CN111690578A - 一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用。该菌株分离自水稻根际土壤，已经于2020年6月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20119。暹罗芽孢杆菌PAPM‑15菌株耐盐碱能力强，产NH₃和ACC脱氨酶能力强，其活菌制剂能有效促进水稻生长，且对藤黑镰孢菌引起的水稻恶苗病具有较高的防效，可用于生产生物肥料，特别是盐碱地水稻专用生物肥料。

Description

一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用

技术领域

本发明涉及一株暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用，属于农业生物技术领域。

背景技术

水稻是我国主要的粮食作物之一，种植面积广泛，除了应用于主食外，还有很多其他用途。因此，水稻的质量和产量与国家粮食安全密不可分。但从当前水稻种植实际情况来看，有很多因素使水稻减产，其中，恶苗病是影响水稻产量的常见因素，该病害发病率高，对水稻稳产、高产的威胁大，一般减产10％-20％，严重的可减产50％以上。

水稻恶苗病又叫徒长病，从苗期至抽穗期均可发生，主要靠带菌种子传播。藤黑镰孢菌(Fusarium fujikuroi)是水稻恶苗病的主要致病菌，禾谷镰孢菌(Fusariumgraminearum)、接骨木镰孢菌(Fusarium sambucinum)、木贼镰孢菌(Fusarium equiseti)等均有不同程度的弱致病作用。水稻恶苗病常导致水稻种子在播种后不能发芽或不能出土。发病的水稻秧苗常因植物缺水以致萎蔫而死。生育期的水稻植株，倘若受到水稻恶苗病的侵害，则会枯萎而死，即便个别植株能抽穗、结实，但大多都穗小、粒少，且谷粒不饱满，严重影响水稻的产量。

长期以来，水稻恶苗病以化学防治为主，并结合选育抗病品种、优化栽培管理等技术措施。水稻恶苗病的传播途径主要是以种子带菌进行传播，为此生产上常采取恶苗灵、克菌丹、多菌灵等药剂对水稻种子进行消毒处理。化学农药的广泛应用，为人类创造了巨大的价值，但与此同时，由于化学农药的长期使用，不仅造成了病菌的抗药性、毒性，而且对环境的污染、对人畜健康构成威胁等问题日益明显，现如今人们也意识到无污染的生态农业的重要性，发展生物防治技术，减量使用化学农药，越来越受到人们重视。

生物防治是利用有益生物或其代谢产物来防治病虫害的方法。其优点是不污染环境、对人和其他生物安全、节约能源、保持生态平衡等，是发展绿色食品、保护人身健康的重要手段。目前，研究表明哈茨木霉、多粘类芽孢杆菌、放线菌等有益微生物在水稻恶苗病防治方面具有一定的效果，但由于防治效果有限，未能在农业生产中大面积推广。

盐碱地是我国重要的土地资源，我国盐碱地和盐碱障碍耕地总面积超过5亿亩，其中具有农业利用潜力的多达2亿亩，占中国耕地面积的10％左右。水稻具有较强的耐盐碱能力，是盐碱地广为栽培的作物之一。盐碱地水稻恶苗病的生物防治，除要求生防菌株具有较好的抗病促生效果外，还要求其具有较强的耐盐碱能力，能够在盐碱土壤中定植。因此，筛选耐盐碱抗病促生菌株，具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一株分离自水稻根际土壤的暹罗芽孢杆菌(Bacillussiamensis)PAPM-15及其活菌制剂的制备方法与应用。暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株耐盐碱能力强，产NH₃和ACC脱氨酶能力强，其活菌制剂能有效促进水稻生长，且对藤黑镰孢菌引起的水稻恶苗病具有较高的防效。

一株分离自水稻根际土壤的耐盐碱暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)PAPM-15，该菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)的保藏编号为CGMCCNo.20119；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2020年6月22日。

所述暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株的菌落及菌体特征：在NA培养基上于37℃培养48h，菌落直径约0.5-0.8mm，白色不透明，圆形，边缘不整齐，表面粗糙，隆起，褶皱；菌体呈杆状。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH7.0。

所述暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株的生理生化特征：革兰氏阳性杆菌；过氧化氢酶试验阳性，淀粉水解试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，丙二酸利用试验阳性，明胶液化试验阳性，甲基红实验阴性，D-葡萄糖发酵试验阳性、D-甘露醇发酵试验阳性、乳糖发酵试验阳性。

所述暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株活菌制剂的制备方法，其特征是，暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)PAPM-15经扩大培养后，接种于(接种量1-3％)发酵培养基，32-37℃培养48-72h，然后加入没食子酸丙酯(PG)0.01-0.02％(w/w)、聚谷氨酸3-5％(w/w)和卡松0.05-0.1％(w/w)，搅拌均匀，即为所述活菌制剂。

具体包括以下步骤：

1)菌种活化：将低温保藏的暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌种转接至NA培养基试管斜面，于32-37℃培养24-36h进行活化；

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌苔，接种于NB培养基中，32-37℃培养24-36h；

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以1-3％的接种量转接入种子罐中，于32-37℃培养20-24h；

4)发酵培养：将种子罐菌种以1-3％的接种量转接入发酵罐；32-37℃培养48-72h，获得暹罗芽孢杆菌PAPM-15的发酵液；

发酵培养基的配方为：豆粕粉15g、淀粉10g、葡萄糖5g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、硫酸锌0.5g、复合酶制剂0.2g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为：按质量比碱性蛋白酶70％、纤维素酶30％。

5)发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01-0.02％(w/w)、聚谷氨酸3-5％(w/w)和卡松0.05-0.1％(w/w)，搅拌均匀，即为所述活菌制剂。

暹罗芽孢杆菌PAPM-15活菌制剂的使用方法：暹罗芽孢杆菌PAPM-15活菌制剂加水稀释200～300倍，浸泡种子或移苗时蘸根或浇水时随水冲施。

本发明还提供了上述的耐盐碱暹罗芽孢杆菌PAPM-15在产NH₃和产ACC脱氨酶，拮抗藤黑镰孢菌方面的应用。

本发明还提供了上述的活菌制剂在促进水稻生长，防治藤黑镰孢菌引起的水稻恶苗病等方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明暹罗芽孢杆菌PAPM-15分离自盐碱地土壤，耐盐碱能力较强，产NH₃和ACC脱氨酶能力强，促进水稻生长，且对水稻恶苗病病原菌具有较强的抑制作用，可用于生产生物肥料，特别是盐碱地水稻专用微生物肥料，可减少水稻恶苗病发生，提高水稻产量和质量。

本发明暹罗芽孢杆菌PAPM-15活菌制剂的生产方法科学，发酵液活菌数高，生产成本低。发酵培养基中添加复合酶制剂，灭菌时在升温过程中对豆粕等原料进行水解，可缩短延迟期，提高原料利用率，提高发酵液中的活菌浓度。发酵液中加入抗氧化剂没食子酸丙酯与对活菌具有保护作用的聚谷氨酸，可以减少菌剂在存放过程中的活菌损失，提高产品的生物稳定性。

附图说明

图1为暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株的菌体形态图；

图2为基于16S rRNA部分序列构建的系统发育树；

图3为暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株在以ACC为唯一氮源的培养基上生长图片，从图中可以看出：暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株能够在以ACC为唯一氮源的培养基上生长，说明其具有产ACC脱氨酶的能力；

图4为暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株培养物加入Nessler’s试剂的图片，从图中可以看出：加入Nessler’s试剂后产生黄色沉淀。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1：暹罗芽孢杆菌PAPM-15的筛选

(1)耐盐碱菌株的筛选

暹罗芽孢杆菌PAPM-15分离自水稻根际土壤。土壤于2018年9月取样于山东省滨州市滨城区中度盐碱土壤。具体分离方法为：土样混匀，称取5g，放入盛有95mL无菌水和10粒玻璃珠的三角瓶中，于37℃、180rpm振荡30min。取土壤悬液1mL进行10^-1-10^-7系列浓度梯度稀释，然后取10^-5、10^-6、10^-7三个稀释度涂布至含选择培养基的平板上，于37℃倒置培养2d。分别挑取单菌落划线至含选择培养基的平板上，于37℃倒置培养2d。挑取单菌落转接至保藏培养基试管斜面上，于37℃培养2d，长满菌苔后，置于4℃冰箱中保存备用。共筛选到182株细菌。

所述选择培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 15g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH8.0，121℃灭菌20min。

所述保藏培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 5g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH7.5，121℃灭菌20min。

(2)耐高盐碱菌株的筛选

在高盐碱平板上接种步骤(1)筛选到的菌株，37℃倒置培养3～7d，观察生长情况。共筛选到72株细菌。

所述高盐碱培养基的配方为：蛋白胨10g、酵母膏5g、NaCl 100g、琼脂20g、蒸馏水1000mL、pH10.0，121℃灭菌20min。

(3)产NH₃菌株的筛选

将步骤(2)中筛选到的耐盐碱程度高的菌株转接到含10mL蛋白胨水(10g/L)试管中，37℃培养72h。以只加10mL蛋白胨水的试管作为对照。每管加入0.5mL Nessler’s试剂，产生黄色或褐色沉淀则表明有NH₃产生(如图4所示)。共筛选出产NH₃菌株20株。

所述蛋白胨水的配方为：蛋白胨10.0g、蒸馏水1000mL；121℃灭菌20min；pH＝7.0。所述的Nessler’s试剂配制方法：称取HgI 50.0g和KI 40.0g溶于200mL无氨水中，将此溶液倒入700mL NaOH溶液(210g/L)中，稀释至1000mL静置，取上层清液使用。

(4)产ACC脱氨酶菌株的筛选

将步骤(3)中筛得的产NH₃的高盐碱耐受菌株接种到以ACC为唯一氮源的DF盐培养基平板中，能够正常生长的菌株则具有产ACC脱氨酶的能力。共筛选出产ACC脱氨酶的菌株12株。

所述DF盐培养基配方为：KH₂PO₄ 4.0g；NaH₂PO₄ 6.0g；MgSO₄·7H₂O 0.2g；FeSO₄·7H₂O 0.lg；葡萄糖2.0g；葡萄糖酸钠2.0g；柠檬酸2.0g；微量元素0.1mL，pH＝7.5。(微量元素100mL：MoO₃ l 0.0mg；H₃BO₃ 10.0mg；MnSO₄·H₂O 11.19mg；CuSO₄·5H₂O 78.22mg；ZnSO₄·7H₂O 124.6mg)。将配制的ACC溶液通过0.2μm的滤膜抽滤除菌后，以3mmo1/L终浓度加入到不含硫酸铵的DF培养基中。

(5)对峙培养法筛选水稻恶苗病致病菌的拮抗菌

将直径5mm藤黑镰孢菌菌块接种到PDA培养基平板的中心，在距平板中心2.5cm处等距离处接种上述所筛菌株，以不接种上述所筛菌株的平板为对照，每个处理3次重复，28℃培养10d，选取抑菌圈直径较大的菌株，保存备用。

所述PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值自然。

通过上述多重筛选，综合考虑菌株的生长速度、耐盐碱度、产NH₃能力、产ACC脱氨酶能力和对水稻恶苗病致病菌藤黑镰孢菌的拮抗能力，得到一株耐盐碱能力强、具有产NH₃、产ACC脱氨酶能力的水稻恶苗病致病菌的拮抗菌，编号为PAPM-15。

实施例2暹罗芽孢杆菌PAPM-15的鉴定

(1)形态与生理生化特特征

所述暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株的形态特征为：在NA培养基上于37℃培养48h，菌落直径约0.5-0.8mm，白色不透明，圆形，边缘不整齐，表面粗糙，隆起，褶皱；菌体呈杆，如图1所示。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH 7.0。

所述暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株的生理生化特征：革兰氏阳性杆菌；过氧化氢酶试验阳性，淀粉水解试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，丙二酸利用试验阳性，明胶液化试验阳性，甲基红试验阴性，D-葡萄糖发酵试验阳性、D-甘露醇发酵试验阳性、乳糖发酵试验阳性。

(2)16S rDNA序列分析

将PAPM-15菌株接种到LB培养基中，于37℃，180r/min摇床培养24h，收集菌体，提取总DNA，然后以其为模板，在原核生物16S rRNA基因的通用引物F27:5′-AGA GTT TGA TCATGG CTC AG-3′和F27:5′-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3′的引导下进行16S rDNA基因的PCR扩增。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，采用胶回收试剂盒回收，交由上海生工生物技术有限公司测序。将所测16S rDNA序列(SEQ No.1)与GenBank数据库中的序列比对，并用MEGA 7.0软件进行多序列同源性分析，并构建系统发育树，如图2所示。

通过形态、生理生化特征和16S rDNA序列分析可知，该菌株为暹罗芽孢杆菌，命名为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)PAPM-15。该菌株于2020年6月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20119。

实施例3暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌剂的制备

所述暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株菌剂的制备方法包括以下步骤：

1)菌种活化：将低温保藏的暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌种转接至NA培养基试管斜面，于32-37℃培养24-36h进行活化。所述NA培养基即营养琼脂培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、琼脂20g、水1000mL、pH7.0。

2)三角瓶种子制备：用接种环刮取活化后的暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌苔，接种于NB培养基中，32-37℃培养24-36h。所述NB培养基即营养肉汤培养基，其配方为：牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、水1000mL、pH7.0。

3)种子罐菌种制备：将三角瓶种子以体积比2％的接种量转接入装有6L NB培养基的10L种子罐中，于32-37℃培养20-24h，全程搅拌转速200rpm，0-6h通风量为3L/min，6-20h通风量为6L/min。

4)发酵培养：将种子罐菌种以体积比2％的接种量转接入500L的发酵罐。发酵罐内装发酵培养基300L，32-37℃培养48-72h，获得暹罗芽孢杆菌PAPM-15的发酵液。全程搅拌转速为180rpm，0-6h通风量为200L/min，6-28h通风量为300L/min。发酵结束后，发酵液中暹罗芽孢杆菌PAPM-15的活菌数为(1～2)×10¹⁰cfu/ml。

步骤4)所述发酵培养基的配方为：豆粕粉15g、淀粉10g、葡萄糖5g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、硫酸锌0.5g、复合酶制剂0.2g、水1000mL，初始pH7.5。所述复合酶制剂的组成为碱性蛋白酶70％、纤维素酶30％。碱性蛋白酶和纤维素酶均由泰安信得利生物科技有限公司生产，产品规格均为10万U/g。碱性蛋白酶的活力单位定义与检测方法执行国家标准GB/T 23527-2009《蛋白酶制剂》，纤维素酶的酶活力单位定义与检测方法执行中华人民共和国轻工行业标准QB 2583-2003《纤维素酶制剂》。

步骤4)所述发酵培养基的制备方法为：按照配方称取原料，溶于水中，加热至50-55℃，保温1-2h，然后升温至121℃，保温20-30min进行灭菌。

5)活菌制剂的制备：向步骤4)所述暹罗芽孢杆菌PAPM-15发酵液中加入没食子酸丙酯(PG)0.01％(w/w)、农用级聚谷氨酸粉3％(w/w)和0.05％卡松(w/w)，搅拌均匀，获得活菌制剂，其活菌含量优选为(1.0～2.0)×10¹⁰cfu/g。所述农用级聚谷氨酸粉由南京轩凯生物科技有限公司生产，其聚谷氨酸含量为25％。

实施例4暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌剂对水稻恶苗病的防治作用

盆栽实验用土取自山东省滨州市滨城区，土壤类型为中度盐碱土壤，按表1进行盆栽实验，水稻恶苗病菌菌剂、PAPM-15菌剂在水稻疏苗后喷施。先喷水稻恶苗病菌菌剂，2天后再喷施暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌剂。水稻苗株高至5cm时进行疏苗，每盆(200g土)保留5株，每个处理10盆，重复3次。按常规方式进行管理，观察记录20d、40d和60d的发病株数、相对病斑高度，计算病情指数和相对防效。

表1盆栽实验设计

所述水稻恶苗病菌菌剂制备方法：将水稻恶苗病原菌(藤黑镰孢菌)接种于PDA平板中，28℃培养8-10d，长满菌丝后制成孢子悬浮液，孢子浓度为1×10⁶cfu/mL。所述PDA培养基配方：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，蒸馏水1000mL，pH值自然。

所述PAPM-15菌剂制备方法：将实施例3制备的暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌剂进行稀释，并将其调整1×10⁸cfu/mL，即PAPM-15菌剂。

病害分级标准以整株为指标，具体分级为：0级：无症状；1级：茎基部轻微变褐，稻苗生长基本正常；3级：茎基部明显变褐，伴有软化和轻微腐烂；5级：茎基部明显变褐和腐烂，心叶萎垂卷缩；7级：茎基部变褐腐烂，全株青枯或黄褐色枯死；9级：整株腐烂。

病情指数＝∑(发病水稻数×病情级别数)/(水稻总株数×最高病情级别数)×100％

相对防效(％)＝(CK2病情指数-PAPM-15处理病情指数)/CK2病情指数×100％

试验结果如表2所示，实验调查期间，CK1发病指数为0，而CK2发病指数高达50.23-68.91％，这说明实验所采用的水稻恶苗病病原菌对受试水稻具有较强的致病性。与CK2相比，接种PAPM-15菌剂的处理发病指数仅为14.01％-27.55％，平均相对防效高达67.00％，这说明暹罗芽孢杆菌株PAPM-15对水稻恶苗病具有较好的防治效果。

表2暹罗芽孢杆菌株PAPM-15菌制剂对水稻恶苗病的防治作用

注：表中数据为3次重复的平均值。“-”表示无。不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan氏新复极差法)。

实施例5暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌剂对水稻促生作用

盆栽实验用土取自山东省滨州市滨城区，土壤类型为中度盐碱土壤。水稻种子采用盐水漂浮法进行挑选，挑选后用清水淘洗3次，清除水稻外壳盐分，将水稻种子放入烧杯中于30℃条件下用无菌水浸种催芽。

分别取实施例3制备的暹罗芽孢杆菌株PAPM-15活菌制剂100倍稀释液50.0mL，加入到装有200.0g盆栽育苗土的圆柱形营养钵(直径为10cm，高为10cm)中，待水稻种子胚芽长至0.5cm左右时，挑选长势一致的种子分别播种到营养钵中，每钵播种5粒。设置对照组为加入灭菌的暹罗芽孢杆菌株PAPM-15活菌制剂100倍稀释液50.0mL的营养钵。每个处理10盆，重复3次。试验期间向营养钵内浇无菌水，把种好水稻的营养钵放入智能人工气候培养箱内，光照时间12h，设置光照等级为3级；黑暗时间12h，设置光照等级为0；温度均为30℃，湿度均为30％。育苗20d后，测量水稻的相关生理指标。

试验结果如表3所示，加入暹罗芽孢杆菌株PAPM-15活菌制剂，20天后使水稻高度增加41.38％，茎粗增加83.21％，地上干质量增加79.17％，地上鲜质量增加80.00％。因此，加入暹罗芽孢杆菌株PAPM-15活菌制剂的土壤相比对照，水稻的各项指标都有所提高，说明PAPM-15菌株对水稻生长具有促生效果。

表3暹罗芽孢杆菌株PAPM-15菌制剂对水稻促生作用

注：表中数据为3次重复的平均值。不同小写字母表示差异显著(P<0.05，Duncan氏新复极差法)。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东佐田氏生物科技有限公司

<120> 一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌及其活菌制剂的生产方法与应用

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<212> DNA

<213> 暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）PAPM-15

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gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg agccagccgc cgaaggtgga 1440

ca 1442

Claims (7)

1.一株耐盐碱暹罗芽孢杆菌菌株，其为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)PAPM-15，保藏编号为CGMCC No.20119。

2.权利要求1所述的耐盐碱暹罗芽孢杆菌菌株在产NH₃和产ACC脱氨酶，拮抗藤黑镰孢菌方面的应用。

3.一种以权利要求1所述的耐盐碱暹罗芽孢杆菌PAPM-15菌株为主要有效成分的活菌制剂。

4.权利要求3所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，暹罗芽孢杆菌菌株PAPM-15经扩大培养后，接种于发酵培养基，32-37℃培养48-72h，得到发酵液，然后进一步制备活菌制剂。

5.如权利要求4所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，所述发酵培养基为：豆粕粉15g、淀粉10g、葡萄糖5g、酵母浸粉1g、磷酸二氢钾1.0g、硫酸镁1.0g、硫酸锌0.5g、复合酶制剂0.2g、水1000mL，初始pH7.5；所述复合酶制剂的组成为：按质量比，碱性蛋白酶70％、纤维素酶30％。

6.如权利要求5所述的活菌制剂的制备方法，其特征是，所述发酵液按质量比加入没食子酸丙酯0.01-0.02％、聚谷氨酸3-5％和卡松0.05-0.1％，搅拌均匀，得到活菌制剂。

7.权利要求3所述的活菌制剂在防治藤黑镰孢菌引起的水稻恶苗病，促进水稻生长方面的应用。

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