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CN111778353B - 用于鉴定普通小麦品种的snp分子标记以及snp分子标记检测方法 - Google Patents

用于鉴定普通小麦品种的snp分子标记以及snp分子标记检测方法 Download PDF

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CN111778353B
CN111778353B CN202010815179.1A CN202010815179A CN111778353B CN 111778353 B CN111778353 B CN 111778353B CN 202010815179 A CN202010815179 A CN 202010815179A CN 111778353 B CN111778353 B CN 111778353B
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Abstract

本发明涉及农业分子检测领域，具体涉及用于小麦品种鉴定的SNP分子标记组合以及SNP分子标记检测方法。本发明的96个SNP位点组合在我国1463份审定小麦品种中共检出192个等位变异，对小麦品种具有较高的分辨率，96个SNP引物及其引物组合均能稳定、重复、特异性扩增，便于推广应用。

Description

用于鉴定普通小麦品种的SNP分子标记以及SNP分子标记检测 方法
技术领域
本发明涉及农业分子检测领域，具体涉及用于鉴定普通小麦品种的SNP分子标记以及SNP分子标记检测方法。
背景技术
小麦是我国种植范围最广，消费面最宽，涉及三农面最大的粮食作物。我国是世界上最大的小麦生产国和消费国，对国际小麦市场具有举足轻重的影响。近年来，品种未审先推、制售假劣种子及套牌侵权等违法行为较为突出，造成了种子市场的混乱，严重影响了我国种业健康持续稳定发展，损害了育种家的权益和农民的利益。这些行为的发生，归根结底还是品种真实性鉴定问题。因此，制定小麦品种真实性分子快速鉴定规范是国家急需的技术。
品种真实性是将送验样品与其对应品种名称的标准样品比较，鉴定送检样品与标准样品是否相符。品种真实性鉴定，过去采用形态法(小区种植鉴定)、蛋白质电泳方法等，由于区分能力十分有限，特别是随着育种技术的进步，品种间差异越来越小，这些方法已完全不能满足准确、快速鉴定的需要。目前品种区分国际上主要推行SSR、SNP两种分子标记检测技术。近几年国内外的实践证明，SNP分子标记检测方法具有简单、经济、高效、检测周期短、数据可共享等优点，具有结果准确、规模化和自动化程度高的优势，是解决种子质量鉴定的有效手段，能够为种子市场监管提供有效的技术支撑，保障种子监管工作依法顺利开展。由于SNP标记技术经过10余年的发展，目前技术和平台已经较为成熟，具备普遍推行的条件。因此，制定小麦品种真实性SNP分子标记检测技术规范，从源头上保证品种的种子质量，发挥品种的应有作用，对于保证国家粮食安全，维护小麦种业健康持续稳定发展具有非常重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供96个小麦SNP分子标记的应用。
本发明的再一目的是提供鉴定小麦品种的SNP分子标记检测方法。
根据本发明的具体实施方式，提供了以下SNP位点组合用于鉴定小麦品种的应用，其中，所述SNP位点选自包括SNP位点WSNP01～SNP位点WSNP96的组合。
根据本发明的具体实施方式，通过对比待测样品与国家小麦审定标准样品的上述96个SNP位点检测结果，从而确定待测样品是否为真实的审定品种。
本发明筛选确定了96个SNP位点组合，所述96个SNP位点的物理位置是基于小麦品种中国春的全基因组序列比对确定的，所述小麦品种中国春全基因组序列的版本号为IWGSC RefSeqv1.0，所述96个SNP位点编号是WSNP01-WSNP96。
本发明提供了96个SNP位点组合可以形成用于鉴定小麦品种真实性、小麦分子育种或辅助小麦品种特异性鉴定。
本发明的再一目的在于提供了进行小麦品种真实性鉴定的方法。
根据本发明具体实施方式，用于普通小麦品种真实性鉴定的96个SNP位点编号、SNP所在的染色体、具体物理位置(参照中国春全基因组序列，版本号为IWGSCRefSeqv1.0)、脱氧核苷酸信息如下：
WSNP01位于1A染色体上第27215962位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP02位于1A染色体上第41817136位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP03位于1A染色体上第495285832位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP04位于1B染色体上第587992062位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP05位于1B染色体上第340381039位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP06位于1D染色体上第20306381位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP07位于1D染色体上第288318891位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP08位于1D染色体上第427323196位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP09位于2A染色体上第43371103位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP10位于2A染色体上第36393269位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP11位于2A染色体上第174150002位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP12位于2A染色体上第41105877位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP13位于2B染色体上第12003721位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP14位于2B染色体上第47427272位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP15位于2B染色体上第108910271位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP16位于2B染色体上第652578839位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP17位于2B染色体上第697446904位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP18位于2B染色体上第773821814位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP19位于2D染色体上第28783896位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP20位于2D染色体上第422881650位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP21位于2D染色体上第431959521位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP22位于2D染色体上第458920669位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP23位于2D染色体上第551877542位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP24位于2D染色体上第615715449位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP25位于3A染色体上第25908324位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP26位于3A染色体上第481678769位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP27位于3A染色体上第735293187位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP28位于3A染色体上第597917383位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP29位于3B染色体上第509365938位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP30位于3B染色体上第627720241位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP31位于3B染色体上第680735249位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP32位于3B染色体上第749862710位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP33位于3B染色体上第819302391位，其脱氧核苷酸为A或T；
WSNP34位于3D染色体上第56675266位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP35位于3D染色体上第537495536位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP36位于3D染色体上第578749369位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP37位于3D染色体上第611664812位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP38位于4A染色体上第584425606位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP39位于4A染色体上第116644494位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP40位于4A染色体上第532224647位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP41位于4A染色体上第669197675位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP42位于4B染色体上第36960078位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP43位于4B染色体上第527111678位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP44位于4B染色体上第179840525位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP45位于4B染色体上第636757506位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP46位于4D染色体上第11870112位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP47位于4D染色体上第364033217位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP48位于4D染色体上第118605639位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP49位于4D染色体上第367933139位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP50位于5A染色体上第448113730位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP51位于5A染色体上第478883696位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP52位于5A染色体上第455550448位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP53位于5A染色体上第500625774位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP54位于5A染色体上第591302258位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP55位于5A染色体上第695003171位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP56位于5B染色体上第6594624位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP57位于5B染色体上第11080396位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP58位于5B染色体上第281675472位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP59位于5B染色体上第485426049位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP60位于5D染色体上第82481988位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP61位于5D染色体上第302000445位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP62位于5D染色体上第370064912位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP63位于5D染色体上第495427294位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP64位于6A染色体上第51949801位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP65位于6A染色体上第617805673位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP66位于6A染色体上第615440555位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP67位于6A染色体上第77112398位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP68位于6A染色体上第445560400位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP69位于6A染色体上第457660545位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP70位于6A染色体上第579446448位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP71位于6B染色体上第22553387位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP72位于6B染色体上第27687594位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP73位于6B染色体上第158129211位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP74位于6B染色体上第227062800位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP75位于6B染色体上第439018758位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP76位于6B染色体上第630873069位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP77位于6B染色体上第659565617位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP78位于6B染色体上第682326705位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP79位于6D染色体上第86651424位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP80位于6D染色体上第133466400位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP81位于6D染色体上第351234720位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP82位于6D染色体上第438410250位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP83位于6D染色体上第4471905419位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP84位于7A染色体上第537642742位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP85位于7A染色体上第679816107位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP86位于7A染色体上第707833467位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP87位于7B染色体上第67705483位，其脱氧核苷酸为G或C；
WSNP88位于7B染色体上第605748172位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP89位于7B染色体上第678124448位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP90位于7B染色体上第721402941位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP91位于7D染色体上第87479998位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP92位于7D染色体上第349365912位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP93位于7D染色体上第411596748位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP94位于7D染色体上第430012769位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP95位于7D染色体上第452686835位，其脱氧核苷酸为G或C；
WSNP96位于7D染色体上第508179540位，其脱氧核苷酸为T或C。
根据本发明的小麦品种真实性SNP分子标记检测方法，用于检测所述的96个SNP位点的基因型的等位基因特异性引物组成如下：
WSNP01-FAM：5’GGAGAACAAAGCAGAAAAGCTGCAA3’
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WSNP25-FAM：5’CGATTGAATCTCAAGCGAACAAACG3’
WSNP25-HEX：5’GCGATTGAATCTCAAGCGAACAAACA3’
WSNP25-通用：5’TGTAGACATCTAGCAACCCCCTGAA3’
WSNP26-FAM：5’GGTTCGTGCAGCCCGTTCG3’
WSNP26-HEX：5’AAGGTTCGTGCAGCCCGTTCA3’
WSNP26-通用：5’GCGCCATCCTGGACTGCTTCAA3’
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WSNP27-HEX：5’ACGGGCGTAAAGGTAAGAAAGACTT3’
WSNP27-通用：5’TAGGCAAATGCGAGTGTCAATCAATGTTT3’
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WSNP30-HEX：5’GTAAGCTTTGCCTAGCTTTCCTAC3’
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WSNP91-通用：5’TACCTGACTGATTTCGCCCCTCATT3’
WSNP92-FAM：5’TGCCCTTTCAGGTACTACGAC3’
WSNP92-HEX：5’CTTGCCCTTTCAGGTACTACGAT3’
WSNP92-通用：5’GTCTTGGCTCGACAGGCGAGTT3’
WSNP93-FAM：5’CAGGGAAAGATCATTAACGTCAACC3’
WSNP93-HEX：5’GCAGGGAAAGATCATTAACGTCAACT3’
WSNP93-通用：5’GTCCCGACTTCGAATTAATGAAGCCAT3’
WSNP94-FAM：5’CAACCCAAAAGTATTAAAGCCGGC3’
WSNP94-HEX：5’ATCAACCCAAAAGTATTAAAGCCGGT3’
WSNP94-通用：5’CAACGAAAACCAGTTTGAGGGGAGAT3’
WSNP95-FAM：5’AGAACGGAATACCCATGTTTACCC3’
WSNP95-HEX：5’AGAACGGAATACCCATGTTTACCG3’
WSNP95-通用：5’CCTGATAAGACATGGAGGTTTTCTCTTAA3’
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WSNP96-HEX：5’TAGGGAATTCTTCTACTTTTCTAAACCA3’
WSNP96-通用：5’GTTCAGTGTTGGGTCCGTCTGTAAA3’。
本发明的有益效果：
本发明的96个SNP位点组合及其对应的特异性KASP引物组合在育成小麦品种鉴定中具有如下特点：
1、96个SNP标记在我国1463份审定小麦品种中共检出192个等位变异，平均每个位点MAF值为0.42，每个标记的平均PIC值为0.38，对小麦品种具有较高的分辨率；
2、在育成小麦品种中每个位点的等位变异分布频率相对均匀；
3、具有定位信息、物理位置信息，且单位点、单拷贝；
4、96个SNP引物及其引物组合均能稳定、重复、特异性扩增，便于推广应用；
5、筛选的96个SNP位点是将我国所有目前已知品种进行基因分型后才最终筛选并确定的；
6、96个SNP位点之间无联锁关系；
7、96个SNP位点基本均匀分布于小麦21对染色体上；
8、96个SNP位点兼容芯片平台、博奥微流控芯片平台、定点测序平台和基于KASP技术的LGC-SNPline平台；
9、96个SNP位点的成本低、易实现规模化检测，应用本发明的SNP标记及引物组合在室内实验室1天即可完成1536份样品的真实性鉴定和SNP指纹构建，大幅度节约人力、物力、财力、时间和土地资源成本。
附图说明
图1显示根据本发明的具体实施例筛选的8061个扩展位点染色体分布情况；
图2为根据本发明的具体实施例筛选的8061个扩展位点MAF统计图；
图3为根据本发明的具体实施例筛选的8061个扩展位点PIC值统计图；
图4显示根据本发明的具体实施例筛选的420个候选核心位点染色体分布；
图5为根据本发明的具体实施例筛选的420个初选核心位点MAF值统计图；
图6显示根据本发明的具体实施例不同位点组合数目的品种识别率。
图7为75份育成品种聚类分析图，其中，(a)基于SNP标记的聚类分析；(b)基于SSR标记的聚类分析；图编号对应的品种名称见表1，红色圆圈表示亲缘关系较近的品种。
具体实施方式
根据本发明具体实施方式的小麦品种真实性SNP分子标记检测方法包括以下步骤：
(1)提取送检样品和标准样品的种子或其他组织或器官的DNA，混合DNA样品至少含有30个以上的不同个体，为了保证混合DNA样本代表本品种100％的遗传变异，选取的个体越多越好；
(2)DNA质量要求：用紫外分光光度计检测步骤(1)的DNA质量，要求OD260/280值在1.8-2.0之间，OD260/230值在2.0以上，当不去除RNA时，将工作液的DNA浓度调整至30ng/μL，当去除RNA时，将工作液的DNA浓度调整至20ng/μL，4℃备用；
(3)以步骤(2)的工作液DNA样本为模板、使用SNP引物配置反应体系，样品板设计：将DNA分别加入96孔板的中，每板设计两个NTC(灭菌水，无模板对照)，两个阳性内参(中国春和一个基因组DNA纯合的DH株系)和一个杂合内参(两个阳性内参的DNA样品等比例混合)，分别将送检样品和其对应的标准样品放在同一384孔板或1536孔板上，保证同时获得其基因型数据，将DNA样品分至PCR微孔板(384孔板或1536孔板)内，在Kraken软件编辑样品信息；
(4)对步骤(3)配制的反应体系进行PCR扩增，可在水浴PCR仪器或常规PCR仪上进行。
(5)分析待测样品和标准样品的基因型，PCR扩增结束后，使用荧光微孔板扫描仪检测PCR产物，使用Klaster caller软件分析待测样品和标准样品基因型；
(6)数据分析，利用Kraken软件直接记录待测样品和标准样品在每个位点的基因型。首先观察NTC(无模板对照)是否在原点处，若漂移出限定范围，则样品可能被污染，数据不可取，然后观察内参基因型是否正确，若不正确，则数据不可取，选择分型明确，缺失数据少，聚类紧凑的数据提交；
(7)结果统计与记录，A:样品的SNP指纹构建采用两次独立平行试验，所有样品用96个标记一次性全部基因分型的方式，两次指纹数据一致作为样品的真实指纹入库，不一致时采用第三次试验方法。B:真实性检测采取96个标记一次性全部基因分型的方式和两次独立平行试验方法，两次独立平行试验的基因分型结果一致作为送验样品的基因型，记录基因分型结果，统计送检样品和标准样品差异位点数，核实差异位点的引物编号。
实施例1确定本发明的分子标记
1)小麦品种鉴定扩展位点的筛选
利用SNP芯片扫描了190份代表样品，基于190份样品84661个SNP位点基因型数据进行分析。从中筛选出单拷贝SNP标记，并去除重复，进行连锁不平衡(linkagedisequilibrium,LD)分析，计算标记间的LD值，保留r2<0.8的标记，连同79个功能标记，共计8061个SNP构成小麦品种鉴定扩展位点。8061个扩展位点染色体分布情况见图1，D染色体组上SNP标记数量较少，共2054个。8061个扩展位点的MAF值分布情况见图2，77％的位点MAF值(最小等位变异频率)高于0.2(图2)。8061个扩展位点PIC值统计图如图3，PIC值(polymorphism information content，多态信息含量)的平均值为0.3，能较好的反应品种间的遗传多样性。
2)小麦品种鉴定初选核心位点的筛选
从扩展位点中筛选MAF>0.2、分布均匀的SNP标记作为初选核心位点，共计420个，每条染色体上有20个SNP标记。420个候选核心位点染色体分布情况见图4。420个候选核心位点的MAF值变化范围为0.24-0.5，77％的位点MAF值高于0.4(图5)。PIC值变化范围为0.3-0.41，平均值分别为0.37。
3)适于小麦品种指纹图谱构建的SNP位点筛选
获取420个SNP位点的侧翼序列，设计并合成KASP引物，从187份样品中选出95份代表性品种和一个阴性对照(H2O)，共96个样品，进行基因分型。420个位点有282个位点成功转化成KASP引物，转化效率为67％，而有些引物的特异性不好，造成其扩增产物不能够对品种进行准确基因分型，故难以转化。用1433份标准样品进行评价，确定了112个重复性、稳定性好以及基因分型质量佳的建库位点，用于标准样品DNA指纹数据库的构建。112个的建库位点的染色体分布，D染色体组标记最多，共42个；A、B染色体组各35个。第6同源群标记最多，共30个；第5同源群次之，共20个；第1同源群最少，仅7个。其中6B染色体上标记最多，共12个；5A染色体次之，共10个；1A和1B染色体上均只有一个标记。
4)适于小麦品种真实性鉴定的核心位点组合筛选
基于112个SNP位点1433份小麦标准样品指纹数据，分析最优核心位点组合数目。结果表明，不同位点的组合品种识别效率显著不同，最终确定用96个核心位点作为品种身份鉴定的首选标记(表1)，如图6所示，96个SNP位点的品种识别率为99.16％，平均基因多样性和多态性信息指数分别为0.5265和0.4355。
表1品种真实性鉴定的SNP位点(标记)的多态性信息
Figure BDA0002632425720000151
Figure BDA0002632425720000161
Figure BDA0002632425720000171
Figure BDA0002632425720000181
实例2 SNP标记用于小麦品种真实性鉴定和SNP指纹数据库构建
采用实施例1的96个SNP标记组合构建了我国1463份审定小麦品种标准样品的SNP指纹，去除同名品种后剩余1433份非同名小麦品种，依据1433份指纹数据进行聚类分析，结果表明，利用96个SNP标记能够区分99.16％的审定小麦品种，说明利用该套标记进行小麦品种真实性鉴定和标准样品SNP指纹数据库构建具备科学性、准确性、可行性、有效性和可操作性。
实施例3 SNP标记用于小麦品种遗传多样性和特异性鉴定实例
对75份选自十大生态麦区的代表性育成品种(表2)利用SNP和SSR技术分别构建了指纹，利用PowermakerV3.25软件分析SNP和SSR位点的遗传多样性指数，计算品种间的Nei's(1983)遗传距离，并进行UPOVE聚类分析，结果显示利用不同标记技术聚类结果相对一致(如图7)，如品种编号为14和70、48和68、34和71、56和51以及1、63和69，均在聚类图中优先聚在一起。说明利用SNP标记技术能够与SSR标记技术一样用于小麦遗传多样性分析、聚类分析，两者具有相同的效果，因此SNP标记能够辅助前期大样本量的特异性鉴定的筛查工作，减少的土地的浪费，节约了大量人力、物力和财力等成本。
表2 75份材料信息
Figure BDA0002632425720000182
Figure BDA0002632425720000191
序列表
<110> 北京市农林科学院
<120> 用于鉴定普通小麦品种的SNP分子标记以及SNP分子标记检测方法
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggagaacaaa gcagaaaagc tgcaa 25
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gagaacaaag cagaaaagct gcag 24
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gtgaacattc aggatatttg tgctgcata 29
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgtagtcctc cagaaaatcg 20
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gctcgtagtc ctccagaaaa tca 23
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggatctggac ggcttcccac tt 22
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
agatgttgag aacactttcg tccc 24
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gagatgttga gaacactttc gtcca 25
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cagagaagag ggcgtcagcg ta 22
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ggcaactcta acaaacacac tcc 23
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
agggcaactc taacaaacac actc 24
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gacgaactcg gcgggaccat tt 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
accggcgact ctcaagttga tg 22
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaccggcgac tctcaagttg ata 23
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgggaaacaa tgctcatagg gacaa 25
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gtaggatatc gcggaagacc ac 22
<210> 17
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtaggatatc gcggaagacc ag 22
<210> 18
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtgatctagc taggttgtcg gctaa 25
<210> 19
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
aaacatgtaa aactaacttc acataccca 29
<210> 20
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
acatgtaaaa ctaacttcac atacccg 27
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gacccttcga gaccctaccc at 22
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aacacattca gagaatatga ctaggg 26
<210> 23
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ataacacatt cagagaatat gactagga 28
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gcctgagcgg gcgtttggta a 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gcatacattc ctcctgttcg ac 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
gtgcatacat tcctcctgtt cgat 24
<210> 27
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
attgccaagg cgtagtttga gatattcat 29
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
gtagaattag tcgaggacca agag 24
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ggtagaatta gtcgaggacc aagaa 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaaacgcgac cgtgattggg atctt 25

Claims (1)

1.一种鉴定普通小麦品种真实性、小麦分子育种或辅助小麦品种特异性鉴定的方法，其特在于，所述方法包括以下步骤：
提取送检样品和标准样品的DNA；
对送检样品和标准样品的DNA进行PCR扩增，确定送检样品在以下96个SNP位点的基因型，所述SNP位点的编号、SNP所在的染色体、具体物理位置以及脱氧核苷酸信息如下：
WSNP01位于1A染色体上第27215962位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP02位于1A染色体上第41817136位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP03位于1A染色体上第495285832位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP04位于1B染色体上第587992062位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP05位于1B染色体上第340381039位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP06位于1D染色体上第20306381位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP07位于1D染色体上第288318891位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP08位于1D染色体上第427323196位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP09位于2A染色体上第43371103位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP10位于2A染色体上第36393269位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP11位于2A染色体上第174150002位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP12位于2A染色体上第41105877位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP13位于2B染色体上第12003721位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP14位于2B染色体上第47427272位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP15位于2B染色体上第108910271位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP16位于2B染色体上第652578839位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP17位于2B染色体上第697446904位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP18位于2B染色体上第773821814位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP19位于2D染色体上第28783896位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP20位于2D染色体上第422881650位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP21位于2D染色体上第431959521位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP22位于2D染色体上第458920669位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP23位于2D染色体上第551877542位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP24位于2D染色体上第615715449位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP25位于3A染色体上第25908324位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP26位于3A染色体上第481678769位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP27位于3A染色体上第735293187位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP28位于3A染色体上第597917383位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP29位于3B染色体上第509365938位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP30位于3B染色体上第627720241位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP31位于3B染色体上第680735249位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP32位于3B染色体上第749862710位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP33位于3B染色体上第819302391位，其脱氧核苷酸为A或T；
WSNP34位于3D染色体上第56675266位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP35位于3D染色体上第537495536位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP36位于3D染色体上第578749369位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP37位于3D染色体上第611664812位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP38位于4A染色体上第584425606位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP39位于4A染色体上第116644494位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP40位于4A染色体上第532224647位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP41位于4A染色体上第669197675位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP42位于4B染色体上第36960078位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP43位于4B染色体上第527111678位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP44位于4B染色体上第179840525位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP45位于4B染色体上第636757506位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP46位于4D染色体上第11870112位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP47位于4D染色体上第364033217位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP48位于4D染色体上第118605639位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP49位于4D染色体上第367933139位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP50位于5A染色体上第448113730位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP51位于5A染色体上第478883696位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP52位于5A染色体上第455550448位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP53位于5A染色体上第500625774位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP54位于5A染色体上第591302258位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP55位于5A染色体上第695003171位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP56位于5B染色体上第6594624位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP57位于5B染色体上第11080396位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP58位于5B染色体上第281675472位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP59位于5B染色体上第485426049位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP60位于5D染色体上第82481988位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP61位于5D染色体上第302000445位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP62位于5D染色体上第370064912位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP63位于5D染色体上第495427294位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP64位于6A染色体上第51949801位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP65位于6A染色体上第617805673位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP66位于6A染色体上第615440555位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP67位于6A染色体上第77112398位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP68位于6A染色体上第445560400位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP69位于6A染色体上第457660545位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP70位于6A染色体上第579446448位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP71位于6B染色体上第22553387位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP72位于6B染色体上第27687594位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP73位于6B染色体上第158129211位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP74位于6B染色体上第227062800位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP75位于6B染色体上第439018758位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP76位于6B染色体上第630873069位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP77位于6B染色体上第659565617位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP78位于6B染色体上第682326705位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP79位于6D染色体上第86651424位，其脱氧核苷酸为T或G；
WSNP80位于6D染色体上第133466400位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP81位于6D染色体上第351234720位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP82位于6D染色体上第438410250位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP83位于6D染色体上第4471905419位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP84位于7A染色体上第537642742位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP85位于7A染色体上第679816107位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP86位于7A染色体上第707833467位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP87位于7B染色体上第67705483位，其脱氧核苷酸为G或C；
WSNP88位于7B染色体上第605748172位，其脱氧核苷酸为C或G；
WSNP89位于7B染色体上第678124448位，其脱氧核苷酸为A或G；
WSNP90位于7B染色体上第721402941位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP91位于7D染色体上第87479998位，其脱氧核苷酸为A或C；
WSNP92位于7D染色体上第349365912位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP93位于7D染色体上第411596748位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP94位于7D染色体上第430012769位，其脱氧核苷酸为T或C；
WSNP95位于7D染色体上第452686835位，其脱氧核苷酸为G或C；
WSNP96位于7D染色体上第508179540位，其脱氧核苷酸为T或C；
用于检测所述的96个SNP位点的基因型的等位基因特异性引物组成如下：
WSNP01-FAM：5’GGAGAACAAAGCAGAAAAGCTGCAA3’
WSNP01-HEX：5’GAGAACAAAGCAGAAAAGCTGCAG3’
WSNP01-通用：5’GTGAACATTCAGGATATTTGTGCTGCATA3’；
WSNP02-FAM：5’CGTAGTCCTCCAGAAAATCG3’
WSNP02-HEX：5’GCTCGTAGTCCTCCAGAAAATCA3’
WSNP02-通用：5’GGATCTGGACGGCTTCCCACTT3’
WSNP03-FAM：5’AGATGTTGAGAACACTTTCGTCCC3’
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WSNP04-通用：5’GACGAACTCGGCGGGACCATTT3’
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WSNP05-HEX：5’AACCGGCGACTCTCAAGTTGATA3’
WSNP05-通用：CGGGAAACAATGCTCATAGGGACAA3’
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WSNP06-HEX：5’GTAGGATATCGCGGAAGACCAG3’
WSNP06-通用：5’GTGATCTAGCTAGGTTGTCGGCTAA3’
WSNP07-FAM：5’AAACATGTAAAACTAACTTCACATACCCA3’
WSNP07-HEX：5’ACATGTAAAACTAACTTCACATACCCG3’
WSNP07-通用：5’GACCCTTCGAGACCCTACCCAT3’
WSNP08-FAM：5’AACACATTCAGAGAATATGACTAGGG3’
WSNP08-HEX：5’ATAACACATTCAGAGAATATGACTAGGA3’
WSNP08-通用：5’GCCTGAGCGGGCGTTTGGTAA3’
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WSNP11-通用：5’TTTAGCTGCAGGGTTTATCACTGATGATT3’
WSNP12-FAM：5’CCTCCCTCCCGACCTCTG3’
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WSNP13-通用：5’TGAGCATCAAAACTCACTCTGTTCAGAA3’
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WSNP15-通用：5’GAACACTATATGTTCTGGTGGAAGGAAA3’
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WSNP19-FAM：5’CATGAGATCCTAAATCAGAGTCGCA3’
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WSNP19-通用：5’GGTCAAGTTTTCTGGACCCCATAATTATT3’
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WSNP20-通用：5’TGGTGCTTGCGATGACTTCGTCAAT3’
WSNP21-FAM：5’CCTGACGCTTCCACGCTGAAC3’
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WSNP21-通用：5’TGGCTCAAGTTGATCGGCCAGAAAT3’
WSNP22-FAM：5’TTATATGTTTGAAGTAGATGTTGCACG3’
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WSNP24-通用：5’GTTTAGACTGCAATCCTCCATCGGAA3’
WSNP25-FAM：5’CGATTGAATCTCAAGCGAACAAACG3’
WSNP25-HEX：5’GCGATTGAATCTCAAGCGAACAAACA3’
WSNP25-通用：5’TGTAGACATCTAGCAACCCCCTGAA3’
WSNP26-FAM：5’GGTTCGTGCAGCCCGTTCG3’
WSNP26-HEX：5’AAGGTTCGTGCAGCCCGTTCA3’
WSNP26-通用：5’GCGCCATCCTGGACTGCTTCAA3’
WSNP27-FAM：5’GGGCGTAAAGGTAAGAAAGACTC3’
WSNP27-HEX：5’ACGGGCGTAAAGGTAAGAAAGACTT3’
WSNP27-通用：5’TAGGCAAATGCGAGTGTCAATCAATGTTT3’
WSNP28-FAM：5’AAAGTGGAGCTACAGGAGAAAATGATA3’
WSNP28-HEX：5’AGTGGAGCTACAGGAGAAAATGATC3’
WSNP28-通用：5’GTCGGCTAAAAGGTGTTGGCTTTGTA3’
WSNP29-FAM：5’GTGGTGCAGGACCAAGAGTC3’
WSNP29-HEX：5’CTGTGGTGCAGGACCAAGAGTT3’
WSNP29-通用：5’CTCTGACTGCTGCATTGAATTGTCAATAA3’
WSNP30-FAM：5’GGTAAGCTTTGCCTAGCTTTCCTAT3’
WSNP30-HEX：5’GTAAGCTTTGCCTAGCTTTCCTAC3’
WSNP30-通用：5’GTTTGTCCAACTAAGATAGAGTATGGGAA3’
WSNP31-FAM：5’CATGCCACTGATAATGTGGACGC3’
WSNP31-HEX：5’ACATGCCACTGATAATGTGGACGT3’
WSNP31-通用：5’CTACTCATCGGAACCAACTCTACTCAA3’
WSNP32-FAM：5’GGGGAACTTTCCACCTGATCATG3’
WSNP32-HEX：5’GGGGAACTTTCCACCTGATCATT3’
WSNP32-通用：5’GCCTGTTTTCCCGGCACGGAAT3’
WSNP33-FAM：5’GAATACGGCGCCTTTCGTGCA3’
WSNP33-HEX：5’GAATACGGCGCCTTTCGTGCT3’
WSNP33-通用：5’GCTTACACGTCTAGCTATGATGCCAA3’
WSNP34-FAM：5’ATTGCTCCTGTTCCCAGCAAGG3’
WSNP34-HEX：5’CATTGCTCCTGTTCCCAGCAAGA3’
WSNP34-通用：5’AAATTGGTGGAGCTAAGGAACTATGGAAA3’
WSNP35-FAM：5’GTAAGGGACACACCTCCATCCAT3’
WSNP35-HEX：5’AAGGGACACACCTCCATCCAG3’
WSNP35-通用：5’ATAGCTAGATTGTCATCTGGCCAAACAAA3’
WSNP36-FAM：5’AAGGGCGTTTATTTATGCTTGAAGACA3’
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WSNP36-通用：5’TAAACTAGTCGACTTCTTTTCCACGACAA3’
WSNP37-FAM：5’CGTTTGCGTTCAGGTCGTGC3’
WSNP37-HEX：5’GTCGTTTGCGTTCAGGTCGTGT3’
WSNP37-通用：5’GGCAAGTCCTCCGAGGCTCAT3’
WSNP38-FAM：5’GCATAAGGGTTATCACCAAGTCG3’
WSNP38-HEX：5’CTGCATAAGGGTTATCACCAAGTCA3’
WSNP38-通用：5’CAGGTACTTTATGTGAAAGCTCTTGAGAT3’
WSNP39-FAM：5’GATAACAGCGTTTTCCTGACGAGA3’
WSNP39-HEX：5’ATAACAGCGTTTTCCTGACGAGG3’
WSNP39-通用：5’CCATCCCCAACCATAGGACCGAT3’
WSNP40-FAM：5’AGTCCTTTCTTAAGCACGGCAAC3’
WSNP40-HEX：5’CAGTCCTTTCTTAAGCACGGCAAA3’
WSNP40-通用：5’AATTTCATATGCCTGGAGAAGCATCCTT3’
WSNP41-FAM：5’CTTGGGTGACAAAATGGTTGTACAA3’
WSNP41-HEX：5’CTTGGGTGACAAAATGGTTGTACAG3’
WSNP41-通用：5’ATGGTTTGAGTTAACTTGCACAACGGAAT3’
WSNP42-FAM：5’ATGCTGATAGATCATTTGGCAGTA3’
WSNP42-HEX：5’CTATGCTGATAGATCATTTGGCAGTG3’
WSNP42-通用：5’CAATGGCAGTTGCACTATTTGTTGGTATA3’
WSNP43-FAM：5’CCTTTGACCCGCTGGTGGG3’
WSNP43-HEX：5’GCCTTTGACCCGCTGGTGGA3’
WSNP43-通用：5’GCTCGGCCCAGGATGCTACTA3’
WSNP44-FAM：5’TGATCATGCGCTTTCCCACTGAT3’
WSNP44-HEX：5’GATCATGCGCTTTCCCACTGAC3’
WSNP44-通用：5’GCCCTTGCCCCATCGTCTTGAT3’
WSNP45-FAM：5’AGATTCCTGGAGCTGCGTTTGC3’
WSNP45-HEX：5’AGATTCCTGGAGCTGCGTTTGG3’
WSNP45-通用：5’AGTTGAATTTGGCGGACGTGAGGTT3’
WSNP46-FAM：5’CACAGGGATACCGAAACATGGA3’
WSNP46-HEX：5’CACAGGGATACCGAAACATGGG3’
WSNP46-通用：5’TTGTTACCGATTTTGTTCTCTTTTGTCGTT3’
WSNP47-FAM：5’AGGTTTCCGAATCTAATGATCCG3’
WSNP47-HEX：5’CTAGGTTTCCGAATCTAATGATCCA3’
WSNP47-通用：5’GGCAGCATCACACTTCATGCTGATT3’
WSNP48-FAM：5’ATAGAGCTTTGGCCTTCTACAATTGA3’
WSNP48-HEX：5’AGAGCTTTGGCCTTCTACAATTGC3’
WSNP48-通用：5’GGATCTGTTTGGTTTATGCCTGTAATGTA3’
WSNP49-FAM：5’GTACCTCATTGCGTTTAATGGTAGCA3’
WSNP49-HEX：5’ACCTCATTGCGTTTAATGGTAGCG3’
WSNP49-通用：5’GACACGCGTCATCGAGTTTCACAAT3’
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