CN111658668B - 功能性抗菌组合药物及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种功能性抗菌组合药物及其应用，所述组合药物包括各自独立存在的以下两种成分：氨基苯硼酸和三水合氯金酸，并且，所述组合药物中不含表面活性剂。氨基苯硼酸是一种药物中间体，在合成过程中作为还原剂制备抗菌金纳米颗粒方法简单，不易诱发细菌产生耐药性，具有较高的生物安全性；修饰在金纳米颗粒表面的氨基苯硼酸，通过顺式二醇与细菌表面的多糖结合，改变细菌细胞壁的通透性，导致细菌死亡，具有更强的细菌靶向性；氨基苯硼酸和氯金酸稳定易于储存，整个制备工艺简单可控，制备的抗菌金纳米颗粒分散性好，可实现工业化生产。

Description

功能性抗菌组合药物及应用

技术领域

本发明属于医药领域，涉及一种具有抗菌作用的功能性抗菌组合药物及应用。

背景技术

由细菌感染引发的多项疾病已经是全球最大的健康问题之一，每年都有数百万人口死于细菌感染。革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均可引起多种类型的感染。例如，大肠杆菌可诱发胃肠道和泌尿道感染；肺炎克雷伯菌可引起肝脓肿；金黄色葡萄球菌会引起皮肤感染。抗生素自20世纪20年代首次被研发以来，已被广泛用于治疗各类感染。然而，广泛的使用和抗生素的滥用迅速导致细菌耐药性的产生，并引起新的社会恐慌。由于临床和市场需求的增长，新型抗菌药物的开发迫在眉睫。由于纳米材料具有比表面积大，表面功能化程度高，物理化学性质独特的特性，已被广泛应用于医疗器械，安全化妆品，烧伤敷料，水处理，食品保存等方面。金纳米颗粒在兼具以上优良性质的前提下，同时具有许多独特的性质，如：良好的生物相容性，多价效应，易于功能化和快捷的合成方法。因此，金纳米颗粒成为开发新型抗生素的潜在对象。许多研究表明，金纳米颗粒自身并没有抗菌活性，但通过硫醇、胺和膦酸化合物等官能团修饰后表现出有效的抗菌活性。氨基苯硼酸作为一种药物中间体，通过硼酸基与细菌表面的肽聚糖结合，提高对细菌的靶向性，提高利用率；苯胺基团中的氨基具有还原性，能够再不使用还原剂的情况下，迅速将氯金酸还原，实现金纳米颗粒的快速制备。基于上述考虑，通过氨基苯基硼酸还原金纳米颗粒作为新型抗菌剂的制备是一个合适的选择。

由于感染风险低、管理程序简单并且能够有效的提高药物的溶解度和渗透性，口服给药已成为最广泛使用的给药途径，制剂形式主要包括片剂、颗粒剂、胶囊、口服液、滴丸等。口服时，药物可经淋巴吸收，通过胃肠屏障，使得药物的生物利用度得到改善，主要表现在包括但不限于药物峰值时间降低、药物最大浓度增加和曲线下面积增大等各种不同的药代动力学参数方面。国内外学者利用现有药物制备口服类抗菌剂及其在细菌感染方面的应用领域做了一些探索。目前，现有技术公开了一种纳米硫银复合溶胶及其制备方法与应用，将硫粉加入聚乙二醇中后，加入硝酸银得到纳米硫银复合溶胶。但该方法制备反应需要高温且纳米银不稳定，对人体有较强的毒性，美国FDA已经明确禁止纳米银在医疗方面的使用，我国CFDA也在医用领域对纳米银进行了限制。因此，探索生物相容性能优越、毒性低的抗菌剂具有重要的意义。现有技术公开了一种复方螺旋霉素纳米乳口服液及其制备方法，利用口服方式显著提高螺旋霉素的生物利用度和药物稳定性，但该口服液的粒径分布广泛，原料成分复杂，包括：表面活性剂、助表面活性剂、油相、螺旋霉素、三甲氧苄氨嘧啶和去离子水，其中有效成分不超过10％。因此，探索具有抗菌性能优异，原料利用率高，能够口服方便使用的新型抗菌剂具有重要的意义。现有技术还公开了溶解超滤-喷雾干燥-分子分散包衣-水化制粒-冷冻干燥生产脂质体组合药物，提供了脂质体口服制剂的各组分原料摩尔数比配方及工艺，但制备工艺复杂，成分多样，成分间的相互影响不明确，且只能使用已知药物，无法避免耐药性的产生。因此，探究能够有效治疗多药耐药细菌感染的口服抗菌剂具有重要的意义。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种具有抗菌作用的功能性金功能性抗菌组合药物及应用。本发明的功能性金纳米颗粒具有广谱抗菌活性，特别是针对多药耐药细菌，可用于制备新型的有效抗菌药物。该药物组分简单，可以在胃内强酸环境下快速合成，并通过口服给药使用。

在阐述本发明内容之前，定义本文中所使用的术语如下：

术语“ABA”是指：氨基苯硼酸。

术语“2ABA”是指：邻氨基苯硼酸。

术语“3ABA”是指：间氨基苯硼酸。

术语“4ABA”是指：对氨基苯硼酸。

术语“Au_4ABAe NPs”是指：pH＝2条件下，对氨基苯硼酸还原氯金酸形成的金纳米颗粒。

术语“Au_4ABAi NPs”是指：对氨基苯硼酸和氯金酸在胃内按照一比一混合，形成的金纳米颗粒。

为实现上述目的，本发明的第一方面提供了一种功能性抗菌组合药物，所述组合药物包括各自独立存在的以下两种成分：氨基苯硼酸和三水合氯金酸，并且，所述组合药物中不含表面活性剂。

根据本发明第一方面的组合药物，其中，所述氨基苯硼酸选自以下一种或多种：对氨基苯硼酸、间氨基苯硼酸、邻氨基苯硼酸。

根据本发明第一方面的组合药物，其中，所述组合药物中，所述氨基苯硼酸和三水合氯金酸的摩尔比为1:0.1～100，优选为1:0.2～5。

根据本发明第一方面的组合药物，其中，所述药物为口服药物。

根据本发明第一方面的组合药物，其中，述药物固体口服制剂或液体口服制剂。

优选地，所述固体口服制剂剂型选自以下一种或多种：片剂、颗粒剂、胶囊和滴丸；和/或

所述液体口服制剂为氨基苯硼酸和三水合氯金酸两种成分各自独立存在的溶液组合。

根据本发明第一方面的组合药物，其中，所述组合药物中还包括药学上可接受的辅料。

优选地，所述药学上可接受的辅料选自以下一种或多种：填充剂、崩解剂和润滑剂。

本发明的第二方面提供了第一方面所述的功能性抗菌组合药物在制备抗菌产品中的应用；

优选地，所述细菌选自大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌。

为了设计方便使用的抗菌纳米材料，针对多药耐药菌的感染问题，本发明设计提供了一种成本低、生物安全性好、针对多药耐药菌疗效好的分子还原氯金酸制备金纳米颗粒抗菌剂的方法，并可以口服使用治疗腹腔感染。所述金纳米颗粒通过靶向细菌表面的多糖，破坏细菌细胞壁进而增加细胞膜的通透性，导致细菌死亡。在这项工作中，本发明人通过氨基苯硼酸(ABA邻位2ABA、间位3ABA、对位4ABA)还原氯金酸制备功能性金纳米颗粒抗菌抗菌剂，针对革兰氏阴性细菌的敏感株和临床分离的多药耐药株具有很好的抗菌效果。氨基苯硼酸含有硼酸基团和苯胺基团两部分官能团，苯胺基团具有还原性，能够在不使用还原剂的情况下，直接将氯金酸还原为金纳米颗粒，并将配体分子稳定连接在金纳米颗粒上；硼酸基能够靶向细菌表面的多糖，通过破坏细菌细胞壁进而增加细胞膜的通透性，导致细菌死亡。通过口服使用过程中，在胃部氨基苯硼酸和氯金酸能够快速形成抗菌金纳米颗粒，通过胃肠道屏障经血液循环到达全身，使得药物的生物利用度得到提升。与现有的合成金纳米颗粒的方法相比，该金纳米抗菌颗粒对温度和pH极端变化均具有稳定性。合成的抗菌金纳米颗粒表面带负电具有优异的生物相容性。本发明设计的原理图如图1所示。进一步通过小鼠感染模型验证了通过口服治疗腹腔感染的可行性。

为达到目的，本发明采用以下技术方案：

根据本发明提供小分子还原的金纳米颗粒作为抗菌剂，其中，所述小分子是具有较高生物安全性苯硼酸的衍生物，如所述苯环上的取代基为氨基。所述取代基位置为邻位、间位和对位。

根据本发明提供的氨基苯硼酸还原氯金酸制备金纳米颗粒的抗菌剂的合成方法，其中，所述合成金纳米颗粒时氯金酸与氨基苯硼酸的比例为1:5-5:1(即摩尔质量比)。合成条件酸碱度pH值为2至12，优选地，酸碱度pH值为2至7，为了更好的模拟胃部的强酸环境，更优选地，酸碱度pH值为2。所述具有抗菌效果的金纳米颗粒的平均粒径在50nm以下。更优选为2-10nm。

本发明选择的氨基苯硼酸含有硼酸基团和苯胺基团两部分官能团，苯胺基团具有还原性，能够在不使用还原剂的情况下，直接将氯金酸还原为金纳米颗粒，并将配体分子稳定连接在金纳米颗粒上；硼酸基能够靶向细菌表面的多糖，通过破坏细菌细胞壁进而增加细胞膜的通透性，导致细菌死亡，实现抗菌效果。

本发明方法制备的氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒具有优异的抗菌性，可对抗多药耐药菌。通过口服使用过程中，在胃部氨基苯硼酸和氯金酸能够快速形成抗菌金纳米颗粒，通过胃肠道屏障经血液循环到达全身，使得药物的生物利用度得到提升。与现有的合成金纳米颗粒的方法相比，该金纳米抗菌颗粒对温度和pH极端变化均具有稳定性。合成的抗菌金纳米颗粒表面带负电具有优异的生物相容性。可用于制作片剂、口服液及胶囊，是一种极为优良的抗菌剂。

本发明的功能性抗菌组合药物可以具有但不限于以下有益效果：

1、氨基苯硼酸是一种药物中间体，在合成过程中作为还原剂制备抗菌金纳米颗粒方法简单，不会诱发细菌产生耐药性，具有较高的生物安全性；

2、修饰在金纳米颗粒表面的氨基苯硼酸，通过顺式二醇与细菌表面的多糖结合，改变细菌细胞壁的通透性，导致细菌死亡，具有更强的细菌靶向性；

3、氨基苯硼酸和氯金酸稳定易于储存，整个制备工艺简单可控，制备的抗菌金纳米颗粒分散性好，可实现工业化生产；合成方法便捷，可以不受温度，酸碱度和转速的限制，能口服使用。相比制备好的金纳米颗粒溶液，以原料保存的试剂更加的稳定，不会出现聚沉的现象，且可以不使用表面活性剂，成分更加纯净。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1示出了本发明设计合成氨基苯硼酸还原氯金酸制备抗菌金纳米颗粒及口服使用治疗腹腔感染的原理图。

图2示出了实施例1对氨基苯硼酸修饰的金纳米颗粒的形貌表征及其抗菌性能。

图3示出了实施例2间氨基苯硼酸修饰的金纳米颗粒的形貌表征及其抗菌性能。

图4示出了实施例3邻氨基苯硼酸修饰的金纳米颗粒的形貌表征及其抗菌性能。

图5示出了实施例4不同酸碱度条件下对氨基苯硼酸修饰的金纳米颗粒的形貌表征及其抗菌性能。

图6示出了实施例4中pH为2条件下对氨基苯硼酸修饰的金纳米颗粒抗菌机理表征。

图7示出了实施例4对氨基苯硼酸，氯金酸及金纳米颗粒及生物安全性表征。

图8示出了实施例5氨基苯硼酸还原氯金酸口服使用金纳米颗粒在血液和不同脏器中随时间的代谢情况。

图9示出了实施例5氨基苯硼酸还原氯金酸口服使用金纳米颗粒针对小鼠腹腔感染的治疗效果及小鼠体重监控。

具体实施方式

下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细具体地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

本部分对本发明试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。本领域技术人员清楚，在上下文中，如果未特别说明，本发明所用材料和操作方法是本领域公知的。

以下实施例中使用的试剂和仪器如下：试剂：

三水氯金酸，购自国药集团化学试剂有限公司；

对氨基苯硼酸，间氨基苯硼酸，邻氨基苯硼酸，购自Sigma；

吐温80，购自阿拉丁生物科技股份有限公司；

透析袋，购自Solarbio；

过滤器，购自Millipore。

仪器：

透射电子显微镜，购自FEI company，USA、型号Tecnai G2 20 S-TWIN；

酶标仪，购自Tecan、型号Tecan infinite M200；

紫外-可见吸收光谱，购自Shimadzu,Japan、型号UV2450。

图1为合成方法和治疗使用流程图。下面通过具体实施例来说明：

实施例1

本实施例用于说明本发明功能性金纳米颗粒的制备方法。

步骤如下：

(1)在圆底烧瓶中，将0.05毫摩尔的三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司)和30毫克的吐温80加入10毫升去离子水中。在不同反应条件下(转速：1000转每分钟，500转每分钟和100转每分钟；温度：0摄氏度和25摄氏度)，逐滴添加含0.05毫摩尔的对氨基苯硼酸(4ABA分子量136.941，Sigma)的水溶液1毫升，瓶中的溶液颜色立即变成棕色，保持此反应条件再反应2小时。

(2)将获得的对氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒用透析袋(14kDa MW cut-off，Solarbio)透析24小时以除去未处理的化学物质。将纳米颗粒通过0.22微米过滤器(Millipore)过滤灭菌，并保存于4摄氏度冰箱备用。通过透射电子显微镜(TEM，Tecnai G220 S-TWIN，FEI company，USA)进行对金颗粒的形态表征，观察结果如图2A所示。样品的紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)测试结果如图2B所示。

(3)大肠杆菌(E.coli)和多药耐药的大肠杆菌(MDR E.coli)在液体细菌培养基中培养。将金纳米颗粒稀释2-128倍后分别加入接有细菌的培养基中，接种浓度1×10⁴CFU/mL，在37℃培养12小时和24小时后分别测试细菌悬浮液浊度在600nm处(OD_600nm)的光密度来分析金纳米颗粒的抗菌活性，结果如图2C所示。

实施例2

本实施例用于说明本发明功能性金纳米颗粒的制备方法。

步骤如下：

(1)在圆底烧瓶中，将0.05毫摩尔的三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司)和30毫克的吐温80加入10毫升去离子水中。在不同反应条件下(转速：1000转每分钟，500转每分钟和100转每分钟；温度：0摄氏度和25摄氏度)，逐滴添加含0.05毫摩尔的间氨基苯硼酸(3ABA分子量136.941，Sigma)的水溶液1毫升，瓶中的溶液颜色立即变成棕色，保持此反应条件再反应2小时。

(2)间氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒的处理及颗粒表征与实施例1相同，结果如图3A-B所示。

(3)间氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒的抗菌活性表征与实施例1相同，结果如图3C所示。

实施例3

本实施例用于说明本发明功能性金纳米颗粒的制备方法。

步骤如下：

(1)在圆底烧瓶中，将0.05毫摩尔的三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司)和30毫克的吐温80加入10毫升去离子水中。在不同反应条件下(转速：1000转每分钟，500转每分钟和100转每分钟；温度：0摄氏度和25摄氏度)，逐滴添加含0.05毫摩尔的邻氨基苯硼酸(2ABA分子量136.941，Sigma)的水溶液1毫升，瓶中的溶液颜色立即变成棕色，保持此反应条件再反应2小时。

(2)邻氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒的处理及颗粒表征与实施例1相同，结果如图4A-B所示。

(3)邻氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒的抗菌活性表征与实施例1相同，结果如图4C所示。

实施例4

本实施例用于说明本发明功能性金纳米颗粒的制备方法及性能评价。

步骤如下：

(1)使用盐酸配制pH值为2和4的溶液各10毫升；使用氢氧化钠配制pH值为10和12的溶液各10毫升；使用10毫升去离子水作为pH值为7的溶液。

(2)将对氨基苯硼酸分别加入不同pH值的溶液中配制1毫升含0.05毫摩尔氨基苯硼酸的溶液。

(3)将配好的不同pH值的对氨基苯硼酸的溶液分别加入0.05毫摩尔的三水氯金酸(分子量393.83，国药集团化学试剂有限公司)溶液中，摇晃2-3次，瓶中的溶液颜色立即变成棕色，即可获得不同酸碱度下合成金纳米颗粒。该反应加料顺序、加料方式对产物没有影响。(4)对氨基苯硼酸在不同酸碱环境下还原的金纳米颗粒的处理及颗粒表征与实施例1相同，结果如图5A-B所示。

(5)对氨基苯硼酸在不同酸碱环境下还原的金纳米颗粒的抗菌活性表征与实施例1相同，与左氧氟沙星进行对比，金纳米颗粒的抗菌效果在对待多药耐药菌的效果更加有效，结果如图5C-D所示。胃部是一种强酸的环境，为了更好的模拟体内的环境，本发明人使用pH＝2条件下，对氨基苯硼酸还原的金纳米颗粒(Au_ABAe NPs)进行抗菌机制和生物安全性的探究。本发明人将细菌(大肠杆菌(E.coli)和铜绿假单胞菌(P.a)的敏感株以及多药耐药株(MDR E.coli，MDR P.a))与不同浓度的金纳米颗粒在摇床上以260转每分钟的转速振荡4小时。将细菌离心后进行固定、脱水、再切成超薄切片，通过扫描和透射电子显微镜进行观察，结果如图6A-B所示。

(6)为了进一步的临床应用，本发明人通过酶标仪(Tecan infinite M200)测量样品在540nm(OD_540nm)的光密度法测试了不同浓度金纳米颗粒和合成金纳米颗粒的原料(对氨基苯硼酸(4ABA)和氯金酸(HAuCl₄))的溶血性能，使用盐水作为阴性对照，水作为阳性对照，结果如图7A。通过测试小鼠成纤维细胞(3T3)细胞在不同样品处理下的活力来评估其的体外细胞毒性，结果如图7B所示。

实施例5

步骤如下：

(1)将对氨基苯硼酸(4ABA)配制成0.05毫摩尔的溶液，三水氯金酸配制成0.05毫摩尔的溶液。(2)将对氨基苯硼酸(4ABA)和氯金酸(HAuCl₄)按照不同的体积比例分别通过灌胃的方式灌入小鼠体内以探究两种组分在体内的合成及代谢情况，实施例4中pH为2时，体外合成的金纳米颗粒的代谢情况作为参考依据。将小鼠随机分为4组(n＝5)进行灌胃实验，组1(4ABA和HAuCl₄灌胃体积为150微升：50微升(3：1))；组2(4ABA和HAuCl₄灌胃体积为100微升：100微升(1：1)Au_4ABAi NPs)；组3(4ABA和HAuCl₄灌胃体积为50微升：150微升(1：3))；组4(体外模拟胃部环境合成的金纳米颗粒(Au_4ABAe NPs)。该颗粒为实施例4中合成的金纳米颗粒，在pH为2条件下，原料配比为0.05毫摩尔对氨基苯硼酸与0.05毫摩尔氯金酸合成的金纳米颗粒。

(3)将灌胃后的小鼠在不同时间点(1、2、6、12、18、24、48和72小时)进行眼眶取血和解剖获得胃、肝、脾和肾；将血液和脏器用王水(硝酸：盐酸1:3)进行硝解，使用感应耦合等离子体分析仪(ICP,iCAP 6300,Thermo Scientific,USA)分析各个脏器中的金纳米颗粒的含量。结果如图8A-D所示，不同体积比4ABA和HAuCl₄在胃中合成的初始阶段达到最大值，证明口服的可行性；血浆浓度-时间曲线表明，血液中金原子浓度在胃内给药后6小时迅速增加，并在24小时内降低。肾脏和肝脏的金浓度在72小时后基本降为0，说明高效的清除效率。与Au_4ABAe NPs中各个脏器水平进行对照，组2显示出最类似的趋势。

(4)使用组2的比例探究口服金纳米颗粒在小鼠发急性腹膜炎模型中的抗菌效果。将处于指数期的细菌大肠杆菌的敏感株(E.coli)和多药耐药株(MDR E.coli)的注射到小鼠腹腔内，注射浓度为1×10⁶CFU/mL。在感染1小时和6小时后，将5毫摩尔每升4ABA和5毫摩尔每升HAuCl₄各100微升进行灌胃，无菌生理盐水作为阴性对照，左氧氟沙星作为阳性对照，小鼠的死亡率及小鼠体重监测如图9。所示，说明4ABA和HAuCl₄口服使用时，治疗多药耐药菌导致的腹腔感染比常用抗生素左氧氟沙星效果更佳显著。

尽管本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。

Claims (11)

1.一种功能性抗菌组合药物，其特征在于，所述组合药物包括各自独立存在的以下两种成分：氨基苯硼酸和三水合氯金酸，并且，所述组合药物中不含表面活性剂；

能够在不使用还原剂的情况下，直接将氯金酸还原为金纳米颗粒，并将配体分子稳定连接在金纳米颗粒上。

2.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于，所述氨基苯硼酸选自以下一种或多种：对氨基苯硼酸、间氨基苯硼酸、邻氨基苯硼酸。

3.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于，所述组合药物中，所述氨基苯硼酸和三水合氯金酸的摩尔比为1:0.1～100。

4.根据权利要求3所述的组合药物，其特征在于，所述组合药物中，所述氨基苯硼酸和三水合氯金酸的摩尔比为1:0.2～5。

5.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于，所述药物为口服药物。

6.根据权利要求5所述的组合药物，其特征在于，所述药物为固体口服制剂或液体口服制剂。

7.根据权利要求6所述的组合药物，其特征在于：

所述固体口服制剂剂型选自以下一种或多种：片剂、颗粒剂、胶囊和滴丸；和/或

所述液体口服制剂为氨基苯硼酸和三水合氯金酸两种成分各自独立存在的溶液组合。

8.根据权利要求1所述的组合药物，其特征在于，所述组合药物中还包括药学上可接受的辅料。

9.根据权利要求8所述的组合药物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自以下一种或多种：填充剂、崩解剂和润滑剂。

10.权利要求1至9中任一项所述的功能性抗菌组合药物在制备抗菌产品中的应用。

11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述抗菌产品为抗细菌产品，所述细菌选自大肠杆菌和/或铜绿假单胞菌。

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