CN111718328A - 4-甲基-1h-二芳基吡唑类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及式(I)的4‑甲基‑1H‑二芳基吡唑类衍生物及其在药物学上可接受的卤素阴离子盐、异构体、前药和药物组合物的抗肿瘤应用。其中R₁为卤素，X为‑C(＝O)N、脲基、胍基，R₂为C₁～C₆的直链或支链烷基、取代或未取代的饱和环烷烃或芳基、取代或未取代的饱和杂环或杂环芳基。本发明还公开了所述化合物具有抑制HPIP(hematopoietic PBX‑interacting protein)的生物学作用，为其抗肿瘤的全新作用机制。

Description

4-甲基-1H-二芳基吡唑类衍生物在制备抗肿瘤药物中的用途

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及具有抑制HPIP作用的化合物及其在药物学上可接受的卤素阴离子盐、异构体、前药和药物组合物，以及它们在制备抗肿瘤药物中的用途

背景技术

癌症(cancer)是指起源于上皮组织的恶性肿瘤，具有细胞分化和增殖异常、生长失去控制、浸润性和转移性等生物学特征。近年来，癌症的发生率和死亡率逐渐升高，截至2018年，全球每年约有1800万新病例发生，约880万人死亡(占死亡人数的15.7％)，已经成为社会的主要健康威胁。

近年来围绕癌症临床治疗取得了一定的进展，其治疗手段包括：手术、化疗、放疗、生物治疗及靶向治疗在内的综合治疗。其中，手术治疗为局部治疗，更适用于早期癌症，一旦癌细胞已经入侵蔓延至邻近组织或出现远处转移，手术切除效果有限。另外，传统的化疗与放射治疗通过杀死癌细胞或通过破坏癌细胞的DNA来减缓其生长，同时也会损伤人体正常的细胞，表现出骨髓抑制，胃肠道不良反应等明显的毒副作用。其次，近年来兴起的免疫疗法通过激活人体本身的免疫系统，依靠自身的免疫机能杀灭癌细胞，但临床上仍有一部分患者对免疫疗法没有应答，同时某些类型的免疫疗法可能攻击人体自身的正常细胞，引发自身免疫性疾病，导致严重甚至致命的过敏和炎症相关反应。随着医学以及分子生物学的发展，靶向治疗已逐渐成为肿瘤治疗中最具前景的治疗方案。靶向治疗是指利用癌症和正常细胞之间的特定分子差异，以肿瘤细胞受体、关键基因、调控分子为靶点的治疗。临床上可以通过检测患者是否存在相关基因突变或基因表达谱变化，据此来选择靶向治疗药物，实现肿瘤治疗的个体化靶向治疗。因此，靶向治疗具有特异性强、效果显著、对正常细胞和组织损伤轻微等特点。

据2018年全球癌症统计数据，男性最常见的癌症类型是肺癌、前列腺癌、结肠直肠癌和胃癌。在女性中，最常见的类型是乳腺癌、肺癌、结肠直肠癌和宫颈癌。上述癌症类型临床上都存在靶向疗法。以肺癌为例，作为是世界上最常见的恶性肿瘤之一，肺癌的发病率和死亡率分别占全部癌症的13％和18％，全球每年因肺癌死亡的人数约为150万。其中，小细胞肺癌约占所有肺癌的14％，治疗主要以放化疗为主。而非小细胞肺癌(non-small celllung cancer，NSCLC)约占所有肺癌的80％-85％，约75％的患者发现时已处于中晚期，晚期非小细胞肺癌患者的5年生存率低于5％。2019年，NCCN指南建议NSCLC患者应进行EGFR，ALK，ROS1，c-MET，BRAF，和NTRK等靶向治疗相关基因的检测。其中，EGFR基因是第一个被发现的NSCLC治疗靶点。为了克服体内EGFR蛋白突变引起的通路异常激活及耐药性的问题，临床上先后发展了三代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)用于非小细胞肺癌的靶向治疗，包括针对EGFR外显子19的缺失和L858R的点突变研发的第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼，克服因服用吉非替尼和厄洛替尼而产生T790M突变耐药的第二代EGFR-TKIs阿法替尼和达克替尼，以及在此基础上提高选择性，降低毒副作用的第三代EGFR TKI奥西替尼。

对于乳腺癌而言，近年来在我国，特别是在一些大城市及沿海经济发展较快的地区，乳腺癌的发病率在逐渐上升，而且有年轻化的趋势。随着针对乳腺癌的发生、发展研究的不断深入，分子靶向治疗通过特异性地阻断乳腺癌细胞生长中起关键作用的信号传导通路，从而达到治疗肿瘤的目的。例如以人类表皮生长因子受体2(HER-2)为靶点的药物赫赛汀、以磷脂酰肌醇激酶/雷帕霉素靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信号通路为靶点的药物依维莫司、细胞周期依赖性激酶药物黄酮吡多、以及以血管新生过程为靶点的药物贝伐珠单抗等。

虽然现阶段以驱动基因为主导的靶向治疗方向进展很快，但是出现了很多问题，如耐药突变的产生、缺乏有效的靶点等。例如，使用奥西替尼进行一段时间的治疗后，少数患者出现了EGFR^C797S突变而产生了耐药性。与此同时，研究显示NSCLC抑制剂原发性耐药与KRAS突变有密切关系。临床试验表明，对于EGFR抑制剂如吉非替尼和厄洛替尼或化疗，KRAS突变阳性的患者更易产生耐药，最终导致病情不断进展恶化，然而目前尚未发现针对KRAS突变治疗的靶向药物。对于乳腺癌而言，由于其发病原因的复杂性，乳腺癌的靶向药物存在一定的副作用和耐受性，进而限制了药物在临床中的应用。其次，三阴性乳腺癌缺乏有效的治疗靶点，目前临床以新辅助化疗为主，其预后依然较差。因此，仍需开发更多有效的新靶点、新机制的药物。

HPIP(hematopoietic PBX-interacting protein)也被称为前B淋巴细胞转录因子1相互作用蛋白，是2000年由Abramovich等首次发现的一种新型的支架蛋白。近年研究表明，HPIP与肿瘤发生发展密切相关。一方面，HPIP广泛存在于在多种肿瘤中，通过免疫组化方法检测肝癌、乳腺癌、肾癌、肺癌、宫颈癌和胃癌组织发现，癌组织中HPIP的表达水平远高于癌旁组织(Journal of Clinical Investigation，2013，123(2)：630-645.)。另一方面，HPIP参与调控肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡和细胞周期功能(Oncogenesis，2016，5(10)：e260.)，有望成为一个潜在的肿瘤治疗新靶点。

发明内容

本发明所用的化合物是有效的HPIP抑制剂。该化合物具有如权利要求1所描述的含4-甲基-1H-二芳基吡唑骨架结构的化合物。

本发明提供了式I所示的化合物及其药学上可接受的卤素阴离子盐、异构体、溶剂化物。

其中：

R₁为卤素，

X为-C(＝O)N、脲基、胍基，

R₂为C₁～C₆的直链或支链烷基、取代或未的饱和环烷烃或、取代或未取代的饱和杂环基或杂环芳基。

本发明式I还可以是其盐的形式，一般是与有机或无机碱或酸形成的盐。

本发明优选生理学可接受的盐。本发明化合物的生理学可接受的盐可以是本发明物质与无机酸、有机羧酸盐，特别优选的是例如与盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、富马酸、乙酸、琥珀酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸苯乙酸、苯甲酸、水杨酸、、苹果酸形成的盐。其它的酸，如草酸，虽然其本身并非药学上可接受的，但可以用于制备用作中间体的盐，以获得本发明化合物及其药学上可接受的盐的用途。

本发明的化合物可以以互变异构形式存在，并且本发明同样也包含了该类形式的用途。

本发明的化合物还可以是其可能的溶剂化物的用途。

烷基通常是具有1至6个碳原子的直连或支链烷基，优选1至4个碳原子的直连或支链烷基，特别优选1至3个碳原子的直链或支链烷基。

卤素是氟、氯。

优选化合物的具体结构如下，但它们不代表对上述权利要求的限制。

本发明所提供的式I所示化合物的用途为其在下述方面的应用：

1)作为HPIP抑制剂；

2)在制备预防和/或抗肿瘤药物中的用途。

所述肿瘤为癌；所述癌包括乳腺癌、肺癌、肝细胞癌、肾癌、宫颈癌、胰腺癌、甲状腺癌。

本发明还涉及一种包含至少一种本发明化合物的药物，其优选的包含一种或多种药理学可接受的赋形剂或载体的用途。这里的药用载体包括但不限于：离子交换剂，氧化铝，硬脂酸铝，卵磷脂，血清蛋白如人血白蛋白，缓冲物质如磷酸盐，甘油，山梨酸，山梨酸钾，饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物，水，盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白，磷酸氢二钠，磷酸氢钾，氯化钠，锌盐，胶态氧化硅，三硅酸镁，聚乙烯吡咯烷酮，纤维素物质，聚乙二醇，羧甲基纤维素钠，聚丙烯酸酯，蜂蜡，羊毛脂。

该活性成分可以是全身和/或局部起药效作用，因此，其可采用适宜的途径进行给药，所说的适宜途径，如口服、胃肠外、肺、鼻、舌下、舌、颊、直肠、经皮、结膜等形式给药。

所述预防和/或治疗肿瘤的药物可通过注射、喷射、滴鼻、滴眼、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

适于口服给药的有可以迅速和/或以改变的方式传递活性成分的公知的给药形式，如片剂(未包衣片或包衣片，如具有肠包衣或莫包衣的片剂)、胶囊、糖衣片、颗粒、小药丸、粉剂、乳剂、混悬液和气雾剂。

采用胃肠外给药(静脉内、动脉内、心内、脊柱内或腰髓内给药)可避免吸收步骤或者包含吸收(肌内、皮下、皮内、经皮或腹膜内给药)。适于胃肠外给药的给药形式特别是用于注射和输入的溶液、混悬液、乳剂、冷冻干燥物和无菌粉末形式的制剂。

适于其他给药途径的有例如吸入(特别是粉末吸入、喷雾)的药物、鼻滴剂/溶液、喷雾剂；用于舌、舌下或颊给药的片剂或胶囊、栓剂、用于耳朵和眼睛的制剂、阴道胶囊、水性混悬液(洗剂、振摇混合物)、亲脂性混悬液、软膏、乳膏、乳液、糊剂、撒粉或植入物，如斯腾特固定膜。

可以用本身已知的方法将该活性成分转化成所述的给药形式。其可以用惰性无毒的适宜药用赋形剂来实现。特别是包括载体(例如微晶纤维素)、溶剂(例如液体聚乙二醇)、乳化剂(例如十二烷基硫酸钠)、分散剂(例如聚乙烯吡咯烷酮)、合成和天然生物聚合物(例如蛋白质)、稳定剂(例如抗氧剂和抗坏血酸)、着色剂(例如无机颜料如氧化铁)或矫味剂和/或掩味剂。在适宜的情况中，所说的活性成分可以以微囊包封的形式存在于一种或多种上述载体中。

除本发明式I的化合物外，上述药物制剂还可以包含其他药物活性成分。

附图说明

图1为实施例1中各化合物对高表达HPIP乳腺癌ZR75-1细胞生长的抑制作用。

图2为实施例3中分别用TXX-1-10、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Taxol)和生理盐水处理荷瘤小鼠随着时间的推移各组小鼠的肿瘤体积变化情况。

图3为实施例3中分别用TXX-1-10、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Taxol)和生理盐水处理的荷瘤小鼠处死后取出的瘤体照片

图4为实施例3中分别用TXX-1-10、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Taxol)和生理盐水处理的荷瘤小鼠处死后取出的瘤体重量统计。

图5为实施例3中分别用TXX-1-10、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Taxol)和生理盐水处理荷瘤小鼠随着时间的推移各组小鼠的体重变化情况。

图6为实施例3中分别用TXX-1-10、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Taxol)和生理盐水处理荷瘤小鼠随着时间的推移各组小鼠的生存变化情况。

图7为实施例3中分别用TXX-1-10、奥沙利铂(Oxaliplatin)、紫杉醇(Taxol)和生理盐水处理荷瘤小鼠瘤体HE染色，Ki67、cleaved-Caspase 3、CD31免疫组化抗体表达情况。

具体实施方式

下面的实施例是本发明优选的说明性优选方案，对本发明不构成任何限制。

本发明提供的式I所示化合物(TXX-1-10)为HPIP抑制剂，其具有优良的抗肿瘤活性，能显著抑制三阴性乳腺癌MDA-MB-231裸鼠移植瘤的生长，抗肿瘤活性明显优于奥沙利铂，对成瘤鼠的生命延长优于紫杉醇，且具有良好的安全性。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所涉及的定量实验，均设置至少3个重复，结果取均值。

下述实施例中所使用的实验细胞系均购买自美国模式培养物集存库(ATCC)。

实施例1、式1化合物对乳腺癌ZR75-1肿瘤细胞的抑制活性测定

对于细胞活力测定，将每孔约1×10⁴个细胞在37℃下接种到96孔板过夜。然后在CCK8测定之前用10μM浓度的化合物处理细胞48小时，每个化合物三个重复孔。按照制造商的方案，通过CCK-8试剂盒(Dojindo Laboratories)评估细胞数。通过酶标仪检查每个孔在450nm处的吸光度，计算细胞存活率，公式如下：

活性测定结果如附图1所示。

实施例2、TXX-1-10的体外抗肿瘤活性测定

1、化合物对肿瘤细胞生长抑制IC₅₀值的测定方法

对于细胞活力测定，将每孔约1×10⁴个细胞在37℃下接种到96板孔过夜。然后在CCK8测定之前用不同浓度的TXX-1-10处理细胞48小时，每个化合物三个重复孔。按照制造商的方案，通过CCK-8试剂盒(Dojindo Laboratories)评估细胞数。通过酶标仪检查每个孔在450nm处的吸光度。IC₅₀值由在线IC₅₀计算器(www.aatbio.com/tools/ic50-calculator/)生成。

2、化合物抗肿瘤活性IC₅₀值测试结果

TXX-1-10的对不同肿瘤细胞系的抑制作用IC₅₀(μM)值测试结果见表1。

表1

由表1可知，TXX-1-10具有较好的广谱抗肿瘤活性，且对正常组织细胞的抑制作用较弱，提示化合物可能具有较低的毒性作用。

实施例3、TXX-1-10对裸鼠移植肿瘤生长的抑制作用

取对数生长期的乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，制成单细胞悬液，调节细胞浓度至5×10⁷个细胞/ml。将0.1ml细胞悬浊液(含5×10⁶个细胞)皮下注射到7周龄BABL/c裸鼠的乳腺脂肪垫中。植入一周后，随机将荷瘤裸鼠分为生理盐水、紫杉醇(Taxol)、奥沙利铂(Oxaliplatin)、TXX-1-10低剂量(TXX-1-10-L)、TXX-1-10高剂量(TXX-1-10-H)五组。第一组为空白组(control)组，每2天瘤周注射生理盐水(30mg/kg)；第二组为阳性对照药紫杉醇(Taxol)组，每2天瘤周注射紫杉醇(15mg/kg)；第三组为阳性对照药奥沙利铂(Oxaliplatin)组，每2天瘤周注射奥沙利铂(15mg/kg)；第四组为TXX-1-10低剂量组，每2天瘤周注射TXX-1-10(15mg/kg)；第五组为TXX-1-10高剂量组，每2天瘤周注射TXX-1-10(30mg/kg)。以上给药周期持续24天，每2天通过游标卡尺测量监测肿瘤生长和小鼠体重，并根据下式计算肿瘤体积：体积＝(最长直径×最短直径²)/2。在第24天处死小鼠，取出瘤体称重。实验期间记录裸鼠的死亡情况及相应的日期，结果如图所示。

由图2、3可知，药物处理24天内，TXX-1-10低剂量组和高剂量组肿瘤体积分别为406.2±92.5mm³和210.4±60.7mm³，肿瘤体积明显小于空白组(1325.0±353.8mm³)和奥沙利铂组(695.1±186.8mm³)，TXX-1-10高剂量组体积略高于紫杉醇组(112.8±45.0)，表现出良好的抗肿瘤活性。

由图4可知，药物处理24天内，TXX-1-10低剂量组和高剂量组肿瘤重量分别为0.39±0.06g和0.18±0.08g，肿瘤质量小于空白组(1.33±0.23g)和奥沙利铂组(0.68±0.17g)；TXX-1-10高剂量组重量略高于紫杉醇组(0.093±0.10g)，表现出良好的抗肿瘤活性。

由图5可知，药物处理24天内，相比于奥沙利铂组(14.67±0.76g)和紫杉醇组(14.84±0.86g)组，TXX-1-10低剂量(18.31±1.51g)和TXX-1-10高剂量(18.03±1.61g)组裸鼠体重较高，具有显著性差异；相比于空白组(18.97±0.87g)没有表现出差异性，表明TXX-1-10在给药实验期间对小鼠的生长未表现出明显影响，可能具有较低的毒副作用。

由图6可知，药物处理24天内，相比于空白组，TXX-1-10低剂量组和高剂量组显著延长荷瘤裸鼠的生存，具有显著性差异；相比于奥沙利铂组和紫杉醇组，TXX-1-10高剂量组显著延长荷瘤裸鼠的生存时间，具有显著性差异，表明TXX-1-10可以显著延长荷瘤小鼠的生存期，提高荷瘤裸鼠的存活率。

由图7可知，药物处理24天内，相比于空白组和奥沙利铂组，TXX-1-10低剂量组和高剂量组显著降低肿瘤增殖标志物Ki67和血管生成CD31的表达水平，升高肿瘤凋亡标志物cleaved-caspase 3(C-caspase 3)，表明TXX-1-10可以显著抑制肿瘤生长，血管生成，诱导细胞凋亡，表现出良好的抗肿瘤活性。

Claims (6)

1.本发明提供了式I所示的化合物及其药学可接受的卤素阴离子盐、异构体、溶剂化物。

其中：

R₁为卤素，

X为-C(＝O)N、脲基、胍基，

R₂为C₁～C₆的直链或支链烷基、取代或未取代的饱和环烷烃或芳基、取代或未取代的饱和杂环或杂环芳基。

2.如权利要求1所述的化合物及其药学可接受的卤素阴离子盐、异构体、溶剂化物。其中所述化合物优选具有下面结构。

3.一种药物，其包含至少一种如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的卤素阴离子盐、异构体、溶剂化物和至少一种其他的赋形剂。

4.一种药物，其包含至少一种如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的卤素阴离子盐、异构体、溶剂化物和与其结合的至少一种有机硝酸盐或NO供体。

5.一种药物，其包含至少一种如权利要求1所定义的式I化合物或其药学可接受的卤素阴离子盐、异构体、溶剂化物和与其结合的至少一种可以预防和/或治疗肿瘤药物的化合物。

6.权利要求1所定义的式I化合物或其药学上可接受的卤素阴离子盐、酯、溶剂合物在下述至少一方面的应用：

1)作为HPIP抑制剂；

2)在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的用途。

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