CN111848765B

CN111848765B - 水稻基因OsFBK4及其突变体与应用

Info

Publication number: CN111848765B
Application number: CN202010719983.XA
Authority: CN
Inventors: 张迎信; 曹立勇; 沃凯·安力; 吴玮勋; 陈代波; 程式华; 沈希宏; 占小登; 刘群恩
Original assignee: China National Rice Research Institute
Current assignee: China National Rice Research Institute
Priority date: 2020-07-22
Filing date: 2020-07-22
Publication date: 2021-10-08
Anticipated expiration: 2040-07-22
Also published as: CN111848765A

Abstract

本发明公开了水稻基因OsFBK4及其突变体与应用。本发明分离克隆了与植物株型生长发育相关的水稻基因OsFBK4，其核苷酸序列、cDNA序列及编码的蛋白质序列分别如SEQ ID NO：1‑3所示。在水稻半矮杆突变体RE9586中，该基因在第3外显子发生一个单碱基突变(基因组DNA 2626bp处A突变为G)。本发明通过基因敲除实验和过表达实验在水稻中验证了基因OsFBK4的功能，功能丧失型突变导致水稻植株变矮，过表达该基因可导致水稻株高变高。本发明为深入了解植物株高调节机理和水稻株型育种提供了新的基因资源。

Description

水稻基因OsFBK4及其突变体与应用

技术领域

本发明涉及基因工程和植物遗传育种领域，具体地说，涉及水稻基因OsFBK4及其突变体与应用。

背景技术

水稻是世界上主要的粮食作物之一。株高作为水稻重要的农艺性状之一，通过直接影响植株的抗倒伏性而影响水稻的产量。株高过高抗倒伏性差，会导致水稻产量下降；过矮的水稻植株虽然抗倒伏能力比较强，但是其生长量会不足，也会导致水稻产量降低。上世纪50年代基于半矮杆基因sd1的矮化育种兴起的绿色革命是水稻单产的一次重要飞跃式提升(Peng et al.，1999)，然而目前应用的半矮杆基因资源仍然非常狭窄，主要为sdl及其等位基因。因此挖掘新的矮杆或半矮杆基因资源仍然是水稻遗传育种研究中的一个重要方向，具有重要的实际应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供水稻基因OsFBK4及其突变体与应用。从水稻中恢8015的诱变植株中克隆得到

本发明的另一目的是提供与水稻基因OsFBK4共分离的SNP分子标记及其应用。

本发明构思如下：发明人从甲磺酸乙酯(EMS)诱变的籼稻品种中恢8015(ZH8015，WT)中鉴定出一个新的半矮杆突变体RE9586，成熟期其株高显著低于野生型中恢8015，扫描电镜观察结果表明，突变体RE9586最顶端节间细胞的纵向长度明显减少，这很有可能是引起其半矮化表型的主要原因。进一步从水稻中分离到一个控制该表型的新基因OsFBK4(LOC_Os02g11790或Os02g0208700)，其编码一个含F-BOX结构域和Kelch重复的蛋白。在突变体RE9586中，该基因在第3外显子发生一个单碱基突变(基因组DNA 2626bp处或cDNA1240bp处A突变为G)，导致其编码蛋白氨基酸序列中精氨酸突变为甘氨酸。利用CRISPR/Cas9系统将OsFBK4敲除，转基因株系显示出株高较矮，而OsFBK4过表达株系则株高显著增加，说明OsFBK4负责突变体RE9586半矮化表型，且对水稻株高存在正调控作用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供从水稻‘中恢8015’中克隆得到的基因OsFBK4(水稻半矮秆基因)，其为编码如下蛋白质A)或B)的基因：

A)由SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

B)SEQ ID NO：3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由A)衍生的蛋白质。

优选地，基因OsFBK4的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。

进一步地，本发明提供用于扩增基因OsFBK4的特异性PCR引物对，其上、下游引物序列分别如SEQ ID NO：5-6所示。

用于扩增基因OsFBK4 cDNA序列的特异性PCR引物对，其上、下游引物序列分别如SEQ ID NO：7-8所示。

第二方面，本发明提供含有基因OsFBK4的生物材料。

本发明中，所述生物材料包括但不限于重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、工程菌或非可再生的植物部分。

第三方面，本发明提供所述基因OsFBK4或含有该基因的所述生物材料的以下任一应用：

(1)控制植物株高(正调控)；

(2)控制植物产量性状(正调控)；

(3)用于植物品种改良(包括株型改良)；

(4)用于制备转基因植物。

本发明中，所述植物为禾本科植物，优选稻属植物，更优选水稻。

所述产量性状包括但不限于分蘖数、千粒重、粒厚、单株粒数、结实率和穗密。

第四方面，本发明提供一种降低水稻株高的方法，包括：利用基因工程手段，敲除水稻中的基因OsFBK4。例如，利用基因编辑技术创制OsFBK4基因的突变体，从而在水稻的基因OsFBK4中引入功能缺失型突变。

优选地，所述方法包括：以基因OsFBK4为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体(如商品化CRISPR/Cas载体BGK03)中，转化水稻，进而获得该基因功能缺失的转基因水稻。

更优选地，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GCCACTTCCTCCGGTAGCCC-3’和5’-GGCCCGGCTAACAAGTACGC-3’。

在本发明的一个具体实施方式中，通过构建CRISPR/Cas9基因敲除载体后转化野生型中恢8015，转基因植株变矮。可用于在水稻株型育种中降低水稻的株高。

第五方面，本发明提供一种增加水稻株高的方法，包括：利用基因工程手段，增强水稻中的基因OsFBK4(功能增强或表达量上升)。

所述增强的途径可以选自下述1)～5)，或任选的组合：

1)通过导入具有所述基因的质粒而增强(使水稻包含携带基因OsFBK4的过表达载体，例如构建pCAMBIA2300-OsFBK4过表达载体)；

2)通过增加水稻染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3)通过改变水稻染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5)通过导入增强子而增强。

优选地，在植物中过表达OsFBK4基因创制过表达植株。在本发明的一个具体实施方式中，构建pCAMBIA2300-OsFBK4过表达载体后转化突变体RE9586，转基因植株变高。可用于在水稻株型育种中增加水稻的株高。

本发明中，携带有目的基因的表达载体可通过使用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电穿孔等常规生物技术方法导入植物细胞中(Weissbach，1998，Methodfor Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463页；Geiserson和Corey，1998，Plant Molecular Biology，2^nd Edition)。

第六方面，本发明提供按照上述方法获得的转基因水稻在植物育种中的应用。

优选地，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

第七方面，本发明提供水稻基因OsFBK4突变体，其为编码如下蛋白质a)或b)的基因：

a)由SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或

b)SEQ ID NO：4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由a)衍生的蛋白质。

第八方面，本发明提供所述基因OsFBK4突变体或含有该突变体的生物材料的以下任一应用：

(1)负调控植物株高；

(2)负调控植物产量性状；

(3)用于植物品种改良；

(4)用于制备转基因植物。

第九方面，本发明提供一种与水稻基因OsFBK4共分离的SNP分子标记，所述SNP分子标记含有水稻基因OsFBK4如SEQ ID NO：1所示序列第2626bp处的多态性为A/G的核苷酸序列。该位点为G的水稻植株的株高显著低于该位点为A的水稻植株。

优选地，所述SNP分子标记的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，其中第257位碱基n为t或c。

第十方面，本发明提供所述SNP分子标记或其检测试剂的以下任一应用：

(1)用于水稻株高的鉴定；

(2)用于水稻株高的早期预测；

(3)用于水稻基因OsFBK4的基因分型；

(4)用于水稻种质资源鉴定或分子标记辅助育种。

所述检测试剂包括用于检测所述SNP分子标记的引物。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明分离克隆了与植物株型生长发育相关的水稻基因OsFBK4，并通过基因敲除实验和过表达实验在水稻中验证了基因OsFBK4的功能，功能丧失型突变导致水稻植株变矮，过表达该基因可导致水稻株高变高。该半矮秆基因可应用于水稻品种的改良。本发明为植物(特别是水稻)株型育种提供了新的基因资源，对水稻株型改良和植物生长发育的调控机制研究具有重要意义，对于深入了解植物株高调节机理起着至关重要的作用。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中野生型中恢8015(左)和突变体RE9586(右)的表型特征。其中，A：中恢8015和RE9586成熟期的形态特征；标尺＝20cm。B和C：穗长；标尺＝1cm。D：籽粒表型；标尺＝5mm。E：穗长和不同的节间长度。F：节间长度表型。标尺＝2m。G：第1节间纵切面；标尺＝50μm。H：中恢8015和RE9586第一节间纵切面细胞长度和细胞宽度的统计；**表示t检验p＜0.01水平下有显著性差异。

图2为本发明较佳实施例中野生型中恢8015(ZH8015)和突变体RE9586突变体农艺、产量性状比较。其中，A：Plant height，株高；B：Effective tiller，有效分蘖；C：Panicle length，穗长；D：Grain number per panicle，穗粒数；E：Seed seeting，结实率；F：Grain yield per plant，单株产量；G：Number of filled seeds，实粒数；H：Number ofprimary branch，一次枝梗；I：Number of secondary branch，二次枝梗；J：Unfilledseed，瘪粒数；K：Panicle density，穗着粒密度；L：TGW，千粒重；M：Thickness，粒厚；N：Grain length，粒长；O：Grain width，粒宽；P：Grain length width ratio，粒长宽比；*，**表示显著性水平分别为t检验p＜0.05和p＜0.01水平下差异显著。

图3为本发明较佳实施例中OsFBK4(LOC-Os02g11790)基因结构及序列分析。其中，A：LOC_Os02g11790的基因结构。B：中恢8015和RE9586的OsFBK4基因处基因组突变位点的比对。C：中恢ZH8015和RE9586的OsFBK4突变位点处蛋白质序列比对。D：连锁分析验证OsFBK4的基因组DNA突变位点。E：酶切验证RE9586中OsFBK4基因组DNA的突变位点。箭头表示RE9586突变体中OsFBK4的突变；ATG和TAG分别表示翻译起始密码子和终止密码子。Arg和Gly分别代表精氨酸和甘氨酸。

图4为本发明较佳实施例中利用CRISPR/Cas9进行基因敲除验证OsFBK4的功能。其中，A：OsFBK4基因目标敲除位点设计的示意图。B：在T₀代转基因植株中检测到的纯合突变植株Cas9-1及其序列；以浅蓝色基底突出显示的是原间隔基序邻接基序(PAM)，PAM处为突变检测到的位点。C和D：野生型(左)、突变体RE9586(中)和敲除突变体Cas9-1(右)的株高表型。标尺＝10cm。E：野生型、突变体RE9586和敲除突变体Cas9-1株高差异分析。F：野生型、突变体RE9586和敲除突变体Cas9-1中OsFBK4基因表达量差异显著性分析。平均值±标准差(n＝3)。图中字母表示多重比较试验，a、b、c表示p＜0.01。相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著。

图5为本发明较佳实施例中过表达OsFBK4的表型和表达量分析结果。其中，A：苗期野生型、突变体RE9586和和过表达植株(OE)的形态。标尺＝10cm。B：分蘖期野生型、突变体RE9586和和过表达植株的形态。标尺＝10cm。C：野生型、突变体RE9586和过表达植株中OsFBK4的表达水平。平均值±标准差(n＝3)。图中字母表示多重比较试验，a、b、c表示p＜0.01显著水平，不同字母表示差异显著。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW，Molecular Cloning：a LaboratoryManual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1水稻基因OsFBK4的获得

1、突变体株高表型：从甲磺酸乙酯诱变的籼稻品种中恢8015(ZH8015，WT)中鉴定出一个新的半矮杆突变体RE9586，成熟期其株高显著低于WT。在成熟期，RE9586植株的株高低于野生型(图1)，野生植物的平均值为124.03cm，而RE9586株高为92.4cm，为野生植物高度的74.5％(图2)。为了探讨节间数和节间长是导致RE9586突变体半矮化表型的主要原因，对两个亲本的节间数和节间长进行了比较。除第四节间外，所有节间均短于WT(图1)。但双亲间节间数不显著。值得注意的是，突变体RE9586穗下最上部节间的长度显著减少。以上结果表明，导致RE9586突变体半矮化表型的主要原因是最上部节间长度的缩短。扫描电镜观察结果表明，突变体RE9586最顶端节间细胞的纵向长度明显减少，这很有可能是引起其半矮化表型的主要原因。

2、突变体农艺及产量性状：与野生型相比，RE9586的千粒重和粒厚显著降低(图2)，野生型的千粒重为33.51g，而RE9586为28.49g；野生型和RE9586籽粒的平均厚度分别为1.99mm和1.89mm(图2)。WT和RE9586籽粒长度、宽度和长宽比上没有显著差异(图2)。突变体RE9586植株的穗长明显短于野生型，而初生穗分枝数没有显著差异(图2)。此外与野生型相比，RE9586突变体的二级穗分枝数明显减少，表明OsFBK4突变影响了穗的大小(图2)。并且，RE9586的有效分蘖数、每穗粒数、实粒数、结实率和穗密显著低于野生型，而野生稻的未结实种子明显少于RE9586(图2，J)。由此可见，OsFBK4突变对结实率有一定的影响，突变体RE9586单株粒数较低的原因是穗长减少，二次穗分枝数减少(未见前人报道)，未灌浆粒数较多。

3、水稻基因OsFBK4的克隆

从水稻‘中恢8015’中克隆得到基因OsFBK4(LOC_Os02g11790)，全长2927bp，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，cDNA序列如SEQ ID NO：2所示。基因OsFBK4含有3个外显子，编码的多肽由429个氨基酸残基组成(SEQ ID NO：3)，分子量为45.7KD。对野生型中恢8015和突变体RE9586的基因组DNA序列分析表明，LOC_02g11790的基因组DNA 2626bp处或cDNA1240bp处存在A到G的单核苷酸替换，导致第414个氨基酸残基发生精氨酸(AGA)到甘氨酸(GGA)的错义突变(图3，A-C)。该基因编码参与赤霉素信号传导的F-box结构域和kelch重复序列，可能是导致RE9586突变株半矮秆表型的潜在候选基因，将该基因命名为OsFBK4。对8个分离群体中出现的突变体表型的单株进行测序和序列比对发现，所有的等位基因都与突变体RE9586 CDS中1240位的等位突变相同，表明所有隐性突变个体存在完全的共分离(图3，D)。

进一步开发出一个带有Hind-III限制性位点的dCAPS标记，结果显示突变体RE9586中目标基因位点处Hind-III限制性位点的265bp片段(该片段位于基因OsFBK4第2384～2648bp，SEQ ID NO：9)，RE9586消化为24bp和241bp片段，而野生型缺乏Hind III限制位点未被消化(图3，E)，这表明LOC_Os02g11790的第3外显子中1240 CDS位置处存在A到G的转换。

实施例2水稻基因OsFBK4的功能

1、利用基因敲除技术验证OsFBK4的功能

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在LOC_Os02g11790的第一个外显子处敲除OsFBK4基因(图4，A)。具体方法如下：

1)sgRNA的设计

sgRNA1作用位点的核苷酸序列为5’-GCCACTTCCTCCGGTAGCCC-3’，sgRNA2作用位点的核苷酸序列为5’-GGCCCGGCTAACAAGTACGC-3’。

2)打靶载体的构建

将含有编码sgRNA1、sgRNA2序列的DNA片段构建到同一CRISPR/Cas载体BGK03中(CRISPR/Cas载体BGK03购自百格基因科技(江苏)有限公司)，构建得到打靶载体，命名为SK-gRNA-pC1300cas9。

3)转基因水稻的制备

采用农杆菌介导的转化方法，将打靶载体SK-gRNA-pC1300cas9转化入野生型水稻中恢8015中。根据T₀植株的测序结果，获得两个插入1bp的纯合敲除个体(纯合突变效率12.5％)，命名为Cas9-1和Cas9-2(图4，B)，分别导致起始密码子下游24bp和234bp的移码突变。转基因植株的株高均比野生株矮，但与突变体RE9586相比没有显著差异(图4，C-E)。采用qRT-PCR技术检测基因敲除植株的转录水平，结果表明RE9586与基因敲除的转基因植株在表达上没有差异，但均高于野生型中恢8015(图4，F)。以上结果表明OsFBK4基因的功能破坏导致了植物的半矮秆表型，OsFBK4是一个正调控株高的基因。

2、利用基因过表达实验验证基因OsFBK4的功能

为进一步验证OsFBK4具有调控水稻株高发育的功能，又创制了在Actin启动子驱动下过表达OsFBK4的转基因植株。具体方法如下：

为构建pCAMBIA2300-OsFBK4过表达载体，先扩增得到基因OsFBK4的CDS全长序列，然后利用融合HD克隆试剂盒(Clontech，日本)，将CDS全长序列克隆到pCAMBIA2300双元表达载体(购自CAMBIA公司)上的SmaI和XbaI限制位点之间。采用农杆菌介导的转化方法，将所建重组表达载体pCAMBIA2300-OsFBK4转化到突变体RE9586中，获得转基因水稻植株。

在27株转基因水稻植株中，8株为阳性。与野生型相比，阳性过表达转基因植株的株高显著增加(图5，A和B)。利用qRT-PCR进一步检测了过表达植株的表达水平，结果显示转基因植株的表达水平几乎是WT植株的两倍(图5，C)，表明OsFBK4可能是水稻株高的正调控基因。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国水稻研究所

<120> 水稻基因OsFBK4及其突变体与应用

<130> KDI060653

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2676

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 1

atgagtgatg acgagctgat tccggggcta ccggaggaag tggcccggga atgcctgctg 60

cgcgtgggat tcgaccagct gccggcggcg aggagcacgt cgcggcggtg gaaggcggag 120

gtcgagtcgc cgttctacca ccgcctccgc agggcccgcg gcatggcgcg cccgctcctc 180

gccctcgccc aggccgagcc gccgctcgcc gccgccggcc cggctaacaa gtacgccggc 240

ctgtccacct cctaccgcct cgtcctccac gaccccgtca ccggcggctg ggccgcgctg 300

ccgccgctcc ccggcgccgg tgggctgccg ctcttctgcc agctcgcctc ggtggcggcg 360

tgcggcgggg agaggaggcg gctggtggtg gtcggcgggt gggatcccga gacgtgggcg 420

ccgacggacg cggtgcacgt gtacgacttc ctgtccgggt cgtggcggcg cggcgcggcg 480

atgcctggac cgaggcggtc gttcttcgcg tgcgccgcgg tggggaggtg ggtgttcgtc 540

gccggcgggc acgacgagga gaagaacgcg ctgcggtcgg cggtcgcgta cgacgccgag 600

gccgacgcgt gggtgccgct cccggacatg gcggcggagc gggacgaggc caggggcgtc 660

tgcgtcggcg gcaggttcgt cgccgtcggc gggtacccga cggaggcgca gggccggttc 720

gccggctccg ccgaggcgtt cgacccggcc gcgtgggcgt ggggccccgt gcaggagcgt 780

gtcctcgacg aggggacgtg cccgaggacg tgctgcgccg cgccggcgcc cgcggcgggc 840

gcgacgatgt acatgctccg cgacggccac ctcgcggcgc gcgacgccac gaacaacggc 900

ggcgccgcgt ggcgggcggt ggcgagcctg cccgaggacg gccgcgcggt gacggccctc 960

gccgccatcg gggacggccg cgtggtcgcc atcggcgcgg ggagccacgg cggcgagcag 1020

gcggtgtacc tgctcaccac cgaggagggc ggcgacaaga acggcgcggc gcagtcgtgg 1080

gcgcgcgccg cggcgccgcc ggagttcgcg gggtacgtgc aggccgcgtg ctgcgtcgaa 1140

gtataacgat acgtgcaagt aatgtacgta cagagacgta cactgtacgt acgtacatat 1200

wtttcgaaat acgggtcaca taatgtacgt acagagacgt acactgtacg tacgtacata 1260

tgcgcgcgcg cgcgcgattg tgtatacgtt tttgtgcgca attgttatag tgtatatgtt 1320

tgtgttgtac acttaaagct cagcgtttcg tatatacgat gatccgagat ggagatgatc 1380

agttttgcat aagctctgtt ttgtttgttt acttcacata agcagataag ctcattgaag 1440

tcttctgtgc atccacaaat tgaacgctat ttttttcttt tcaaatatgc aaacagcatc 1500

aagcgtgtgt acactgcacg gaagaagctt cttttgatat aggacgctga catgtaggtc 1560

cgtgatatgt aggctaatga actgtgggac tatcaggcat tcaaaatcag agagcaggag 1620

agtaaggggg ttagaacatg tttaaagaga caaaagatta taataaattc atattcttgc 1680

tgaaatcctt ttaaagtgtt gtatatatat acttcctctg ctctataaaa aaaaactatt 1740

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caatcatctg tgacatttcc ctcttgaaga cacggacagg acaaaccaaa aaaaaccatg 1980

agccaaatgg attcaaagtg gaccctgtag acacatcaca catatccctg cagcggcaag 2040

tgacgatgtg taaaccagaa gacgacgaac ggcgacgatc tgatccgaaa acccgccgcc 2100

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<210> 2

<211> 1290

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 2

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cgcgtgggat tcgaccagct gccggcggcg aggagcacgt cgcggcggtg gaaggcggag 120

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ggcgccgcgt ggcgggcggt ggcgagcctg cccgaggacg gccgcgcggt gacggccctc 960

gccgccatcg gggacggccg cgtggtcgcc atcggcgcgg ggagccacgg cggcgagcag 1020

gcggtgtacc tgctcaccac cgaggagggc ggcgacaaga acggcgcggc gcagtcgtgg 1080

gcgcgcgccg cggcgccgcc ggagttcgcg ggtgtttcat attgggctag ggctaagtca 1140

agattttcac tttacaccat gtttctttgc caattgccaa gagttgcact ttggggtagg 1200

gtagagatgg ctaaacccac tcatgacatg acgaaagaaa gagatgtgtg ctatcgtttc 1260

atgcgtgcag aacttccttc gcatatctag 1290

<210> 3

<211> 429

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 3

Met Ser Asp Asp Glu Leu Ile Pro Gly Leu Pro Glu Glu Val Ala Arg

1 5 10 15

Glu Cys Leu Leu Arg Val Gly Phe Asp Gln Leu Pro Ala Ala Arg Ser

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Trp Lys Ala Glu Val Glu Ser Pro Phe Tyr His Arg

35 40 45

Leu Arg Arg Ala Arg Gly Met Ala Arg Pro Leu Leu Ala Leu Ala Gln

50 55 60

Ala Glu Pro Pro Leu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Asn Lys Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Leu Ser Thr Ser Tyr Arg Leu Val Leu His Asp Pro Val Thr Gly Gly

85 90 95

Trp Ala Ala Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Phe

100 105 110

Cys Gln Leu Ala Ser Val Ala Ala Cys Gly Gly Glu Arg Arg Arg Leu

115 120 125

Val Val Val Gly Gly Trp Asp Pro Glu Thr Trp Ala Pro Thr Asp Ala

130 135 140

Val His Val Tyr Asp Phe Leu Ser Gly Ser Trp Arg Arg Gly Ala Ala

145 150 155 160

Met Pro Gly Pro Arg Arg Ser Phe Phe Ala Cys Ala Ala Val Gly Arg

165 170 175

Trp Val Phe Val Ala Gly Gly His Asp Glu Glu Lys Asn Ala Leu Arg

180 185 190

Ser Ala Val Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Asp Ala Trp Val Pro Leu Pro

195 200 205

Asp Met Ala Ala Glu Arg Asp Glu Ala Arg Gly Val Cys Val Gly Gly

210 215 220

Arg Phe Val Ala Val Gly Gly Tyr Pro Thr Glu Ala Gln Gly Arg Phe

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Glu Ala Phe Asp Pro Ala Ala Trp Ala Trp Gly Pro

245 250 255

Val Gln Glu Arg Val Leu Asp Glu Gly Thr Cys Pro Arg Thr Cys Cys

260 265 270

Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Gly Ala Thr Met Tyr Met Leu Arg Asp

275 280 285

Gly His Leu Ala Ala Arg Asp Ala Thr Asn Asn Gly Gly Ala Ala Trp

290 295 300

Arg Ala Val Ala Ser Leu Pro Glu Asp Gly Arg Ala Val Thr Ala Leu

305 310 315 320

Ala Ala Ile Gly Asp Gly Arg Val Val Ala Ile Gly Ala Gly Ser His

325 330 335

Gly Gly Glu Gln Ala Val Tyr Leu Leu Thr Thr Glu Glu Gly Gly Asp

340 345 350

Lys Asn Gly Ala Ala Gln Ser Trp Ala Arg Ala Ala Ala Pro Pro Glu

355 360 365

Phe Ala Gly Val Ser Tyr Trp Ala Arg Ala Lys Ser Arg Phe Ser Leu

370 375 380

Tyr Thr Met Phe Leu Cys Gln Leu Pro Arg Val Ala Leu Trp Gly Arg

385 390 395 400

Val Glu Met Ala Lys Pro Thr His Asp Met Thr Lys Glu Arg Asp Val

405 410 415

Cys Tyr Arg Phe Met Arg Ala Glu Leu Pro Ser His Ile

420 425

<210> 4

<211> 429

<212> PRT

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 4

Met Ser Asp Asp Glu Leu Ile Pro Gly Leu Pro Glu Glu Val Ala Arg

1 5 10 15

Glu Cys Leu Leu Arg Val Gly Phe Asp Gln Leu Pro Ala Ala Arg Ser

20 25 30

Thr Ser Arg Arg Trp Lys Ala Glu Val Glu Ser Pro Phe Tyr His Arg

35 40 45

Leu Arg Arg Ala Arg Gly Met Ala Arg Pro Leu Leu Ala Leu Ala Gln

50 55 60

Ala Glu Pro Pro Leu Ala Ala Ala Gly Pro Ala Asn Lys Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Leu Ser Thr Ser Tyr Arg Leu Val Leu His Asp Pro Val Thr Gly Gly

85 90 95

Trp Ala Ala Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Gly Leu Pro Leu Phe

100 105 110

Cys Gln Leu Ala Ser Val Ala Ala Cys Gly Gly Glu Arg Arg Arg Leu

115 120 125

Val Val Val Gly Gly Trp Asp Pro Glu Thr Trp Ala Pro Thr Asp Ala

130 135 140

Val His Val Tyr Asp Phe Leu Ser Gly Ser Trp Arg Arg Gly Ala Ala

145 150 155 160

Met Pro Gly Pro Arg Arg Ser Phe Phe Ala Cys Ala Ala Val Gly Arg

165 170 175

Trp Val Phe Val Ala Gly Gly His Asp Glu Glu Lys Asn Ala Leu Arg

180 185 190

Ser Ala Val Ala Tyr Asp Ala Glu Ala Asp Ala Trp Val Pro Leu Pro

195 200 205

Asp Met Ala Ala Glu Arg Asp Glu Ala Arg Gly Val Cys Val Gly Gly

210 215 220

Arg Phe Val Ala Val Gly Gly Tyr Pro Thr Glu Ala Gln Gly Arg Phe

225 230 235 240

Ala Gly Ser Ala Glu Ala Phe Asp Pro Ala Ala Trp Ala Trp Gly Pro

245 250 255

Val Gln Glu Arg Val Leu Asp Glu Gly Thr Cys Pro Arg Thr Cys Cys

260 265 270

Ala Ala Pro Ala Pro Ala Ala Gly Ala Thr Met Tyr Met Leu Arg Asp

275 280 285

Gly His Leu Ala Ala Arg Asp Ala Thr Asn Asn Gly Gly Ala Ala Trp

290 295 300

Arg Ala Val Ala Ser Leu Pro Glu Asp Gly Arg Ala Val Thr Ala Leu

305 310 315 320

Ala Ala Ile Gly Asp Gly Arg Val Val Ala Ile Gly Ala Gly Ser His

325 330 335

Gly Gly Glu Gln Ala Val Tyr Leu Leu Thr Thr Glu Glu Gly Gly Asp

340 345 350

Lys Asn Gly Ala Ala Gln Ser Trp Ala Arg Ala Ala Ala Pro Pro Glu

355 360 365

Phe Ala Gly Val Ser Tyr Trp Ala Arg Ala Lys Ser Arg Phe Ser Leu

370 375 380

Tyr Thr Met Phe Leu Cys Gln Leu Pro Arg Val Ala Leu Trp Gly Arg

385 390 395 400

Val Glu Met Ala Lys Pro Thr His Asp Met Thr Lys Glu Gly Asp Val

405 410 415

Cys Tyr Arg Phe Met Arg Ala Glu Leu Pro Ser His Ile

420 425

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cactttgggc cagtttctt 19

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

caatagaaac acacgcaaa 19

<210> 7

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtacatcg tcgcgccc 18

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

acgcaaatta aaacacacct cca 23

<210> 9

<211> 265

<212> DNA

<213> 水稻(Oryza sativa)

<400> 9

ccagtgtttc atattgggct agggctaagt caagattttc actttacacc atgtttcttt 60

gccaattgcc aagagttgca ctttggggta gggtatgttc ataacctagg catgtgtgac 120

tgacctcgcc gtagatatta tgattggatt gtgatgacac tcaattcaaa caacttcttg 180

atgcgcggtg tggcacggtt caggtagaga tggctaaacc cactcatgac atgacgaaag 240

aaagagatgt gtgctancgt ttcat 265

Claims

1.水稻基因OsFBK4或含有该基因的生物材料的以下任一应用：

（1）控制植物株高；

（2）控制植物产量性状；

（3）用于植物品种改良；

（4）用于制备转基因植物；

所述产量性状为分蘖数、千粒重、粒厚、单株粒数、结实率和穗密；

所述植物为水稻；

其中，水稻基因OsFBK4编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

2.降低水稻株高的方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段，敲除水稻中的基因OsFBK4；所述基因OsFBK4编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法包括：以基因OsFBK4为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码所述sgRNA序列的DNA片段连接到携带CRISPR/Cas的载体中，转化水稻，进而获得该基因功能缺失的转基因水稻。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，sgRNA作用位点的核苷酸序列为5’-GCCACTTCCTCCGGTAGCCC -3’ 和5’- GGCCCGGCTAACAAGTACGC -3’。

5.增加水稻株高的方法，其特征在于，包括：利用基因工程手段，增强水稻中的基因OsFBK4；所述基因OsFBK4编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

所述增强的途径选自以下1）~5），或任选的组合：

1）通过导入具有所述基因的质粒而增强；

2）通过增加水稻染色体上所述基因的拷贝数而增强；

3）通过改变水稻染色体上所述基因的启动子序列而增强；

4）通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；

5）通过导入增强子而增强。

6.按照权利要求2-5任一项所述方法获得的转基因水稻在植物育种中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，育种方法包括转基因、杂交、回交、自交或无性繁殖。

8.水稻基因OsFBK4突变体或含有该突变体的生物材料的以下任一应用：

（1）负调控植物株高；

（2）负调控植物产量性状；

（3）用于植物品种改良；

（4）用于制备转基因植物；

所述植物为水稻；

其中，水稻基因OsFBK4突变体编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述生物材料为重组DNA、表达盒、转座子、质粒载体、病毒载体或工程菌。

9.与水稻基因OsFBK4共分离的SNP分子标记，其特征在于，所述SNP分子标记含有如SEQID NO:1所示的水稻基因的核苷酸序列，且第2626bp处的多态性为A/G。

10.权利要求9所述SNP分子标记或其检测试剂的以下任一应用：

（1）用于水稻株高的鉴定；

（2）用于水稻株高的早期预测；

（3）用于水稻基因OsFBK4的基因分型；

（4）用于水稻种质资源鉴定或分子标记辅助育种。