240254199A1 (en) Modified mammalian cells
JP2022538430A (ja) Ｓｉｒｔ－１遺伝子ノックアウトを有する哺乳類細胞株
US20220041672A1 (en) Apoptosis resistant cell lines
CN111936625A (zh) 调节哺乳动物细胞中的生乳活性
CN118201956A (zh) 用于表达抗体-多聚体-融合物的方法
TWI857954B (zh) 調節哺乳動物細胞之生乳活性
US20240190944A1 (en) Modified cells for the production of a recombinant product of interest
CN114703244A (zh) 重组产生多肽期间减少三硫键的方法
US20240309092A1 (en) Antibodies binding to csf1r and cd3
JP2010536345A (ja) 新規な方法および細胞系
EP4148067A1 (en) Method for the expression of an antibody-multimer-fusion
CN112262154A (zh) 人类重链伪γ基因编码的新型IGG5类重组免疫球蛋白
CN117003872A (zh) 含有突变轻链可变区骨架的单链抗体片段

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40040827

Country of ref document: HK