CN111808194A - 一种结合密蛋白的用于治疗癌症的人源化抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种结合密蛋白18.2的用于治疗癌症的人源化抗体,所述抗体与Claudin18.1均不结合,但是与Claudin18.2选择性结合,破坏细胞间的紧密连接,使Claudin18.2无法发挥其正常功能,可用于预防或治疗肿瘤,尤其是晚期胃癌。
Description
技术领域
本发明涉及一种结合密蛋白18.2的用于治疗癌症的人源化抗体,属于抗体药物技术领域。
背景技术
胃癌在全世界范围内是发病率最高的癌症之一,是中国的第二大常见肿瘤。据2017年4月在北京召开的第12届国际胃癌大会上披露,中国胃癌每年新发现病例约为68万例,占全球发病总数的一半左右,同比2012年公布的44.65万例,年平均增长率超过了13%。中国胃癌死亡率是欧美发达国家的4~8倍,约每2~3分钟就有1名中国人死于胃癌。相比其他国家,中国的胃癌形势更加严峻。
中国大部分胃癌患者确诊时,病情已经进入中晚期,手术后效果极不理想,且预后极差,是临床上极为棘手的恶性肿瘤。
细胞间紧密连接(tight junction,TJs)是一种跨膜蛋白复合体,紧密连接的稳定需要几种不同蛋白的协调活动来维持,而Claudin蛋白是保证紧密连接渗透性具有特异性的主要蛋白。迄今在哺乳动物中已发现27个Claudin家族成员。Claudin蛋白家族分子量为20~27KD,结构中包括4个跨膜区域、两个细胞外环和一个细胞内环,其N端和C末端在胞浆内。两个细胞外环使其成为理想的抗体靶点。Claudin蛋白是构成紧密连接结构的骨架蛋白,位于相临细胞间隙顶侧,其分布具有组织器官特异性,功能主要为细胞间粘附、维持细胞极性、调节细胞旁通透性及参与细胞增殖、分化调节。
Claudin18蛋白分子量约为26KD,可以通过选择性剪切使Claudin蛋白变成具有不同特性的Claudin亚型:Claudin18.1和Claudin18.2。Claudin18.1和Claudin18.2的第一胞外结构域之间虽然只有八个氨基酸的差异,但表达分布却不同,Claudin18.1在正常肺和胃的上皮中选择性表达,Claudin18.2只在短暂分化的胃上皮细胞上表达,在任何其他正常人器官中完全检测不到,但是Claudin18.2在多种恶性肿瘤中有显著上调,包括80%的胃肠道腺瘤、60%的胰腺肿瘤、30%食道癌以及25%非小细胞肺癌。在肿瘤中,细胞间的紧密连接遭到破坏,Claudin18.2无法发挥其正常功能。因此,Claudin18.2是一个合适的肿瘤治疗靶标。
发明内容
本发明的第一方面,提供一种结合Claudin18.2人源化抗体,所述抗体包括重链高变区(HCDR,或称重链互补决定区)和轻链高变区(LCDR,或称轻链互补决定区),所述重链高变区包括:
氨基酸序列为GYX1FTNYG的HCDR1,氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2,以及氨基酸序列为ARLGFGNAMDY的HCDR3;
所述轻链高变区包括:
氨基酸序列为QX2X3LNX4X5NX6KNY的LCDR1,氨基酸序列为WAX7的LCDR2,以及氨基酸序列为QX8DYX9YPLT的LCDR3,
其中所述HCDR1中氨基酸X1选自S或T;
所述LCDR1中氨基酸X2选自T或S,X3选自L或V,X4选自T或S,所述X5选自G或S,X6选自Q或N;
所述LCDR2中氨基酸X7选自T或S;
所述LCDR3中氨基酸X8选自N或Q,X9选自T或S。
一个优选的实施方案中,所述抗体包含如下所述的HCDR及LCDR,
氨基酸序列为GYSFTNYG(SEQ ID NO:1)或GYTFTNYG(SEQ ID NO:2)的CDR1(HCDR1);
氨基酸序列为INTNTGEP(SEQ ID NO:3)的CDR2(HCDR2);
氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(SEQ ID NO:4)的CDR3(HCDR3);以及
氨基酸序列为QTLLNTGNQKNY(SEQ ID NO:5)、QSVLNSGNQKNY(SEQ ID NO:6)、QSLLNSSNNKNY(SEQ ID NO:7)、QSVLNSSNNKNY(SEQ ID NO:8)、QTLLNSGNQKNY(SEQ ID NO:9)、QTLLNSGNNKNY(SEQ ID NO:10)、QTLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:11)、QTLLNSSNNKNY(SEQ IDNO:12)、QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:13)、QSLLNSGNNKNY(SEQ ID NO:14)、QSLLNSGNQKNY(SEQID NO:15)、QSVLNSSNQKNY(SEQ ID NO:16)、QSVLNSGNNKNY(SEQ ID NO:17)或QTVLNSGNNKNY(SEQ ID NO:18)的CDR1(LCDR1);
氨基酸序列为WAT(SEQ ID NO:19)或WAS(SEQ ID NO:20)的CDR2(LCDR2);
氨基酸序列为QNDYTYPLT(SEQ ID NO:21)、QQDYTYPLT(SEQ ID NO:22)、QQDYSYPLT(SEQ ID NO:23)或QNDYSYPLT(SEQ ID NO:24)的CDR3(LCDR3)。
本发明一个更为优选的实施方案中,所述的人源化抗体,其包含如下组合的重链高变区和轻链高变区:
(1)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:5的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:21的LCDR3;或
(2)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:6的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:22的LCDR3;或
(3)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:7的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:21的LCDR3;或
(4)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:8的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:23的LCDR3;或
(5)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:9的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(6)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:5的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(7)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:9的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:21的LCDR3;或
(8)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:10的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(9)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:11的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(10)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:12的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(11)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:6的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(12)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:13的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(13)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:14的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(14)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:15的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:23的LCDR3;或
(15)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:7的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(16)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:13的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:23的LCDR3;或
(17)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:16的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(18)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:14的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:23的LCDR3;或
(19)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:17的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(20)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:8的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(21)SEQ ID NO:2的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:7的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:23的LCDR3;或
(22)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ IDNO:18的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;或
(23)SEQ ID NO:17的HCDR1、SEQ ID NO:32的HCDR2、SEQ ID NO:54的HCDR3,和SEQID NO:61的LCDR1、SEQ ID NO:63的LCDR2、SEQ ID NO:66的LCDR3。
本发明的第二方面,提供了具有如下所述氨基酸序列的抗体,所述抗体具有如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列:
氨基酸序列为QVQLVQSGXa1ELKKPGASVKISCKASZH1MNWVRQAPGQGLKWMGZH2TYAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYXa2CZH3WGQGTLVTVSS所示的VH;以及
氨基酸序列为DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSZL1LTWYQQKPGQPPKLLIYZL2TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCZL3FGAGTKLEIK所示的VL,
其中Xa1为P或S,Xa2为F或Y,ZH1、ZH2及ZH3分别为重链的三个CDR区,ZL1、ZL2及ZL3为轻链的三个CDR区,
其中ZH1的氨基酸序列为GYX1FTNYG,ZH2的氨基酸序列为INTNTGEP,ZH3的氨基酸序列为ARLGFGNAMDY;ZL1的氨基酸序列为QX2X3LNX4X5NX6KNY,ZL2的氨基酸序列为WAX7,ZL3的氨基酸序列为QX8DYX9YPLT;
X1选自S或T;
X2选自T或S;X3选自L或V;X4选自T或S;X5选自G或S;X6选自Q或N;X7选自T或S;X8选自N或Q;X9选自T或S。
本发明一个更为具体的实施方案中,所述的人源化抗体,具有如下所述的VH和VL序列,
氨基酸序列为SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51所示的VH,以及
氨基酸序列为SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52所示的VL。
列举性的人源化抗体,具有如下任意一组所述的VH和VL序列:
SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的VL(BY5-1);SEQ ID NO:27所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的VL(BY5-5);SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的VL(BY6-1);SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的VL(BY6-2);SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:34所示氨基酸序列的VL(BY6-3);SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的VL(BY6-4);SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的VL(BY6-6);SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的VL(BY6-7);SEQ ID NO:41所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的VL(BY6-8);SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的VL(BY6-9);SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的VL(BY6-13);SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的VL(BY6-15);SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的VL(BY6-19)。
所述各候选抗体中,重量恒定区选自人IgG系列,如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,优选IgG1;所述轻链的恒定区选自κ或λ链,优选κ链。
一个具体的实施方案中,本发明所述抗体名称、对应序列如下表:
VH序列:
QVQLVQSGXa1ELKKPGASVKISCKASGYX1FTNYGMNWVRQAPGQGLKWMGINTNTGEPTYAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYXa2CARLGFGNAMDYWGQGTLVTVSS;
VL序列:
DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSQX2X3LNX4X5NX6KNYLTWYQQKPGQPPKLLIYWAX7TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCQX8DYX9YPLTFGAGTKLEIK所示的VL,
表1结合Claudin18.2的人源化抗体名称及对应的VH、VL序列
BY0-0的VH及VL氨基酸序列(SEQ ID NO:51及52)
VH互补决定区:CDR1:GYTFTNYG,CDR2:INTNTGEP;CDR3:ARLGFGNAMDYVH框架区:FR1:QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS;FR2:MNWVKQAPGKGLKWMGW;FR3:TYAEEFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFC;FR4:WGQGTSVTVSS
VL高变区/互补决定区:CDR1:QSLLNSGNQKNY;CDR2:WAS;CDR3:QNDYSYPLT。
VL框架区:FR1:DIVMTQSPSSLTVTAGEKVTMSCKSS;FR2:LTWYQQKPGQPPKLLIY;FR3:TRESGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVQAEDLAVYYC;FR4:FGAGTKLELK。
本发明所述的抗体或抗原结合片段,其中所述HVR的恒定区选自人IgG系列,如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,优选IgG1;所述LVR的恒定区选自κ或λ链,优选κ链。
本发明的第三方面,提供了及一种药物组合物,其包含本发明所述的抗体或其抗原结合片段和可药用载体。
适合的可药用载体,包括但不限于:抗氧化剂(例如抗坏血酸和硫酸氢钠)、防腐剂(例如苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、羟基苯酸乙酯或正丙酯)、乳化剂、助悬剂、分散剂、溶剂、填充剂、膨胀剂、缓冲剂、载体、稀释剂和/或佐剂。例如,适合的载体可以是生理盐水溶液或柠檬酸盐缓冲盐水,其可能补充了在肠外施用药物组合物中常见的其它材料。中兴缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是其它的示例性载体。本领域那些技术人员将容易地分辨可以在本发明中使用的药物组合物和剂量形式中使用的多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括但不限于,药物可用的弱酸、弱碱或其混合物。缓冲液组分还包括水溶性材料,如磷酸、酒石酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸、乙酸、抗坏血栓、门冬氨酸、谷氨酸及其盐。
药物组合物和可以作为溶液、混悬液、凝胶、乳浊液、固体或者脱水或冷冻干燥的粉末保存在无菌小瓶中。这些组合物可以作为即可使用的形式、使用前需要复原的冷冻干燥形式、使用前需要稀释的液体形式或其它可用形式存储。
本发明还涉及一种分离的核酸分子,其编码本发明所述的抗体或其抗原结合片段;一种表达载体,含有本发明所述核酸分子,以及包含本发明所述的表达载体的宿主细胞,优选真核细胞。
本发明第四方面,提供了一种制备与Claudin18.2特异性结合的抗体或其抗原结合片段的方法,该方法包括在有利于本发明所述的抗体或其抗原结合片段表达的条件下表达本发明所述的核酸分子,并回收表达的抗体或其抗原结合片段。
用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基,如基本培养基或含有适宜添加物的复合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基,或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由所述宿主细胞产生的多肽,例如用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分,根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行进一步纯化。
可以将上述编码DNA序列插入任何适当的载体中。通常,载体的选择常常取决于该载体将要被引入的宿主细胞,因此,载体可以是一种自主复制型载体,即作为染色体外实体存在的载体,其复制不依赖于染色体复制,如质粒。或者,载体可以是这样一种类型,当将其引入宿主细胞时,它将整合到宿主细胞基因组中,并与它所整合入的染色体一起复制。
载体优选是一种表达载体,其内编码所述肽的DNA序列与该DNA转录所需的其它区段(如启动子)有效相连。本领域熟知适合于在多种宿主细胞中指导编码本发明肽的DNA进行转录的启动子例子,参见例如Sambrook,J,Fritsch,EF和Maniatis,T,分子克隆:实验操作指南,Cold Spring Harbor Laboratory Press,纽约,1989中所述。
载体还可以含有选择标记,如可以是这样的一种基因,其基因产物将弥补宿主细胞内的一个缺陷,或者能赋予对药物如氨苄青霉素、阿霉素、四环素、氯霉素、新霉素、链霉素或氨甲喋呤等的抗性。
为将本发明表达的肽引入宿主细胞的分泌途径,可以在重组载体中提供分泌信号序列(也称之为前导序列)。分泌信号序列以正确读框与编码该肽的DNA序列连接。分泌信号序列通常位于编码该肽的DNA序列的5’侧。分泌信号序列可以是正常地与该肽连接的分泌信号序列,或可以源于编码另一种分泌蛋白质的基因。
用于分别连接编码本发明肽的DNA序列,启动子和可选择的终止子和/或分泌信号肽序列,并将其插入到适宜的含有复制所必需的信息的载体中的方法,对本领域的技术人员是已知的。
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的成核细胞)中的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所需的序列,这种个序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和(偶尔的)3’末翻译区获得。这些区域包含作为编码结合Claudin18.2的人源化抗体的mRNA的未翻译部分中的多腺苷酸化片段转录的核苷酸区段。
将导入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是能够产生本发明肽的任何细胞,包括细菌、病毒、酵母、真菌和高等真核生物细胞。本领域技术人员熟知并使用的适宜的宿主的例子包括但不限病毒。
可以从培养基或宿主细胞裂解液回收多种形式的本发明抗体或抗原结合片段,如果是膜结合的,则可以使用合适的去垢剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶切来使其从膜释放,可以通过多种物理或化学方法如冻融循环、超声、机械破碎或细胞裂解试剂来破裂用于表达本发明所述结合Claudin18.2的抗体的细胞。
可能需要的是从重组细胞蛋白纯化本发明抗体或抗原结合片段,以下方法是合适纯化方法的示例:通过在离子交换柱上的分部分离;乙醇沉淀;反相HPLC;在二氧化硅或在阳离子交换树脂如DEAE上的层析;色谱聚焦;SDS-PAGE;硫酸铵沉淀;使用例如Sephadex G-75的凝胶过滤;除去污染物如IgG的蛋白A Sepharose柱。
另一方面,本发明涉及抗体或其抗原结合片段在制备药物中的用途,所述药物用于预防或治疗癌症相关的疾病,尤其是胃癌。
本发明的第五方面,提供了一种预防或治疗癌症药的方法,包括给药受试本发明所述的结合Claudin18.2的抗体;其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌;所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。
本发明的第六方面,提供了一种制品或药盒,包含容器和包装插页,其中所述容器中装有本发明所述的抗体或其抗原结合片段,或者本发明所述的药物组合物,所述包装插页上载有药物的使用说明书。在一个优选实施方案中,该制品或药盒进一步包含一个或多个容器,该容器中装有一种或多种预防或治疗癌症的其它药物。
合适的容器包括例如安瓿、针剂药水瓶、注射器等。容器可由多种物质(如玻璃或塑料)形成,容器盛有或容纳对于治疗由小的组合物并且可以具有无菌接入端(例如该容器可以是静脉溶液包或具有可被皮下注射针头刺穿的塞子的瓶)。组合物中的至少一种活性药剂是本发明抗体或抗原结合片段。标签或药品说明书表明该组合物在关于抗体和提供的任何其它药物的用药量的间隔时间的具体指导下被用于治疗遭受代谢相关的疾病、病症或症状的个体的代谢相关疾病、病症或症状。该制品还可以包括第二容器、所述第二容器包含药用稀释缓冲液、加注射用抑菌水、磷酸盐缓冲液、Ringer氏溶液和葡萄糖溶液。该制品还可以包括从商业和使用者角度看是需要的其它物质,包括其它缓冲、稀释剂、过滤器、针头和注射器。使用“药品说明书”通常包括在治疗产品的商业包装中的说明书,其包含关于指示、用法、剂量、给药、禁忌、与所包装产品结合的其它治疗产品和/或关于使用这些治疗产品的警告等的信息。
制品还可以包括其它组分,制品的每种组分可以包装在单个容器内并且可以将所有多个容器放置在单个包装内。
发明详述
1.定义:
本文所述“抗体”由四条肽链即由二硫键互联的两条重链(H)和两条轻链(L)组成的免疫球蛋白分子,每条重链包含重链可变区(HVR或VH)和重链恒定区,重链恒定区包含CH1、CH2和CH3三个结构域,每条轻链包括轻链可变区(LVR或VL)和轻链恒定区,轻链恒定区包含一个结构域(CL1),VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区,其中散布着较保守的被称为框架区(FR)的区域,每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,从氨基末端到羧基末端按下列次序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。本文中,重链恒定区可选自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,优选IgG4,而轻链恒定区选自κ或λ。
术语“可变区”在本文中用于描述抗体的某些部分在抗体序列间有差异且涉及特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的区域。然而,变异性通常不是均匀分布于抗体的整个可变区的。它典型的集中于轻链和重链可变区中称作互补决定区(CDR)或高变区的三个区段。可变区中相对比较保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变区各自包含四个FR,它们大多采取β-折叠片构象,通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个CDR连接。每条链中的CDR通过FR非常接近的保持在一起,并与另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但展现出多种效应物功能,诸如抗体依赖性细胞毒性中抗体的参与。
术语“互补决定区”、“高变区”和“CDR”指抗体轻链或重链的可变区中存在的高变区或互补决定区(CDR)的一个或多个(参见,Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.,(1987))。这些术语包括Kabat等人定义的高变区(“Sequences ofProteinsofImmunologicalInterest,”KabatE.,等人,USDept.ofHealth andHumanServices,1983)或抗体三维结构中的高变环(Chothia和Lesk,J Mol.Biol.196901-917(1987))。每条链中的CDR通过构架区保持紧密靠近,并且与来自其它链的CDR一起促进抗原结合位点的形成。
术语“构架区”和“FR”指抗体轻链和重链的可变区内构架区的一个或多个(参见,Kabat,E.A.等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.,(1987))。这些术语包括抗体轻链和重链中位于氨基末端和第一CDR之间的那些氨基酸序列,介于CDR之间的那些以及第三CDR和恒定区起点之间的那些氨基酸序列。
CDR和FR残基可以根据标准序列定义(Kabat等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInteres,NationalInstitutesofHealth,BethesdaMd.(1987))和结构定义(Chothia和Lesk,J.Mot.Biol.196:901-217(1987))来确定。
在本文指出时,参考Kabat,E.A.,等人,SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md.(1987)和(1991)的编号方案。Kabat利用为所列序列中每个氨基酸分配残基编号的方法,并且分配残基编号的该方法已经成为本领域的标准。当明确指出使用Kabat编号时,本说明书遵循Kabat编号方案。当未指出Kabat编号时,使用顺序氨基酸序列编号(即,序列中的氨基酸使用顺序整数(1、2、3等)以氨基末端到羧基末端的方向从左到右编号。
抗体对抗原或表位的“亲和力”是本领域很好理解的术语,并且表示抗体对表位结合的程度或强度。亲和力可以本领域已知的多种方式测量和/或表示,包括但不限于平衡解离常数(KD或Kd,它可以被定义为抗体的解离速率与结合速率的比率,即,Koff/Kon)、表观平衡解离常数(KD′或Kd′)、EC50(实现与抗原结合50%时所需要的量)和IC50(实现竞争测定中50%抑制所需的量);人源化抗体的相对亲和力也可以通过与例如相关的鼠或嵌合抗体比较来确定。对于本发明目的而言,亲和力是结合抗原或表位的具体抗体群体的平均亲和力。抗体的亲和力可以使用酶联免疫吸附测定(ELISA)或荧光激活的细胞分选(FACS)测定来测量,本文实施例采用了ELISA方法测定本发明抗体与Claudin18.2结合的亲和力,参见实施例所述。
2.本发明抗体的制备方法
本发明抗体可以通过任何可用的方法生产,例如重组表达技术。编码与恒定区可操作连接的轻链和重链可变区的核酸可以被插入表达载体。轻链和重链可以在相同或不同表达载体中克隆。编码免疫球蛋白链的DNA区段可以被可操作连接至确保免疫球蛋白多肽表达的表达载体的控制序列。表达控制序列包括但不限于启动子(例如,天然结合的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件和转录终止序列。在一个实施方案中,表达控制序列是能够转化或转染真核宿主细胞的载体中的原核启动子系统。一旦载体被引入适当的宿主,宿主被保持在适合高水平表达核苷酸序列和收集并纯化抗体的条件下。
表达载体可以是在任何宿主生物体中可复制的,作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分。在一个实施方案中,表达载体含有选择标记(例如,氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性或新霉素抗性)以允许检测经预期DNA序列转化的那些细胞。
表达载体可用于从任何宿主细胞表达本发明的抗体,包括原核宿主细胞(例如大肠杆菌)、酵母宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、植物宿主细胞和昆虫宿主细胞。
在一个实施方案中,使用大肠杆菌生产本发明抗体。适合这种应用的其他原核宿主包括杆菌,例如芽孢杆菌和其他肠杆菌科,例如沙门氏菌属、赛氏杆菌属和各种假单胞杆菌种。在这些原核宿主中,还可以制备表达载体,该表达载体通常含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。此外,将存在任何数目的多种公知启动子,例如乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、β-内酰胺酶启动子系统或来自λ噬菌体的启动子系统。启动子通常任选地与操纵子序列一起控制表达,并且具有核糖体结合位点序列等,用于起始和完成转录和翻译。
其他微生物例如酵母也可用于表达本发明抗体。例如,酵母菌属可用作酵母宿主,具有含有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列及所需其他序列的适合启动子。用于酵母表达技术的启动子包括3-磷酸甘油酸激酶和其他糖酵解酶启动子。可诱导的酵母启动子包括但不限于来自醇脱氢酶、异细胞色素C和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
在另一个实施方案中,哺乳动物组织细胞培养物可用于表达和生产本发明抗体。任何哺乳动物组织细胞可以用于此类方法,并且本领域已经开发了能够分泌异源蛋白(例如完整免疫球蛋白)的许多适合的宿主细胞系,包括哺乳动物BHK或CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞系、优选骨髓瘤细胞系或转化的B细胞或杂交瘤。在一个实施方案中,细胞是非人的。哺乳动物细胞的表达载体可以包括表达控制序列,例如复制起点、启动子和增强子,以及必要的加工信号位点,例如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点和转录终止子序列。在一个实施方案中,表达控制序列是源自免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等的启动子。
含有感兴趣的多核苷酸序列(例如重链和轻链编码序列和表达控制序列)的载体可以通过公知方法转移至宿主细胞,所述方法根据细胞宿主类型而改变。例如,氯化钙转染常用于原核细胞,而磷酸钙处理、电穿孔、脂质转染、生物弹道术或病毒转染可以用于其它细胞宿主。用于转化哺乳动物细胞的其他方法包括使用凝聚胺(polybrene)、原生质体融合、脂质体、电穿孔和显微注射。为了生产转基因动物,转基因可以被显微注射入受精卵,或者可以被引入胚胎干细胞基因组,此类细胞的核被转移入去核卵母细胞。
当编码重链和轻链的核酸分子被克隆入单独表达载体时,该载体可以被共转染以获得表达并组装完整免疫球蛋白。一经表达,完整抗体、其二聚体、单个的轻链和重链、或抗体的其它免疫球蛋白形式可以根据本领域的标准方法纯化,包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱色谱、HPLC纯化、凝胶电泳等。至少约90至95%同质性的基本上纯的免疫球蛋白可以被制备用于药物用途。在另一个实施方案中,至少约98至99%或更高同质性的基本上纯的人源化抗体可以被生产用于药物配制和方法。
因此,本发明提供了表达本发明抗体的方法,包括:(a)用编码本文所述抗体的核酸分子转化宿主细胞,和(b)在允许表达该抗体的条件下培养转化的宿主细胞。可以使用在载体上包括选择标记的已知技术,使得表达所述抗体的所述标记的宿主细胞可以容易被选择。
所述抗体的“抗原结合片段”或称为抗体的“抗原结合部分”指抗体保留了与抗原(如Claudin18.2)特异性结合能力的一个或多个片段。业已证明,抗体的抗原结合功能可由全长抗体的某些片段来实现。抗体的“抗原结合片段”的实例包括但不限于:(i)Fab片段,即由VL、VH、CL1和CH1结构域组成的单价片段;(ii)F(ab’)2片段,即由铰链区的二硫键连接的两个F(ab’)片段组成的二价片段;(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段;(iv)由抗体的单臂VL和VH结构域组成的Fv片段;(v)由VH结构域组成的dAb片段;以及(vi)CDR。此外,尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由不同的基因编码,但它们可通过重组方法,由一种合成的接头连接在一起而成为单独的相连的链,其中VL和VH区配对形成单价分子(称为单链Fv,scFv)。这样的单链抗体也涵盖在抗体的“抗原结合片段”范围内。
可以通过这样一种方法制备本发明所述抗体,该方法包括在允许抗体表达的条件下,培养含有编码该抗体的DNA序列并能表达该抗体的宿主细胞,然后从培养物中回收产生的抗体。
用来培养细胞的培养基可以是用于培养该宿主细胞的任何常规培养基,如基本培养基或含有适宜添加物的符合培养基。可以通过市售得到适宜的培养基,或根据已公开的制法制备适宜的培养基。然后可以通过常规方法从培养基中回收由该细胞产生的多肽,这些方法包括通过离心或过滤而从培养基中分离宿主细胞,用盐如硫酸铵沉淀上清液或滤液中的蛋白质成分,根据目的肽的种类而选用各种层析方法如例子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等进行纯化。
3.治疗方法和药剂
本发明提供了包含本发明的结合Claudin18.2的抗体或其抗原结合片段的药物组合物。本发明的药物组合物将与适当的载体、赋形剂以及其它制剂一起施用。这些制剂纳入配方是为了改善递送和耐受性等。在所有药剂化学家熟知的药典:雷氏药学大全(Remington′s Pharmaceutical Sciences,Mack Publishing Company,Easton,PA)中可找到大量适当的配方。
给药剂量随受试者年龄和体型大小、目标疾病、症状、施用途径等不同而调整。当本发明的抗体用来治疗成人的各种与癌症相关的病症和疾病时,可采用静脉给药本发明抗体,通常单剂按每公斤体重计约0.01至约20mg/kg给药,更优选的是约0.1至约15、约1至约10,或约3至约10mg/kg体重。根据病症的严重性,可对治疗的频度和持续时间进行调整。
已知有各种药物递送系统可用来施用本发明的药物组合物,例如包在脂质体、微颗粒、微胶囊中的胶囊化,能够表达变异病毒的重组细胞,受体介导的胞吞作用(参阅如Wu等人(1987),J.Biol.Chem.262:4429-4432)。给予药物的方法包括但不限于皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜,和口腔等途径。该药物组合物可采用任何方便的途径施用,如通过灌注或静脉团注、上皮和粘膜层(如口腔粘膜、直肠和小肠粘膜)吸收,并可与其它生物活性药剂一起施用。施用方式可为全身性或局部性施用。
该药物组合物也可通过液囊递送,尤其是通过脂质体液囊递送(参阅Langer(1990)Science249:1527-1533;Treat等人(1989)in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez Berestein and Fidler(编著),Liss,New York,第353-365页;Lopez-Berestein,同上,第317-327页)。
在某些情况下,该药物组合物可以受控释放系统递送。在一个实施方案中,可使用泵(参阅Langer,如上;Sefton(1987)CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201)。在另一个实施方案中,可采用聚合物材料(参阅Medical Applications of Controlled Release,Langerand Wise(编著),CRC Pres.,Boca Raton,Florida(1974)。关于其它受控释放系统的讨论见Langer(1990)Science249:1527-1533。
注射制剂可包括用于静脉内、皮下、皮内和肌肉内注射、滴注等的剂型。这些注射制剂可用已公开的方法制备。例如,注射制剂可通过将抗体或其盐溶于、悬浮于或乳化于惯常用于注射的无菌水介质或油介质的方式来制备。用于注射的水性介质有,例如生理盐水、含有葡萄糖和其它辅助剂的等渗溶液等。它们可与适当的增溶剂如醇(如乙醇)、多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)、非离子型表面活性剂[如聚山梨醇酯80、HCO-50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加成物)等结合使用。所用的油介质有,如芝麻油、大豆油等。它们可与增溶剂如苯甲酸苄酯、苯甲醇等结合使用。这样制备的注射剂最好封装在适当的安瓿瓶中。
单一治疗和联合治疗本发明的抗体和抗体片段对于治疗可通过破坏细胞间的紧密连接,使Claudin18.2无法发挥其正常功能而得到改善。
本发明涵盖联合治疗,其中结合Claudin18.2的抗体或抗体片段与一种或多种治疗药剂(或称第二种治疗药剂)联合施用。共同给药和联合治疗并不限于同时给药,而是还包括在涉及给予患者至少一种其它治疗药剂的疗程中至少给予一次抗Claudin18.2抗体或抗体片段的治疗方案。第二种治疗药剂可能为另一种胃癌症(如胃癌)治疗药物。
本发明还包括本文所述的任何抗Claudin18.2抗体或抗原结合片段在制备治疗疾病或症状的药物中的应用,其中的疾病或症状是通过破坏细胞间的紧密连接,使得Claudin18.2无法发挥其正常功能而实现。
本发明的一方面,提供了一种药物组合物,其包括本发明与Claudin18.2结合的抗体或其抗原结合片段,以及药学上可接受的载体。
在本文中,如无矛盾或特别说明,药物、药物组合物和药物制剂(药剂)可以互换使用。在本文中,药学上可接受的辅料指无毒的填充剂、稳定剂、稀释剂、载体、溶剂或其他制剂辅料。例如,稀释剂、赋形剂,如微晶纤维素、甘露醇等;填充剂,如淀粉、蔗糖等;粘合剂,如淀粉、纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和/或聚乙烯吡咯烷酮;崩解剂,如碳酸钙和/或碳酸氢钠;吸收促进剂,如季铵化合物;表面活性剂,如十六烷醇;载体、溶剂,如水、生理盐水、高岭土、皂粘土等;润滑剂,如滑石粉、硬脂酸钙/镁、聚乙二醇等。另外,本发明的药物组合物优选为注射剂。
在本发明的一些实施方案中,本发明药物组合物中的抗体或其抗原结合片段以1mg/ml至1000mg/ml的浓度存在,优选以10mg/ml至1000mg/ml的浓度存在,更优选以50mg/ml至500mg/ml的浓度存在,更优选以100mg/ml至300mg/ml的浓度存在。
本发明的药物组合物优选具有3.0至9.0的pH。其中,可进一步包含缓冲系统、防腐剂、表面张力剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在本发明的一个实施方案中,本发明的药物组合物是含水制剂。这种制剂通常是溶液或悬浮。本发明的具体实施方案中,该药物组合物是稳定的含水溶液。在本发明的另一个具体实施方案中中,该药物组合物是一种冻干制剂,在使用前医师或患者加入溶剂和/或稀释液溶解所述冻干制剂。
附图说明
图1为抗Claudin18.2抗体筛选-细胞ELISA结合活性图。
图2为抗Claudin18.2抗体筛选-增殖抑制活性图。
图3为抗Claudin18.2抗体筛选-抗体依赖性细胞毒性图。
图4为抗Claudin18.2抗体筛选-补体依赖性细胞毒性图。
图5(5-1,5-2)为候选抗体对KATO细胞裸鼠移植瘤模型相对肿瘤体积(RTV)的影响图。
图6(6-1,6-2)为候选抗体对NUGC细胞裸鼠移植瘤模型相对肿瘤体积(RTV)的影响图。
具体实施方式
实施例1表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞的构建
将编码人Claudin18.1及Claudin18.2抗原的pcDNA3.1载体(购自Invitrogen公司)转染HEK293细胞(购自ATCC),采用200μg/mL的遗传霉素作为筛选压力得到稳定表达Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。以Ganymed公司的Claudin18.2抗体IMAB362(自制,CHO-S细胞瞬转表达,并进一步层析纯化,参考实施例2及3,本发明中为BY0-0)为阳性抗体,通过FACS方法筛选稳定表达人Claudin18.1及Claudin18.2抗原的HEK293细胞。
实施例2候选抗体BY6-4表达载体的构建
将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的重链编码基因(包括重链可变区编码基因SEQ ID NO:59和恒定区IgG1编码基因SEQ ID NO:63)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATTC依次串联融合,并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点,将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.4(+)((购自Invitrogen公司))中并测序验证,得到抗体重链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY6-4。
将HindIII酶切位点(AAGCTT)、KoZAK序列(GCCGCCACC)、ATG、信号肽基因GAGAGAGACACACTCCTGCTATGGGTACTGCTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGT和抗体的轻链编码基因(包括轻链可变区编码基因SEQ ID NO:60和恒定区κ编码基因SEQ ID NO:64)、终止码TAA和EcoRI编码基因GAATTC依次串联融合,并使用化学合成的方式获得基因片段。通过EcoRI和HindIII位点,将上述片段插入真核表达质粒pCDNA 3.4(+)中并测序验证,得到抗体轻链的表达质粒PCDNA3.4(+)-BY6-4。
将BY6-1的重链编码基因(SEQ ID NO:53)和轻链编码基因(SEQ ID NO:54)、BY6-2的重链编码基因(SEQ ID NO:55)和轻链编码基因(SEQ ID NO:56)、BY6-3的重链编码基因(SEQ ID NO:57)和轻链编码基因(SEQ ID NO:58)、BY0-0的重链编码基因(SEQ ID NO:61)和轻链编码基因(SEQ ID NO:62),替换BY6-4的重轻链编码基因,可得到相应的重轻链表达质粒。
在知道所述抗体氨基酸序列的情况下,获得这些抗体的编码基因是本领域所熟知的。依据上述同样方法,根据不同候选抗体氨基酸序列,可以得到一系列候选抗体的表达质粒:BY5-1、BY5-2、BY5-3、BY5-4、BY5-5、BY5-6、BY5-7、BY5-8、BY5-9、BY6-5、BY6-6、BY6-7、BY6-8、BY6-9、BY6-10、BY6-11、BY6-12、BY6-13、BY6-14、BY6-15、BY6-16、BY6-17、BY6-18、BY6-19的重链及轻链表达质粒
各候选抗体的重链恒定区均为IgG1,轻链恒定区为κ。
实施例3抗Claudin18.2抗体的表达、纯化
使用实施例2所述DNA构建体,分别瞬转至CHO-S细胞(购自Invitrogen公司),表达目的抗体,按照CHO-S细胞操作手册(FreedomTMCHO-STMKitUSER GUIDE),在质粒转染前一天将细胞密度调整至1x106个/毫升。在质粒转染当天,与转染试剂混合后加入EXPICHOEXPRESSION MEDIUM细胞培养基(购自Invitrogen公司)中,37℃,8%CO2持续培养至第8天后收集细胞液,采用离心方式去除细胞,0.2μm过滤后,ProteinA亲和层析纯化,收集的样品的pH调至5.5,2~8℃保存。纯化后的抗体进行SDS PAGE、SEC检测,纯度在95%以上。
实施例4特异性与亲和力鉴定
以Claudin18.2 N端胞外结构域的合成肽部分为抗原,通过ELISA包被稳转Claudin18.2及Claudin18.1的HEK293细胞对抗体进行ELISA筛选,采用双抗体夹心法检测(以0.1mg/mL的多聚赖氨酸包被96孔细胞培养板,5min后,除去包被液,加入5×104/孔HEK293-Claudin18.2或HEK293-Claudin18.1细胞,细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h贴壁后,去上清,每孔加PBST洗涤细胞3次,以100μl/孔加入梯度稀释抗体溶液,37℃2小时,用洗涤液洗板3次;稀释液(使用洗涤液配置2%牛血清白蛋白溶液)1/5000稀释HRP标记二抗(编号ab6858,产品来源于Abcam公司),以100μl/孔加至酶标板内,37℃1小时;用洗涤液洗板3次;以100μ1/孔加入TMB显色液,置室温避光反应5~10分钟,以50μl/孔加人终止液终止反应,并在波长450nm处测定吸光度),测定各候选抗体与Claudin18.2的EC50值,并以BY0-0的EC50值为基准,计算各候选抗体的相对结合活性(结构见表2)。计算方法如下,相对结合活性=参考品BY0-0的EC50/各候选抗体的EC50值。
表2各候选抗体的相对结合活性
细胞ELISA结合活性结果表明,候选抗体的特异性较好,与Claudin18.1均不结合,但是与Claudin18.2结合活性有显著差异,其中BY6-1、BY6-2、BY6-3、BY6-4、BY6-6、BY6-7、BY6-8、BY6-9、BY6-13及BY6-19与Claudin18.2的结合活性较优,而BY5-2、BY5-3、BY5-4、BY5-6、BY5-7、BY5-8、BY6-10、BY6-12、BY6-14、BY6-17、BY6-18与Claudin18.2结合活性则较差。
实施例5细胞体外功能活性
抗Claudin18.2抗体介导四种独立的高度有效的作用机制来诱导肿瘤细胞的杀伤和凋亡:抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、补体依赖性细胞毒性(CDC)、诱导肿瘤细胞表面上的靶标交联诱导的凋亡和直接抑制增殖。第二轮抗体筛选是对第一轮全人源抗体库筛选出来的亲和力较高的7个抗体(BY6-1、BY6-2、BY6-3、BY6-4、BY6-6、BY6-7、及BY6-9)进行进一步的细胞模型上的功能性(ADCC、CDC、增殖抑制)鉴定,为临床候选药物的确定提供依据。
(1)增殖抑制活性
利用CCK8法研究抗Claudin18.2抗体对KATOIII细胞(购自ATCC)的增值抑制作用:取对数期生长的KATO III细胞,用IMDM(购自Invitrogen)+10%FBS培养基调整细胞浓度到2×105/ml,37℃,5%CO2培养箱中待用。将样品及参考品(Ch163,或称BY0-0)用IMDM+5%FBS培养基预稀释终浓度为400μg/ml,然后进行2倍稀释,共14个梯度:400ug/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml、6.25μg/ml、3.125μg/ml、1.56μg/ml、0.78μg/ml、0.39μg/ml、0.19μg/ml、0.097μg/ml、0μg/ml。在平底96孔板中每孔加入60ul细胞悬液,再依次加入梯度稀释好的抗CLDN18.2抗体60μl。轻轻震荡,混匀。细胞培养板置含5%CO2的37℃的培养箱孵育72h。孵育结束后,加入CCK-8显色液,12μl/孔,置含5%CO2的37℃的培养箱孵育2-4h。在450nm波长处读取各孔吸光度值。
数据处理使用GraphPad.Prism.v5.01软件,计算样品和参考品的IC50值。试验结果如图2所示。
增殖抑制活性结果表明,候选抗体BY6-2、BY6-3、BY6-4的抗体的体外细胞增殖抑制效果明显。
(2)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)
以稳转HEK18.2细胞作为靶细胞,从新鲜的人外周血中分离出来的PBMC细胞作为效应细胞检测待检抗体的ADCC活性。分别采用胰酶消化的NUGC细胞(购自JCRB)和HEK18.2细胞作为靶细胞对7种抗体进行检测,每孔5000个细胞。
试验前一天分别提取2个健康自愿者各30ml血液中的PBMC,以RPMI-1640(购自Invitrogen)+10%FBS培养过夜,效应细胞每孔使用2.5×105个。受试药初始浓度为10μg/ml(使用前稀释到40μg/ml),以5倍稀释法稀释至8个样品。采用RPMI-1640+2%FBS(灭活血清)为ADCC的实验培养基。
结果计算方法
ER=ER孔吸光度-CMB孔吸光度
ESR=ESR孔吸光度-CMB孔吸光度
TSR=TSR孔吸光度-CMB孔吸光度
TMR=TMR孔吸光度-VCC孔吸光度
细胞毒性(%)=(ER-ESR-TSR)/(TMR-TSR)×100%)
死细胞和受损细胞的量通过Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST试剂盒(购自日本同仁化学)进行检测。该试剂盒是通过测定细胞释放到培养基中的乳酸脱氢酶(LDH)活性进而测定细胞损害。试验结果如图3所示。
ADCC活性结果表明,候选抗体BY6-1、BY6-2、BY6-3、BY6-4的抗体的体外ADCC活性抑制效果明显。
(3)补体依赖性细胞毒性
利用CCK8方法检测抗Claudin18.2抗体、人血清与HEK8.2细胞作用后的CDC效应。补体裂解试验用血清取自于健康自愿者,600g离心20min,收获血清,并保存在-20℃。HEK18.2细胞用RPMI-1640完全培养基于37℃、5%CO2条件下培养至对数生长期。消化HEK18.2细胞,使用无血清RPMI-1640培养基洗两遍。细胞计数,并用无血清RPMI-1640培养基配制成含5×105/ml的细胞悬液。筛选抗体常规稀释1000μg/mL(用RPMI-1640培养基),5倍梯度继续稀释(1000、300、100、30、10μg/mL);阳性对照抗体Rituxan(购自罗氏)常规稀释500μg/mL(用RPMI-1640培养基),5倍梯度稀释(500、100、20、4μg/mL)。每孔100μl,其中;RPMI-1640培养液悬浮的HEK18.2细胞的体积85μL,其细胞数量为5.0×104/孔,人血清(补体)5μL(1:30稀释);不同浓度的抗体10μL(阳性对照加稀释抗体用的RPMI-1640培养基,同时设立无细胞的培养基对照孔);筛选抗体的终浓度为(100、30、10、3、1μg/mL),Rituxan单抗的终浓度为(50、10、2、0.4μg/mL)。上述96孔细胞培养板置于5%CO2,于37℃培养4小时,加入10微升CCK8。4小时后,检测吸光度:放入酶标仪内测读:波长为450nm;
计算处理样品实际吸光读数:处理样品孔吸光读数-无细胞培养基对照孔吸光读数。
细胞死亡率(%)计算:
[(未加抗体药物孔最大实际吸光值-处理样品实际吸光值)÷未加抗体药物孔最大实际吸光值]×100%
试验结果如4所示。
CDC活性结果表明,候选抗体BY6-1、BY6-3、BY6-4的抗体的体外细胞CDC活性效果明显。
实施例6体内抑瘤活性
使用表达Claudin18.2的人胃癌KATO(购自:ATCC)及NUGC细胞系(购自:JCRB)构建裸鼠(购自:北京维通利华实验动物技术有限公司)皮下移植瘤模型,采用瘤块接种法。
无菌条件下收集KATO及NUGC细胞,用灭菌生理盐水调整细胞密度至1×107vc/ml,取0.2ml接种于裸鼠腋窝皮下,待肿瘤生长至直径1000mm3大小,无菌条件下取出,切成1mm×1mm大小的瘤块,均匀接种于裸鼠腋窝皮下。待肿瘤体积长至100~300mm3大小时,按肿瘤体积大小进行筛选,瘤体积过大及未成瘤者不予入选,随机分组每组10只,KATO细胞、NUGC细胞各5组,分别腹腔注射给药BY0-0、BY6-1、BY6-2、BY6-4,给药剂量为10mg/kg/只,阴性对照组给予PBS,在4周中,每周周一、周四给药两次,连续给药7次,首次给药当天计为D0,每周两次检测小鼠的肿瘤生长(测小鼠体重、游标卡尺测量肿瘤长短计算体积(对照组肿瘤体积超过1000mm3即可结束实验))。
肿瘤瘤重抑制率(%)=(对照组肿瘤瘤重-给药组肿瘤瘤重)/对照组肿瘤瘤重×100%
试验结果如表3-1、3-2,图5-1、5-2及6-1/6-2所示。
表3-1抗Claudin18.2抗体对KATO细胞裸鼠移植瘤生长的影响
表3-2抗Claudin18.2抗体对NUGC细胞裸鼠移植瘤生长的影响
两种人胃癌细胞系小鼠异种移植模型试验结果表明,候选抗体抑制人胃癌KATO及NUGC细胞裸鼠异体移植瘤生长的作用与剂量呈正相关。在一定的剂量和给药时间内对人胃癌KATO及NUGC细胞裸鼠异体移植瘤的生长有明显的抑制作用。在BY6-1、BY6-2、BY6-4三种候选抗体中,BY6-4在两种胃癌细胞的裸鼠异体移植瘤中效果最优。
实施例7稳定性实验
考察候选抗体在高温、强光、反复冻融、强酸、强碱条件等因素影响下的稳定性并按照检验重点考察项目进行检测。具体实验设计、检测项目、取样方式如表4-1、表4-2、表4-3所示;稳定性结果见表4-4。
表4-1候选抗体成药性分析实验设计
*每个考察条件放置相同包装的buffer,用于空白对照。
表4-2候选抗体成药性分析检测方法
表4-3候选抗体成药性分析取样表格
表4-4候选抗体稳定性实验结果
零点检测结果显示,CHO-S表达及一步亲和纯度的抗体,SEC检测单体纯度均高于98%,IEX检测主峰含量70%左右,8种抗体无明显差异,羧肽酶酶切后检测,赖氨酸的修饰比例不同,除BY6-15外,7种抗体的赖氨酸修饰比例3%-5%,BY6-15赖氨酸修饰比例10%左右,SDS-PAGE结果显示抗体分子量大小正常,轻重链完整,8种抗体无明显的差异,与Claudin18.2的相对结合活性差异比较大,BY6-1、BY6-2、BY6-3与BY6-4相对BY0-0的活性较高,BY6-6、BY6-15与BY6-19相对BY0-0的活性较低,但是与抗体筛选阶段的相对活性一致。
高温稳定性实验结果显示:1)SEC检测:8种抗体高温稳定性的SEC检测无显著性差异,20天50℃高温检测的SEC结果均等于或优于原研对照抗体163E12;2)IEX检测:除BY6-15在20天50℃高温主峰比例较低,酸峰比例较高外,其余7种抗体的20天50℃高温稳定性IEX检测无显著差异;3)SDS-PAGE:非还原SDS结果中,BY6-3纯度略低;4)相对结合活性:8种抗体的相对结合活性随着50℃高温孵育时间的延长均呈下降趋势,其中BY6-1和BY6-4的相对结合活性优于BY0-0,BY6-2和BY6-3的相对结合活性与BY0-0较一致,BY6-6、BY6-15和BY7-1相对结合活性则偏低。
强酸稳定性实验结果显示:1)各抗体的SEC、SDS及IEX的主峰比例均呈下降趋势,其中BY6-3/4的SEC、SDS与IEX的主峰下降比例相比其他抗体较为显著。2)BY6-3/4抗体的相对结合活性在稳定性研究期间呈下降趋势,但仍然是对照抗体相对活性的80%;BY7-1相对结合活性在起始点偏低(59.2%),但是在稳定性研究中相对活性升高(130.4%);其余各抗体的相对结合活性在稳定性研究期间无显著变化趋势。BY6-6及BY6-15的相对结合活性起始点和终点仍较低。
光照稳定性实验结果显示:1)SEC检测:在稳定性研究期间,各抗体SEC主峰纯度均呈下降趋势,但都不低于对照抗体BY0-0;2)IEX检测:在稳定性研究期间,各抗体的IEX主峰比例均下降,酸峰比例均上升,除BY6-3的主峰纯度略低外,其余各抗体的主峰和酸峰比例无明显差异;3)SDS-PAGE:除BY6-6的还原SDS-PAGE主带纯度偏低,其余各抗体无显著差异;4)相对结合活性:在稳定性研究期间,各抗体无显著变化趋势。
IEX检测BY6-3主峰纯度下降显著,约20%,BY6-1/2主峰纯度下降10%,BY6-6/16与BY6-19相对结合活性偏低,其他无显著差异。
反复冻融稳定性实验结果显示:1)SEC及IEX检测:在稳定性研究期间,各抗体无显著变化趋势;2)SDS-PAGE:BY6-6的轻重链含量偏低,其他抗体无明显差异;3)相对结合活性:BY6-1//2/3/4/6相对活性均显著降低,只有BY6-1相对活性高于对照80%,且BY6-15与BY6-19相对活性无变化。提示BY6-1//2/3/4/6尽量避免反复冻融。
序列表
<110> 北京凯因科技股份有限公司
<120> 一种结合密蛋白的用于治疗癌症的人源化抗体
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Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 40
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 41
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 42
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 43
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 44
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 45
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 46
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 47
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 48
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 49
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Thr Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 51
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Thr Asn Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Glu Glu Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Leu Gly Phe Gly Asn Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser
20 25 30
Gly Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Lys
<210> 53
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
caggtgcagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgccag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggccagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180
gccgaggagt tcaagggcag gttcgtgttc agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac 240
ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt acttctgcgc caggctgggc 300
ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 54
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60
atgaactgca agagcagcca gaccctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc caccaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 55
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
caggtgcagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgccag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggccagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180
gccgaggagt tcaagggcag gttcgtgttc agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac 240
ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt acttctgcgc caggctgggc 300
ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 56
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60
atgaactgca agagcagcca gaccctgctg aacaccggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc caccaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 57
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
caggtgcagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgccag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggccagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180
gccgaggagt tcaagggcag gttcgtgttc agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac 240
ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt acttctgcgc caggctgggc 300
ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 58
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60
atgaactgca agagcagcca gaccctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc caccaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacacctac 300
cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 59
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
caggtgcagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgccag cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta cagcttcacc aactacggca tgaactgggt gaggcaggcc 120
cccggccagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180
gccgaggagt tcaagggcag gttcgtgttc agcctggaca ccagcgtgag caccgcctac 240
ctgcagatca gcagcctgaa ggccgaggac accgccgtgt acttctgcgc caggctgggc 300
ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccctgg tgaccgtgag cagc 354
<210> 60
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60
atgaactgca agagcagcca gaccctgctg aacagcggca acaacaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc caccaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagatcaag 339
<210> 61
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
cagatccagc tggtgcagag cggccccgag ctgaagaagc ccggcgagac cgtgaagatc 60
agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc aactacggca tgaactgggt gaagcaggcc 120
cccggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg atcaacacca acaccggcga gcccacctac 180
gccgaggagt tcaagggcag gttcgccttc agcctggaga ccagcgccag caccgcctac 240
ctgcagatca acaacctgaa gaacgaggac accgccacct acttctgcgc caggctgggc 300
ttcggcaacg ccatggacta ctggggccag ggcaccagcg tgaccgtgag cagc 354
<210> 62
<211> 339
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gacatcgtga tgacccagag ccccgacagc ctggccgtga gcctgggcga gagggccacc 60
atcaactgca agagcagcca gagcctgctg aacagcggca accagaagaa ctacctgacc 120
tggtaccagc agaagcccgg ccagcccccc aagctgctga tctactgggc cagcaccagg 180
gagagcggcg tgcccgacag gttcagcggc agcggcagcg gcaccgactt caccctgacc 240
atcagcagcc tgcaggccga ggacgtggcc gtgtactact gccagaacga ctacagctac 300
cccctgacct tcggcgccgg caccaagctg gagctgaag 339
<210> 63
<211> 990
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 63
gccagcacca agggccccag cgtgttcccc ctggccccca gcagcaagag caccagcggc 60
ggcaccgccg ccctgggctg cctggtgaag gactacttcc ccgagcccgt gaccgtgagc 120
tggaacagcg gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc ccgccgtgct gcagagcagc 180
ggcctgtaca gcctgagcag cgtggtgacc gtgcccagca gcagcctggg cacccagacc 240
tacatctgca acgtgaacca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa ggtggagccc 300
aagagctgcg acaagaccca cacctgcccc ccctgccccg cccccgagct gctgggcggc 360
cccagcgtgt tcctgttccc ccccaagccc aaggacaccc tgatgatcag caggaccccc 420
gaggtgacct gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaggacc ccgaggtgaa gttcaactgg 480
tacgtggacg gcgtggaggt gcacaacgcc aagaccaagc ccagggagga gcagtacaac 540
agcacctaca gggtggtgag cgtgctgacc gtgctgcacc aggactggct gaacggcaag 600
gagtacaagt gcaaggtgag caacaaggcc ctgcccgccc ccatcgagaa gaccatcagc 660
aaggccaagg gccagcccag ggagccccag gtgtacaccc tgccccccag cagggacgag 720
ctgaccaaga accaggtgag cctgacctgc ctggtgaagg gcttctaccc cagcgacatc 780
gccgtggagt gggagagcaa cggccagccc gagaacaact acaagaccac cccccccgtg 840
ctggacagcg acggcagctt cttcctgtac agcaagctga ccgtggacaa gagcaggtgg 900
cagcagggca acgtgttcag ctgcagcgtg atgcacgagg ccctgcacaa ccactacacc 960
cagaagagcc tgagcctgag ccccggcaag 990
<210> 64
<211> 321
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 64
aggaccgtgg ccgcccccag cgtgttcatc ttccccccca gcgacgagca gctgaagagc 60
ggcaccgcca gcgtggtgtg cctgctgaac aacttctacc ccagggaggc caaggtgcag 120
tggaaggtgg acaacgccct gcagagcggc aacagccagg agagcgtgac cgagcaggac 180
agcaaggaca gcacctacag cctgagcagc accctgaccc tgagcaaggc cgactacgag 240
aagcacaagg tgtacgcctg cgaggtgacc caccagggcc tgagcagccc cgtgaccaag 300
agcttcaaca ggggcgagtg c 321
Claims (11)
1.一种结合密蛋白18.2的人源化抗体,所述抗体包括重链高变区(HCDR)和轻链高变区(LCDR),所述重链高变区包括:
氨基酸序列为GYX1FTNYG的HCDR1,氨基酸序列为INTNTGEP的HCDR2,以及氨基酸序列为ARLGFGNAMDY的HCDR3;所述轻链高变区包括:
氨基酸序列为QX2X3LNX4X5NX6KNY的LCDR1,氨基酸序列为WAX7的LCDR2,以及氨基酸序列为QX8DYX9YPLT的LCDR3,
其中所述HCDR1中氨基酸X1选自S或T;
所述LCDR1中氨基酸X2选自T或S,X3选自L或V,X4选自T或S,所述X5选自G或S,X6选自Q或N;
所述LCDR2中氨基酸X7选自T或S;
所述LCDR3中氨基酸X8选自N或Q,X9选自T或S。
2.根据权力要求1所述的人源化抗体,其中所述抗体包括重链高变区和轻链高变区,其中重链高变区包含如下CDR序列,
氨基酸序列为GYSFTNYG(SEQ ID NO:1)、GYTFTNYG(SEQ ID NO:2)的CDR1(HCDR1);
氨基酸序列为INTNTGEP(SEQ ID NO:3)的CDR2(HCDR2);
氨基酸序列为ARLGFGNAMDY(SEQ ID NO:4)的CDR3(HCDR3);
所述轻链高变区包含如下CDR序列,
氨基酸序列为QTLLNTGNQKNY(SEQ ID NO:5)、QSVLNSGNQKNY(SEQ ID NO:6)、QSLLNSSNNKNY(SEQ ID NO:7)、QSVLNSSNNKNY(SEQ ID NO:8)、QTLLNSGNQKNY(SEQ ID NO:9)、QTLLNSGNNKNY(SEQ ID NO:10)、QTLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:11)、QTLLNSSNNKNY(SEQ IDNO:12)、QSLLNSSNQKNY(SEQ ID NO:13)、QSLLNSGNNKNY(SEQ ID NO:14)、QSLLNSGNQKNY(SEQID NO:15)、QSVLNSSNQKNY(SEQ ID NO:16)、QSVLNSGNNKNY(SEQ ID NO:17)、QTVLNSGNNKNY(SEQ ID NO:18)的CDR1(LCDR1);
氨基酸序列为WAT(SEQ ID NO:19)、WAS(SEQ ID NO:20)的CDR2(LCDR2);
氨基酸序列为QNDYTYPLT(SEQ ID NO:21)、QQDYTYPLT(SEQ ID NO:22)、QQDYSYPLT(SEQID NO:23)、QNDYSYPLT(SEQ ID NO:24)的CDR3(LCDR3)。
3.根据权力要求2所述的人源化抗体,其包含如下任意一组重链高变区和轻链高变区:
(1)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ ID NO:5的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:21的LCDR3;
(2)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ ID NO:6的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:22的LCDR3;
(3)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ ID NO:7的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:21的LCDR3;
(4)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ ID NO:8的LCDR1、SEQ ID NO:20的LCDR2、SEQ ID NO:23的LCDR3;(5)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ IDNO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ ID NO:9的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQID NO:24的LCDR3;
(6)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ ID NO:5的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:24的LCDR3;
(7)SEQ ID NO:1的HCDR1、SEQ ID NO:3的HCDR2、SEQ ID NO:4的HCDR3,和SEQ ID NO:9的LCDR1、SEQ ID NO:19的LCDR2、SEQ ID NO:21的LCDR3;
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4.根据权力要求1-3中任意一权利要求所述的人源化抗体,其中所述抗体具有如下的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)序列:
氨基酸序列为QVQLVQSGXa1ELKKPGASVKISCKASZH1MNWVRQAPGQGLKWMGZH2TYAEEFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYXa2CZH3WGQGTLVTVSS所示的VH;以及
氨基酸序列为DIVMTQSPDSLAVSLGERATMNCKSSZL1LTWYQQKPGQPPKLLIYZL2TRESGVPDRFSGSGSGTDFTLTISSLQAEDVAVYYCZL3FGAGTKLEIK所示的VL,
其中Xa1为P或S,Xa2为F或Y,ZH1、ZH2及ZH3分别为重链的三个CDR区,ZL1、ZL2及ZL3为轻链的三个CDR区,
其中ZH1的氨基酸序列为GYX1FTNYG,ZH2的氨基酸序列为INTNTGEP,ZH3的氨基酸序列为ARLGFGNAMDY;ZL1的氨基酸序列为QX2X3LNX4X5NX6KNY,ZL2的氨基酸序列为WAX7,ZL3的氨基酸序列为QX8DYX9YPLT;
X1选自S或T;
X2选自T或S;X3选自L或V;X4选自T或S;X5选自G或S;X6选自Q或N;X7选自T或S;X8选自N或Q;X9选自T或S。
5.根据权力要求4所述的人源化抗体,其中所述抗体具有如下所述的VH和VL序列,
氨基酸序列为SEQ ID NO:25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49或51所示的VH,以及
氨基酸序列为SEQ ID NO:26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50或52所示的VL。
6.根据权力要求5所述的人源化抗体,其中所述抗体具有如下任意一组所述的VH和VL序列,
SEQ ID NO:25所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:26所示氨基酸序列的VL;SEQ IDNO:27所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:28所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:29所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:30所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:31所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:32所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:33所示氨基酸序列的VH,以及SEQID NO:34所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:35所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:36所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:37所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:38所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:39所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:40所示氨基酸序列的VL;SEQID NO:41所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:42所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:43所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:44所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:45所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:46所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:47所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:48所示氨基酸序列的VL;SEQ ID NO:49所示氨基酸序列的VH,以及SEQ ID NO:50所示氨基酸序列的VL。
7.根据权利要求1-6中任意权利要求所述的人源化抗体,其中所述重链的恒定区选自人IgG系列,如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4,优选IgG1;所述轻链的恒定区选自κ或λ链。
8.一种分离的核酸分子,其编码权利要求1-7中任一权利要求所述的人源化抗体。
9.药物组合物,其包含权力要求1-7中任意一权利要求所诉人源化抗体,以及制药上可接受的赋形剂。
10.权利要求1-7中任一项所述的人源化抗体在制备具有治疗和/或预防癌症药物中的应用;其中所述癌症例如可以是包括胃肠道癌、胰腺癌、食道癌或非小细胞肺癌;所述胃肠道癌优选为晚期胃癌。
11.一种制品或药盒,包含容器和包装插页,其中所述容器中装有权力要求1-7中任意一权力要求所述的人源化抗体,或者权力要求9所述的药物组合物,所述包装插页上载有药物的使用说明书。
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