CN111879924A - 快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法 - Google Patents
快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及免疫诊断技术领域，针对现有技术的消化道中血红蛋白易被胃蛋白酶破坏导致检测结果不准确的问题，公开了快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白‑血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法，具体包括以下步骤：1）制备第一检测线T和第一质控线C；2）制备第二检测线T和第二质控线C；3）金标垫的制备；4）制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、微球探针处理垫、包被好抗体的改性硝酸纤维素膜及PVC底板按顺序进行连接组装，即得成品。本发明采用血红蛋白+血红蛋白结合珠蛋白复合物联合检测，提高了包括上消化道出血在内的隐血检测的灵敏度，操作简便、快速，结果显示直观、准确，灵敏度高、特异性好，制备工艺简单。
Description
技术领域
本发明涉及免疫诊断技术领域，尤其涉及快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法。
背景技术
粪便中的血红蛋白(Hb,Hemoglobin)又称便隐血(FOB,Fecal Occult Blood)，目前在临床上被看作是诊断直肠癌、结肠癌的肿瘤标志物之一。血红蛋白容易与结合珠蛋白结合形成稳定不可逆的复合物，叫做血红蛋白-结合珠蛋白复合物(Hb-Hp Complex)。凡是消化道疾病引起少量出血的，均可有隐血便，因此隐血检查对于诊断多种消化道出血性疾病都有重要价值，是普查筛选消化道疾病的有效手段，便隐血试验已经成为人们不断深入研究的热点。
免疫层析一步法目前是用抗人血红蛋白抗体来特异性结合人血红蛋白抗原，此法简便、快捷，基本排除了饮食及药物等因素的干扰，被世界卫生组织胃肠镜检查协会推荐作为粪便隐血实验的一种较为确认的方法。血红蛋白极其不稳定，上消化道出血，血红蛋白经过胃部时，易被胃蛋白酶破坏，临床出现漏检情况。
专利号CN201410797586.9，专利名称“用于预测和诊断大肠肿瘤和癌前病变的联合检测试剂盒及其用途”，本发明提供了一种用于预测和/或诊断大肠肿瘤和/或癌前病变的联合检测试剂盒及其用途，该试剂盒包括用于检测来自受试者血液样本中的甲基化的Septin9基因的试剂和工具，和用于检测来自受试者大便样本中血红素和/或血红蛋白的试剂和工具。本发明将两种不同生物学检测机制的检测手段结合在一起，在大肠肿瘤和癌前病变的判读和诊断中产生了协同作用，极大地提高了大肠肿瘤和癌前病变的检出率。
其不足之处在于，上述检测方法中检测血红蛋白，血红蛋白及其不稳定，上消化道出血，血红蛋白经过胃部时，易被胃蛋白酶破坏，临床出现漏检情况检测结果不够准确。
发明内容
本发明是为了克服现有技术的消化道中血红蛋白易被胃蛋白酶破坏导致检测结果不准确的问题，提供快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法，采用血红蛋白+血红蛋白-结合珠蛋白复合物联合检测，提高了包括上消化道出血在内的隐血检测的灵敏度，血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物二合一检测试剂能同时检测上下消化道出血。采用该检测试纸检测具有操作简便、快速，结果显示直观、准确，灵敏度高、特异性好，制造和检测成本低，能广泛应用于基层样品检测，检测效率高，制备工艺简单。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸，包括PVC底板，所述PVC底板依次设有样品垫、金标探针处理垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，PVC底板中间设有硝酸纤维素膜，所述硝酸纤维素膜两端分别设有金标探针处理垫和吸水垫，所述金标探针处理垫和所述吸水垫一端底侧分别连接于所述硝酸纤维素膜的两端，另一端底侧分别与 PVC底板连接；金标探针处理垫与PVC底板连接的一端上侧设有样品垫，所述样品垫一端底侧与金标探针处理垫上侧连接，另一端底侧与PVC底板连接，所述硝酸纤维素膜的非连接段从金标探针处理垫一侧开始依次设有包被鼠抗人结合珠蛋白的检测线T和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C。
产品所运用的原理为胶体金免疫层析、双抗夹心法，当样本中含有血红蛋白或结合珠蛋白-血红蛋白复合物，加样后血红蛋白或结合珠蛋白-血红蛋白复合物会先与标记垫中的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-金标探针结合，形成抗原-抗体复合物，随着层析过程的进行，该复合物会被包被在硝酸纤维素膜上的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体或鼠抗人结合珠蛋白单克隆捕获，形成鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-血红蛋白-鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-金标探针或鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体-结合珠蛋白-血红蛋白复合物-鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-金标探针，颜色呈紫红色，清晰可辨，且不需要任何辅助设备，操作方便。
利用上述的试纸条，可以检测含有血红蛋白和结合珠蛋白-血红蛋白复合物的样本。将样本用试纸条进行检测，当检测线T和质控线C均出现红色条带，说明样本中含有血红蛋白或者结合珠蛋白-血红蛋白复合物；若仅有质控线C出现红色条带，说明样本中不含血红蛋白和结合珠蛋白-血红蛋白复合物或样本中血红蛋白和结合珠蛋白-血红蛋白复合物的含量低于检测值；若质控线C没有出现红色条带，则说明该试纸条失效
作为优选，所述金标探针处理垫为标记鼠抗人血红蛋白抗体-胶体金偶联物的金标垫。
胶体金探针，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的静电结合，并且不影响蛋白质的生物特性。胶体金探针因包括相应的抗体和显色颗粒，因此在整个过程中起到结合和显色的作用，较好的金标探针应粒径大小合适、均匀度好、色彩透明度高。
作为优选，所述检测线T包被的包被用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体浓度为 0.5～2.0mg/ml；所述检测线T包被用鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-2.0mg/ml。
当包被抗体浓度低于0.5mg/ml，反应过程中，样本中血红蛋白被鼠抗人血红蛋白单克隆抗体捕获不充分；或样本中结合珠蛋白-血红蛋白复合物被鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体捕获不充分，临床上出现漏检情况。当包被抗体浓度高于2mg/ml，样本中的杂蛋白在层析过程中会被非特异性捕获，临床上会出现假阳性风险，因此检测线T包被用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体的最佳浓度范围为0.5mg/ml-2mg/ml。
作为优选，所述质控线C包被的羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0～3.0mg/ml。
当质控线包被抗体浓度低于1mg/ml，反应过程中，标记垫中的鼠IgG单克隆抗体-金标偶联物和羊抗鼠多克隆抗体结合不充分，临床上出现质控线偏弱的问题。当质控线包被抗体浓度高于3mg/ml，处理到硝酸纤维素膜上的羊抗鼠多克隆抗体因溢量会出现扩散现象，影响整体美观。因此质控线C包被用羊抗鼠IgG多克隆抗体的最佳浓度范围为1mg/ml-3mg/ml。
所述快速检测血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：
1)制备第一检测线T和第一质控线C：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体稀释后以1.0-1.2ul/cm 的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第一检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第一质控线C，置于36-38℃烘干，得到检测线和质控线；
2)制备第二检测线T和第二质控线C：将鼠抗人结合珠蛋白-血红蛋白复合物单克隆抗体稀释后以1.0-1.2ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第二检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第二质控线C，置于36-38℃烘干，得到检测线和质控线；
3)金标垫的制备：将纯化的金标探针溶液稀释成浓度为OD30-OD70喷点到聚酯纤维膜上并置于鼓风干燥设备处理，制得金标垫；
4)制备检测试纸：将吸水垫(6)、样品垫(1)、金标探针处理垫(2)、包被好抗体的硝酸纤维素膜(5)及PVC底板(7)按顺序进行连接组装，即得成品。
本发明为两个检测试纸联合检测，因此设置了第一检测线T、第一质控线C、制备第二检测线T和第二质控线C。步骤3)中用阳性参考品50ng/ml血红蛋白，100ng/ml血红蛋白，10μg/ml血红蛋白，1mg/ml血红蛋白，50ng/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物，200ng/ml 结合珠蛋白-血红蛋白复合物，2μg/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物和阴性参考品进行测试， 5-10分钟读数结果显示鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-金标偶联物的使用浓度OD30-OD70时，效果最佳。
作为优选，所述纯化的金标抗体的制备过程：
A、获得胶体金：在98-102ml沸腾的0.008-0.012％氯金酸水溶液中加入1.8-2.2ml的0.8-1.2％柠檬酸三钠水溶液，可获得胶体金；
B、标记胶体金：用0.18-0.22mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.4-8.6，将标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记20-25min；
C、纯化金标抗体：向步骤B的标记胶体金溶液中加入质量分数8-12％的BSA水溶液，至BSA的终浓度为0.8-1.2％，后停止加入，继续搅拌25-30min，继续加入8-12％PEG20000至PEG20000终浓度为0.18-0.22％，继续搅拌10-15min，离心，弃上清液，加入复溶液酪蛋白钠溶液，即得纯化金标抗体。
鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-金标偶联物制备过程中，胶体金和抗体的偶联过程尤为重要，由于该产品选择的颗粒粒径偏大，因此在偶联过程中容易出现漂金、死金现象。在反应过程中，加入复溶液可大大降低漂金、死金现象。
作为优选，所述胶体金颗粒直径为40-100nm。
氯金酸通过还原剂柠檬酸三钠反应成一定粒径大小的金颗粒，颗粒大小的不同会影响产品的性能、标记偶联物的稳定性以及标记偶联物的颜色，颗粒大小＜40nm颜色偏红，灵敏度较弱；而颗粒大小＞100nm颜色偏黑，形状不均匀，及其容易沉淀，因此胶体金颗粒粒径为40-100nm最为合适。
作为优选，步骤B中标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体与调整pH后的胶体金的体积比为1:1-1:1.2。
将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体和氯金酸按1:0.5，1:1，1:1.2，1:1.4，1:1.6，1:2.0比例进行偶联，偶联物最终浓缩值均大于OD100，用金标稀释液将偶联物稀释到OD40，并处理到聚酯纤维膜上，真空冷冻烘制过夜(12-24小时)，用阳性参考品50ng/ml血红蛋白，100ng/ml 血红蛋白，10μg/ml血红蛋白，1mg/ml血红蛋白，50ng/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物， 200ng/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物，2μg/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物和阴性参考品进行测试，5-10分钟读数结果显示体积比为1:1-1:1.2结果最佳。
作为优选，步骤C中的离心条件为：离心温度4-6℃，离心转速9900-10000rpm，离心时间30-40min。
蛋白质在2-8℃条件下比较稳定，根据文献金标偶联物离心速度一般定于12000rpm，离心时间约为0.5小时，由于该产品选用的胶体金颗粒粒径大小约为70nm，因此将离心速度控制在9900-10000rpm，离心时间为30-40分钟，效果最佳。
作为优选，步骤C中所述复溶液酪蛋白钠溶液的加入量占标记总体积的34-36％。
因此，本发明具有如下有益效果：
(1)提供一种快速检测血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸，制备出利用抗体检测试纸检测抗原的产品，检测时间短，仅需5-10min，能够满足现场检测的需要；
(2)血红蛋白及其不稳定，上消化道出血，血红蛋白经过胃部时，易被胃蛋白酶破坏，临床出现漏检情况。结合珠蛋白-血红蛋白复合物相对较为稳定，不易被胃蛋白酶破坏，因此开发的血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物二合一检测试剂能同时检测上下消化道出血；
(3)操作简便，不需要借助其他设备仪器；检测结果显示直观，肉眼就可判断，适合个人使用；检测效率高，检测结果更直接，避免了抗体潜伏期所带来的检测误差；
(4)和各类动物血红蛋白如牛血红蛋白、猪血红蛋白、羊血红蛋白、兔血红蛋白等不存在交叉，因此可明显降低临床假阳性，减少相关物质的干扰；
(5)制备工艺简单，检测试纸条可在常温下保存，无需特殊的设备仪器，只需保持试纸条干燥即可，保存期可达2年。
附图说明
图1是本发明的试纸结构示意图。
图2是本发明的试纸检测窗口结构示意图。
图中：1、样品垫，2、标记布鲁氏菌抗体-胶体金的金标垫，3、包被布鲁氏菌抗体的检测线T，4、包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C，5、硝酸纤维素膜，6、吸水垫，7、PVC底板。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明做进一步的描述。
一种快速诊断布鲁氏菌病的胶体金免疫层析检测试纸，包括PVC底板7，所述PVC底板7依次设有样品垫1、微球探针处理垫2、硝酸纤维素膜5和吸水垫6，PVC底板7中间设有硝酸纤维素膜5，所述硝酸纤维素膜5两端分别设有微球探针处理垫2和吸水垫6，所述微球探针处理垫2和所述吸水垫6一端底侧分别连接于所述硝酸纤维素膜5的两端，另一端底侧分别与PVC底板7连接；微球探针处理垫2与PVC底板7连接的一端上侧设有样品垫1，所述样品垫1一端底侧与微球探针处理垫2上侧连接，另一端底侧与PVC底板7连接，所述硝酸纤维素膜5的非连接段从微球探针处理垫2一侧开始依次设有包被鼠抗布鲁氏菌抗体的检测线T3和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C 4。
鼠抗人血红蛋白单克隆抗体的制备：(1)用抗原免疫八周龄的BALB/C小鼠，进行皮下注射，每隔三周注射一次，共免疫五次，采血用ELISA测抗体效价，效价可以，再融合前三天加强注射；(2)细胞融合与培养：超强免疫3d的小鼠，脱颈致死小鼠，无菌手术取出脾脏制备脾细胞，与SP2/0细胞在PEG作用下进行细胞融合，将融合后的细胞悬液加到细胞培养板上，置37℃,5％CO 2培养箱中以HAT、HT培养基选择培养；(3)细胞筛选：用间接竞争E LISA筛选阳性孔，对强阳性、细胞生长旺盛的孔进行三次有限稀释克隆化；(4)腹水单克隆抗体的生产：取小鼠六只，腹腔注射石蜡，2.5ml/只，10d后再注射克隆化杂交瘤细胞株，12d后抽取腹水，以辛酸一硫酸铵盐析法提纯抗体，紫外吸收法测定其浓度。
鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体的制备：(1)用抗原免疫八周龄的BALB/C小鼠，进行皮下注射，每隔三周注射一次，共免疫五次，采血用ELISA测抗体效价，效价可以，再融合前三天加强注射；(2)细胞融合与培养：超强免疫3d的小鼠，脱颈致死小鼠，无菌手术取出脾脏制备脾细胞，与SP2/0细胞在PEG作用下进行细胞融合，将融合后的细胞悬液加到细胞培养板上，置37℃，5％CO2培养箱中以HAT、HT培养基选择培养；(3)细胞筛选：用间接竞争E LISA筛选阳性孔，对强阳性、细胞生长旺盛的孔进行三次有限稀释克隆化；(4)腹水单克隆抗体的生产：取小鼠六只，腹腔注射石蜡，2.5ml/只，10d后再注射克隆化杂交瘤细胞株，12d后抽取腹水，以辛酸一硫酸铵盐析法提纯抗体，紫外吸收法测定其浓度。
粪便收集液的制备：25-45g/L螯合剂、0.2-1g/L防腐剂、1-10g/L封闭剂、6-12g/L缓冲剂、25-30g/L聚乙二醇用水混合，调整最终pH＝9.4。
用于收集并保存人体所排出粪便，防止血红蛋白变质。粪便收集液的制备为关键技术，粪便中的血红蛋白非常不稳定，低浓度血红蛋白常温下放置超过8小时，临床上会出现漏检的风险，即使高浓度血红蛋白常温下放置3天，灵敏度下降也会非常明显。基于此技术难点，我司通过不断研究，开发出一种粪便收集液，可以稳定保存血红蛋白达一周时间，大大提高临床检出率，放置漏检，且便于患者、医生对于粪便样本的运输。
实施例1
所述快速检测人血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：
1)制备第一检测线T和第一质控线C：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体稀释后以1.0-1.2ul/cm 的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第一检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第一质控线C，置于36℃烘干，得到检测线和质控线；所述检测线T包被的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体浓度为0.5mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/ml；
2)制备第二检测线T和第二质控线C：将鼠抗人结合珠蛋白-血红蛋白复合物单克隆抗体稀释后以1.0ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第二检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第二质控线C，置于36℃烘干，得到检测线和质控线；鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体浓度为0.5mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0mg/ml；
3)金标垫的制备：将纯化的金标抗体稀释后浓度为OD30时包被于玻纤垫上置于冷冻干燥机处理，制得金标垫；所述纯化的金标抗体的制备过程：A、获得胶体金：在98ml沸腾的0.008％氯金酸水溶液中加入1.8ml的0.8％柠檬酸三钠水溶液，获得直径为70nm的胶体金；B、标记胶体金：用0.18mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.4，将浓度为5mg/ml的标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记用鼠抗人血红蛋白抗体与调整pH后的胶体金的体积比1:1，标记20min，得到鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-胶体金偶联物；C、纯化金标抗体：向步骤B的标记胶体金溶液中加入质量分数8％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为0.8％，后停止加入，继续搅拌25min，继续加入8％PEG20000至PEG20000终浓度为0.18％，继续搅拌10min，4℃、9900rpm离心30min，弃上清液，加入占标记总体积的34％的酪蛋白钠溶液，即得纯化金标抗体；
4)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、金标探针处理垫、包被好抗体的硝酸纤维素膜及PVC 底板按顺序进行连接组装，即得两条检测试纸联合检测的组合试纸。
实施例2
所述快速检测人血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：
1)制备第一检测线T和第一质控线C：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体稀释后以1.15ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第一检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第一质控线C，置于36.5℃烘干，得到检测线和质控线；所述检测线T包被的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体浓度为0.8mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为1.5mg/ml；
2)制备第二检测线T和第二质控线C：将鼠抗人结合珠蛋白-血红蛋白复合物单克隆抗体稀释后以1.0-1.2ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第二检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第二质控线C，置于36.5℃烘干，得到检测线和质控线；鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体浓度为0.8mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为1.5mg/ml；
3)金标垫的制备：将纯化的金标抗体稀释后浓度为OD40时包被于玻纤垫上置于冷冻干燥机处理，制得金标垫；所述纯化的金标抗体的制备过程：A、获得胶体金：在99ml沸腾的0.009％氯金酸水溶液中加入1.9ml的0.9％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为60nm的胶体金；B、标记胶体金：用0.19mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.5，将浓度为5mg/ml的标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记用鼠抗人血红蛋白抗体与调整pH后的胶体金的体积比1:1.1，标记22min，得到鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-胶体金偶联物；C、纯化金标抗体：向步骤B的标记胶体金溶液中加入质量分数9％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为0.9％，后停止加入，继续搅拌26min，继续加入9％PEG20000至PEG20000终浓度为0.19％，继续搅拌11min，4.5℃、9920rpm离心32min，弃上清液，加入占标记总体积的34.5％的酪蛋白钠溶液，即得纯化金标抗体；
4)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、金标探针处理垫、包被好抗体的硝酸纤维素膜及PVC 底板按顺序进行连接组装，即得两条检测试纸联合检测的组合试纸。
实施例3
所述快速检测人血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：
1)制备第一检测线T和第一质控线C：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体稀释后以1.1ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第一检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第一质控线C，置于37℃烘干，得到检测线和质控线；所述检测线T包被的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体浓度为1.2mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为2mg/ml；
2)制备第二检测线T和第二质控线C：将鼠抗人结合珠蛋白-血红蛋白复合物单克隆抗体稀释后以1.1ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第二检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第二质控线C，置于37℃烘干，得到检测线和质控线；鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体浓度为1.5mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为2mg/ml；
3)金标垫的制备：将纯化的金标抗体稀释后浓度为OD50时包被于玻纤垫上置于冷冻干燥机处理，制得金标垫；所述纯化的金标抗体的制备过程：A、获得胶体金：在100ml沸腾的0.010％氯金酸水溶液中加入2.0ml的1.0％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为60nm的胶体金；B、标记胶体金：用0.2mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.5，将浓度为5mg/ml的标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记用鼠抗人血红蛋白抗体与调整pH后的胶体金的体积比1:1.1，标记22min，得到鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-胶体金偶联物；C、纯化金标抗体：向步骤B的标记胶体金溶液中加入质量分数10％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1％，后停止加入，继续搅拌28min，继续加入10％PEG20000至PEG20000终浓度为0.2％，继续搅拌12min，5℃、9950rpm离心35min，弃上清液，加入占标记总体积的35％的酪蛋白钠溶液，即得纯化金标抗体；
4)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、金标探针处理垫、包被好抗体的硝酸纤维素膜及PVC 底板按顺序进行连接组装，即得两条检测试纸联合检测的组合试纸。
实施例4
所述快速检测人血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：
1)制备第一检测线T和第一质控线C：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体稀释后以1.15ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第一检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第一质控线C，置于37.5℃烘干，得到检测线和质控线；所述检测线T包被的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体浓度为1.8mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为2.5mg/ml；
2)制备第二检测线T和第二质控线C：将鼠抗人结合珠蛋白-血红蛋白复合物单克隆抗体稀释后以1.15ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第二检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第二质控线C，置于37℃烘干，得到检测线和质控线；鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体浓度为1.5mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为2.5mg/ml；
3)金标垫的制备：将纯化的金标抗体稀释后浓度为OD60时包被于玻纤垫上置于冷冻干燥机处理，制得金标垫；所述纯化的金标抗体的制备过程：A、获得胶体金：在101ml沸腾的0.01％氯金酸水溶液中加入2.1ml的1.0％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为80nm的胶体金；B、标记胶体金：用0.21mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.5，将浓度为5mg/ml的标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记用鼠抗人血红蛋白抗体与调整pH后的胶体金的体积比1:1.1，标记24min，得到鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-胶体金偶联物；C、纯化金标抗体：向步骤B的标记胶体金溶液中加入质量分数11％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1.1％，后停止加入，继续搅拌28min，继续加入11％PEG20000至PEG20000终浓度为0.21％，继续搅拌14min，5℃、9980rpm离心38min，弃上清液，加入占标记总体积的35.5％的酪蛋白钠溶液，即得纯化金标抗体；
4)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、金标探针处理垫、包被好抗体的硝酸纤维素膜及PVC 底板按顺序进行连接组装，即得两条检测试纸联合检测的组合试纸。
实施例5
所述快速检测人血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，具体包括以下步骤：
1)制备第一检测线T和第一质控线C：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体稀释后以1.2ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第一检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第一质控线C，置于38℃烘干，得到检测线和质控线；所述检测线T包被的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体浓度为2.0mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为3.0mg/ml；
2)制备第二检测线T和第二质控线C：将鼠抗人结合珠蛋白-血红蛋白复合物单克隆抗体稀释后以1.2ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第二检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第二质控线C，置于38℃烘干，得到检测线和质控线；鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体浓度为2.0mg/ml，羊抗鼠IgG抗体浓度为3.0mg/ml；
3)金标垫的制备：将纯化的金标抗体稀释后浓度为OD70时包被于玻纤垫上置于冷冻干燥机处理，制得金标垫；所述纯化的金标抗体的制备过程：A、获得胶体金：在102ml沸腾的0.012％氯金酸水溶液中加入2.2ml的1.2％柠檬酸三钠水溶液，可获得直径为40-100nm的胶体金；B、标记胶体金：用0.22mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.6，将浓度为5mg/ml的标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记用鼠抗人血红蛋白抗体与调整pH后的胶体金的体积比1:1.2，标记25min，得到鼠抗人血红蛋白单克隆抗体-胶体金偶联物；C、纯化金标抗体：向步骤B的标记胶体金溶液中加入质量分数12％的BSA(牛血清白蛋白)水溶液，至BSA的终浓度为1.2％，后停止加入，继续搅拌30min，继续加入 12％PEG20000至PEG20000终浓度为0.22％，继续搅拌15min，6℃、10000rpm离心40min，弃上清液，加入占标记总体积的36％的酪蛋白钠溶液，即得纯化金标抗体；
4)制备检测试纸：将吸水垫、样品垫、金标探针处理垫、包被好抗体的硝酸纤维素膜及PVC 底板按顺序进行连接组装，即得两条检测试纸联合检测的组合试纸。
对比例1
与实施例3的区别在于，鼠抗人血红蛋白抗体-胶体金偶联物的直径过小为20nm。
对比例2
与实施例3的区别在于，省去了步骤2)中纯化金标抗体的步骤。
对比例3
与实施例3的区别在于，将复溶液Casein-Na(酪蛋白钠溶液)换成Casein(酪蛋白溶液)。
对比例4
与实施例3的区别在于，将最终离心速度降至5500r/min，离心0.4小时。
对比例5
与实施例3的区别在于，粪便收集液换成普通的缓冲液。
灵敏度试验，分别阳性参考品50ng/ml血红蛋白，100ng/ml血红蛋白，10μg/ml血红蛋白，1mg/ml血红蛋白，50ng/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物，200ng/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物，2μg/ml结合珠蛋白-血红蛋白复合物和阴性参考品进行测试，每个浓度设定重复三次，检测结果完全一致，证明本发明试纸条检测结果稳定可靠。
稳定性试验采用加速稳定性试验，将同一批次的试纸条分别置于45℃和55℃烘箱，并以下表的时间段分别用上述标准品进行检测。
实施例1-5，对比例1-5所得成品的测试结果见表1。
表1各项目与胶体金免疫层析检测试纸相关性能评价指标
结论分析：实施例1-5均能制备出检测灵敏度高、检测结果准确、使用周期长的胶体金免疫层析检测试纸。
对比例1-5与实施例3相比较，对比例1中鼠抗人血红蛋白抗体-胶体金偶联物的直径过小为20nm。抗体和胶体金的偶联方式为物理吸附，粒径过小的胶体金虽然稳定，但是其表面吸附的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体的数量有限，影响产品的灵敏度。
对比例2中省去了步骤2)中纯化金标抗体的步骤。在标记过程中，因杂蛋白的干扰，可能会出现临床假阳性风险。
对比例3中步骤C中将复溶液Casein-Na(酪蛋白钠溶液)换成Casein(酪蛋白溶液)， PH值由7.4提高到8。在反应过程中，加入复溶液可大大降低漂金、死金现象；若将复溶液酪蛋白钠溶液换成酪蛋白溶液，该产品所用胶体金粒径胶体，在标记过程容易出现漂金、死金，且标记好的金标偶联物颜色偏黑，临床容易出现假阳性。
对比例4中将最终离心速度降至5500r/min，离心0.4小时。离心速度偏慢，时间偏短，离心不充分，金标偶联物的浓缩值偏低，部分有效成分未被收集，灵敏度偏弱。
对比例5中检测时将粪便收集液换成普通的缓冲液。血红蛋白极其不稳定，常温放置很容易导致检测灵敏度下降，粪便收集液是专属配方，可以明显稳定血红蛋白，常温下可保存7天，若将粪便收集液换成普通的缓冲液，则导致检测灵敏度下降。
如图2所示，滴加阳性标准品后，试纸检测线显色，滴加阴性样品后，试纸检测线不显色。血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物二合一检测试剂盒采用双窗口模式，同一份样本需要加到两个不同的加样孔，读数结果需要观察两个窗口。由于血红蛋白检测试剂和结合珠蛋白-血红蛋白复合物检测试剂所用的标记原料一样，因此无法做到同一试纸条上。
临床样本验证
发明人收集100例消化道出血的粪便样本，利用本发明制备的胶体金试纸条进行检测，检测结果显示，例均显示95例血红蛋白阳性，2例结合珠蛋白-血红蛋白复合物阳性，40例两者同时阳性。与国外已上市Alere对照试剂结果完全一致，证明本发明的试纸条结果可靠，特异性强，操作简便、快速，而且可以不用借助任何设备就能进行临床样本的检测，检测结果显示直观、准确。由实施例1-5以及对比例1-5的数据可知，只有在本发明权利要求范围内的方案，才能够在各方面均能满足上述要求，得出最优化的方案，得到最优的性能的胶体金免疫层析检测试纸。而对于配比的改动、原料的替换/加减，或者加料顺序的改变，均会带来相应的负面影响。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。
Claims (10)
1.快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，包括PVC底板（7），所述PVC底板（7）依次设有样品垫（1）、金标探针处理垫（2）、硝酸纤维素膜（5）和吸水垫（6），PVC底板（7）中间设有硝酸纤维素膜（5），所述硝酸纤维素膜（5）两端分别设有金标探针处理垫（2）和吸水垫（6），所述金标探针处理垫（2）和所述吸水垫（6）一端底侧分别连接于所述硝酸纤维素膜（5）的两端，另一端底侧分别与PVC底板（7）连接；金标探针处理垫（2）与PVC底板（7）连接的一端上侧设有样品垫（1），所述样品垫（1）一端底侧与金标探针处理垫（2）上侧连接，另一端底侧与PVC底板（7）连接，所述硝酸纤维素膜（5）的非连接段从金标探针处理垫（2）一侧开始依次设有包被鼠抗人结合珠蛋白的检测线T（3）和包被羊抗鼠IgG抗体的质控线C（4）。
2.根据权利要求1所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，所述金标探针处理垫（2）为标记鼠抗人血红蛋白抗体-胶体金偶联物的金标垫。
3.根据权利要求1所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，所述检测线T（3）包被的包被用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体浓度为0.5~2.0mg/ml；所述检测线T包被用鼠抗人结合珠蛋白单克隆抗体的浓度为0.5-2.0mg/ml。
4.根据权利要求1所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸，其特征是，所述质控线C（4）包被的羊抗鼠IgG抗体浓度为1.0~3.0mg/ml。
5.如权利要求1-4任一所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是，具体包括以下步骤：
1）制备第一检测线T和第一质控线C：将鼠抗人血红蛋白单克隆抗体稀释后以1.0-1.2ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第一检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第一质控线C，置于36-38℃烘干，得到检测线和质控线；
2）制备第二检测线T和第二质控线C：将鼠抗人结合珠蛋白-血红蛋白复合物单克隆抗体稀释后以1.0-1.2ul/cm的速度喷点于硝酸纤维素膜上作为第二检测线T，羊抗鼠IgG抗体溶液稀释后喷点于硝酸纤维素膜上作为第二质控线C，置于36-38℃烘干，得到检测线和质控线；
3）金标垫的制备：将纯化的金标抗体溶液稀释成浓度为OD30-OD70喷点到聚酯纤维膜上并置于鼓风干燥设备处理，制得金标垫；
4）制备检测试纸：将吸水垫（6）、样品垫（1）、金标探针处理垫（2）、包被好抗体的硝酸纤维素膜（5）及PVC底板（7）按顺序进行连接组装，即得成品。
6.根据权利要求5所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是，所述纯化的金标抗体的制备过程：
A、获得胶体金：在98-102ml沸腾的0.008-0.012%氯金酸水溶液中加入1.8-2.2ml的0.8-1.2%柠檬酸三钠水溶液，可获得胶体金；
B、标记胶体金：用0.18-0.22 mol/L的K2CO3溶液调节上述胶体金的pH至8.4-8.6，将标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体加入到调整pH后的胶体金中，标记20-25min；
C、纯化金标抗体：向步骤B的标记胶体金溶液中加入质量分数8-12％的BSA水溶液，至BSA的终浓度为0.8-1.2％，后停止加入，继续搅拌25-30min，继续加入8-12％PEG20000至PEG20000终浓度为0.18-0.22％，继续搅拌10-15min，离心，弃上清液，加入复溶液酪蛋白钠溶液，即得纯化金标抗体。
7.根据权利要求6所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是，所述胶体金颗粒直径为40-100nm。
8.根据权利要求7所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是，步骤B中标记用鼠抗人血红蛋白单克隆抗体与调整pH后的胶体金的体积比为1:1-1:1.2。
9.根据权利要求7所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是，步骤C中的离心条件为：离心温度4-6℃，离心转速9900-10000rpm，离心时间30-40min。
10.根据权利要求7所述快速诊断血红蛋白、结合珠蛋白-血红蛋白复合物的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征是，步骤C中所述复溶液酪蛋白钠溶液的加入量占标记总体积的34-36%。
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