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CN111909277A - 一种靶向trbc1的人源化嵌合抗原受体、t细胞及用途 - Google Patents

一种靶向trbc1的人源化嵌合抗原受体、t细胞及用途 Download PDF

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CN111909277A
CN111909277A CN202010811462.7A CN202010811462A CN111909277A CN 111909277 A CN111909277 A CN 111909277A CN 202010811462 A CN202010811462 A CN 202010811462A CN 111909277 A CN111909277 A CN 111909277A
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cell
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张岩
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Shanghai First Peoples Hospital
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Abstract

本发明公开了一种靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体、T细胞及用途，嵌合抗原受体的胞外段结构由CD8α信号肽序列、myc标签序列、scFv序列、CD8α链的铰链序列依次串联而构成；跨膜区序列为CD8α链的跨膜区序列；胞内段结构由人41BB分子的胞内段序列，串联人CD3ζ链(CD247)胞内段序列构成；scFv序列来自于鼠源抗体JOVI.1，其中，CDR区移植到人源抗体框架VH1_1‑02和VK2_A17。本发明提供的优化后的CAR(H104)能够有效且特异性地识别和杀伤TRBC1+肿瘤靶细胞，并且减低CAR‑T细胞的自激活水平，缓解其功能耗竭的情况，使其在持续抗肿瘤作用等方面，更具优势。

Description

一种靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体、T细胞及用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体、T细胞及用途。
背景技术
CAR-T细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor T-Cell therapy)，即嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是将特异性抗体的单链抗原识别序列(scFv)与CD3ζ的穿膜区及包内信号序列相连，并表达于T细胞，使其具有不依赖于MHC分子的、特异性识别肿瘤抗原并杀伤肿瘤靶细胞的功能。
2011年，美国宾夕法尼亚大学Carl June教授团队的CAR-T疗法在3例慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者的治疗中获得突破：融合4-1BB(CD137)共刺激结构域的二代CAR-T细胞在患者体内实现了有效的靶细胞杀伤和长期增殖；2012年，Carl June团队使用该CAR-T产品治疗对放化疗无反应的急性淋巴细胞性白血病(ALL)患者、“明星小女孩”Emily，使其病情得到了奇迹般的控制：白血病完全缓解，其至今仍保持着无癌生存。
2017年，美国食品药品管理局(FDA)批准上市了两款适用于复发难治性B细胞肿瘤的CAR-T产品，表明了社会对该新兴肿瘤治疗方法的认可与期待。
据世界卫生组织(WHO)统计，全球淋巴瘤发病年增长率为7.5％，是目前发病率增长最快的恶性肿瘤之一，全球每年约有35万新发病例，死亡人数超过20万。近年来，我国淋巴肿瘤的发病率也呈逐年上升趋势，目前我国该疾病发病率超过6.68/10万人，且多发于儿童和青壮年。若将白血病和淋巴瘤，这两大淋巴系统恶性肿瘤合并分析，我国每年恶性淋巴瘤的发病率约为25/12万，即每年大约有20万人罹患淋巴瘤或白血病，给百姓的生命健康带来了巨大威胁。
恶性淋巴瘤患者中，非霍奇金淋巴瘤发生比例约占90％以上，其中我国T淋巴瘤患者约占所有非霍奇金淋巴瘤的25％，高于欧美国家的约15％。T细胞淋巴瘤(T celllymphoma)是一种侵袭性强，进展快，且对放化疗反应率低，预后差，复发率高的淋巴系统恶性肿瘤，平均5年生存率不足25％。目前，该疾病尚无明确有效的标准治疗方案，且缺乏靶向治疗药物。因此，探索其更为安全有效的治疗方案，是国内外临床与科研机构共同努力的方向。
目前正在进行临床或前临床实验的CAR-T产品大多靶向B细胞来源肿瘤如淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤等，靶向T细胞淋巴瘤的CAR-T产品却鲜有报道。其中，主要的困难点包括：
1.缺乏合适的肿瘤相关抗原作为靶点。由于肿瘤T细胞来源于变异的T细胞，其表面抗原与正常T细胞基本相似，缺乏特异性的肿瘤抗原。目前已见报道的，适用于T细胞淋巴瘤的CAR-T产品，或靶向T细胞共同抗原(如CD5,CD3,CD7等)，在杀伤肿瘤T细胞的同时也会杀伤患者的正常T细胞，导致患者发生获得性免疫缺失或低下；或靶向T细胞亚群的表面抗原(如CD4,CD30,CCR4等)，适用范围相当有限，并存在抗原缺失、肿瘤逃逸的风险；同时，由于存在CAR-T细胞同时表达抗原的情况，还会导致CAR-T之间的“自相残杀”，降低CAR-T细胞的功能活性，影响其持续作用。
2.在以自体淋巴细胞制备CAR-T细胞的过程中，需严格避免肿瘤T细胞的污染：若在制备的CAR-T中混入了肿瘤细胞，由于CAR上识别肿瘤抗原的单链抗体序列(scFv)会与细胞自身表达的抗原结合，使其不能被其他的CAR-T细胞识别，从而导致肿瘤细胞的“逃逸”与肿瘤的复发，这样的案例已在CD19 CAR-T产品的临床实践中出现过；若以异体淋巴细胞制备CAR-T细胞，则需考虑免疫排斥问题。
3.T细胞受体β链恒定区由两个基因(TRBC1和TRBC2)编码，成熟T细胞仅表达其中之一。由于肿瘤细胞单克隆起源的性质，使得TRBC1与TRBC2成为一个可以应用于T细胞恶性淋巴瘤的CAR-T治疗靶点，在有效规避肿瘤细胞污染问题的同时，保留患者部分正常的T细胞免疫功能。目前，已有相关靶向TRBC1的CAR-T产品被开发问世，但由于其使用鼠源抗体作为抗原识别域，具有一定的免疫原性，易被宿主自身的免疫细胞识别而清除，降低CAR-T细胞在体的长期疗效，增加了疾病复发的风险。
4.已有靶向TRBC1的CAR，但具有较高的自激活水平，易造成T细胞功能过早的耗竭，导致其增殖能力不足，影响其肿瘤杀伤功能和持续性的疾病控制能力。
正在开展的相关CAR-T产品的开发工作，已经在以下几个方面有所突破，例如：
1.开发NK CAR-T细胞系统：由于NK T细胞同样具备杀伤靶细胞的功能，且增殖能力有限，寿命较短，可以有效避免对免疫系统以及正常T细胞造成长期的影响，并可有效避免肿瘤T细胞的污染。但也因其增殖能力有限，寿命短的特点，使得NK CAR-T细胞的输注次数以及细胞量，需要较一般CAR-T细胞有所增加；且NK T细胞的基因编辑以及细胞扩增的难度较高，对生产以及工艺优化提出了更高的要求。
2.以基因编辑技术，在制备CAR-T细胞的同时，敲除其本身表达的靶点抗原。但由于基因编辑技术的应用，仍存在可能的潜在脱靶风险，技术要求较高。
3.开发通用型异体CAR-T细胞系统。以基因编辑技术，同时敲除T细胞所表达的抗原蛋白以及T细胞受体(T cell receptor,TCR)，以免回输的T细胞产生移植物抗宿主反应(Graft versus host disease,GVHD)，以及CAR-T自我杀伤的情况；在主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)差异性允许的情况下，实现利用异体T细胞制备CAR-T细胞的临床应用，从而规避肿瘤T细胞的污染。
发明内容
本发明的目的是针对目前市场上针对靶向T细胞淋巴瘤的CAR-T产品数量少并且效果不理想的情况，提供靶向TRBC1基因的CAR-T产品。
为了达到上述目的，本发明提供了一种靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体，所述的嵌合抗原受体的胞外段结构由CD8α信号肽序列、myc标签序列、scFv序列、CD8α链的铰链序列依次串联而构成；跨膜区序列为CD8α链的跨膜区序列；胞内段结构由人41BB分子的胞内段序列，串联人CD3ζ链(CD247)胞内段序列构成；所述的scFv序列来自于鼠源抗体JOVI.1，其中，所述的鼠源抗体JOVI.1的CDR区移植到人源抗体框架VH1_1-02和VK2_A17。
较佳地，所述的scFv包含重链和轻链，人类JH6和JK4分别用于重链和轻链的J区。
较佳地，所述的嵌合抗原受体克隆至载体中。
本发明还提供了一种T细胞，其包含：上述的靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体。
较佳地，所述的T细胞来自于人外周血单核细胞。
较佳地，所述的T细胞为经磁珠纯化后的T细胞；所述的磁珠包被有TRBC1特异性抗体。
较佳地，所述的T细胞的制备方法包含以下步骤：
(1)将TRBC1抗体结合到磁珠上；
(2)取待纯化的T细胞，与结合有TRBC1抗体的磁珠混合；
(3)置于磁力架上静置后，取上清，获得所述的T细胞。
本发明还提供了上述的靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体的用途，所述的嵌合抗原受体用于制备靶向性抗肿瘤的药物。
相对于现有技术，本发明的有益效果是：
(1)本发明开发并优化的特异性识别并杀伤TRBC1+T细胞的CAR-T产品，可以用于肿瘤T细胞呈TRBC1阳性的T淋巴细胞瘤患者。
(2)本发明通过偶联TRBC1特异性抗体的磁珠，利用阴性选择的方法，去除患者或供者提供的T细胞中TRBC1+的细胞(包括正常T细胞和T淋巴瘤细胞)，避免制备的CAR-T细胞中污染有肿瘤T细胞。
(3)本发明提供的抗体序列人源化、特异性识别并杀伤TRBC1+T细胞的CAR-T产品，对于不表达TRBC1的正常细胞(包括表达TRBC2的正常T细胞)，几乎不存在非特异性杀伤的情况，从而保留患者正常的细胞免疫功能，避免患者出现免疫低下或缺失的情况。
(4)本发明优化后的CAR(H104)能够有效且特异性地识别和杀伤TRBC1+肿瘤靶细胞，并且减低CAR-T细胞的自激活水平，缓解其功能耗竭的情况，使其在荷瘤小鼠体内模型中的肿瘤杀伤能力，以及持续抗肿瘤作用等方面，都更具优势。
附图说明
图1为利用TRBC1特异性抗体偶联磁珠对人外周血单核细胞(PBMC)中T细胞样品进行分选，并以流式细胞术检测、评估的分选效果图。
图2是对TRBC1 CAR的功能特异性的检测结果图。
图3是表达TRBC1 CAR的敲除TCR的Jurkat T细胞系的本底激活水平的检测结果图。
图4是在人原代T细胞上表达不同TRBC1 CAR后，其识别并杀伤靶细胞的激活指征水平的结果图。
图5的(a)为不同CAR-T细胞体外杀伤TRBC1+肿瘤靶细胞的结果对比图；图5的(b)为不同CAR-T细胞体外杀伤TRBC2+肿瘤靶细胞的结果对比图。
图6为不同CAR-T细胞分泌IL-2与IFN-γ的结果对比图。
图7是在荷瘤小鼠动物模型上，H104 CAR-T细胞杀伤TRBC1+肿瘤靶细胞的效果图。
图8为萤火虫发光酶氧化底物而产生的荧光强度的检测结果图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步的说明。
成熟T细胞均表达一个特异性的T细胞受体(Tcellreceptor，TCR)，由α和β两条链组成，其中β链的恒定区(constantregion)由两个基因编码：TRBC1和TRBC2。在发育成熟的T细胞中，仅表达其中之一来构建完整的TCR。本发明开发并优化了特异性识别并杀伤TRBC1+T细胞的CAR-T产品，可以用于肿瘤T细胞呈TRBC1阳性的T淋巴细胞瘤患者。
实施例：TRBC1抗体序列的人源化改造
IgG型抗体的可变区由轻、重链的各4个框架区(framework region,FR)和3个互补决定区(complementarity determining region,CDR)组成：其中6个CDR区构成主要的抗原结合表面，序列和结构的多样性极高；而FR区的作用主要是为CDR区的结构提供支撑骨架，其序列在物种内具有一定的保守性。因此，可以通过同源建模和结构分析的方法，在不显著影响抗体的结构，以及其与抗原结合能力的情况下，将原抗体FR区的氨基酸序列替换为人源抗体的FR区序列，以降低其他物种来源抗体引起人体抗抗体反应的可能。这种抗体人源化的技术又被称为CDR移植抗体技术。
通过以下方法，本发明构造CDR移植人源化抗体的过程包括：将鼠源抗体JOVI.1的CDR区，移植到人源抗体框架VH1_1-02和VK2_A17(vBASE数据库)；同时为了保证CDR结构的完整性，除了CDR区之外，一小部分鼠源抗体的位点也做了保留，例如：VK2-#3，#46，#87；VH1_1_02-#71，#73，#76。抗体氨基酸的编号方式遵循KABAT(Kabat E.A.,Wu,T.T.,Perry,H.,Gottesman,K.and Foeller,C.(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,Fifth Edition.NIH Publication No.91-3242.Kabat E.A.et al,1991,Supra)数字方法标示。人类JH6和JK4分别用于重链和轻链的J区。改造后的人源化抗体命名为H104。
一、CAR的表达载体构建
本发明使用的TRBC1 CAR的抗原特异性单链抗体(scFv)序列来自于小鼠杂交瘤细胞JOVI.1(Joanne LV,Haydn MP,Colin RA,etc.Generation of Monoclonal AntibodiesAgainst a Human T cell ReceptorβChain Expressed in Transgenic Mice,HYBRIDOMA1992)，并对该抗体序列的骨架进行人源化序列优化。CAR的胞外段结构由CD8α信号肽序列、myc标签序列、scFv序列、CD8α链的铰链序列依次串联而构成；跨膜区序列为CD8α链的跨膜区序列；胞内段结构由人41BB分子的胞内段序列，串联人CD3ζ链(CD247)胞内段序列构成。本发明中所有CAR的碱基序列通过Gibson连接的方式(NEB#E2611L)克隆至pHR-hEF1α-IRES-EGFP载体中，经一代测序确认。
二、人的原代T细胞培养及慢病毒感染
人的原代T细胞均取自健康的知情志愿者。原代T细胞培养在含有10％的胎牛血清(Gibco#16000044)、100U/ml的青霉素和100μg/ml的硫酸链霉素(Gibco#10378016)、1mM丙酮酸盐(Gibco#11360070)的RPMI-1640(Gibco#11875-093)培养基中。为了维持T细胞的增殖，培养基中加入100U/ml的重组IL-2(Sigma-Aldrich#SRP3085)。
制备慢病毒：将Lenti-X 293T细胞(TaKaRa#632180)消化后，以不含抗生素的、含10％胎牛血清的DMEM培养基(Gibco#11995-065)重悬，计数后将6.25×105个细胞接种于6孔细胞培养板(Corning#CLS3516)，37℃5％CO2培养箱内静置培养24小时。利用脂质体转染系统(Mirus#2300)，将500ng慢病毒包装质粒pCMVdR8.92(Addgene#8455)和50ngpMD2.G(Addgene#12259)与500ng待包装的慢病毒质粒按照脂质体转染说明书的操作步骤，配置为转染复合体，加入Lenti-X 293T细胞培基中，37℃5％CO2培养箱内静置培养。转染后18小时，更换为新鲜培养基。换液后48小时，收集细胞上清，测定病毒滴度，冻存在-80℃冰箱中备用。必要时，可通过超速离心、PEG沉淀等方法，将病毒浓缩，
原代T细胞的慢病毒感染：以人T细胞磁珠阴性选择富集试剂盒(Stemcell#19051HLA)，根据其说明书操作将T细胞纯化出来，并以包被TRBC1特异性抗体的rProteinA磁珠(Life Technologies#10001D)对所得T细胞进行TRBC1去除纯化，具体操作如下：将100μl rPreteinA磁珠(含一半体积保存液)加入1ml PBST(PBS+0.1％TWEEN-20)，置于磁力架上吸附磁珠后，弃去上清液，重复2次，以平衡磁珠；将10μg TRBC1特异性抗体稀释于100-200μl PBST中，加入平衡后的磁珠中，置于4℃转轮，结合过夜；次日，将磁珠置于磁力架上，弃去上清，并以1ml PBST冲洗磁珠以去除游离抗体，重复洗涤2次后，以适量培养基重悬。提前复苏人外周血单核细胞，以T细胞富集试剂盒得到纯化的T细胞，每2*10^6个T细胞中，加入100μl结合有TRBC1特异性抗体的rPreteinA壁子，室温转轮结合10分钟后，加入PBS至2.5ml，置于磁力架上静置5分钟，使得TRBC1+T细胞因磁珠作用而被吸引于管壁，其余细胞随上清倾出。
使用包被了抗人CD3和抗人CD28抗体的磁珠(Life Technologies#11132D)，与T细胞在1：1的比例下共孵育24小时后，加入制备好的慢病毒进行感染。18小时后，去除含有慢病毒细胞的上清，并更换成新鲜的T细胞完全培养基。T细胞经磁珠刺激5天后，将磁珠撤去并每隔2-3天补充含100U/mlhIL2的新鲜T细胞完全培养基。
三、流式细胞术分析
对于细胞表面标志物的染色：将抗体稀释在FACS缓冲液(磷酸缓冲液PBS+2％胎牛血清)中，将待检测细胞以FACE缓冲液洗涤1次后，以抗体稀释液重悬并在4℃、黑暗环境下共孵育25分钟；以FACE缓冲液洗涤3次后，以FACE缓冲液重悬，上机检测。
对于细胞胞内标志物的染色：以4％多聚甲醛(Meilunbio#MA0192)重悬细胞，室温固定15分钟后，离心去除多聚甲醛；然后缓慢滴加预冷的甲醇，冰上破膜50分钟，离心去除甲醇；加入抗体稀释液(同表面染色)重悬，室温、黑暗环境下共孵育60分钟，FACE缓冲液洗涤3次后，以FACE缓冲液重悬，上机检测。可在细胞固定之前，使用Zombie Violet Fixableviability试剂盒(Biolegend#423114)，依据产品说明操作，对细胞的死活状态进行标记。
流式细胞术的数据通过BD LSRFortessa设备(BD bioscience)获得，并使用FlowJo software软件(Tree Star)进行数据分析。流式细胞术所用抗体信息可参考下表。
Figure BDA0002631101090000081
四、CAR-T细胞体外杀伤功能检测
TRBC1+Jurkat靶细胞，以及敲除内源TCR后过表达TRBC2+外源TCR的非靶细胞(TRBC2+Jurkat)，各自转入萤火虫发光酶(Luciferase)基因。分别将上述两种细胞，与不同CAR-T细胞，或未转导入CAR的对照T细胞，更换为新鲜的、不含IL-2的培养基后，按照不同效应细胞：靶细胞比例(E:T)，共孵育培养12-16小时。取细胞培养基进行细胞因子分泌水平检测。将细胞以100μl萤火虫发光酶底物D-荧光素(1.5mg/ml,Perkinelmer#122799)重悬，酶标仪检测460-540nm荧光值。以仅有相同数量靶细胞的样品孔荧光值(X0)为参考，计算各个样品孔荧光值(Xe)的减少量，即为靶细胞被杀伤的比例。T细胞的杀伤效率＝(X0-Xe)/X0×100％。
五、CAR-T细胞体外刺激条件下细胞因子分泌水平检测
以人IL-2，IFN-γELISA检测试剂盒(BD biosciences#550611,#550612),依照其说明书操作，对步骤四中所得CAR-T细胞与靶细胞共孵育培养的培养基上清，进行细胞因子分泌水平检测。依据标准品所建立的标准曲线，计算样品中相应细胞因子的含量。
六、小鼠肿瘤模型及CAR-T功能检测
体内实验所用均为5至8周龄重症联合免疫缺陷型(NOD/SCID/IL2Rγnull，NSG)小鼠。为了比较CAR-T的体内抗肿瘤效果，通过尾静脉注射给小鼠接种1×106个表达有萤火虫荧光素酶基因的TRBC1+Jurkat靶细胞；4天后，再通过尾静脉注射，给予荷瘤小鼠2×106个CAR-T细胞，或未转入CAR的对照T细胞治疗。通过小动物活体成像技术，检测靶细胞表达萤火虫发光酶产生荧光信号强度，追踪肿瘤的发展情况。具体操作包括：通过腹腔注射方式，给与荷瘤小鼠萤火虫荧光素底物D-荧光素(Perkinelmer#122799)，按照小鼠体重，以1.5mg/g的剂量施用；8分钟后待底物充分循环至小鼠全身，用2.5％-3.5％的异氟烷气体麻醉小鼠2分钟后，进行成像。生物发光成像通过IVIS光谱成像系统(Perkin Elmer)进行并定量，荧光定量数据通过活体成像软件(Perkin Elmer)分析获得。
实验结果：
(1)图1是利用TRBC1特异性抗体偶联磁珠对人外周血单核细胞(PBMC)中T细胞样品进行分选，并以流式细胞术检测、评估分选效果。取野生型Jurkat T细胞(TRBC1+)，敲除内源TCR后，过表达含TRBC2的TCR的Jurkat T细胞，以及以磁珠富集前后的T细胞样品，各1*10^6细胞；300g离心3分钟后弃去上清，以稀释于PBS的anti-TRBC1抗体(稀释至0.02mg/ml)重悬细胞样品，避光条件下，于冰上孵育20分钟；以适量PBS洗涤细胞样品2次后，以稀释于PBS的anti-human IgG APC二抗重悬细胞样品，避光条件下，于冰上孵育20分钟；以适量PBS洗涤细胞样品2次后，以含DAPI的PBS重悬细胞样品至适宜细胞浓度，以流式细胞术检测各细胞样品上APC荧光信号强度。以TRBC1+以及TRBC2+Jurkat T细胞分别作为阳性与阴性对照；在磁珠分选前，人T细胞中TRBC1+T细胞的比例约为30-35％；磁珠分选后，TRBC1+T细胞比例显著下降，约0-5％左右。
(2)图2是对TRBC1 CAR功能特异性的检测情况。分别将特异性识别TRBC1的鼠源抗体JOVI.1，以及改造后的人源化抗体(H104)，构建为单链抗体(scFv)，通过CD8 Hinge以及穿膜区与41-BB共刺激结构域以及CD3ζ链信号域相连，构建为靶向TRBC1的二代CAR，表达于敲除TCR的JurkatT细胞系。分别检测野生型CAR(M001)和改造后的CAR(H104)在静息(rest)状态，以及靶细胞(TRBC1+T cell)，非靶细胞(TRBC2+T cell，TCR-KO T cell)刺激12小时条件下，CAT-T细胞激活水平(以T细胞激活指征蛋白CD69的上调水平来反应T细胞的激活水平及其变化情况)。如图所示，两种CAR-T细胞均仅在表达TRBC1的靶细胞刺激下，被激活并上调CD69的表达，表明其特异性良好，抗体的序列人源化改造并未改变其对抗原的特异性识别。
(3)图3是对TRBC1 CAR本底激活水平的检测情况。在CAR导致T细胞本底激活水平较高的情况下，T细胞会由于持续处于激活状态，而进入耗竭状态(T cell Exhaustion)，导致T细胞增殖能力下降，杀伤功能减弱；在CAR-T细胞上进一步表现为体外扩增困难，体内持续增殖和杀伤靶细胞能力减弱，抗肿瘤治疗效果不足。将上述野生型CAR(M001)和人源化改造后的CAR(H104)分别表达于敲除TCR的Jurkat T细胞系，并检测其在无抗原刺激情况下，T细胞激活的指征蛋白CD69的表达情况，观察不同CAR对于T细胞本底激活水平的影响。如图3所示，对TRBC1抗体的序列进行人源化改造，一方面消除了鼠源抗体的免疫原性，降低了可能带来免疫排斥反应的风险；另一方面，通过人源化抗体序列的优化，降低了CAR造成T细胞本底激活水平较高的情况，有助于提升CAR-T细胞的增殖能力，提升其持续抗肿瘤功能。
(4)图4至图6是在人原代T细胞上表达鼠源抗体构建的靶向TRBC1的M001 CAR，以及序列人源化优化后的抗体构建的H104 CAR，验证其识别并杀伤靶细胞的功能及细胞因子分泌情况等。如图4所示，H104的本底激活水平较低，表现为静息情况下T细胞激活指征水平低。
请参阅图5的(a)，较低的本底激活水平保证了H104 CAR-T细胞可以更为有效的杀伤TRBC1+肿瘤靶细胞，且不改变其特异性，请参阅图5的(b)，对非靶细胞(TRBC2+T cell)的非特异性杀伤水平低；在与靶细胞共孵育24小时后，收集培养基上清并通过酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测CAR-T细胞分泌细胞因子IL-2以及IFN-γ的水平，如图6所示，H104能够更为有效的响应TRBC1+肿瘤靶细胞刺激，分泌更多IL-2与IFN-γ。
(5)图7是在荷瘤小鼠动物模型上，检测H104 CAR-T细胞杀伤TRBC1+肿瘤靶细胞的效果。通过给NSG(NOD/SCID/IL2Rγnull)重症联合免疫缺陷小鼠尾静脉注射接种1x106个TRBC1+Jurkat-T细胞，形成TRBC+T细胞淋巴瘤小鼠模型；3天后，给予其2x106个H104 CAR-T细胞或未表达CAR的外周单核粒细胞(PBMC)治疗；通过每周检测T肿瘤细胞所表达的萤火虫发光酶(Luciferase)氧化底物而产生的荧光强度，追踪肿瘤的发生与发展情况。如图7和图8的(a)所示，对照组小鼠所接种的PBMC细胞不能有效控制肿瘤的发展，所有试验小鼠在35天内或因瘤负荷而死亡，或因其病情发展达到实验动物伦理要求的安乐死标准而处以安乐死。如图7和图8的(b)所示，接受H104 CAR-T细胞治疗的小鼠，其肿瘤得到了有效控制，肿瘤清除达75％以上，荷瘤小鼠的生存率与生存状态显著提升。
综上所述，本发明提供的优化后的CAR(H104)能够有效且特异性地识别和杀伤TRBC1+肿瘤靶细胞，并且减低CAR-T细胞的自激活水平，缓解其功能耗竭的情况，使其在持续抗肿瘤作用等方面，更具优势。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

Claims (8)

1.一种靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体的胞外段结构由CD8α信号肽序列、myc标签序列、scFv序列、CD8α链的铰链序列依次串联而构成；跨膜区序列为CD8α链的跨膜区序列；胞内段结构由人41BB分子的胞内段序列，串联人CD3ζ链胞内段序列构成；所述的scFv序列来自于鼠源抗体JOVI.1，其中，所述的鼠源抗体JOVI.1的CDR区移植到人源抗体框架VH1_1-02和VK2_A17。
2.根据权利要求1所述的靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体，其特征在于，所述的scFv包含重链和轻链，人类JH6和JK4分别用于重链和轻链的J区。
3.根据权利要求1所述的靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体，其特征在于，所述的嵌合抗原受体克隆至载体中。
4.一种T细胞，其特征在于，包含：权利要求1至3中任意一项所述的靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述的T细胞，其特征在于，所述的T细胞来自于人外周血单核细胞。
6.根据权利要求4所述的T细胞，其特征在于，所述的T细胞为经磁珠纯化后的T细胞；所述的磁珠包被有TRBC1特异性抗体。
7.根据权利要求6所述的T细胞，其特征在于，所述的T细胞的制备方法包含以下步骤：
(1)将TRBC1抗体结合到磁珠上；
(2)取待纯化的T细胞，与结合有TRBC1抗体的磁珠混合；
(3)置于磁力架上静置后，取上清，获得所述的T细胞。
8.权利要求1至3中任意一项所述的靶向TRBC1的人源化嵌合抗原受体的用途，其特征在于，所述的嵌合抗原受体用于制备靶向性抗肿瘤的药物。
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