CN111808897B

CN111808897B - 一种生物制备甘露寡糖的方法

Info

Publication number: CN111808897B
Application number: CN202010564516.4A
Authority: CN
Inventors: 杨建刚; 孙媛霞; 田朝玉; 曾艳; 马延和
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2020-06-19
Filing date: 2020-06-19
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2040-06-19
Also published as: CN111808897A

Abstract

本发明公开了一种生物制备甘露寡糖的方法，涉及构建体外多酶催化反应体系，实现转化甘露糖合成甘露寡糖；本发明还公开了重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，并将重组菌株应用于甘露寡糖的发酵合成，实现了以甘露糖为原料发酵法合成甘露二糖和甘露三糖产物，并且实现发酵生产单一产物甘露三糖，便于产物分离纯化，所获得的甘露寡糖可应用于食品、医药、化妆品等领域。

Description

一种生物制备甘露寡糖的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种生物制备甘露寡糖的方法，属于生物制造领域。

背景技术

甘露寡糖(MOS)及其衍生物是自然界中存在的一系列功能化合物，例如甘露寡糖由2至10个甘露糖组成的低度聚合糖，因为这些寡糖具有多种多样的结构，因而衍生出不同的生物学功能，并在食品、制药和动物饲料等行业中发挥着重要作用。首先，MOS同样可以选择性促进人类肠道有益菌群增长，可以作为非营养性食品添加剂。此外，甘露二糖能够明显改善和提高鸡的免疫能力，增强对沙门氏菌的杀伤力，因而可用作饲料以控制沙门氏菌在家禽中的传染。

魔芋、角豆胶、瓜儿豆胶等来源的甘露聚糖经甘露聚糖酶水解可用于制备甘露寡糖，该方法是目前的甘露寡糖主要制备途径。然而，单纯依赖酶法水解或提取甘露寡糖及其衍生物，一方面，无法获得聚合度均一的产品，往往需要复杂的分离纯化工艺；另一方面，生产方法依赖于天然多糖资源，限制了寡糖产物多样性。因此，亟待开发新的甘露寡糖的绿色制备技术，获得产品单一、构型多样及结构可控的甘露寡糖产品，建立低成本、高效率的生物合成技术，为甘露寡糖更广范围内应用提供基础。

发明内容

本发明目的一是提供一种制备甘露寡糖的方法，其以甘露糖为底物，通过体外多酶催化反应催化生产甘露寡糖，该方法具有产率高、环境友好、产物构型单一等优点。

其特征在于，以甘露糖为底物，加入甘露糖激酶和甘露糖磷酸化酶，进行多酶催化反应。在本发明中，甘露糖为底物，甘露糖经甘露糖激酶催化转化为甘露糖-1-磷酸，甘露糖-1-磷酸和甘露糖经甘露糖磷酸化酶催化生成甘露二糖和甘露三糖。

优选地，甘露糖原料可以是甘露糖纯品也可以是采用酸解或者酶转化方法转化魔芋、淀粉、纤维素、蔗糖、麦芽糖、果糖、葡萄糖、甘露醇等原料获得的甘露糖。

优选地，多酶催化反应中甘露糖的浓度为1-200g/L，进一步优选为5-50g/L，更优选为8-20g/L，最优选为20g/L。

优选地，多酶催化反应的反应温度为10-95℃，进一步优选为20-80℃，更优选为30-60℃，最优选为37℃。

优选地，多酶催化反应的反应时间为0.5-150小时，进一步优选为1-60小时，更优选为6-48小时，最优选为30小时。

优选地，多酶催化反应中还加入缓冲液、磷酸盐、金属离子。

优选地，甘露糖激酶来源于长双歧杆菌(SEQ ID NO:1)，或其氨基酸序列与上述来源的甘露糖激酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性；甘露二糖磷酸化酶来源于高温厌氧杆菌属(SEQ ID NO:2)，或其氨基酸序列与上述来源的甘露二糖磷酸化酶具有至少60％，优选至少80％，更优选至少90％，最优选至少95％的同一性。

本发明目的二是提供发酵生产甘露寡糖的微生物重组菌株的构建方法。

所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：

1)向微生物重组菌株中引入由甘露糖激酶和甘露糖磷酸化酶组成的甘露寡糖合成途径。

2)增强微生物体内的甘露糖6-磷酸变位酶，促使胞内甘露糖6-磷酸转化为前体甘露糖1-磷酸。

所述微生物重组菌株的构建方法适用于多种微生物模式菌株，包括，大肠杆菌，谷氨酸棒杆菌，枯草芽孢杆菌，乳酸菌，酿酒酵母等微生物。

本发明目的三是提供用于发酵生产甘露寡糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法。

所述重组菌株的构建方法包括以下步骤：

1)在谷氨酸棒杆菌中引入来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK(SEQ ID NO:1)和来源于高温厌氧杆菌属的甘露二糖磷酸化酶MBP(SEQ ID NO:2)，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MOS1；

2)向重组谷氨酸棒杆菌MOS1中引入来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶ManB(SEQ ID NO:3)，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为MOS2；

所述步骤1)中重组谷氨酸棒杆菌MOS1的具体方法包括以下步骤：

委托江苏金唯智生物技术有限公司合成来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK基因(SEQ ID NO:4)和来源于高温厌氧杆菌属的甘露二糖磷酸化酶MBP基因(SEQ ID NO:5)，并要求其提供含有甘露糖激酶基因的载体pUC57-MK和含有甘露二糖磷酸化酶基因的载体pUC57-MBP；以质粒pUC57-MK为模板PCR扩增甘露糖激酶基因，以质粒pUC57-MBP为模板PCR扩增甘露二糖磷酸化酶MBP基因，连接至载体pEC-XK99E中，得到携带有MK基因和MBP基因的重组载体，命名为pE-MK-MBP；通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MBP，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1。

所述步骤2)中重组谷氨酸棒杆菌MOS2的具体方法包括以下步骤：

PCR扩增来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因(SEQ ID NO:6)，连接入载体pE-MK-MBP中，得到携带甘露糖激酶MK基因、甘露二糖磷酸化酶MBP基因和甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因的重组载体，命名为pE-MK-MBP-ManB，通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MBP-ManB，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2。

本发明目的四是提供一种发酵法生产甘露寡糖的方法，其特征在于，培养本发明目的之三所述构建方法得到的谷氨酸棒状杆菌重组菌株MOS1和MOS2,以甘露糖为底物,发酵生产甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖等甘露寡糖。

在优选的实施方式中，所述的方法，其特征在于，发酵生产条件初始菌体密度菌体浓度(OD₆₀₀)为0.5-60；温度30-37℃；甘露糖为20-100g/L。

本发明的谷氨酸棒杆菌重组菌株可应用于甘露糖基寡糖及其衍生物的合成领域中，所获得的甘露寡糖将在食品和医药行业具有广泛的应用前景。

下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为甘露基寡糖的合成技术路线。

图2为谷氨酸棒杆菌重组菌株合成甘露寡糖的高效液相色谱分析结果。

具体实施方式

以下结合实施例进一步详述本发明。

本发明及实施例中提到的百分比浓度如无特别说明均为质量/质量(W/W，单位g/100g)百分比浓度、质量/体积(W/V，单位g/100mL)百分比浓度或体积/体积(V/V，单位mL/100mL)百分比浓度。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》(Sambrook，J.，Russell，David W.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

各实施例中所用相同名称的材料或试剂如无特别说明即为相同的。实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为实施本发明时对生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

本发明中所用引物由江苏金唯智生物技术有限公司合成。

实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，实施例将有助于理解本发明，但是本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1体外多酶催化将甘露糖转化为甘露寡糖

通过体外多酶催化体系将甘露糖转化为甘露寡糖的催化途径见图1。其中涉及的关键酶与关键步骤包括：(1)甘露糖激酶，用于催化甘露糖磷酸化生成甘露糖1-磷酸；(2)甘露二糖磷酸化酶，用于催化甘露糖-1-磷酸和甘露糖生成甘露寡糖。

在本实施例中，甘露糖激酶来源于长双歧杆菌，氨基酸序列在UniProt上的编号为B7GN78(SEQ ID NO:1)；甘露二糖磷酸化酶来源于高温厌氧杆菌属，氨基酸序列在UniProt上的编号为B0K2C3(SEQ ID NO:2)。

委托江苏金唯智生物技术有限公司合成来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK基因(SEQ ID NO:4)和来源于高温厌氧杆菌属的甘露二糖磷酸化酶MBP基因(SEQ ID NO:5)，并要求其提供含有甘露糖激酶MK基因的载体pUC57-MK和含有甘露二糖磷酸化酶MBP基因的载体pUC57-MBP。以合成的甘露糖激酶MK基因序列和甘露二糖磷酸化酶基因序列设计引物,分别以质粒pUC57-MK和pUC57-MBP为模板，PCR扩增获得MK基因和MBP基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pET21中，得到重组质粒pET21-MK和pET21-MBP。将这两个质粒分别转化至大肠杆菌表达菌BL21(DE3)(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，进行蛋白质表达与纯化。

随后反应体系中含有25mM PBS缓冲液(pH 7.5)，5mM的二价镁离子，2U/mL甘露糖激酶，4U/mL甘露二糖磷酸化酶，20g/L甘露糖，50mM ATP，在37℃进行催化反应，反应时间为30个小时。

高效液相色谱检测甘露寡糖的浓度，经标准曲线斜率计算，反应体系合成6.1g/L甘露二糖和2.6g/L甘露三糖，相对于甘露糖转化率为53.4％。

实施例2、构建谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1和MOS2

1、谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1的构建，包括以下步骤：

1.1、在谷氨酸棒杆菌重组菌株中引入甘露糖激酶MK基因和甘露二糖磷酸化酶MBP基因，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MOS1。

具体构建过程如下：

分别以质粒pUC57-MK和pUC57-MBP为模板，PCR扩增获得MK基因和MBP基因，通过限制性酶切连接方法，连接至载体pEC-XK99E中，得到重组质粒pE-MK-MBP。

1.2、通过电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株中导入重组载体pE-MK-MBP，得到携带有甘露糖激酶MK基因和甘露二糖磷酸化酶MBP基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MOS1。

2、谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2的构建,包括以下步骤：

2.1、根据Genbank中大肠埃希氏菌MG1655的甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因(SEQID NO:8)，设计引物，以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模板，PCR扩增来甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因，采用酶切连接方法连接入载体pE-MK-MBP中，得到重组载体pE-MK-MBP-ManB。

2.2、采用电转化方法向谷氨酸棒杆菌重组菌株中导入重组载体pE-MK-MBP-ManB，得到携带有甘露糖激酶基因、甘露二糖磷酸化酶基因和甘露糖6-磷酸变位酶基因的谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MOS2。

实施例3、谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1和MOS2在甘露寡糖合成中的应用

谷氨酸棒杆菌重组菌株在甘露寡糖合成中的应用包括以下步骤：

选用BHI丰富培养基(脑心浸粉37g/L)，培养基中添加甘露糖(20g/L).在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1进行48h发酵培养。发酵结束后，对样品进行14000rmp离心20min，并用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液做高效液相分析。高效液相色谱分析按如下条件进行：仪器为安捷伦高效液相色谱仪1200，分析柱：Sugar-Pak，流动相：超纯水，流速：0.4mL/min，柱温：80℃，检测器：示差折光检测器，上样量为10μl。

结果如图2((a)表示发酵0h；(b)表示发酵48h)所示，可以看出，经过48小时反应，重组菌株MOS1可以发酵甘露糖合成甘露二糖和甘露三糖，二者总产量为7.1g/L，其中甘露三糖产量为5.4g/L,甘露二糖产量为1.7g/L。与重组菌株MOS1相比，重组菌株MOS2产量提高30.9％，达到9.2g/L。

实施例4、谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2制备单一产物甘露三糖

1、谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养

选用丰富培养基，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2进行培养，得到的谷氨酸棒杆菌重组菌株菌液，离心收集菌体。

2、以甘露糖为底物生产甘露三糖

取谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2的浓缩菌液，加入终浓度为40g/L的甘露糖进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度(OD₆₀₀)为60。

发酵结束后，对样品进行高效液相色谱检测，经过48小时反应，重组菌株MOS2发酵甘露糖获得单一产物甘露三糖，产量为5.0g/L。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种生物制备甘露寡糖的方法

<130> 2020.5.25

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 359

<212> PRT

<213> 长双歧杆菌()

<400> 1

Met Asn Asn Thr Asn Glu Ala Leu Phe Asp Val Ala Ser His Phe Ala

1 5 10 15

Leu Glu Gly Thr Val Asp Ser Ile Glu Pro Tyr Gly Asp Gly His Ile

20 25 30

Asn Thr Thr Tyr Leu Val Thr Thr Asp Gly Pro Arg Tyr Ile Leu Gln

35 40 45

Arg Met Asn Thr Gly Ile Phe Pro Asp Thr Val Asn Leu Met Arg Asn

50 55 60

Val Glu Leu Val Thr Ser Thr Leu Lys Ala Gln Gly Lys Glu Thr Leu

65 70 75 80

Asp Ile Val Arg Thr Thr Ser Gly Asp Thr Trp Ala Glu Ile Asp Gly

85 90 95

Gly Ala Trp Arg Val Tyr Lys Phe Ile Glu His Thr Met Ser Tyr Asn

100 105 110

Leu Val Pro Asn Pro Asp Val Phe Arg Glu Ala Gly Arg Ala Phe Gly

115 120 125

Asp Phe Gln Asn Phe Leu Ser Gly Phe Asp Ala Asn Gln Leu Thr Glu

130 135 140

Thr Ile Ala His Phe His Asp Thr Pro His Arg Phe Glu Asp Phe Lys

145 150 155 160

Lys Ala Leu Ala Ala Asp Glu Leu Gly Arg Ala Ala Gly Cys Gly Pro

165 170 175

Glu Ile Glu Phe Tyr Leu Ser His Ala Asp Gln Tyr Ala Val Val Met

180 185 190

Asp Gly Leu Arg Asp Gly Ser Ile Pro Leu Arg Val Thr His Asn Asp

195 200 205

Thr Lys Leu Asn Asn Ile Leu Met Asp Ala Thr Thr Gly Lys Ala Arg

210 215 220

Ala Ile Ile Asp Leu Asp Thr Ile Met Pro Gly Ser Met Leu Phe Asp

225 230 235 240

Phe Gly Asp Ser Ile Arg Phe Gly Ala Ser Thr Ala Leu Glu Asp Glu

245 250 255

Arg Asp Leu Asp Lys Val His Phe Ser Thr Glu Leu Phe Arg Ala Tyr

260 265 270

Thr Glu Gly Phe Val Gly Glu Leu Arg Asp Ser Ile Thr Ala Arg Glu

275 280 285

Ala Glu Leu Leu Pro Phe Ser Gly Asn Leu Leu Thr Met Glu Cys Gly

290 295 300

Met Arg Phe Leu Ala Asp Tyr Leu Glu Gly Asp Val Tyr Phe Ala Thr

305 310 315 320

Lys Tyr Pro Glu His Asn Leu Val Arg Ser Arg Thr Gln Ile Lys Leu

325 330 335

Val Arg Glu Met Glu Gln Arg Ala Asp Glu Thr Arg Ala Ile Val Ala

340 345 350

Asp Val Met Glu Thr Thr Lys

355

<210> 2

<211> 302

<212> PRT

<213> 高温厌氧杆菌属()

<400> 2

Met Phe Arg Leu Thr Arg Leu Ser Asn Lys Pro Ile Leu Ser Pro Ile

1 5 10 15

Lys Glu His Glu Trp Glu Lys Glu Ala Val Phe Asn Ala Ala Val Ile

20 25 30

Tyr Glu Gly Asn Lys Phe His Leu Phe Tyr Arg Ala Ser Asn Asn Lys

35 40 45

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Ser Ile Gly Tyr Ala Val Ser Glu Asp Gly Ile Asn Phe Glu Arg Phe

65 70 75 80

Asp Lys Pro Val Leu Val Gly Glu Ile Pro Gln Glu Ala Trp Gly Val

85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

Trp Ser Asp Asp Leu Lys Asn Trp Lys Gly His Arg Ile Val Leu Asp

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Glu Pro Asn Lys Asp Ala Ala Leu Leu Ser Glu Lys Ile Asn Gly Lys

145 150 155 160

Tyr Val Leu Phe His Arg Arg Met Pro Asp Ile Trp Ile Ala Tyr Ser

165 170 175

Asp Asp Leu Val Asn Trp Tyr Asn His Lys Ile Ile Met Ser Pro Lys

180 185 190

Ser His Thr Trp Glu Ser Lys Lys Ile Gly Ile Ala Gly Pro Pro Ile

195 200 205

Lys Arg Glu Asp Gly Trp Leu Leu Ile Tyr His Gly Val Asp Asn Asn

210 215 220

Asn Val Tyr Arg Leu Gly Val Ala Leu Leu Asp Leu Lys Asp Pro Ser

225 230 235 240

Lys Val Ile Ala Arg Gln Lys Glu Pro Ile Leu Glu Pro Glu Leu Asp

245 250 255

Trp Glu Ile Asn Gly Leu Val Pro Asn Val Val Phe Ser Cys Gly Ala

260 265 270

Val Glu Val Asn Asp Met Tyr Tyr Val Tyr Tyr Gly Ala Ala Asp Thr

275 280 285

His Ile Gly Val Ala Val Ile Glu Lys Glu Lys Val Lys Phe

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<210> 3

<211> 456

<212> PRT

<213> 大肠埃希氏菌()

<400> 3

Met Lys Lys Leu Thr Cys Phe Lys Ala Tyr Asp Ile Arg Gly Lys Leu

1 5 10 15

Gly Glu Glu Leu Asn Glu Asp Ile Ala Trp Arg Ile Gly Arg Ala Tyr

20 25 30

Gly Glu Phe Leu Lys Pro Lys Thr Ile Val Leu Gly Gly Asp Val Arg

35 40 45

Leu Thr Ser Glu Thr Leu Lys Leu Ala Leu Ala Lys Gly Leu Gln Asp

50 55 60

Ala Gly Val Asp Val Leu Asp Ile Gly Met Ser Gly Thr Glu Glu Ile

65 70 75 80

Tyr Phe Ala Thr Phe His Leu Gly Val Asp Gly Gly Ile Glu Val Thr

85 90 95

Ala Ser His Asn Pro Met Asp Tyr Asn Gly Met Lys Leu Val Arg Glu

100 105 110

Gly Ala Arg Pro Ile Ser Gly Asp Thr Gly Leu Arg Asp Val Gln Arg

115 120 125

Leu Ala Glu Ala Asn Asp Phe Pro Pro Val Asp Glu Thr Lys Arg Gly

130 135 140

Arg Tyr Gln Gln Ile Asn Leu Arg Asp Ala Tyr Val Asp His Leu Phe

145 150 155 160

Gly Tyr Ile Asn Val Lys Asn Leu Thr Pro Leu Lys Leu Val Ile Asn

165 170 175

Ser Gly Asn Gly Ala Ala Gly Pro Val Val Asp Ala Ile Glu Ala Arg

180 185 190

Phe Lys Ala Leu Gly Ala Pro Val Glu Leu Ile Lys Val His Asn Thr

195 200 205

Pro Asp Gly Asn Phe Pro Asn Gly Ile Pro Asn Pro Leu Leu Pro Glu

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Gly Ile Ala Phe Asp Gly Asp Phe Asp Arg Cys Phe Leu Phe Asp Glu

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Lys Gly Gln Phe Ile Glu Gly Tyr Tyr Ile Val Gly Leu Leu Ala Glu

260 265 270

Ala Phe Leu Glu Lys Asn Pro Gly Ala Lys Ile Ile His Asp Pro Arg

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Leu Ser Trp Asn Thr Val Asp Val Val Thr Ala Ala Gly Gly Thr Pro

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325 330 335

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340 345 350

Glu Leu Val Cys Leu Lys Asp Lys Thr Leu Gly Glu Leu Val Arg Asp

355 360 365

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Gln Pro Val Glu Ala Ile Asn Arg Val Glu Gln His Phe Ser Arg Glu

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Ala Leu Ala Val Asp Arg Thr Asp Gly Ile Ser Met Thr Phe Ala Asp

405 410 415

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420 425 430

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450 455

<210> 4

<211> 1080

<212> DNA

<213> 长双歧杆菌()

<400> 4

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gacggtccgc gttacatcct gcagcgtatg aacaccggca ttttcccgga taccgttaac 180

ctgatgcgta acgtggaact ggttaccagc accctgaagg cgcagggtaa agagaccctg 240

gacattgtgc gtaccaccag cggtgacacc tgggcggaaa tcgatggtgg cgcgtggcgt 300

gtttataagt ttattgagca caccatgagc tacaacctgg tgccgaaccc ggatgttttc 360

cgtgaagcgg gtcgtgcgtt cggcgacttt cagaacttcc tgagcggttt tgatgcgaac 420

caactgaccg agaccatcgc gcacttccac gacaccccgc accgttttga ggatttcaag 480

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ccgctgcgtg tgacccacaa cgacaccaag ctgaacaaca ttctgatgga tgcgaccacc 660

ggtaaagcgc gtgcgatcat tgacctggat accatcatgc cgggcagcat gctgttcgac 720

tttggtgata gcattcgttt tggtgcgagc accgcgctgg aggatgaacg tgacctggat 780

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cgtgatagca tcaccgcgcg tgaggcggaa ctgctgccgt tcagcggtaa cctgctgacc 900

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aagtatccgg agcacaacct ggtgcgtagc cgtacccaga tcaaactggt tcgtgagatg 1020

gaacaacgtg cggacgagac ccgtgcgatt gtggcggatg ttatggaaac caccaaataa 1080

<210> 5

<211> 1395

<212> DNA

<213> 高温厌氧杆菌属()

<400> 5

atgaaagctc tgatcctggc tggtggtaaa ggtacccgtc tgtggccgct gtctcgtgaa 60

gctatgccga aacagttcat caaagttttc tctgaccgtt ctctgttcca gaaaaccgtt 120

gaacgtgctc tgatcttctc taaaccgaaa gaaatcttcg ttgttaccaa caaagaatac 180

cgtttccgtg ttctggacga cctgaacgaa ctgggtctga aagttccgga agaaaacatc 240

ctgctggaac cggttggtaa aaacaccctg ccggctatct actggggtct gaaagttatc 300

aacgacaact acggtgactc tgttgttgct gttctgccgt ctgaccacgc tatcgaagtt 360

aacgaatctt acatggaagc tttcaaaaaa gctgaaaaac tggctgaaaa atacctggtt 420

accttcggta tcaaaccgac caaaccgcac accggttacg gttacatcaa accgggtgaa 480

aaaatcgaag ttgaaggtaa agttctgggt tacctggttg acgaattcaa agaaaaaccg 540

gacctggaaa ccgctcgtaa atacgttgaa aacggttact actggaactc tggtatgttc 600

atgttcaaag tttctgtttt catggaagaa gctcgtaaac actctccgga cgttgttaaa 660

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gactacggta tcatggaaaa aaccaacaaa gctgctgttg ttccgctgaa cacctactgg 780

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aaactgaaag aagaaaacga cgaacgtgct atcgttcacc gtaccgctta ccgtccgtgg 1080

ggttcttaca ccgttctgga agaaggtgaa cgttacaaaa tcaaacgtct gaccgttctg 1140

ccgggtaaac gtctgtctct gcagatccac taccaccgtt ctgaacactg ggttgttgtt 1200

cgtggtaccg ctaaagttaa agttggtgac aaagaattca tcctgcgtcc gggtgaatct 1260

accttcatcc cggctggtgt tccgcaccgt ctggaaaacc cgggtaaagt tatcctggaa 1320

gttatcgaaa cccagatcgg tgaatacctg ggtgaagacg acatcgttcg tctgcaggac 1380

gactacggtc gttaa 1395

<210> 6

<211> 1371

<212> DNA

<213> 大肠埃希氏菌()

<400> 6

atgaaaaaat taacctgctt taaagcctat gatattcgcg ggaaattagg cgaagaactg 60

aatgaagata tcgcctggcg cattggtcgc gcctatggcg aatttctcaa accgaaaacc 120

attgtgttag gcggtgatgt ccgcctcacc agcgaaacct taaaactggc gctggcgaaa 180

ggtttacagg atgcgggcgt tgacgtgctg gatattggta tgtccggcac cgaagagatc 240

tatttcgcca cgttccatct cggcgtggat ggcggcattg aagttaccgc cagccataat 300

ccgatggatt ataacggcat gaagctggtt cgcgaggggg ctcgcccgat cagcggagat 360

accggactgc gcgacgtcca gcgtctggct gaagccaacg actttcctcc cgtcgatgaa 420

accaaacgcg gtcgctatca gcaaatcaac ctgcgtgacg cttacgttga tcacctgttc 480

ggttatatca atgtcaaaaa cctcacgccg ctcaagctgg tgatcaactc cgggaacggc 540

gcagcgggtc cggtggtgga cgccattgaa gcccgcttta aagccctcgg cgcgcccgtg 600

gaattaatca aagtgcacaa cacgccggac ggcaatttcc ccaacggtat tcctaaccca 660

ctactgccgg aatgccgcga cgacacccgc aatgcggtca tcaaacacgg cgcggatatg 720

ggcattgctt ttgatggcga ttttgaccgc tgtttcctgt ttgacgaaaa agggcagttt 780

attgagggct actacattgt cggcctgttg gcagaagcat tcctcgaaaa aaatcccggc 840

gcgaagatca tccacgatcc acgtctctcc tggaacaccg ttgatgtggt gactgccgca 900

ggtggcacgc cggtaatgtc gaaaaccgga cacgccttta ttaaagaacg tatgcgcaag 960

gaagacgcca tctatggtgg cgaaatgagc gcccaccatt acttccgtga tttcgcttac 1020

tgcgacagcg gcatgatccc gtggctgctg gtcgccgaac tggtgtgcct gaaagataaa 1080

acgctgggcg aactggtacg cgaccggatg gcggcgtttc cggcaagcgg tgagatcaac 1140

agcaaactgg cgcaacccgt tgaggcgatt aaccgcgtgg aacagcattt tagccgtgag 1200

gcgctggcgg tggatcgcac cgatggcatc agcatgacct ttgccgactg gcgctttaac 1260

ctgcgcacct ccaataccga accggtggtg cgcctgaatg tggaatcgcg cggtgatgtg 1320

ccgctgatgg aagcgcgaac gcgaactctg ctgacgttgc tgaacgagta a 1371

Claims

1.一种生物制备甘露寡糖的方法，其特征在于，在出发菌株中过表达甘露糖激酶、甘露糖二糖磷酸化酶、甘露糖6-磷酸变位酶，构建获得工程菌，所述工程菌用于生产甘露三糖，所述出发菌株为谷氨酸棒杆菌；

用于发酵生产甘露寡糖的谷氨酸棒杆菌重组菌株的构建方法，包括以下步骤：

1）在谷氨酸棒杆菌中引入来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK ，其氨基酸序列为SEQID NO:1，和来源于高温厌氧杆菌属的甘露二糖磷酸化酶MBP，其氨基酸序列为 SEQ ID NO:2，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株，命名为菌株MOS1；

2）向重组谷氨酸棒杆菌MOS1中引入来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶ManB，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，得到重组谷氨酸棒杆菌，命名为MOS2；

所述步骤1）中重组谷氨酸棒杆菌MOS1的具体方法包括以下步骤：

合成来源于长双歧杆菌的甘露糖激酶MK基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:4，和来源于高温厌氧杆菌属的甘露二糖磷酸化酶MBP基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:5，并要求其提供含有甘露糖激酶基因的载体pUC57-MK和含有甘露二糖磷酸化酶基因的载体pUC57-MBP；以质粒pUC57-MK为模板PCR扩增甘露糖激酶基因，以质粒pUC57-MBP为模板PCR扩增甘露二糖磷酸化酶MBP基因，连接至载体pEC-XK99E中，得到携带有MK基因和MBP基因的重组载体，命名为pE-MK-MBP；通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MBP，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS1；

所述步骤2）中重组谷氨酸棒杆菌MOS2的具体方法包括以下步骤：PCR扩增来源于大肠埃希氏菌的甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:6，连接入载体pE-MK-MBP中，得到携带甘露糖激酶MK基因、甘露二糖磷酸化酶MBP基因和甘露糖6-磷酸变位酶ManB基因的重组载体，命名为pE-MK-MBP-ManB，通过电转化方式向谷氨酸棒杆菌中导入重组质粒pE-MK-MBP-ManB，得到谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2；

谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2制备单一产物甘露三糖的具体方法包括以下步骤：

a.谷氨酸棒杆菌重组菌株的培养：选用丰富培养基，在30℃、200rmp条件下对谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2进行培养，得到的谷氨酸棒杆菌重组菌株菌液，离心收集菌体；

b.以甘露糖为底物生产甘露三糖：取谷氨酸棒杆菌重组菌株MOS2的浓缩菌液，加入终浓度为40 g/L的甘露糖进行发酵，发酵条件为：温度30℃，pH 7.0，菌体浓度OD₆₀₀为60；

发酵结束后，对样品进行高效液相色谱检测，经过48小时反应，重组菌株MOS2发酵甘露糖获得单一产物甘露三糖，产量为5.0 g/L。