CN111704617B

CN111704617B - 一种小分子化合物

Info

Publication number: CN111704617B
Application number: CN202010543553.7A
Authority: CN
Inventors: 方文奎; 李冠群; 蔡雨婷; 朱文浩; 潘翔; 王增全
Original assignee: Technoderma Medicines Pte Ltd
Current assignee: Technoderma Medicines Pte Ltd
Priority date: 2020-06-15
Filing date: 2020-06-15
Publication date: 2022-08-23
Anticipated expiration: 2040-06-15
Also published as: CN111704617A; WO2021254133A1

Abstract

本发明提供了一种小分子化合物，其特征在于，为如下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，所述G为具有芳香性的基团；所述X为含氮基团；所述R为含氟基团；所述C_z与X基团中的氮原子相连。本发明涉及的几类化合物具有良好的Jak激酶活性和细胞生物学活性的抑制能力。

Description

一种小分子化合物

技术领域

本发明提供了一种活性因子，具体地，涉及一种小分子化合物及该小分子化合物作为一种具有高效性和特异性的JAK激酶抑制剂的应用。

背景技术

利用高效的小分子对JAK激酶活性，特别是JAK1，TYK2激酶活性进行抑制可以阻断参与炎症反应的细胞因子介导的信号通路，从而控制炎症，有效治疗自身免疫性疾病和或过敏性炎症性皮肤疾病。但是目前，同时有效抑制JAK1和或TYK2抑制剂的研究鲜有报道。

发明内容

本发明旨在于开发适合高效和特异的JAK激酶抑制剂，特别是Tyk2抑制剂、和/或JAK1抑制剂、和/或JAK1/Tyk2或Tyk2/JAK1和或Tyk2/Jak2双重抑制剂，适用于治疗、预防和缓解自身免疫性疾病如类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)，强直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)，溃疡性结肠炎(Inflammatory Bowel Disease,IBD)，多发性硬化(Multiple Sclerosis,MS)银屑病(Psoriasis)，斑秃(AlopeciaAreata,AA)，白癜风(Vitiligo)等以及过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎，特应性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)，湿疹，神经性皮炎等适应症。

其中，上述G为具有芳香性的基团；

上述X为含氮基团；

上述R为含氟基团；

上述C_z与X基团中的氮原子相连。

本实施例中的芳香性基团G可选自全碳芳香环或杂芳香环；

其中，全碳芳香环选自碳原子数为5-20个的全碳芳香环，如：苯环、萘环等；

杂芳香环选自碳/杂原子总数为5-20个的杂芳环，如：单环如：呋喃、噻吩、吡咯、噻唑、咪唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪等，稠环杂环如：吲哚、喹啉、蝶啶、吖啶等。

上述全碳芳香环或杂芳香环上的任一或任几氢原子还可以为取代基所取代，如：烷基、羟基、卤素、氰基、羧基、酯基等任何常见取代基团。

本实施例中的含氮基团X可以为如下几种形式之一：即、-NH-，-N(R1)-，取代或未取代的含氮烷基，取代或取代的氮杂环等类似结构。

其中，R1为任何取代基，如：烷基、芳基等；

未取代的含氮烷基为烷基碳链上的至少一个碳原子为氮所取代；

取代的含氮烷基为上述含氮烷基上的至少一个氢原子为其他取代基所取代，如：烷基、羟基、卤素、氰基、羧基、酯基、芳基、环烷基、杂环烷基等等任何常见取代基团。

未取代的氮杂环基指三元、四元、五元或六元环烷基环上的至少一个碳原子为氮所取代；

取代的含氮环烷基指上述氮杂环上的至少一个氢原子为其他取代基所取代，如：烷基、羟基、卤素、氰基、羧基、酯基、芳基、环烷基、杂环烷基等等任何常见取代基团。

本实施例中的含氟基团R可选自含氟烷基、含氟环烷基、含氟杂环烷基、含氟芳基、含氟杂芳基等；

上述含氟烷基、含氟环烷基、含氟杂环烷基、含氟芳基、含氟杂芳基指含碳原子数不超过20的烷基、碳原子数不超过10的环烷基、碳原子数不超过10的杂环烷基、碳原子数不超过10的芳基、碳原子数不超过10的杂芳基上的至少一个氢原子为氟原子所取代，其他氢原子还可同时为烷基、羟基、卤素、氰基、羧基、酯基、芳基、环烷基、杂环烷基等等任何常见取代基团。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于：上述G优选自五元或六元的芳香环或杂芳环。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于：上述X优选自取代或未取代的胺、取代或未取代的含氮环烷基。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于：上述R优选自取代或未取代的含氟烷基、取代或未取代的含氟环烷基。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于：上述C_z具有手性。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于，该小分子化合物具有如下一种或多种的用途：

A.Tyk2抑制剂；

B.JAK1抑制剂；

C.JAK1/Tyk2双重抑制剂；

D.Tyk2/JAK2双重抑制剂。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于：用于制备治疗、预防和缓解自身免疫性疾病的药物；

上述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、强制性脊柱炎、红斑狼疮、银屑病、斑秃、白癜风等和过敏性疾病如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎、湿疹、神经性皮炎或类似的适应症。

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于，包括如下步骤制造而成：

S1.由化合物1与化合物2反应生成中间体1；

S2.由中间体1与化合物3反应生成目标产物；

上述化合物1的结构如下所示：

上述化合物2的结构如下所示：

上述化合物3的结构如下所示：

上述中间体1的结构如下所示：

其中，上述L₁与L₁’为能相互发生反应的活性基团；

上述L₂为能与氨基发生反应的活性基团。

反应方程式如下所示：

S1.由化合物1与化合物2反应生成中间体1；

S2.由中间体1与化合物3反应生成中间体2；

S3.由中间体2脱氨基保护基的产物与化合物4反应生成目标产物；

上述化合物1的结构如下所示：

上述化合物2的结构如下所示：

上述化合物3的结构如下所示：

n，m为0或自然数，R₁为吸电子基，pro为氨基保护基；

上述化合物4的结构如下所示：

上述中间体1的结构如下所示：

上述中间体2的结构如下所示：

其中，上述L₁与L₁’为能相互发生反应的活性基团；

上述L₂为氨基保护基；

上述L₃为能与氨基发生反应的活性基团。

反应方程式如下所示：

进一步地，本发明提供的一种小分子化合物，其特征还在于：上述化合物1上的氨基经保护后再进行后续反应。

发明的作用和效果：

本发明根据JAK激酶的蛋白结构，特别是Tyk2的蛋白结构，进行了小分子化合物药物有目的的合理设计，合成的化合物首先进行JAK的激酶生化活性检测，跟据IC50建立SAR(structure-activity relationship)，对IC50在200nM以下的强效抑制剂再进行细胞学的测试，并确定化合物的选择性。参见具体活性实验数据可以发现，本发明涉及的几类化合物具有良好的JAK激酶酶活性抑制和细胞生物学酶细胞活性的抑制能力。

本发明提供的抑制剂也可以用于其它自身免疫性相关的皮肤病如斑秃，白癜风，皮肤表现为主的红斑狼疮，扁平苔藓，光泽苔藓，硬化萎缩性苔藓，脂膜炎，以及过敏性疾病如特应性皮炎，湿疹，神经性皮炎等等。

本发明中获得的适用于口服或静脉给药的Tyk2抑制剂、和/或JAK1抑制剂、和/或JAK1/Tyk2双重抑制剂也仍然可以用于治疗银屑病及其它自身免疫性疾病如RA,IBD,MS等。

附图说明

图1. 384孔板AlphaLISA SureFire测试模板。

具体实施方式

实施例1:合成化合物366的一般方法(TDM-180966)

步骤1:Example 366c

向一个250mL的三口烧瓶中加入化合物366a(500mg,3.26mmol),化合物366b(643mg,2.93mmol),碳酸钠(691mg,6.52mmol),[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(167mg,0.23mmol),1,4二氧六环/水(70mL,6:1)。反应液氮气置换5次，升温至100℃反应过夜。反应完成后，反应液旋干，过柱[洗脱剂:(DCM:MeOH＝10:1)/DCM＝0～40％]，粗品用DCM/MeOH＝30/1打浆得到黄色固体目标化合物，即4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯胺(Example 366c,253mg,产率36.9％)。LCMS[M+1]⁺＝211.

步骤2:Example 366

向化合物366c(68mg,0.32mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(5mL)溶液中加入N,N-二异丙基乙胺(62.68mg,0.49mmol)，2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(184mg,0.49mmmol)和化合物366d(43.4mg,0.356mmol)，反应液在室温下搅拌2小时。反应完成后，反应液旋干，粗品过柱[洗脱剂:(DCM:MeOH＝10:1)/DCM＝0～40％]，得到粗品通过制备HPLC纯化得到白色固体目标化合物，即(S)-N-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)苯基)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酰胺(Example 366,54.7mg,产率53.9％)。LCMS[M+H]⁺＝315.1.

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.21(s,1H),10.68(s,1H),8.80(s,1H),8.21(d,J＝8.7Hz,2H),7.81(d,J＝8.6Hz,2H),7.64(dd,J＝3.4,2.4Hz,1H),6.93(dd,J＝3.6,1.5Hz,1H),2.87(ddd,J＝13.6,10.8,8.0Hz,1H),2.15–1.93(m,2H).

实施例2:合成化合物368的一般方法(TDM-180968)

步骤1:Example 368b

向化合物368a(500mg,3.26mmol)的二氯甲烷(50mL)溶液中加入三乙胺(494.8mg,4.89mmol)和二碳酸二叔丁基甲酯(852mg,1.406mmol)，反应液在室温下搅拌过夜。反应完成后，将反应液缓慢倒入20mL冰水中，分离有机相，水相用二氯甲烷萃取一次，合并有机相，用饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，过柱纯化[洗脱剂:EtOAc/PE＝0～30％]得到白色目标化合物，即4-氯-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-羧酸叔丁酯

(Example 397b,600mg,产率72.2％)，LCMS[M+1]⁺＝254.

步骤2:Example 368d

向一个250mL的三口烧瓶中加入化合物368b(500mg,1.97mmol),化合物368c(455.4mg,2.07mmol),碳酸钠(417.6mg,3.94mmol),[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯(100.9mg,0.14mmol),1,4-二氧六环/水(70mL,6:1)，反应液氮气置换5次，反应在100℃搅拌2小时。反应完成后，浓缩至干，粗品过柱纯化[洗脱剂:(DCM:MeOH＝10:1)/DCM＝0～40％]得到黄色固体目标化合物，即4-(6-氨基吡啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-羧酸叔丁酯(Example 368d,235mg,产率38.1％)，LCMS[M+H]⁺＝312.

步骤3:Example 368f

向化合物368d(146mg,0.47mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(15mL)中加入N,N-二异丙基乙胺(91.1mg,0.71mmol),2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(268mg,0.71mmmol)和化合物368e(86mg,0.71mmol)，反应在90℃搅拌1小时。反应完成后，反应液浓缩至干，过柱纯化[洗脱剂:EtOAc/PE＝0～30％]得到黄色目标化合物，即叔丁基-(S)-4-(6-(2,2-二氟环丙烷-1-羧酰胺基)吡啶-3-基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-7-羧酸盐(Example 368f,80mg,产率54％)。LCMS[M+H]⁺＝416.

步骤4:Example 368

向化合物368f(80mg,0.13mmol)的甲醇(50mL)溶液中加入三氟乙酸(110.1mg,0.95mmol)，反应液室温搅拌过夜。反应完成后，反应液浓缩至干，粗品制备HPLC纯化，得到白色固体目标化合物，即(S)-N-(5-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)吡啶-2-基)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酰胺(Example 368,13.3mg,产率31.7％)。LCMS[M+H]⁺＝316.

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.31(s,1H),11.29(s,1H),9.16(dd,J＝2.4,0.7Hz,1H),8.94–8.79(m,1H),8.62(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),8.27(d,J＝8.7Hz,1H),7.69(dd,J＝3.5,1.9Hz,1H),6.98(d,J＝3.4Hz,1H),3.14–2.98(m,1H),2.15–1.98(m,2H).

实施例3:合成化合物367的一般方法(TDM-180967)

步骤1:Example 367c

向化合物367a(500mg，3.26mmol)即4-氯-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶，化合物367b(1g，3.42mmol)即4-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1H-吡唑-1-甲酸叔丁酯，碳酸钠(690mg，651mmol)和1,1'-双二苯基膦二茂铁二氯化钯(240mg，0.33mmol)的混合物中添加1,4-二氧六环(30mL)和水(5mL)，混合物水泵置换氮气3次。反应加热至100℃并搅拌2h，反应完成后，减压下浓缩混合物，过柱纯化(洗脱剂：二氯甲烷:含10％甲醇/二氯甲烷＝20:80)，得到灰白色固体化合物367c，即4-(1H-吡唑-4-基)-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶(288mg，47.7％产率)。LCMS[M+1]⁺＝186.1.

步骤2:Example 367e

向化合物367c(140mg，0.756mmol)的乙腈(80mL)溶液中添加化合物367d(146.7mg，0.756mmol)即3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(230mg，1.511mmol)。混合物加热至70℃并搅拌1.5小时。减压浓缩混合物，粗品硅胶柱层析(二氯甲烷:含10％甲醇/二氯甲烷＝70:30)纯化，得到灰白色固体化合物367e，即3-(4-(7(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-3-(氰基甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯(100mg，34.9％产率)。LCMS[M+1]⁺＝380.2.

步骤3:Example 367f

在室温下向化合物367e(100mg，0.264mmol)的甲醇(30mL)溶液中添加HCl/1,4-dioxane(1.32mL，5.27mmol,4M)，将混合物加热至40℃并搅拌过夜。减压浓缩混合物，得到所需白色固体化合物367f，即2-(3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]-1H-吡唑-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈盐酸盐(110mg，粗品)。LCMS[M+1]⁺＝280.2.

步骤4:Example 367在室温下向化合物367f(70mg，0.222mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(7mL)溶液A中添加N，N-二异丙基乙胺(230mg，1.776mmol)，向化合物367g(40.6mg，0.333mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(3mL)溶液B中添加2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(126.6mg，0.333mmol)，将溶液A和B分别搅拌5min，然后将溶液A添加到溶液B中，反应在室温下搅拌10分钟。减压浓缩混合物，硅胶柱层析纯化(二氯甲烷:10％甲醇/二氯甲烷＝50:50)制备(甲酸)再次纯化，得到白色固体化合物367，TDM-180967，即(S)-2-(3-(4-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡唑-1-基)-1-(2,2-二氟环丙烷-1-羰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(60mg，54.9％产率)。LCMS[M+1]⁺＝384.1.

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.14(s,1H),8.94(s,1H),8.71(s,1H),8.48(s,1H),7.66–7.58(m,1H),7.09(dt,J＝3.8,2.1Hz,1H),4.95(dd,J＝36.8,9.6Hz,1H),4.71(d,J＝9.7Hz,1H),4.66–4.53(m,2H),4.30(t,J＝9.9Hz,1H),3.75(d,J＝3.0Hz,2H),2.88–2.75(m,1H),2.00–1.85(m,2H).

实施例4:合成化合物370的一般方法(TDM-180970)

步骤1:Example 370b

在0℃下向化合物370a(1g，6.6mmol)，即4-氯-7H-吡咯[2,3-d]嘧啶的N,N-二甲基甲酰胺(10mL)溶液中加入钠氢(300mg，13mmol,60％w.t.)，将混合物在0℃搅拌1小时。然后向混合物添加2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯(1.27g，8mmol)，反应液室温搅拌过夜。将混合物缓慢加入水(50mL)中，乙酸乙酯(50mL x 3)萃取，合并有机层，分别用水(50mL x 3)和饱和食盐水(50mL x 2)洗涤，用硫酸钠干燥，滤液减压浓缩，硅胶柱层析纯化(石油醚∶乙酸乙酯＝94∶6)，得到淡黄色油状物化合物370b，即4-氯-7-(((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶(1.5g，80.1％收率)。LCMS[M+1]⁺＝284.

步骤2:Example 370d

向化合物370b(665mg，2.342mmol)，化合物370c(900mg，2.576mmol)即3-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧杂硼烷-2-基)-1-(三异丙基甲硅烷基)-1H-吡咯，碳酸钾(809mg，5.855mmol)和四三苯基膦钯(270mg，0.234mmol)的混合物中加入正丁醇(10mL)和水(10mL)，水泵置换氮气3次。反应液加热至100℃并搅拌过夜。反应完成后，减压浓缩，硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝50：50)，得到棕色固体化合物370d(142mg，20％产率)，即4-(1H-吡咯-3-基)-7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶。LCMS[M+1]⁺＝315.

步骤3:Example 370f

在室温下向化合物370d(140mg，0.446mmol)的乙腈(10mL)混合物中加入化合物370e(130mg，0.668mmol)即3-(氰基亚甲基)氮杂环丁烷-1-羧酸叔丁酯和1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(68mg，0.446mmol)。反应加热至70℃，搅拌2小时。反应完成后，减压浓缩，硅胶柱层析纯化(二氯甲烷：10％甲醇/二氯甲烷＝53：47)，得到黄色油状化合物370f(230mg，粗品)，即叔丁基3-(氰甲基)-3-(3-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基)氮杂环丁烷-1-羧酸盐。LCMS[M+1]⁺＝509.3.

步骤4:Example 370g

在室温下向化合物370f(230mg，0.453mmol)的甲醇(3mL)溶液中加入HCl/1,4-dioxane(2.3mL，9.06mmol,4M)，将混合物加热至40℃并搅拌3.5小时。反应完成后，减压浓缩，得到白色固体化合物370g(110mg，粗品)，即2-(3-(3-(7-(((2-(三甲基硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈盐酸盐。LCMS[M+1]⁺＝409.1.

步骤5:Example 370i

在室温下向化合物370g(195mg，0.447mmol)的N,N-二甲基甲酰胺(5mL)溶液A中添加N，N-二异丙基乙胺(347mg，2.682mmol)，向化合物370h(70mg，0.572mmol)即(S)-2,2-二氟环丙烷-1-羧酸的N,N-二甲基甲酰胺(5mL)溶液B中添加2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(217mg，0.572mmol)，溶液A，B分别搅拌5分钟。然后溶液A添加到溶液B中，反应在室温下搅拌10分钟。反应完成后，减压浓缩，硅胶柱层析纯化(石油醚：乙酸乙酯＝25：75)，得到白色固体化合物370i，即(S)-2-(1-(2,2-二氟环丙烷-1-羰基)-3-(3-(7-((2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基)甲基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基)-1H-吡咯-1-基)氮杂环丁-3-基)乙腈(210mg，91.3％产率)。LCMS[M+1]⁺＝513.

步骤6:Example 370

在0℃下向化合物370i(100mg，0.195mmol)的二氯甲烷(5mL)溶液中加入三氟乙酸(5mL)，反应室温下搅拌1小时。反应完成后，减压浓缩，向残余物中加入甲醇(5mL)和二乙胺(1mL)，混合物在室温搅拌1小时。再次减压浓缩，残余物通过制备高效液相色谱法(甲酸)纯化，得到白色固体化合物370，即(S)-2-(3-(3-(3-(7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基]-1H-吡咯-1-基)-1-(2,2-二氟环丙烷-1-羰基)氮杂环丁烷-3-基)乙腈(35mg，46.9％产率)。LCMS[M+1]⁺＝383.1

¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.99(s,1H),8.63(s,1H),8.00–7.91(m,1H),7.53(d,J＝2.3Hz,1H),7.20(s,1H),6.99(s,2H),4.93(d,J＝9.7Hz,1H),4.81(d,J＝9.7Hz,1H),4.69(d,J＝9.7Hz,1H),4.59(d,J＝9.6Hz,1H),4.47(d,J＝10.8Hz,1H),4.30(dd,J＝10.5,8.4Hz,1H),3.61(d,J＝3.3Hz,2H),2.79(dt,J＝12.8,9.2Hz,1H),1.98–1.84(m,2H)。

JAK激酶小分子抑制剂的酶活性抑制检测

实验方案

1.试剂准备

激酶反应缓冲液

配置激酶反应缓冲液，组分如下：50mM HEPES，pH 7.5，1mM EGTA，10mM MgCl₂，2mMDTT，0.01％Tween20

1X检测缓冲液

配置检测缓冲液，去离子水9：1稀释10X检测缓冲液至1X

4X激酶溶液

激酶反应缓冲液稀释JAK激酶至4X终浓度(JAK1：80nM，JAK2/JAK3/Tyk2：4nM)

4X底物溶液

激酶反应缓冲液稀释ULight^TM-JAK(Tyr1023)底物至200nM(终浓度：50nM)

4X ATP溶液

激酶反应缓冲液稀释ATP至4X终浓度(JAK1：160μM，JAK2/JAK3/Tyk2：40μM)

4X测试化合物溶液

DMSO溶解测试用化合物至10mM储存液，3倍梯度稀释配置成所需浓度，每个化合物设置10个浓度点，测试化合物终浓度范围为：10μM-0.5nM

4X酶反应终止液:

1X检测缓冲液溶解EDTA至40mM(EDTA终浓度：10mM)

4X检测抗体溶液

1X检测缓冲液稀释Eu标记检测抗体(anti-phosphotyrosine(PT66))至8nM(抗体终浓度：2nM)

2.实验过程

向384微孔板中依次加入2.5μL，4X激酶溶液，和2.5μL，已经稀释好的不同浓度的4X测试化合物溶液，每个浓度设置2个复孔，同时设置酶溶液空白对照组和阴性对照组(DMSO组)

震荡384多孔板，混匀酶和化合物，1000转，离心1分钟，在室温下孵育60分钟

向384多孔板中加入2.5μL，4X底物溶液，1000转离心1分钟

向384多孔板中加入2.5μL，4XATP溶液，1000转离心1分钟，起始酶反应

JAK1室温反应2小时，JAK2/JAK3/Tyk2室温反应1小时

JAK1反应的各组分终浓度分别为：JAK1：20nM，底物：50nM，ATP：40uM，测试化合物终浓度范围为：10μM-0.5nM

JAK2/JAK3/Tyk2反应的各组分终浓度分别为：JAK2：1nM，底物：50nM，ATP：10μM，测试化合物终浓度范围为：10μM-0.5nM

酶反应结束后，向384多孔板每孔中加入5μL，4X酶反应终止液，1000转，离心1分钟，在室温下孵育5分钟

向384多孔板每孔中加入5μL，4X检测抗体溶液，(检测抗体终浓度为2nM)，1000转，离心1分钟，室温条件下孵育1小时

抗体孵育结束后，在Envision读板仪上测定各孔的信号值

3.数据分析

以酶溶液空白对照组为100％抑制率和阴性对照组(DMSO组)为0％抑制率，计算检测化合物各个浓度对应的百分比抑制率

在GraphPad Prism软件中对检测化合物的浓度对数值和相对应的百分比抑制率进行非线性回归分析，得到检测化合物的半数抑制浓度(IC₅₀)，所得实验结果即化合物队对酶活性的抑制列在如下表格中：

下表列出了上述各实施例中所示的化合物的IC50值。“A”表示≥10μM；“B”表示≥1μM同时<10μM；“C”表示≥0.1μM同时<1μM；“D”表示<0.1μM。

TKLNo.	Tyk2/μM	JAK1/μM	JAK2/μM	JAK3/μM
					TDM-180966	2.997	1.658
TDM-180967	0.020	0.001	D	C
					TDM-180968	7.054	4.677
TDM-180970	0.018	0.002	D	C

上述激酶酶活性抑制试验显示效果最好的两个化合物是TDM-180967和TDM-180970，为了进一步了解两个化合物的特性，我们采用了两个细胞学测试系统针对化合物对细胞因子在细胞内的信号传导抑制进行测试。这两个测试是根据细胞因子在炎症细胞内的信号传导的机理建立的。细胞因子IL-4诱导的人单核细胞系THP-1细胞内pSTAT6定量试验用于评价JAK1抑制剂的细胞学效应，IL-4和细胞表面受体结合后，激活JAK1，后者招募和激活STAT6从而调控IL-4/JAK1下游基因的表达。细胞因子IFN-alpha-B2诱导的人骨肉瘤上皮细胞系U2OS细胞内pSTAT1定量试验用于评价Tyk2抑制剂的细胞学效应，IFN-alpha-B2和细胞表面受体结合后，主要导致Tyk2的磷酸化，后者通过磷酸化激活STAT1，最终pSTAT1进入细胞核进行基因调控。细胞学测试对于下分子化合物的性能评价非常重要，它不但进一步验证体外酶活性的抑制，为下一步的动物试验奠定基础，并且为小分子能否顺利进入细胞提供最初的依据，在药物发现阶段非常重要。

JAK激酶小分子抑制剂的细胞活性抑制检测

1.细胞培养、细胞因子刺激和pSTAT检测

a)收集THP-1或U2OS细胞，重悬于1*HBSS

b)将细胞接种到384孔板，37℃&CO₂孵箱孵育

c)每个孔加入5μL稀释于DMSO的化合物,DMSO的终浓度为0.1％,继续37℃&CO₂孵箱孵育

d)每个孔加入5μL的IL4或IFN-alpha-B2，继续37℃&CO₂孵箱孵育

e)弃细胞培育上清，加入细胞裂解液，室温孵育

f)对细胞裂解混悬液用AlphaLISA SureFire Ultra p-STAT6 HV试剂盒检测pSTAT6，或AlphaLISA SureFire Ultra p-STAT1 HV试剂盒检测pSTAT1

g)反应板室温孵育2小时

h)在Envision读板仪上读取每个培养空的信号

2.数据分析

Fit the cpd IC50 from non-linear regression equation:

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

X:cpd concentration

Y:inhibition％

Top and Bottom:Plateaus in same units as Y

logIC50:same log units as X

HillSlope:Slope factor or Hill slope

3.384孔板AlphaLISA SureFire测试模板如图1所示。

根据上述数据分析方法，我们发现TDM-180967和TDM-180970对JAK1和Tyk2的细胞内信号传导有很强的抑制，其半数抑制浓度(IC₅₀)实验结果列在如下表格中：

TKL No.	JAK1 cell/nM	Tyk2 cell/nM
			TDM-180967	6.01	7.46
TDM-180970	3.69	6.73

综上所述，我们的化合物在体外酶活性和细胞学上都有很强的抑制作用，特别是在细胞模型上对JAK1和TYK2介导的细胞因子炎症通路有高效的抑制作用。总所周知，JAK1和TYK2对于自身免疫性疾病和过敏性炎症性皮肤疾病的发生和疾病严重程度具有极为重要的相关性，进一步的临床开发和应用这类新发明的小分子JAK抑制剂为治疗这类疾病提供了潜在的可能性。

Claims

1.一种小分子化合物，其特征在于，为如下结构所示的化合物或其药学上可接受的盐：

其中，所述G为吡咯基或吡唑基。

2.如权利要求1所述的小分子化合物在制备Tyk2抑制剂、JAK1抑制剂、JAK1/Tyk2双重抑制剂或Tyk2/JAK2双重抑制剂中的用途。

3.如权利要求1所述的小分子化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗、预防或缓解自身免疫性疾病和过敏性疾病。

4.如权利要求3所述的用途，其中所述自身免疫性疾病为类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、红斑狼疮、银屑病、斑秃或白癜风。

5.如权利要求3所述的用途，其中所述过敏性疾病为哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎、湿疹或神经性皮炎。