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CN111684063A - 细胞的制造方法 - Google Patents

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CN111684063A
CN111684063A CN201980011114.7A CN201980011114A CN111684063A CN 111684063 A CN111684063 A CN 111684063A CN 201980011114 A CN201980011114 A CN 201980011114A CN 111684063 A CN111684063 A CN 111684063A
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cell
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inhibitor
ability
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山崎奈穗
村上裕太
细谷昌树
村口太一
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Fujifilm Corp
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Abstract

本发明的课题在于提供一种能够高效地分化为目标分化细胞的多能干细胞的制造方法。根据本发明，可提供一种细胞的制造方法，其包括：第一工序，获得作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞；及第二工序，一边维持未分化状态一边处理上述细胞而获得分化为上述特定的分化细胞的能力相对较高的细胞。

Description

细胞的制造方法
技术领域
本发明涉及一种具有分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力的细胞的制造方法。
背景技术
作为多能干细胞，已知有人工多能干细胞(induced pluripotent stem cell；也称为iPS细胞)、胚胎干细胞(embryonic stem cell：也称为ES细胞)等。在再生医学类领域，尤其针对iPS细胞的实用化的研究正在进行中。
已知有iPS细胞等多能干细胞存在初始(naive)型细胞和诱导(prime)型细胞。初始型细胞接近发育初期的状态，诱导型细胞则为发育进一步进行的细胞。
在非专利文献1中记载有利用组蛋白去乙酰化酶抑制剂使多能干细胞复位(reset)而转换为初始型细胞的方法。
在专利文献1中记载有一种将非多能哺乳动物细胞诱导成诱导多能干细胞的方法，其包括如下阶段：在足以将细胞诱导成多能干细胞的条件下，使非多能细胞与TGFβ受体/ALK5抑制剂；MEK抑制剂；及ROCK抑制剂接触，并且记载有使细胞进一步与组蛋白去乙酰化酶抑制剂接触。在专利文献2中记载有一种将非多能哺乳动物细胞诱导成诱导多能干细胞的方法，其包括如下工序：在细胞足以诱导成多能干细胞的条件下，使非多能细胞与3’-磷酸肌醇依赖性激酶-1(PDK1)激活剂接触，由此将非多能哺乳动物细胞诱导成诱导多能干细胞，并且记载有还可以包括使非多能细胞与组蛋白去乙酰化酶抑制剂接触的工序。
在专利文献3中记载有一种初始型多能干细胞的制造方法，其包括：使Nanog及Klf2在诱导型多能干细胞中临时表达，且在包含LIF、MEK抑制剂、GSK3抑制剂、cAMP产生促进剂、TGF-β抑制剂及PKC抑制剂的培养基中培养。
在专利文献4中记载有一种使人干细胞复位为更初始的状态的方法，其包括：(a)提供应初始化的人干细胞；(b)(i)根据需要，将一个以上的不同种类的初始化因子在细胞中表达或导入，(ii)通过在包含MEK抑制剂且进一步包含根据所需的STAT3激活剂及根据所需的一种以上的进一步的抑制剂的复位培养基中培养细胞来诱发更初始的状态；及(c)在包含MEK抑制剂、PKC抑制剂及根据所需的GSK3抑制剂及STAT3激活剂的初始培养基中维持细胞。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2016-027808号公报
专利文献2：日本特开2016-171798号公报
专利文献3：国际公开WO2016/148253号
专利文献4：国际公开WO2016/027099号
非专利文献
非专利文献1：Guo G.et al.Development,2017Aug 1；144(15)：2748-2763
发明内容
发明要解决的技术课题
本发明人等通过至今为止的研究发现，关于通过将初始化因子导入体细胞而制作出的iPS细胞，即使在作为iPS细胞的标志物(marker)表达的情况下，也会存在无法分化为三个胚层全部的iPS细胞。
本发明要解决的课题在于提供一种能够高效地分化为目标分化细胞的多能干细胞的制造方法。
用于解决技术课题的手段
本发明人为了解决上述课题而进行了深入研究，其结果，通过如下过程成功制造出能够高效地分化为目标分化细胞的多能干细胞：获得作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞之后，一边维持未分化状态一边处理上述细胞而获得分化为上述特定的分化细胞的能力相对较高的细胞。本发明是根据上述见解而完成的。
即，根据本发明，提供以下发明。
(1)一种细胞的制造方法，其包括：
第一工序，获得作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞；及
第二工序，一边维持未分化状态一边处理上述细胞而获得分化为上述特定的分化细胞的能力相对较高的细胞。
(2)根据(1)所述的方法，其中，与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力得到了提高。
(3)根据(1)所述的方法，其中，与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及外胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及外胚层的能力分别得到了提高；或者
与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及中胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及中胚层的能力分别得到了提高。
(4)根据(2)或(3)所述的方法，其中，第二工序中获得的细胞为能够分化为内胚层、中胚层及外胚层的全部的细胞。
(5)根据(1)所述的方法，其中，上述特定的分化细胞为中胚层细胞或外胚层细胞。
(6)根据(1)所述的方法，其中，上述特定的分化细胞为血细胞、心肌细胞或神经细胞。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的方法，其中，第二工序中获得的细胞中的STELLA的表达量高于第一工序中获得的细胞中的STELLA的表达量。
(8)根据(1)至(7)中任一项所述的方法，其中，第二工序中获得的细胞中的KLF17的表达量高于第一工序中获得的细胞中的KLF17的表达量。
(9)根据(1)至(8)中任一项所述的方法，其中，上述第二工序为一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理上述细胞的工序。
(10)根据(9)所述的方法，其中，上述第二工序为一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子处理上述细胞的工序。
(11)根据(9)或(10)所述的方法，其中，第二工序包括如下工序：将细胞在包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂、MAPK/ERK激酶抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养之后，在不包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂而包含MAPK/E RK激酶抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、Wnt信号抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养。
(12)根据(9)至(11)中任一项所述的方法，其中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸或其盐。
(13)根据(1)至(12)中任一项所述的方法，其中，上述第二工序中的培养基不包含抗坏血酸。
(14)根据(1)至(13)中任一项所述的方法，其中，上述体细胞为源自成人的体细胞。
(15)根据(1)至(14)中任一项所述的方法，其还包括使第二工序中获得的细胞分化的第三工序。
(16)一种制造多能干细胞的方法，与诱导型多能干细胞相比，上述多能干细胞的三胚层分化能力得到了提高，所述制造多能干细胞的方法包括一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理诱导型多能干细胞的工序。
(17)一种制造多能干细胞的方法，与诱导型多能干细胞相比，上述多能干细胞的向特定的分化细胞的分化能力得到了提高，所述制造多能干细胞的方法包括一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理诱导型多能干细胞的工序。
(18)根据(17)所述的方法，其中，特定的分化细胞为血细胞、心肌细胞或神经细胞。
(19)根据(16)至(18)中任一项所述的方法，其中，一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的工序包括如下工序：在包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂、MAPK/ERK激酶抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养之后，在不包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂而包含MAPK/ERK激酶抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、Wnt信号抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养。
(20)根据(16)至(19)中任一项所述的方法，其中，组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸或其盐。
(21)根据(16)至(20)中任一项所述的方法，其中，一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的工序中的培养基不包含抗坏血酸。
发明效果
根据本发明，能够制造能够高效地分化为目标分化细胞的多能干细胞。
附图说明
图1表示通过定量RT-PCR测定出定义未处理及实施了处理的人iPS细胞株(253G1株)中的未分化性的基因的表达的结果。
图2表示通过定量RT-PCR测定出分化为三胚层谱系的细胞(253G1株)中的各胚层特异性基因表达的结果。
图3表示通过定量RT-PCR测定出分化为三胚层谱系的另一iPS细胞株(201B7株及A株)中的各胚层特异性基因表达的结果。
图4表示将未处理及处理后的iPS细胞分别分化为血液细胞并通过流式细胞仪分析了作为血液细胞的标志物的CD34与KDR的表达细胞的比例的结果。
图5表示iPS细胞的基于定量RT-PCR的三胚层分化能力的评价结果。
图6表示iPS细胞的三胚层分化能力的评价结果的总结。
图7表示在改变MEK抑制剂的浓度的情况下评价了基于流式细胞仪的处理效率的结果。
图8表示在改变MEK抑制剂的浓度的情况下评价了染色体的特定区域的拷贝数的的结果。
图9表示将未处理及处理后的iPS细胞分别诱导成心肌细胞并通过流式细胞仪比较了活细胞中的cTnT阳性率的结果。
图10表示测定出将iPS细胞株诱导成心肌细胞时的cTnT的阳性率的结果。
图11表示用荧光显微镜观察了通过向神经干细胞的分化诱导而获得的细胞的图像。
图12表示将用荧光显微镜观察了通过向神经干细胞的分化诱导而获得的细胞的图像的亮度进行定量化的结果。
具体实施方式
以下，对用于实施本发明的方式进行详细说明。
本说明书中的缩写具有以下含义。
Klf：Kruppel-like factor(Kruppel样因子)
LIF：Leukemia inhibitory factor(白血病抑制因子)
MEK：MAPK/ERK激酶(MAPK：mitogen-activated protein kinase(丝裂原活化蛋白激酶)；ERK：extracellular signal-regulated kinase(细胞外信号调节激酶))
GSK3：glycogen syn-thase kinase-3(糖原合成酶激酶-3)
TGF：Transforming growth factor(转化生长因子)
PKC：Protein kinase C(蛋白激酶C)
RT-PCR：Reverse Transcription polymerase chain reaction(逆转录聚合酶链反应)
PCR：polymerase chain reaction(聚合酶链反应)
KDR：kinase insert domain-containing receptor(含激酶插入区受体)
Tert：Telomerase Reverse Transcriptase(端粒酶逆转录酶)
Fbx15：F-Box Protein 15(F-盒蛋白15)
ECAT：ES cell associated transcripts(ES细胞相关转录物)
Dnmt3L：DNA Methyltransferase 3Like(DNA甲基转移酶3L抗体)
Gdf3：Growth differentiation factor-3(生长分化因子-3)
Fthl17：Ferritin heavy polypeptide-like 17(铁蛋白重肽样17)
Sall4：Sal-like protein 4(Sal样蛋白)
Rex1：Reduced-expression 1(减弱表达1)
UTF1：Undifferentiated Embryonic Cell Transcription Factor 1(未分化胚胎细胞转录因子1)
Stat3：Signal Transducer and Activator of Transcription 3(信号转导和转录激活因子3)
Grb2：Growth factor receptor-bound protein 2(生长因子受体结合蛋白2)
Prdm14：PR/SET domain family 14(PR/SET域家族14)
Nr5a1：nuclear receptor subfamily 5,group A,member 1(核受体亚家族5，组A，成员1)
Nr5a2：nuclear receptor subfamily 5,group A,member 2(核受体亚家族5，组A，成员2)
bFGF：basic Fibroblast Growth Factor(成纤维细胞生长因子)
POU5F1：POU domain,class 5,transcription factor 1(POU域，类5，转录因子1)
DNMT3B：DNA(cytosine-5-)-methyltransferase 3beta(DNA(胞嘧啶-5-)-甲基转移酶3β)
GAPDH：Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase(3-磷酸甘油醛脱氢酶)
FOXA2：forkhead box protein A2(叉头盒蛋白A2)
T：Brachyury(鼠短尾突变体表型)
PDGFRA：platelet-derived growth factor receptor alpha(小板源性生长因子受体)
PAX6：paired box 6(配对基因盒6)
MAP：mitogen-activated protein(丝裂原活化蛋白)
BMP：Bone Morphogenetic Protein(骨形成蛋白)
VEGF：vascular endothelial growth factor(血管内皮生长因子)
IL：interleukin(白细胞介质)
IGF：Insulin-like growth factor(胰岛素样生长因子)
SCF：Stem cell factor(干细胞因子)
ROCK：Rho-associated coiled-coil forming kinase/Rho结合激酶(Rho相关螺旋形成激酶/Rho结合激酶)
ALK5：TGF-beta type I receptor(TGF-β1型受体)
CD34：Cluster of differentiation 34(分化簇34)
Sox：SRY-boxes(SRY盒)
ERas：ES cell expressed Ras(ES细胞表达Ras)
Tcl1：T-cell leukemia/lymphoma 1A(重组人T细胞白血病/淋巴瘤1A)
多能干细胞中，已知有初始型多能干细胞及诱导型多能干细胞这两种不同状态的细胞。初始型多能干细胞及诱导型多能干细胞能够根据分子特征及细胞特征来区分。
初始型多能干细胞典型地具有如下特征：表达高水平的多能因子Oct4、Na nog、Sox2、Klf2及Klf4，对Lif/Stat3或2i(ERKi/GSKi)中的任一个产生反应而自我更新，对Fgf/Erk产生反应而分化，并呈现XaXa的X染色体激活状态。诱导型多能干细胞典型地具有如下特征：表达高水平的多能因子Oct4、Sox2及Nanog，不对Lif/Stat3产生反应而对Fgf/Erk产生反应而自我更新，并呈现XaX i的X染色体激活状态(Nichols et al.,(2009)Cell StemCell 4(6)：487-4 92)。另外，Xa表示活性X染色体，Xi表示失活X染色体。
根据本发明的第一方式的细胞的制造方法包括：
第一工序，获得作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞；及
第二工序，一边维持未分化状态一边处理上述细胞而获得分化为上述特定的分化细胞的能力相对较高的细胞。
即使个体不同，在相同的培养条件下进行了相同的操作的细胞也视为具有相同的性质的细胞。
根据本发明的第二方式的细胞的制造方法为一种制造多能干细胞的方法，与诱导型多能干细胞相比，该多能干细胞的三胚层分化能力或向特定的分化细胞的分化能力得到了提高，该制造多能干细胞的方法包括一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理诱导型多能干细胞的工序。
在专利文献1及2中记载有在从非多能细胞诱导成多能细胞时，使细胞与组蛋白去乙酰化酶抑制剂接触。在专利文献3中记载有通过在规定的条件下培养诱导型多能干细胞来制造初始型多能干细胞。然而，并没有关于如下内容的见解：关于通过将初始化因子导入体细胞而制作出的iPS细胞，即使在作为iPS细胞的标志物表达的情况下，也会存在无法分化为三个胚层全部的iPS细胞。在专利文献4中记载有将人干细胞复位为更初始的状态的方法，且记载有所获得的干细胞分化为神经细胞、内胚层及平滑肌细胞，但并没有记载通过复位为初始的状态而分化能力得到提高。并且，专利文献4中的培养基为包含抗坏血酸的培养基。
在本发明中，已鉴定出在将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞中存在分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞。在此基础上，通过一边维持未分化状态一边处理上述细胞，成功地获得了分化为上述特定的分化细胞的能力相对较高的细胞。
[关于第一工序]
本发明中的第一工序为获得作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞的工序。
作为体细胞并不受特别限定，能够利用任意的体细胞。例如，除了胎儿期的体细胞以外，还可以使用源自成人的体细胞(即，成熟的体细胞)。作为体细胞，例如可以举出(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、齿髓干细胞等组织干细胞(体干细胞)、(2)组织祖细胞、(3)成纤维细胞(皮肤细胞等)、上皮细胞、肝细胞、淋巴细胞(T细胞、B细胞)、内皮细胞、肌肉细胞、毛细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞、皮肤细胞等分化的细胞。
作为成为体细胞的来源的活体并不受特别限定，例如可以举出人、非人动物(例如，猴子、绵羊、牛、马、狗、猫、兔子、大鼠、小鼠)。优选为人。
作为导入体细胞的初始化因子并不受特别限定，例如可以举出Oct3/4、Klf4、c-Myc、Sox2、Nanog、Klf2、L-Myc、N-Myc、Klf5、Lin28、Tert、Fbx15、ERas、ECAT15-1、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、ECAT1、Esg1、Dnmt3L、ECAT8、Gdf3、Sox15、Fthl17、Sall4、Rex1、UTF1、Stella、Stat3、Grb2、Prdm14、Nr5a1、Nr5a2、E-cadherin。在此，能够从这些基因组中选择两种以上的基因并任意地组合导入。其中，优选至少具有Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc的组合、至少具有Oct3/4、Sox2、Klf4及L-Myc的组合或至少具有Oct3/4、Sox2、Nanog及Lin28的组合。
并且，所导入的基因的种类优选为与导入目标基因的细胞的种类相同。例如，导入人源细胞的基因优选为人基因。例如，作为导入人源体细胞的基因，优选至少具有人Oct3/4、人Sox2、人Klf4及人c-Myc的组合、至少具有人Oct3/4、人Sox2、人Klf4及人L-Myc的组合或至少具有人Oct3/4、人Sox2、人Nanog及人Lin28的组合。
能够使用基因表达载体将初始化因子的基因导入体细胞。作为基因表达载体并不受特别限定，例如可以举出病毒载体、质粒载体、人工染色体载体、转座子载体。作为病毒载体，可以举出逆转录病毒载体、腺病毒载体、仙台病毒载体、慢病毒载体、腺相关病毒载体。
作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞可以通过将初始化因子导入体细胞而自己制作，但也可以获得由研究机构或企业提供或销售的细胞。即，本发明中的第一工序可以为从人造多能干细胞库获得人造多能干细胞的工序。
例如，能够获得并使用由京都大学iPS细胞研究所提供的201B7、253G1、253G4、1201C1、1205D1、1210B2、1231A3、1383D2、1383D6、iPS-TIG120-3f7、iPS-TIG120-4f1、iPS-TIG114-4f1、CiRA086Ai-m1、CiRA188Ai-M1或iRA188Ai-W1。
并且，也能够从NIH(National Institutes of Health：美国国立卫生研究院)或California Institute for Regenerative Medicine(加利福尼亚再生医学研究所)、NewYork Stem Cell Foundation(纽约干细胞基金会)、European Bank for inducedPluripotent Stem Cells(欧洲诱导多能干细胞银行)等所制作的iPS细胞库获得。
“将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞”中的未分化细胞是指最终未分化的细胞，优选为具有分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力的细胞。“分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞”中的“特定的分化细胞”是指内胚层、中胚层及外胚层中的任一种或源自内胚层、中胚层及外胚层中的任一种的、任意特定的分化的细胞例如血细胞、心肌细胞或神经细胞。“分化为特定的分化细胞的能力相对较低”是指与本发明中的后述的第二工序中获得的“分化为特定的分化细胞的能力相对较高的细胞”相比，分化为特定的分化细胞的能力较低。
第一工序中获得的“作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞”能够在涂覆有饲养细胞的板或涂覆有基质胶(Matrigel)(注册商标)等支架的板上在适当的培养基中维持培养。作为饲养细胞并不受特别限定，可以举出小鼠胚胎成纤维细胞(MEF细胞)、小鼠胚成纤维细胞(STO细胞)。
作为维持培养时的培养基，能够使用mTeSR(注册商标)1(Stemcell Technologies)或StemFlex(注册商标)等市售的培养基。可替代地，例如作为基础培养基，可以举出DMEM(Dulbecco Modified Eagle medium：改良伊格尔培养基)、DMEM与F12的混合培养基(DMEM/F12＝1:1)、KnockoutTM D-MEM(Invitrogen公司)等，并且可以举出将血清替代物(KSR；KnockoutTM Serum Replacement(Invitrogen公司))、胎牛血清(FBS)、非必需氨基酸(NEAA)、L-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、抗生物质(例如，链霉素、青霉素、嘌呤霉素、丝裂霉素)、bFGF等添加成分任意地组合而添加到上述任一基础培养基中而准备出的培养基。
维持培养时的培养基优选不包含抗坏血酸。
维持培养的培养条件优选37℃、5％CO2、10％O2条件下等，但并不限定于此。
[关于第二工序]
本发明中的第二工序为一边维持未分化状态一边处理第一工序中获得的细胞而获得分化为特定的分化细胞的能力相对较高的细胞的工序。以下，当称为第二工序时，包括本发明的第二方式中的“一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的工序”。
“分化为特定的分化细胞的能力相对较高的细胞”中的“特定的分化细胞”是指属于内胚层、中胚层及外胚层中的任一种的、任意特定的分化的细胞。“分化为特定的分化细胞的能力相对较高”是指与本发明中的第一工序中获得的“分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞”相比，分化为特定的分化细胞的能力较高。
第二工序中的“一边维持未分化状态一边处理”是指在能够维持未分化状态的培养基中，在可获得分化为特定的分化细胞的能力相对较高的细胞的条件下培养第一工序中获得的细胞。
第二工序优选为一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理第一工序中获得的细胞的工序。即，第二工序优选为包括在包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基中培养第一工序中获得的细胞的工序。
第二工序更优选为在一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子处理第一工序中获得的细胞的工序。
第二工序(或一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的工序)中的培养基优选不包含抗坏血酸。
作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能够使用丙戊酸或其盐(丙戊酸钠等)、丁酸或其盐(丁酸钠等)、曲古抑菌素A及制蚜菌素等，但并不受特别限定。
培养基中的组蛋白去乙酰化酶抑制剂的浓度能够根据组蛋白去乙酰化酶抑制剂的种类等适当地进行设定。例如，丙戊酸的情况，优选为0.1mmol/L～10mmol/L，更优选为0.2mmol/L～5mmol/L，进一步优选为0.5mmol/L～2mmol/L。
作为用于制备在一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理第一工序中所获得的细胞的工序中使用的培养基的基础培养基，可以举出DMEM(DulbeccoModified Eagle medium：改良伊格尔培养基)、DMEM与F12的混合培养基(DMEM/F12＝1:1)、KnockoutTM D-MEM(Invitrogen公司)等。作为第二工序中使用的培养基，优选为如下培养基，该培养基是将Neurobasal(注册商标)(Thermo Fisher Scientific公司)、B27(注册商标)(Thermo Fisher Scientific公司)、N2(Thermo Fisher Scientific公司)、1-硫代甘油及GlutaMAX(注册商标)(Thermo Fisher Scientific公司)或L-Glutamin(Thermo FisherScientific公司)等添加成分任意地组合(优选上述添加成分的全部)而添加到上述基础培养基中，还添加LIF及MEK抑制剂而成的。
作为MEK抑制剂并不受特别限定，例如可以举出PD0325901(N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯)氨基]-苯甲酰胺；CAS注册号：391210-10-9)、U0126(1,4-二氨基-2,3-二氰基-1,4-双[2-氨基苯硫基]丁二烯；CAS注册号：109511-58-2)、PD98059(2-(2-氨基-3-甲氧基苯基)-4H-1-苯并吡喃-4-酮；CAS注册号：167869-21-8)、PD184352(2-(2-氯-4-碘苯氨基)-N-环丙基甲氧基-3,4-二氟苯甲酰胺；CAS注册号：212631-79-3)。其中，优选PD0325901。
第二工序可以包括：将第一工序中所获得的细胞在包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基中培养之后，在不包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基中培养。作为不包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂的培养基，能够使用如下培养基，该培养基是将Neurobasal(注册商标)(Thermo Fisher Scientific公司)、B27(注册商标)(Thermo Fisher Scientific公司)、N2(Thermo Fisher Scientific公司)、1-硫代甘油及GlutaMAX(注册商标)(ThermoFisher Scientific公司)或L-Glutamin(Thermo Fisher Scientific公司)等添加成分任意地组合(优选上述添加成分的全部)而添加到上述基础培养基中，还添加LIF、MEK抑制剂(具体例如上所述)、PKC抑制剂、GSK3-β抑制剂及Wnt信号抑制剂而成的。
优选第二工序(或一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的工序)包括如下工序：将细胞在包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂、MAPK/ERK激酶抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养之后，在不包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂而包含MAPK/ERK激酶抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、Wnt信号抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养。
作为PKC抑制剂并不受特别限定，例如可以举出Go6983(3-[1-[3-(二甲基氨基)丙基]-5-甲氧基-1H-吲哚-3-基]-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS注册号：133053-19-7)、GF109203X(3-(1-(3-二甲基氨基)丙基)-1H-吲哚-3-基)-4-(1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯-2,5-二酮；CAS注册号：133052-90-1)。其中，优选Go6983。
作为GSK3-β抑制剂并不受特别限定，但优选CHIR99021(CAS注册号：252927-06-9)。
作为Wnt信号抑制剂并不受特别限定，可以举出XAV939(tankyrase(端锚聚合酶)抑制剂)(CAS注册号：284028-89-3)、IWP-1、IWP-2、IWP-3、IWP-4、IWR-1、53AH(以上为porcupine(豪猪)抑制剂)、KY02111等低分子化合物及它们的衍生物或IGFBP4、DKK1、Wnt-C59等蛋白质。其中，优选XAV939。
LIF在培养基中的浓度并不受特别限定，例如为0.1ng/mL～100ng/mL，优选为0.2ng/mL～10ng/mL。
MEK抑制剂在培养基中的浓度并不受特别限定，例如为50nmol/L～100μmol/L，优选为100nmol/L～10μmol/L，更优选为200nmol/L～5μmol/L，进一步优选为500nmol/L～2μmol/L，尤其优选为800nmol/L～1.2μmol/L。
PKC抑制剂在培养基中的浓度并不受特别限定，例如为50nmol/L～100μmol/L，优选为100nmol/L～10μmol/L。
GSK3-β抑制剂在培养基中的浓度并不受特别限定，但优选为0nmol/L～0.3nmol/L。
Wnt信号抑制剂在培养基中的浓度并不受特别限定，例如为50nmol/L～100μmol/L，优选为100nmol/L～10μmol/L。
第二工序中的培养条件对于本领域技术人员而言是显而易见的，作为一例，能够举出37℃、5％CO2条件下。优选在低氧(5％O2)的条件下培养。
第二工序中的培养期间并不受特别限定，例如能够培养1天～14天，优选培养2天～14天。
作为判断初始化效率的指标，一般已知有作为特异性细胞表面标志物的CD75(ST6GAL1)。因此，能够利用细胞表面标志物CD75的阳性率来评价第二工序的处理的完成。能够从培养容器中回收进行了第二工序的处理的细胞，用荧光标记的抗CD75抗体(例如Alexa Fluor 647Mouse Anti-Human CD75抗体)进行染色，并利用流式细胞仪分析CD75的阳性率。CD75的阳性率例如为20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、60％以上或70％以上即可。
并且，第二工序的处理后获得的细胞优选DNA突变的发生率低。例如，能够通过利用常规方法(例如，实时PCR等)测定20号染色体的长臂区域的拷贝数来评价DNA突变的发生率低。第二工序的处理后获得的细胞中的20号染色体的长臂区域的拷贝数优选为1.5～4.5，更优选为1.5～3.5，进一步优选为1.5～2.5。
第一工序中获得的细胞及第二工序中获得的细胞的未分化性并不受特别限定，能够通过测定定义未分化性的基因的表达来评价。定义未分化性的基因的表达的测定方法并不受特别限定，例如能够通过定量RT-PCR进行测定。RT-PCR为将成为测定对象的mRNA作为模板而合成cDNA，并将该cDNA作为模板而通过PCR扩增的方法。作为定量RT-PCR，例如能够举出如下方法(实时PCR)等：使用结合有淬灭荧光色素和报告荧光色素的引物进行PCR而在各循环中对扩增产物量进行定量，并根据所检测的荧光强度急剧增大的循环数测定试样中的模板DNA量。定量RT-PCR的方法在本技术领域中是周知的，并且也能够使用市售的试剂盒来实施。根据定量RT-PCR，能够将基因的表达量或拷贝数作为相对于成为对照的管家基因(例如，GAPDH基因)的表达量或拷贝数的相对值进行检测。另外，基因的mRNA的测定也能够通过如下来进行：对通过通常的RT-PCR等进行mRNA的扩增而获得的扩增产物施加凝胶电泳，染色后，测定带(band)强度。或者，也能够使用DNA芯片对基因的mRNA或cDNA进行检测或定量。
作为定义未分化性的基因并不受特别限定，能够举出NANOG、POU5F1、LIN28、SOX2、DNMT3B、STELLA及KLF17等。
优选第二工序中获得的细胞中的STELLA的表达量高于第一工序中获得的细胞中的STELLA的表达量。
优选第二工序中获得的细胞中的KLF17的表达量高于第一工序中获得的细胞中的KLF17的表达量。
优选第二工序中获得的细胞中的SOX2的表达量高于第一工序中获得的细胞中的SOX2的表达量。
第二工序中获得的细胞中的STELLA的表达拷贝数以相对于GAPDH的表达拷贝数的比率计优选为0.001以上，更优选为0.002以上，进一步优选为0.003以上，尤其优选为0.004以上。
第二工序中获得的细胞中的KLF17的表达拷贝数以相对于GAPDH的表达拷贝数的比率计优选为5.0×10-5以上，更优选为1.0×10-4以上，进一步优选为1.1×10-4以上，尤其优选为1.2×10-4以上。
第二工序中获得的细胞中的SOX2的表达拷贝数以相对于GAPDH的表达拷贝数的比率计优选为5.0×10-5以上，更优选为6.0×10-5以上，进一步优选为7.0×10-5以上，尤其优选为8.0×10-5以上。
优选与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力得到了提高。
更优选与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及外胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及外胚层的能力分别得到了提高，或者，与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及中胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及中胚层的能力分别得到了提高。
进一步优选第二工序中获得的细胞为能够分化为内胚层、中胚层及外胚层的全部的细胞。
本发明中的特定的分化细胞优选为中胚层细胞或外胚层细胞，更优选为血细胞、心肌细胞或神经细胞。
并且，本发明中的三胚层分化能力的提高只要向内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的分化能力得到提高即可，优选为向中胚层及外胚层中的一个以上的分化能力的提高，更优选为向中胚层及外胚层的分化能力的提高。
在本发明中，细胞所具有的分化为内胚层的能力、细胞所具有的分化为中胚层的能力及细胞所具有的分化为外胚层的能力能够通过使细胞分化为内胚层、中胚层或外胚层并测定上述的分化为三胚层谱系的细胞中的各胚层特异性基因的表达来评价。
各胚层特异性基因的表达的测定方法并不受特别限定，例如能够通过定量RT-PCR法进行测定。
作为内胚层特异性基因并不受特别限定，能够举出SOX17及FOXA2等。
作为中胚层特异性基因并不受特别限定，能够举出T及PDGFRA等。
作为外胚层特异性基因并不受特别限定，能够举出PAX6及MAP2等。
作为与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层的能力得到提高的情况，能够举出将第二工序中所获得的细胞分化为内胚层的细胞中的SOX17的相对表达量相对于将第一工序中所获得的细胞分化为内胚层的细胞中的SOX17的表达量优选为2以上，更优选为4以上、6以上、8以上、10以上、12以上或15以上的情况。
作为与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层的能力得到了提高的情况，能够举出将第二工序中所获得的细胞分化为内胚层的细胞中的FOXA2的相对表达量相对于将第一工序中所获得的细胞分化为内胚层的细胞中的FOXA2的表达量优选为3以上，更优选为5以上、10以上、15以上、18以上、20以上或22以上的情况。
作为与第一工序中获得的细胞所具有的分化为中胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为中胚层的能力得到提高的情况，能够举出将第二工序中所获得的细胞分化为中胚层的细胞中的T的相对表达量相对于将第一工序中所获得的细胞分化为中胚层的细胞中的T的表达量优选为2以上，更优选3以上、5以上、8以上、9以上或10以上的情况。
作为与第一工序中获得的细胞所具有的分化为中胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为中胚层的能力得到提高的情况，能够举出将第二工序中所获得的细胞分化为中胚层的细胞中的PDGFRA的相对表达量相对于将第一工序中所获得的细胞分化为中胚层的细胞中的PDGFRA的表达量优选为1.1以上，更优选为1.2以上、1.3以上或1.4以上的情况。
作为与第一工序中获得的细胞所具有的分化为外胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为外胚层的能力得到提高的情况，能够举出将第二工序中所获得的细胞分化为外胚层的细胞中的PAX6的相对表达量相对于将第一工序中所获得的细胞分化为外胚层的细胞中的PAX6的表达量优选为1.1以上，更优选为1.2以上、1.3以上、1.4以上或1.5以上的情况。
作为与第一工序中获得的细胞所具有的分化为外胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为外胚层的能力得到提高的情况，能够举出将第二工序中所获得的细胞分化为外胚层的细胞中的MAP2的相对表达量相对于将第一工序中所获得的细胞分化为外胚层的细胞中的MAP2的表达量优选为1.1以上，更优选为1.2以上或1.3以上的情况。
[关于第三工序]
根据本发明的细胞的制造方法还可以包括使第二工序中所获得的细胞分化的第三工序。但是，根据本发明的细胞的制造方法也可以不包括上述第三工序。
在本发明中，通过对第二工序中所获得的细胞进行分化诱导而获得的细胞的种类并不受特别限定。根据需要，能够分化诱导为内胚层系细胞、中胚层系细胞或外胚层系细胞。
对第二工序中所获得的细胞进行分化诱导的方法并不受特别限定。例如，能够使用市售的STEMDiff(注册商标)Trilineage Differentiation Kit(StemcellTechnologies)分别分化诱导为内胚层、中胚层及外胚层。
并且，向血液细胞的分化诱导能够通过在后述的实施例2中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，第1天，在包含BMP4及Y27634(ROCK抑制剂)的培养基中培养，第2天，添加bFGF及BMP4，第3天，确认细胞形成球状的集落并在包含SB431542(TGF-β受体抑制剂)、CHIR99021(GSK3抑制剂)、bFGF及BMP4中培养基中培养(第3天及第4天)，第5天～第6天，在包含VEGF及bFGF的培养基中培养，第7天～第10天，在包含VEGF、bFGF、IL-6、IGF-1、IL-11及SCF的培养基中培养，由此能够分化诱导为血液细胞。另外，向血液细胞的分化诱导能够通过利用流式细胞仪分析作为血液细胞的标志物的CD34和KDR的表达来确认。
向心肌细胞的分化诱导例如能够通过在后述的实施例5中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，能够使用PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit(ThermoFisherScientific)，按照程序手册将细胞分化诱导为心肌细胞。向心肌细胞的分化诱导能够通过用流式细胞仪测定作为心肌细胞标志物的Cardiac Troponin T(cTnT)的表达来确认。按照后述的实施例5的步骤，对于分化诱导后第14天的细胞，用Alexa Fluor647 Mouse Anti-Cardiac Troponin T抗体(BD Pharmingen)将细胞内进行染色，并利用流式细胞仪AttuneNxT(ThermoFisher Scientific)分析cTnT的阳性率即可。利用上述方法分析出的cTnT的阳性率优选为5％以上，更优选为10％以上，进一步优选为20％以上，再进一步优选为30％以上，尤其优选为40％以上，最优选为45％以上。通过进行本发明的处理(即，一边维持未分化状态一边处理细胞而获得分化为特定的分化细胞的能力相对较高的细胞的第二工序)，与不进行上述处理的情况相比，cTnT的阳性率优选上升1.1～100倍，进一步优选上升1.2～100倍，最优选上升2～50倍。
向神经干细胞的分化诱导例如能够通过在后述的实施例6中所记载的条件下培养细胞来进行。具体而言，能够使用PSC Neural Induction Medium(Thermo FisherScientific)，按照程序手册将细胞分化诱导为神经干细胞。向神经干细胞的分化诱导例如能够通过对作为神经干细胞的Marker(标志物)的SOX1蛋白进行免疫染色来确认。当对SOX1蛋白进行免疫染色而将亮度定量化时，通过进行本发明的处理(即，一边维持未分化状态一边处理细胞而获得分化为特定的分化细胞的能力相对较高的细胞的第二工序)，与不进行上述处理的情况相比，亮度优选上升1.1～10倍，进一步优选上升1.5～5倍。
第二工序中所获得的细胞能够通过在内胚层系细胞分化条件下培养来分化为内胚层系细胞。作为内胚层系细胞并不受特别限定，例如可以举出消化器官系统细胞(肝细胞、胆管细胞、胰腺内分泌细胞、腺胞细胞、导管细胞、吸收细胞、杯状细胞、潘氏细胞、肠内分泌细胞等)、肺、甲状腺等组织的细胞。
第二工序中所获得的细胞能够通过在除上述以外的中胚层系细胞分化条件下培养来分化为中胚层系细胞。作为中胚层系细胞并不受特别限定，可以举出血球·淋巴细胞系统细胞(造血干细胞、红血球、血小板、巨噬细胞、粒细胞、辅助T细胞、杀伤性T细胞、B淋巴细胞等)、血管系细胞(血管内皮细胞等)、心肌细胞(例如心房肌细胞、心室肌细胞等)、成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、平滑肌细胞等。
第二工序中所获得的细胞能够通过在除上述以外的外胚层系细胞分化条件下培养来分化为外胚层系细胞。作为外胚层系细胞并不受特别限定，可以举出神经系统细胞、感觉器官细胞(晶状体、视网膜、内耳等)、皮肤表皮细胞、毛囊等。
在本发明中，使用第二工序中所获得的细胞分化诱导的细胞能够用于筛选各种疾病的治疗用医药品候选化合物。例如，能够通过将医药品候选化合物单独或与其他药剂组合而添加到分化诱导的细胞中来检测细胞的形态或功能变化、各种因子的增减、基因表达谱等来进行评价。在此，细胞优选为具有与治疗对象的疾病相同的表型的细胞，更优选为从使用源自患有疾病的患者的体细胞并通过本发明的方法制造出的细胞分化诱导的细胞。
在本发明中，能够由使用第二工序中所获得的细胞分化诱导的细胞制作组织并在再生医学领域中使用。作为将所制作出的组织移植到患者的方法，只要是本领域技术人员，则显而易见。
利用以下实施例对本发明进行进一步具体的说明,但本发明并不受实施例的限定。
实施例
实施例1
为了改善及提高人iPS细胞的三胚层分化能力而进行了以下实验。
[方法]
＜细胞＞
关于人iPS细胞株，253G1株及201B7株购自iPS PORTAL,Inc.(Takahashi K,etal.Cell.2007,Nakagawa M,et al.Nat Biotechnol.2008)。A株从Cellular DynamicsInternational(CDI)获取。
＜细胞培养及化合物处理＞
在涂覆有Matrigel(基质胶)(注册商标)(Corning)的6孔板上，在StemFlex(注册商标)(Thermo Fisher Scientific)培养基中在37℃、5％CO2、10％O2条件下维持培养了人iPS细胞。在此所获得的细胞为诱导型多能干细胞，是分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞。
第0天：为了研究分化能力改善效果，用TrypLETM Select(Invitrogen)通过37℃、5分钟的处理剥离培养中的人iPS细胞来进行了单细胞化。在已用源自小鼠胎仔的成纤维细胞(MEF、Lonza)以0.5x106cells/well(6well plate(6孔板))接种或已涂覆基质胶的孔中，将人iPS细胞以1x105cells/well接种在mTeSR(注册商标)1(Stemcell Technologies)或StemFlex(注册商标)中添加了Y-27684(10μmol/L，Wako)的培养基中。之后，在37℃、5％CO2、5％O2条件下培养到第9天。
第1天：将培养基更换为表1的培养基1。
第2～3天：将一半培养基更换为新的培养基1。
第4～8天：将培养基更换为表1的培养基2，直至第8天为止每隔1天更换为该培养基。
第9天：用TrypLETM Select在37℃下处理5分钟而剥离细胞，并将其在培养基2中添加了Y-27684(10μmol/L，Wako)的培养基中，在已接种MEF或涂覆有基质胶(注册商标)的板上进行了传代。之后，利用培养基2维持培养了细胞。
[表1]
Figure BDA0002611494780000211
＜三胚层分化＞
为了研究向三胚层的分化能力，将实施了上述处理的细胞在已涂覆基质胶的板上利用StemFlex(注册商标)培养了4～7天，直至增殖至所需要的细胞数。在三胚层分化中，使用StemDiff(注册商标)Trilineage Differentiation Kit(Stemcell Technologies)，按照程序手册使未处理或实施了上述处理的人iPS细胞分化。
第1天：使用TrypLETM Select(Thermo Fisher Sciecntific)在37℃下处理5分钟而剥离了细胞。将表2的培养基以0.5mL/well放入基质胶涂覆的24孔板中，接种iPS细胞，并在37℃、5％CO2、10％O2条件下进行了培养。
第2天：将培养基更换为新的StemDiff(注册商标)Trilineage Differentiati onKit的各分化用培养基。之后，内胚层及中胚层每天反复进行相同的操作到第5天，外胚层每天反复进行相同的操作到第7天。
[表2]
Figure BDA0002611494780000221
＜基于定量RT-PCR的未分化性及三胚层分化能力的评价＞
使用RNeasy(注册商标)Mini Kit(QIAGEN)从iPS细胞及分化为三胚层谱系的细胞中提取total(总)RNA，并使用High-Capacity RNA-to-cDNATM Kit(Applied Biosystems)进行逆转录反应而合成了cDNA。在所合成的cDNA中添加表3所示的成为未分化性的指标的基因或对各胚层特异性的基因的TaqMan(注册商标)gene expression assay(AppliedBiosystems)和TaqMan(注册商标)Fast Advanced Master Mix(Applied Biosystems)，并利用Viia7TM(Applied Biosystems)进行了PCR反应。表3的Probe primer set所示的是用于利用Thermo Fisher公司的Taqman(注册商标)Gene expression assay(基因表达分析)进行某一基因的PCR的Probe primer set(探针引物组)的代码名。
[表3]
Figure BDA0002611494780000231
[结果]
在图1中示出通过定量RT-PCR测定出定义未处理及实施了上述处理的人iPS细胞株(253G1株)中的未分化性的基因的表达的结果。
如图1所示，NANOG、POU5F1、LIN28、DNMT3B的表达在未处理和处理后的细胞中没有显著的变化。另一方面，由图1可知，在SOX2及初始ES/iPS细胞中特异性表达的STELLA及KLF17的表达在处理后iPS细胞中显著上升。
在图2中示出通过定量RT-PCR测定出分化为三胚层谱系的细胞(253G1株)中的各胚层特异性基因表达的结果。
如图2所示，与未处理的细胞相比，在实施了处理的细胞中，内胚层特异性基因(SOX17及FOXA2)及外胚层特异性基因(PAX6及MAP2)的表达显著上升。
在图3中示出通过定量RT-PCR测定出分化为三胚层谱系的另一iPS细胞株(201B7株及A株)中的各胚层特异性基因表达的结果。
如图3所示，在另一iPS细胞株(201B7及A)中，与未处理的细胞相比，在实施了处理的细胞中，内胚层特异性基因(SOX17及FOXA2)及中胚层特异性基因(T及PDGFRA)的表达显著上升。
从上述结果表明，通过对iPS细胞实施上述处理，三胚层分化能力得到了改善。这次明确了进行了评价研究的iPS细胞株在以往的培养法中一部分的分化能力降低，但通过实施上述处理改善了降低的分化能力。
实施例2
验证了实施例1中所进行的处理对向中胚层谱系中的一种的血液细胞的分化能力产生的影响。
[方法]
＜细胞＞
所使用的iPS细胞B株从CDI获取。
＜细胞培养及化合物处理＞
与实施例1同样地进行。
＜向血液细胞的分化＞
第1天：使用TrypLETM Select在37℃下处理5分钟而剥离了细胞。将该细胞悬浮于表4的Day1培养基中，将2×106cells的iPS细胞接种在球体形成用EZSPHERE(注册商标)(AGC)6孔板的1个孔中。之后，在37℃、5％CO2、5％O2条件下培养了细胞。
第2天：添加了bFGF(5ng/mL)和BMP4(10ng/mL)。
第3天：确认细胞形成球状的集落，并将培养基更换为Day3培养基。
第5天：将培养基更换为Day5培养基。
第7天～：更换为Day7培养基，之后，直至第8～10天为止每隔1天更换为Day7培养基。
[表4]
Supplemented StemPro(注册商标)-34
Figure BDA0002611494780000251
Day1
Figure BDA0002611494780000252
Day3
Figure BDA0002611494780000253
Day5
Figure BDA0002611494780000254
Day7
Figure BDA0002611494780000255
＜基于流式细胞仪的血液细胞的检测＞
回收球状的细胞，使用TrypLETM Select并通过37℃、5分钟的处理将细胞进行了单细胞化。利用Phycoerythrin(PE)-Cy7anti-human CD34(BioLegend)(Cy为注册商标)及PEanti-humanCD309(KDR)(BioLegend)对细胞进行染色，并利用流式细胞仪(Attune(注册商标)Nxt；Thermo Fisher Scientific、FACSAria(注册商标)III；BD Bioscience)进行了分析。
[结果]
在图4中示出将未处理及处理后的iPS细胞B株分别分化为血液细胞并通过流式细胞仪分析了作为血液细胞的标志物的CD34与KDR的表达细胞的比例的结果。如图4所示，与未处理相比，从已处理的iPS细胞分化时，CD34及KDR阳性细胞的比例增加了约17.7倍。
实施例3
为了验证Valproic acid(VPA)及bFGF在三胚层分化能力改善处理中的必要性而进行了以下实验。
[方法]
＜细胞＞
所使用的人iPS细胞253G1株购自iPS PORTAL,Inc.。
＜细胞培养及化合物处理＞
在涂覆有基质胶的6孔板上，在StemFlex(注册商标)培养基中在37℃、5％CO2、10％O2条件下维持了人iPS细胞。
第0天：为了研究分化能力改善效果，通过用TrypLETM Select在37℃下处理5分钟而剥离培养中的人iPS细胞来进行了单细胞化。在已涂覆基质胶(注册商标)的6孔板中的1个孔中，在StemFlex(注册商标)中添加了Y-27684(10μmol/L，Wako)的培养基中以1×105cells/well接种了人iPS细胞。之后，在37℃、5％CO2、5％O2条件下培养到第9天。
第1天：将培养基更换为表5的培养基1。
第2～3天：将一半培养基更换为新的培养基1。
第4～8天：将培养基更换为表5的培养基2，直至第8天为止每隔1天更换为该培养基。
第9天：将所有条件的细胞的培养基更换为StemFlex(注册商标)，并培养了约4天。
[表5]
Figure BDA0002611494780000271
＜三胚层分化＞
与实施例1同样地进行。
＜基于定量RT-PCR的三胚层分化能力的评价＞
与实施例1同样地进行。
[结果]
在图5中示出基于定量RT-PCR的三胚层分化能力的评价结果。
关于253G1株的内胚层分化，通过条件(1)Valproic acid(VPA)+抑制剂(PD0325901、Go6983及XAV939)处理，内胚层特异性基因(SOX17及F OXA2)的表达显著上升。在条件(1)中添加了bFGF的情况(条件(2))及去除了VPA的情况(条件(3))下，未观察到这些基因表达的上升，因此表明提高内胚层分化需要添加VPA及去除bFGF。
接着，关于中胚层分化，通过条件(1)VPA+抑制剂及条件(2)VPA+抑制剂+bFGF的处理，中胚层特异性基因(T及PDGFRA)的表达显著上升。另一方面，当去除了条件(3)的VPA时，基因表达降低，因此表明通过中胚层分化需要添加VPA。
关于外胚层分化，在条件(1)VPA+抑制剂处理中，未观察到外胚层特异性基因(PAX6及MAP2)的表达上升，另一方面，仅在条件(2)VPA+抑制剂+bFGF及(3)抑制剂中观察到明显的表达上升。因此表明为了将经VPA处理的iPS细胞分化为外胚层需要添加bFGF。
在图6中示出图5的结果的总结。
从上述结果表示，通过对人iPS细胞进行VPA处理且去除bFGF，内胚层分化能力得到提高，若用VPA及bFGF处理，则外胚层分化能力得到提高，中胚层分化能力通过哪一种处理都得到提高。
实施例4
验证了人iPS细胞中的MEK抑制剂PD0325901的浓度差异对处理效果产生的影响。
[方法]
＜细胞＞
关于人iPS细胞株，253G1株、201B7株由京都大学iPS细胞研究所(CiRA)提供(Takahashi K,et al.Cell.2007,Nakagawa M,et al.Nat Biotechnol.2008)。C株和D株由Cellular Dynamics International(CDI)提供。
＜细胞培养及化合物处理＞
与实施例1相同，但关于PD0325901，在0.3～1.0μmol/L的浓度条件下进行处理，第9天以后进行了约2周的传代培养。
＜基于流式细胞仪的处理效率的评价法＞
利用细胞表面标志物CD75的阳性率评价了实施例1的处理的完成。利用TrypLETMSelect剥离所培养的人iPS细胞，并用Alexa Fluor 647Mouse Anti-Human CD75抗体进行了染色。用流式细胞仪Attune NxT分析了CD75的阳性率。
＜染色体的特定区域的拷贝数评价＞
为了确认添加到iPS细胞中的PD0325901的浓度的差异对DNA突变发生率产生的影响，通过实时PCR法评价了人多能干细胞中容易发生DNA变异的区域的拷贝数。使用PureLink Genomic DNA Mini Kit(Thermo Fisher Scienti fic)从iPS细胞中提取了基因组DNA。对所提取的DNA使用hPSC Genetic Analysis Kit(STEMCELL Technologies)在利用ViiA7(Thermo Fisher Scientific)中进行实时PCR，计算出染色体区域的拷贝数。
[结果]
在图7中示出基于流式细胞仪的处理效率的评价结果。以0.3～1.0μmol/L浓度的PD0325901处理了3株人iPS细胞，其结果，3株的PD0325901的浓度依赖性处理完成的指标CD75的阳性率均上升(图7)。在0.3～0.5μmol/L的范围内，任何细胞株的CD75均不呈阳性，因此表示PD0325901的浓度优选为0.6～1.0μmol/L。
在图8中示出染色体的特定区域的拷贝数评价结果。通过实时PCR计算出20号染色体长臂区域的拷贝数，其结果，拷贝数依赖于PD0325901的浓度而减少，接近正常拷贝数1.5～2.5(图8)。从以上结果表示，为了将DNA变异抑制为最小限度，优选以0.8～1.2μmol/L添加PD0325901。
实施例5
验证了实施例1中所进行的处理对人iPS细胞向心肌细胞的分化能力产生的影响。
[方法]
＜细胞＞
关于人iPS细胞株，253G1株由京都大学iPS细胞研究所(CiRA)提供(Takahashi K,et al.Cell.2007,Nakagawa M,et al.Nat Biotechnol.2008)。D、E、G、H、I株由CellularDynamics International(CDI)提供。
＜细胞培养及化合物处理＞
对人iPS细胞进行与实施例1相同的处理，并在培养基2中进行了约2周的传代培养。然后，将已处理的细胞在涂覆有基质胶的板上进行传代，并在StemFlex或mTeSR1培养基中进行了约2周的传代培养。
＜向心肌细胞的分化＞
使用PSC Cardiomyocyte Differentiation Kit(ThermoFisher Scientific)，按照程序手册使未处理或进行了上述处理的人iPS细胞分化。
＜评价法＞
关于向心肌细胞的诱导效率，利用流式细胞仪评价了作为心肌细胞标志物的Cardiac Troponin T(cTnT)的表达。利用TrypLETM Select剥离分化诱导后第14天的细胞，并利用Ghost Dye Violet 510(TONBO Bioscience)对死细胞进行了染色。清洗后，利用BDCytofix Fixation buffer和Perm/Wash buffer(BD Bioscience)使细胞固定/渗透。利用Alexa Fluor647 Mouse Anti-Cardiac Troponin T抗体(BD Pharmingen)对细胞内进行染色，并利用流式细胞仪Attune NxT(ThermoFisher Scientific)分析了cTnT的阳性率。
[结果]
在图9中示出将未处理及处理后的iPS细胞分别诱导成心肌细胞并通过流式细胞仪比较了活细胞中的cTnT阳性率的结果。在未处理细胞中为38.2％的阳性率在处理细胞中成为49.4％，上升了1.29倍(图9)。并且，在图10中示出测定了在其他5iPS细胞株中也在相同条件下诱导为心肌细胞时的cTnT的阳性率的结果。在5株中cTnT的阳性率上升(图10)。
实施例6
验证了基于本发明的方法的向神经干细胞的分化改善效果。
[方法]
＜细胞＞
通过实施例1的方法处理从Cellular Dynamics International(CDI)获取的5株(J株、K株、L株、M株、N株)而获得了细胞。
＜神经干细胞诱导＞
为了研究向神经干细胞的分化能力，将实施了上述处理的细胞在已涂覆Geltrex(Thermo Fisher Sciecntific)的板上利用mTeSR(注册商标)培养了1～2天，直至增殖至所需要的细胞数。在神经干细胞分化中，使用PSC Neural Ind uction Medium(ThermoFisher Sciecntific)，按照程序手册使未处理或实施了上述处理的人iPS细胞分化。
＜评价＞
在诱导第7天，使用TrypLETM Select或Accutase(Thermo Fisher Sciecntific)在37℃下处理5分钟而剥离了细胞。在Geltrex涂覆的8孔室板上接种3×105细胞/well，并在37℃、5％CO2、10％O2条件下进行了培养。24小时后，用Human Neural Stem CellImmunocytochemistry Kit(Thermo Fisher Sciecntific)对作为神经干细胞的标志物的SOX1蛋白进行了免疫染色。观察中使用了荧光显微镜(KEYENCE)。
＜图像定量化＞
利用ImageJ(NIH)，从荧光显微镜图像随机地对20个细胞的亮度进行了定量化。用图表示出平均值。
[结果]
在图11中示出荧光显微镜观察的结果，在图12中示出对图像的亮度进行了定量化的结果。在5个细胞中5个细胞的处理前后，SOX1的表达增强并均匀化。在5株中呈现显著的改善。处理后，亮度平均增强了3倍(图11及12)。

Claims (21)

1.一种细胞的制造方法，其包括：
第一工序，获得作为将初始化因子导入体细胞而获得的未分化细胞的、分化为特定的分化细胞的能力相对较低的细胞；及
第二工序，一边维持未分化状态一边处理所述细胞而获得分化为所述特定的分化细胞的能力相对较高的细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，
与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层、中胚层及外胚层中的任意一个以上的能力得到了提高。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，
与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及外胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及外胚层的能力分别得到了提高；或者
与第一工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及中胚层的能力相比，第二工序中获得的细胞所具有的分化为内胚层及中胚层的能力分别得到了提高。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，
第二工序中获得的细胞为能够分化为内胚层、中胚层及外胚层的全部的细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述特定的分化细胞为中胚层细胞或外胚层细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，
所述特定的分化细胞为血细胞、心肌细胞或神经细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中，
第二工序中获得的细胞中的STELLA的表达量高于第一工序中获得的细胞中的STELLA的表达量。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中，
第二工序中获得的细胞中的KLF17的表达量高于第一工序中获得的细胞中的KLF17的表达量。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中，
所述第二工序为一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理所述细胞的工序。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，
所述第二工序为一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂及碱性成纤维细胞生长因子处理所述细胞的工序。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中，
第二工序包括如下工序：将细胞在包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂、MAPK/ERK激酶抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养之后，在不包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂而包含MAPK/ERK激酶抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、Wnt信号抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养。
12.根据权利要求9至11中任一项所述的方法，其中，
组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸或其盐。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中，
所述第二工序中的培养基不包含抗坏血酸。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中，
所述体细胞为源自成人的体细胞。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其还包括使第二工序中获得的细胞分化的第三工序。
16.一种制造多能干细胞的方法，与诱导型多能干细胞相比，所述多能干细胞的三胚层分化能力得到了提高，
所述制造多能干细胞的方法包括一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理诱导型多能干细胞的工序。
17.一种制造多能干细胞的方法，与诱导型多能干细胞相比，所述多能干细胞的向特定的分化细胞的分化能力得到了提高，
所述制造多能干细胞的方法包括一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理诱导型多能干细胞的工序。
18.根据权利要求17所述的方法，其中，
特定的分化细胞为血细胞、心肌细胞或神经细胞。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中，
一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的工序包括如下工序：在包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂、MAPK/ERK激酶抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养之后，在不包含组蛋白去乙酰化酶抑制剂而包含MAPK/ERK激酶抑制剂、蛋白激酶C抑制剂、Wnt信号抑制剂及白血病抑制因子的培养基中培养。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的方法，其中，
组蛋白去乙酰化酶抑制剂为丙戊酸或其盐。
21.根据权利要求16至20中任一项所述的方法，其中，
一边维持未分化状态一边用组蛋白去乙酰化酶抑制剂处理的工序中的培养基不包含抗坏血酸。
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