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CN111632030A - 包含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的制造方法 - Google Patents

包含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的制造方法 Download PDF

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CN111632030A CN202010466892.XA CN202010466892A CN111632030A CN 111632030 A CN111632030 A CN 111632030A CN 202010466892 A CN202010466892 A CN 202010466892A CN 111632030 A CN111632030 A CN 111632030A
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Abstract

本发明涉及一种包含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的制造方法，其是在脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的制造方法，其包括将有机溶剂中溶解有至少1种脂质的油相与水相混合并搅拌包含脂质的水溶液的工序；和使有机溶剂从搅拌的工序中得到的包含脂质体的水溶液中蒸发的工序；其中，有机溶剂为水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合溶剂。

Description

包含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的制造方法
本申请是申请日为2016年11月1日、优先权日为2015年11月2日、中国专利申请号为201680064060.7、发明名称为“包含吉西他滨脂质体组合物的肿瘤治疗药及试剂盒”的分案申请。
技术领域
本发明涉及一种组合脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物与紫杉烷系抗肿瘤药而成的肿瘤治疗药、以及包含脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物及紫杉烷系抗肿瘤药的肿瘤治疗用试剂盒。
背景技术
在恶性肿瘤的化疗中，作为有用的药剂而使用吉西他滨。但是，已知吉西他滨单药下的针对肿瘤的有效率低，为10％，并且癌症患者的存活期短(存活期中位数6.7个月)(非专利文献1)。
并且，在恶性肿瘤的化疗中，作为有用的药剂也用紫杉醇或纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇(Nab-Paclitaxel)等紫杉烷系抗肿瘤药。但是，已知紫杉烷系抗肿瘤药单药下的针对肿瘤的有效率低，为10～25％，并且癌症患者的存活期短(存活期12～15个月)(非专利文献2)。
在临床上，以弥补各抗肿瘤药对肿瘤的敏感性的不同，并增强药效等为目的，进行多药并用疗法。例如，已知吉西他滨与紫杉醇纳米制剂的并用、吉西他滨与紫杉醇的并用、吉西他滨与纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇的并用等。但是，吉西他滨与紫杉醇的并用下的针对乳腺癌患者的有效率为41.4％，且存活期中位数为18.6个月(非专利文献3)。并且，吉西他滨与纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇的并用下的针对胰腺癌患者的有效率为23％，且存活期中位数为8.5个月(非专利文献1)。
脂质体为由使用了脂质的脂质双层膜形成的封闭囊泡，且对其作为药物传递系统的载体的应用进行了研究。已知通过将药物封入脂质体内，能够使该药物的血中稳定性及生物体内分布发生变化来提高向靶组织的到达性(非专利文献4)。并且，已知粒径100～200nm的脂质体容易蓄积在癌组织中(非专利文献5)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：The New England Journal of Medicine(新英格兰医学杂志)，2013，369(18)，1691-1703
非专利文献2：Journal of Clinical Oncology(临床肿瘤学杂志)，2005，23(31)，7794-7803
非专利文献3：Journal of Clinical Oncology(临床肿瘤学杂志)，2008，26(24)，3950-3957
非专利文献4：Journal of Liposome Reserch(脂质体研究杂志)，1994，4，667-687
非专利文献5：Drug Delivery System(药物输送系统)，1999，14，433-447
发明内容
发明要解决的技术课题
作为吉西他滨单药下的抗肿瘤效果低的原因之一，可举出吉西他滨的血中滞留时间的长短。吉西他滨显示时间依赖性强的药效，但在血中滞留时间短，为20分钟，因此无法发挥充分的抗肿瘤效果。并且，作为吉西他滨单药下的抗肿瘤效果低的另一原因，可举出吉西他滨针对肿瘤组织的选择性的高低。当给与抗肿瘤药时，有时从血中快速消失，或者分布于靶以外的器官，并不限定为必须有效地蓄积于肿瘤组织中。因此，抗肿瘤药的大部分无法充分发挥针对肿瘤组织的抗肿瘤作用，并且常常伴随对并不优选的正常组织的作用(副作用)，引起严重的毒性。
作为紫杉烷系抗肿瘤药单药下的抗肿瘤效果低的原因之一，可举出每一肿瘤的紫杉烷敏感性大不同，治疗患者的有效率未提高。因此，除了紫杉烷系抗肿瘤药以外，还需要与机理不同的抗肿瘤药并用。
并且，关于非专利文献3及非专利文献1中所记载的并用疗法，也不能说是作为治疗效果而充分高。
本发明的课题在于提供一种与市售的吉西他滨、紫杉烷系抗肿瘤药及它们的并用疗法相比，抗肿瘤效果优异的肿瘤治疗药及肿瘤治疗用试剂盒。
用于解决技术课题的手段
本发明人等进行深入研究的结果，发现通过并用脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物与紫杉烷系抗肿瘤药，增强抗肿瘤效果，并完成了本发明。
即，本发明提供下述。
(1)一种肿瘤治疗药，其组合脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物与紫杉烷系抗肿瘤药而成。
(2)根据(1)所述的肿瘤治疗药，其中，
紫杉烷系抗肿瘤药为紫杉醇或其盐或纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇。
(3)根据(1)或(2)所述的肿瘤治疗药，其中，
紫杉烷系抗肿瘤药为纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇。
(4)根据(1)至(3)中任一项所述的肿瘤治疗药，其中，
相对于构成脂质体的脂质的合计量的胆固醇类含有率为10mol％～35mol％，脂质体的内水相的渗透压相对于脂质体的外水相的渗透压为2倍～8倍。
(5)根据(1)至(4)中任一项所述的肿瘤治疗药，其中，
脂质体为单层。
(6)根据(1)至(5)中任一项所述的肿瘤治疗药，其中，
血浆中的吉西他滨或其盐从脂质体组合物释放的释放速度为10质量％/24hr～70质量％/24hr。
(7)根据(1)至(6)中任一项所述的肿瘤治疗药，其中，
构成脂质体的脂质包含氢化大豆磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及胆固醇。
(8)根据(1)至(7)中任一项所述的肿瘤治疗药，其中，
脂质体的平均粒径为2nm～200nm。
(9)一种肿瘤治疗用试剂盒，其包含脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物及紫杉烷系抗肿瘤药。
并且，本发明提供下述。
(10)一种包含脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的抗肿瘤效果增强剂，其特征在于，以与选自紫杉烷系抗肿瘤药中的1种以上的抗肿瘤药组合而并用给药的方式使用。
(11)根据(10)所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，
紫杉烷系抗肿瘤药为紫杉醇或其盐或纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇。
(12)根据(10)或(11)所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，
紫杉烷系抗肿瘤药为纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇。
(13)根据(10)至(12)中任一项所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，
相对于构成脂质体的脂质的合计量的胆固醇类的含有率为10mol％～35mol％，脂质体的内水相的渗透压相对于脂质体的外水相的渗透压为2倍～8倍。
(14)根据(10)至(13)中任一项所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，
脂质体为单层。
(15)根据(10)至(14)中任一项所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，
血浆中的吉西他滨或其盐从脂质体组合物释放的释放速度为10质量％/24hr～70质量％/24hr。
(16)根据(10)至(15)中任一项所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，
构成脂质体的脂质包含氢化大豆磷脂酰胆碱、1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇及胆固醇。
(17)根据(10)至(16)中任一项所述的抗肿瘤效果增强剂，其中，
脂质体的平均粒径为2nm～200nm。
而且，本发明提供下述。
(18)一种肿瘤的治疗方法，其特征在于，
组合将脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物使用于并用治疗的情况下的治疗有效剂量及将紫杉烷系抗肿瘤药使用于并用治疗的情况下的治疗有效剂量而向对象给药。
(19)一种肿瘤的治疗方法，其特征在于，将脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物使用于并用治疗的情况下的治疗有效剂量及将紫杉烷系抗肿瘤药使用于并用治疗的情况下的治疗有效剂量同时、分别、连续或隔开间隔而向对象给药。
而且，本发明提供下述。
(20)一种脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的使用，其用于制造组合脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物与选自紫杉烷系抗肿瘤药中的1种以上的抗肿瘤药而成的肿瘤治疗药。
(21)一种用于肿瘤治疗且脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物，其特征在于，所述脂质体组合物以与选自紫杉烷系抗肿瘤药中的1种以上的抗肿瘤药组合而并用给药的方式使用。
发明效果
与吉西他滨单药、紫杉烷系抗肿瘤药单药或吉西他滨与紫杉烷系抗肿瘤药的并用相比，本发明的肿瘤治疗药及肿瘤治疗用试剂盒具有优异的肿瘤消退及肿瘤增大延迟效果。
附图说明
图1为表示Capan-1皮下移植荷瘤模型在小鼠上的肿瘤体积的变化的图。
具体实施方式
本说明书中，用“～”表示的数值范围表示将记载于“～”前后的数值分别作为最小值及最大值而包含的范围。
本发明中，只要没有特别说明，则％是指质量百分率。
本说明书中，关于组合物中的各成分的量，当组合物中存在多种相当于各成分的物质时，只要没有特别说明，则是指存在于组合物中的该多种物质的合计量。
“释放”是指，脂质体中内含的药物通过构成脂质体的脂质膜而向脂质体的外部溢出。
“释放速度”是指，脂质体中内含的药物通过构成脂质体的脂质膜而向脂质体的外部溢出的每单位时间的量。
“血中滞留性”是指，在给与脂质体组合物的对象中，脂质体中内含的状态的药物存在于血液中的性质。
“脂质体的平均粒径”是指，存在于脂质体组合物中的脂质体的体积平均粒径。本发明的脂质体组合物中所含有的脂质体的平均粒径利用动态光散射法来测定。作为利用动态光散射的市售的测定装置，可举出浓厚系粒子分析仪FPAR-1000(OTSUKA ELECTRONICSCo.,LTD制)、NANOTRAC UPA(Nikkiso Co.,Ltd.制)及Nano-sizer(Malvern InstrumentsLtd制)等。
“对象”是指需要预防或治疗的人、小鼠、猴、家畜等哺乳动物，优选为需要预防或治疗的人。
作为“肿瘤”，例如可举出乳腺癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大肠癌、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤及尿路上皮癌等。
以下，对本发明进行详细说明。
(紫杉烷系抗肿瘤药)
作为紫杉烷系抗肿瘤药，可举出以紫杉烷環或具有与其类似结构的化合物为有效成分的药物组合物。
作为紫杉烷系抗肿瘤药，具体而言，可举出紫杉醇、多西他赛(docetaxel)、卡巴他赛(cabazitaxel)、替司他赛(tesetaxel)及奥他赛(ortataxel)等以及这些的盐或衍生物。
作为盐，能够举出通常已知的氨基等碱性基团、羟基及羧基等酸性基团中的盐。
作为碱性基团中的盐，例如可举出与盐酸、氢溴酸、硝酸及硫酸等无机酸的盐；与甲酸、乙酸、柠檬酸、草酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、天门冬氨酸、三氯乙酸及三氟乙酸等有机羧酸的盐；以及与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、均三甲苯磺酸及萘磺酸等磺酸的盐。
作为酸性基团中的盐，例如可举出与钠及钾等碱金属的盐；与钙及镁等碱土类金属的盐；铵盐；以及与三甲基胺、三乙基胺、三丁基胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二乙基胺、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙基胺、1-二苯羟甲胺及N,N'-二苄基乙二胺等含氮有机碱的盐等。
作为紫杉醇的衍生物，例如可举出纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇(白蛋白结合型紫杉醇)等。
作为紫杉烷系抗肿瘤药，优选紫杉醇或其盐或纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇，更优选纳米微粒白蛋白结合型紫杉醇。
紫杉烷系抗肿瘤药可以包含通常用于制剂化的赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、乳化剂、表面活性剂、助溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂及吸收促进剂等添加剂。
作为紫杉烷系抗肿瘤药的给药途径，例如可举出静脉内、动脉内、直肠内、腹腔内、肌肉内、肿瘤内或膀胱内进行注射的方法、口服给药、透皮给药及栓剂等方法。给药量及给药次数例如对于成人而言能够通过口服或非口服(例如，注射、点滴及向直肠部位的给药等)给药，例如每天将0.01～1000mg/kg分成1次至数次给药。作为剂型的例，可举出片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、颗粒剂、丸剂、悬浮剂、乳剂、溶液剂、粉末制剂、栓剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂、贴剂、软膏剂及注射剂。
(脂质体)
脂质体是指通过使用了脂质的脂质双层膜形成的封闭囊泡，且在该封闭囊泡的空间内具有水相(内水相)。内水相中含有水等。脂质体通常以分散在封闭囊泡外的水溶液(外水相)的状态存在。脂质体可以是单层(被称为单层层状或unilamellar，且为双层膜为单层的结构。)，也可以是多层层状(被称为多层，且为洋葱状形状的多个双层膜的结构。各层通过水样层而被划分。)，但在本发明中，从药物用途方面的安全性及稳定性的观点考虑，优选为单层脂质体。
脂质体只要是能够内含药物的脂质体，则其形态并无特别限定。“内含”是指，对于脂质体在内水相及膜本身含有药物的形态。例如，可举出将药物封入通过膜形成的封闭空间内的形态、膜本身内含的形态等，也可以组合这些。
脂质体的平均粒径并无特别限定，优选为2nm～200nm，更优选为5nm～150nm，进一步优选为5nm～120nm，最优选为5nm～100nm。
脂质体优选球状或与其接近的形态。
从脂质选择构成脂质体的脂质双层的成分。作为脂质，能够任意使用溶解于水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合溶剂的物质。作为脂质，例如可举出磷脂质、除了磷脂质以外的脂质、胆固醇类及他们的衍生物等。这些成分可以由单种或多种成分构成。
作为磷脂质，例如可举出磷脂酰胆碱(卵磷脂)、磷脂酰甘油、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、心磷脂等天然或合成磷脂质或将这些氢化而成的物质(例如，氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC))等。这些中，优选氢化大豆磷脂酰胆碱等经氢化的磷脂质或鞘磷脂，更优选氢化大豆磷脂酰胆碱。另外，本发明中，“磷脂质”是指还包含修饰磷脂质而成的磷脂质衍生物。
作为除了磷脂质以外的脂质，可举出不包含磷酸的脂质，例如可举出在其分子内不具有磷酸部分的甘油脂质、在其分子内不具有磷酸部分的鞘脂质等。另外，本发明中，“除了磷脂质以外的脂质”还包含修饰除了磷脂质以外的脂质而成的除了磷脂质以外的脂质的衍生物。
当为脂质中键合有具有碱性官能团的化合物的物质时，脂质被称为阳离子化脂质。阳离子化脂质例如能够修饰脂质体的膜，并能够提高与作为靶部位的细胞的粘附性等。
作为胆固醇类，能够举出将环戊烷多氢菲作为基本骨架，其一部分或所有的碳被氢化的胆固醇及其衍生物。例如，可举出胆固醇。若将平均粒径微细化而使其成为100nm以下，则脂质膜的曲率变高。排列在脂质体中的膜的变形也变大，因此水溶性药物更容易泄漏。作为抑制泄漏性的方法，有效的是为了填补基于脂质的膜的变形(膜稳定化效果)而添加胆固醇等。
脂质体中，关于胆固醇类的添加，期待通过填补脂质体的膜的空隙等而使脂质体的膜的流动性降低。通常，脂质体中，关于胆固醇类的量，优选在脂质成分的合计(总脂质)mol中，通常以50mol％左右的量含有。但是，内水相的渗透压高的脂质体中，胆固醇类的量的最佳范围是未知的。
相对于构成本发明所涉及的脂质体的脂质的合计量的胆固醇类的含有率为10mol％～35mol％，优选为15mol％～25mol％，更优选为17mol％～21mol％。通过将相对于构成脂质体的脂质的合计量的胆固醇类的含有率设为10mol％～35mol％，能够得到能够兼备药物的释放容易性和保管稳定性的脂质体组合物。
脂质体中，除了上述成分以外，为了改善血中滞留性可以加入亲水性高分子等，作为膜结构的稳定剂可以加入脂肪酸或二乙酰磷酸酯(diacetyl phosphate)等，作为抗氧化剂可以加入α-生育酚等。本发明中，优选不使用在药物用途中未认可在静脉注射用途中使用的分散助剂等添加剂，例如，表面活性剂等。
本发明所涉及的脂质体中，作为磷脂质、除了磷脂质以外的脂质、胆固醇类及它们的衍生物，优选用亲水性高分子修饰磷脂质、除了磷脂质以外的脂质或胆固醇类。
作为亲水性高分子，例如可举出聚乙二醇类、聚甘油类、聚丙二醇类、聚乙烯醇、苯乙烯-马来酸酐交替共聚物、聚乙烯吡咯烷酮、合成聚氨基酸等。上述亲水性高分子能够分别单独使用或组合使用2种以上。
这些中，从制剂的血中滞留性的观点考虑，优选聚乙二醇类、聚甘油类及聚丙二醇类，更优选聚乙二醇(PEG)、聚甘油(PG)及聚丙二醇(PPG)。从通用性及血中滞留性的观点考虑，进一步优选聚乙二醇(PEG)。
PEG的分子量并无特别限定，为500道尔顿～10,000道尔顿，优选为1,000道尔顿～7,000道尔顿，更优选为2,000道尔顿～5,000道尔顿。
本发明所涉及的脂质体中，优选与以脂质体中所含有的主要脂质一同使用通过PEG修饰的脂质(PEG修饰脂质)。作为PEG修饰脂质，例如可举出1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-PEG2000(Nippon Oil&Fats Co.,Ltd.制)、1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-PEG5000(Nippon Oil&Fats Co.,Ltd.制)及二硬脂酰甘油酯-PEG2000(Nippon Oil&Fats Co.,Ltd.制)等1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇。这些PEG修饰脂质相对于总脂质量以含有0.3～50质量％，优选为0.5～30质量％，更优选为1～20质量％的方式添加即可。
本发明所涉及的脂质体中，优选氢化大豆磷脂酰胆碱(脂质体中所含有的主要脂质)、1,2-二硬脂酰-3-磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(与主要脂质并用的脂质)及胆固醇的脂质的组合。
本发明所涉及的脂质体中，优选不包含阴离子聚合物(聚阴离子)。
(药物)
本发明所涉及的脂质体至少内含吉西他滨或其盐来作为药物。
作为吉西他滨的盐，能够举出通常已知的氨基等碱性基团、羟基及羧基等酸性基团中的盐。
作为碱性基团中的盐，例如可举出与盐酸、氢溴酸、硝酸及硫酸等无机酸的盐；与甲酸、乙酸、柠檬酸、草酸、富马酸、马来酸、琥珀酸、苹果酸、酒石酸、天门冬氨酸、三氯乙酸及三氟乙酸等有机羧酸的盐；以及与甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、均三甲苯磺酸及萘磺酸等磺酸的盐。
作为酸性基团中的盐，例如可举出与钠及钾等碱金属的盐；与钙及镁等碱土类金属的盐；铵盐；以及与三甲基胺、三乙基胺、三丁基胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二乙基胺、二环己基胺、普鲁卡因、二苄基胺、N-苄基-β-苯乙基胺、1-二苯羟甲胺及N,N'-二苄基乙二胺等含氮有机碱的盐等。
作为吉西他滨的盐，优选盐酸盐。
吉西他滨的含有量相对于脂质体组合物优选为0.1～2.0mg/ml，更优选为0.2～1.0mg/ml。
(以溶解状态内含的药物)
本发明所涉及的脂质体中内含的药物(吉西他滨或其盐)以溶解状态存在于脂质体的内水相中。其中，关于溶解状态，将相对于脂质体的体积所填充的药物的量为其内水相的组合液中的药物的饱和溶解度以下时，视为以溶解状态内含。并且，即使在饱和溶解度以上，通过Cryo-TEM(低温透射电子显微镜)未观察到药物晶体，或者在XRD测定中未观察到因晶体格子所导致的衍射图谱时，脂质体中内含的药物的大部分会溶解，且视为以溶解状态内含。该情况下，推测由于脂质膜所制成的物理化学环境而发生溶解促进或一部分药物摄入脂质膜中等。
(脂质体组合物)
本发明所涉及的脂质体组合物能够包含内含吉西他滨或其盐的脂质体及分散该脂质体的水溶液。
本发明所涉及的脂质体中，脂质体的内水相的渗透压相对于脂质体的外水相的渗透压优选为2倍～8倍，更优选为2.5倍～6倍，进一步优选为3倍～5倍。通过设定为内水相的渗透压相对于外水相的渗透压为2倍～8倍，能够兼备药物的释放容易性和保管稳定性。
脂质体组合物中能够适当加入水性溶剂、添加剂等。脂质体组合物可以包含与给药途径有关，且药物学上容许的等渗剂、稳定剂、抗氧化剂及pH调整剂中的至少1种。
作为等渗剂，并无特别限定，例如可举出如氯化钠、氯化钾、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等无机盐类、如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇等多元醇类、如葡萄糖、果糖、乳糖或蔗糖等糖类。
作为稳定剂，并无特别限定，例如可举出如甘油、甘露糖醇、山梨糖醇、乳糖或蔗糖等糖类。
作为抗氧化剂，并无特别限定，例如可举出抗坏血酸、尿酸、生育酚同系物(例如，维生素E、生育酚α、β、γ、δ这4个异构体)半胱氨酸、EDTA(乙二胺四乙酸)等。稳定剂及抗氧化剂能够分别单独使用或组合使用2种以上。
作为pH调整剂，例如可举出氢氧化钠、柠檬酸、乙酸、三乙醇胺、磷酸氢钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾等。
脂质体组合物可以含有药物学上容许的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯基聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原酸胶、阿拉伯胶、酪蛋白、明胶、琼脂、双甘油、丙二醇、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、PBS、氯化钠、糖类、生物体内降解性聚合物、无血清培养基、作为药品添加物而容许的添加物。
尤其，本发明所涉及的脂质体组合物优选含有硫酸铵、L-组氨酸、精制白糖、氢氧化钠或盐酸等。
填充脂质体组合物的容器并无特别限定，优选为透氧性低的材质。例如，可举出由具有塑料容器、玻璃容器、铝箔、铝蒸镀膜、氧化铝蒸镀膜、氧化硅蒸镀膜、聚乙烯醇、乙烯-乙烯醇共聚物、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚萘二甲酸乙二醇酯、聚偏二氯乙烯等来作为阻气层的层压薄膜制成的袋(bag)等，还能够通过采用根据需要使用了着色玻璃、铝箔或铝蒸镀膜等的袋等来遮光。
填充脂质体组合物的容器中，为了防止由存在于容器内的空间部的氧而氧化，优选用氮气等惰性气体置换容器空间部及药液中的气体。例如，可举出对注射液进行氮气鼓泡，且在氮气环境下进行针对容器的填充。
(释放速度)
本发明所涉及的脂质体组合物中，药物(吉西他滨或其盐)的释放速度优选10质量％/24hr～70质量％/24hr，更优选20质量％/24hr～60质量％/24hr，进一步优选20质量％/24hr～50质量％/24hr。
释放速度依赖于温度，因此优选在恒温条件下测定。例如，当为人时，温度并无特别限定，优选在体温(35℃～38℃)的范围内测定。
若药物(吉西他滨或其盐)的释放速度小于15质量％/24hr，则无法得到在体内的充分的暴露时间，且得不到所期待的药效的情况较多，并且根据情况而包含药物的脂质体在体内残留过于长的时间，从而聚集于皮肤等原本就不易分布的组织中而有时显现出预料之外的毒性。并且，若大于70质量％/24hr，则每单位时间所暴露的药物量变多，因此最高血中浓度变高而使毒性变大，并且泄漏的药物分布于除了肿瘤部以外的组织或受到迅速代谢而使血中滞留性降低，因此不优选。
药物的释放速度的测定方法并无特别限定，对成为对象的哺乳动物、模型系统等给药之后，按每单位时间从哺乳动物或模型系统采集血液或血浆等，并根据需要进行前处理等。而且，能够通过液相高效色谱、质谱等方法测定目标药物。
(脂质体组合物的制造方法)
本发明所涉及的脂质体组合物能够通过如下方法来制造，该方法包括：
乳化工序，不经过干燥固化工序而对溶解在有机溶剂中的脂质进行乳化来形成脂质体；
药物加载工序，使在乳化工序中得到的脂质体内含吉西他滨或其盐；及
渗透压调整工序，将脂质体的内水相的渗透压调整为相对于脂质体的外水相的渗透压为2倍～8倍。
脂质体组合物的制造方法可以根据需要包括使在乳化工序中所使用的有机溶剂蒸发的蒸发工序、无菌过滤、无菌填充等其他工序。
(乳化工序)
乳化工序中，能够将至少1种脂质溶解在有机溶剂中的油相与水相进行混合并搅拌包含脂质的水溶液来进行乳化。将有机溶剂中溶解有脂质的油相及水相进行混合并搅拌，且进行乳化，由此制备油相及水相被乳化成O/W型的乳化液。混合后，通过后述的蒸发工序去除源自油相的有机溶剂的一部分或全部，由此形成脂质体。或者，油相中的有机溶剂的一部分或全部在搅拌、乳化的过程中蒸发而形成脂质体。
作为搅拌的方法，为了粒子微细化而利用超声波或机械剪切力。并且，为了粒径的均匀化，能够进行通过一定孔径的过滤器的挤出机处理或微射流机(Microfluidizer)处理。若使用挤出机等，则能够分散辅助形成的多囊脂质体而使其成为单细胞脂质体。本发明中，从制造工序的简单化的观点考虑，优选不对未加载药物的状态的脂质体进行挤压处理而将其使用于下一工序。
本发明中，能够通过任意选择搅拌的速度及时间来控制所制备的脂质体的平均粒径。在得到具有安全性及稳定性的脂质体的观点上，优选对包含脂质的水溶液赋予圆周速度20m/sec以上的剪切。作为剪切，并无限制，具体而言，优选赋予圆周速度20m/sec～35m/sec的剪切，更优选赋予圆周速度23m/sec～30m/sec的剪切。
乳化工序只要是进行乳化的工序则并无限定，优选为施加高剪切，且在包含有机溶剂的乳化工序中进行微粒子化的工序。根据需要，能够通过使在乳化工序中所使用的有机溶剂蒸发(去溶剂)而形成脂质体。
制造脂质体时的乳化工序的液温能够适当进行调整，优选设为使用油相与水相的混合时的液温的脂质的相转变温度以上，例如使用相转变温度为35～40℃的脂质时，优选设为35℃～70℃。
(油相)
作为用作油相的有机溶剂，使用水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合溶剂。本发明中，作为有机溶剂，优选实质上不使用氯仿、二氯甲烷、己烷及环己烷等有机溶剂，更优选完全不使用这些有机溶剂。
水溶性有机溶剂优选为具有可与水任意混合的性质的有机溶剂。作为水溶性有机溶剂，例如可举出甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇及叔丁醇等醇类，甘油、乙二醇及丙二醇等二醇类，聚乙二醇等聚亚烷基二醇类等。这些中，优选醇类。作为醇类，优选为选自乙醇、甲醇、2-丙醇及叔丁醇中的至少1种，更优选为选自乙醇、2-丙醇及叔丁醇中的至少1种，进一步优选为乙醇。
酯系有机溶剂优选为从有机酸及醇的反应得到的酯。作为酯系有机溶剂，例如可举出乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯及丙酸甲酯等，优选为选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯及丙酸甲酯中的至少1种，更优选为乙酸乙酯。
水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合比率例如能够设为以质量比计，为90:10～30:70，优选为80:20～40:60，更优选为80:20～70:30。水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合溶剂还可以包含水或缓冲液等水性溶剂。水性溶剂例如能够在1～30质量％的范围内加入。混合溶剂的pH例如能够设为3～10，优选为4～9。酯系有机溶剂中也可以包含能够溶解于这些溶剂中的各种药剂等生理活性物质等。
当作为水溶性有机溶剂而使用乙醇，且作为酯系有机溶剂而使用乙酸乙酯时，乙醇与乙酸乙酯的混合比率例如能够设为以质量比计，为80:20～70:30。
脂质的浓度并无特别限定，能够进行适当调整，但作为将水溶性有机溶剂与酯系有机溶剂的混合液作为溶剂的溶液，能够设为40g/L～250g/L，优选为100g/L～200g/L。
(水相)
水相是指外水相及内水相。
本发明中的外水相是指分散脂质体的水溶液。例如为注射剂的情况下，进行药瓶或预充式注射器包装而保管的占脂质体分散液的脂质体外侧的溶液成为外水相。并且，关于通过所添加的分散用溶液或其他溶解液给药时用时分散的溶液也相同，占脂质体分散液的脂质体外侧的溶液成为外水相。
本发明中的内水相是指隔着脂质体的脂质双层膜的封闭囊泡内的水相。
制造脂质体时，作为分散脂质体的水溶液(外水相)，优选使用水(蒸馏水、注射用水等)、生理盐水、各种缓冲液或糖类的水溶液及这些的混合物(水性溶剂)。作为缓冲液，并不限定于有机系、无机系，适宜使用在接近体液的氢离子浓度附近具有缓冲作用的缓冲液，且可举出磷酸缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、柠檬酸缓冲液、乙酸缓冲液及Good’s缓冲液(Good’sbuffer)等。水相的pH例如能够设为5～9，优选为7～8。作为分散脂质体的水溶液(外水相)，优选使用磷酸缓冲液(例如，pH＝7.4)。关于脂质体的内水相，在制造脂质体时，可以是分散脂质体的水溶液，也可以是新添加的水、生理盐水、各种缓冲液或糖类水溶液及这些的混合物。用作外水相或内水相的水优选不包含杂质(尘埃、化学物质等)。
生理盐水是指以调整成与人体等渗的无机盐溶液，且还可以具有缓冲功能。作为生理盐水，可举出含有0.9w/v％的氯化钠的食盐水、磷酸缓冲生理盐水(以下，还称为PBS)及三羟甲基氨基甲烷缓冲生理盐水等。
为了去除未包含在脂质体中的成分或调整浓度或渗透压，可以通过离心分离、超滤、透析、凝胶过滤或冷冻干燥等方法对包含经过乳化工序而制备的脂质体的水溶液实施后处理。
(挤压处理)
挤压处理是指，使脂质体通过具有细孔的过滤器，由此实施物理剪切力，并微粒化的工序。使脂质体通过时，将脂质体分散液及过滤器保温在构成脂质体的膜的相转变温度以上的温度，由此能够迅速微粒化。
(蒸发工序)
在脂质体组合物的制造方法中，根据需要可以设置蒸发工序。蒸发工序中，使有机溶剂从包含在乳化工序中得到的脂质体的水溶液蒸发。本发明中，蒸发工序是指包括作为蒸发工序将源自油相的有机溶剂的一部分或全部强制去除的工序及油相中的有机溶剂的一部分或全部在搅拌、乳化的过程中自然蒸发的工序中的至少一个。
使蒸发工序中的有机溶剂蒸发的方法并无特别限定，例如进行通过对有机溶剂加热而使其蒸发的工序、乳化后的静置或持续缓慢搅拌的工序及进行真空脱气的工序中的至少一个即可。
使有机溶剂蒸发的工序中，优选在使有机溶剂蒸发的工序开始后至30分钟内，将包含脂质体的水溶液中所含有的有机溶剂的浓度设为15质量％以下。
(药物加载工序)
药物加载工序中，当脂质体内含药物(吉西他滨或其盐)时，将药物溶解于进行水合、溶胀的水性介质，并通过相转变温度以上的加热、超声波处理或挤压等方法能够使脂质体的内水相内含药物。并且，还能够将药物溶解于脂质乳化时的水相并使其内含于内水相。
(渗透压调整工序)
渗透压调整工序是指调整脂质体的内水相及外水相的渗透压的工序。通过调整脂质体的内水相及外水相的渗透压，能够控制释放速度。作为渗透压调整工序，并无特别限定，可举出透析等。本发明的制造方法中，从生产效率的观点考虑，优选同时进行使脂质体内含核酸类似物抗癌剂的工序及渗透压调整工序。
在药物加载工序后得到的溶液中，外水相与内水相的溶质均匀，能够将此时的渗透压定义为完成的脂质体的内水相的渗透压。但是，基于之后的外水相的透析的置换/渗透压调整工序中，加热操作限定于通过抑制为脂质的相转变温度以下等而内水相的溶质被充分保持的情况。并且，外水相的渗透压能够由使用于最终的透析工序中的透析液的渗透压来定义。但是，限定于通过透析液充分置换的情况。并且，关于脂质体组合物的完成液，通过利用离心分离或超滤，对外水相的溶质的组成浓度与内水相的溶质的组成浓度进行定量，并测量该组合液的渗透压，也能够得到内水相及外水相的渗透压。
优选将脂质体的内水相的渗透压相对于脂质体的外水相的渗透压调整为2倍～8倍，更优选调整为2.5倍～6倍，进一步优选调整为3倍～5倍。
渗透压的测量按照第十六版日本药典中所记载的渗透压测定法进行即可。具体而言，能够通过水的凝固点(冰点)下降程度测定来求出渗透压摩尔浓度(Osmolarity)。并且，水的凝固点下降程度由溶质摩尔浓度来定义，且能够从溶质摩尔浓度求出渗透压摩尔浓度。
外水相的渗透压在给药时对生物体带来重要的影响。当从体液的渗透压大幅远离时，发生以各组织中的水分的移动为原因的溶血或疼痛。从而，外水相的渗透压优选为200mOsmol/L～400mOsmol/L，更优选为250mOsmol/L～350mOsmol/L，进一步优选为与体液等渗。
(无菌过滤)
脂质体组合物优选进行无菌过滤。作为过滤方法，能够使用中空纤维膜、反渗透膜或膜过滤器等从包含脂质体的水溶液中去除多余物。本发明中，优选通过具有能够灭菌的孔径的过滤器(优选0.2μm的过滤灭菌过滤器)进行过滤。
为了防止因脂质体的变形给平均粒径带来的影响，优选在构成脂质体的脂质的相转变温度以下的温度下进行无菌过滤工序及后述的无菌填充工序。例如，当脂质的相转变温度为50℃附近时，优选为0℃～40℃左右，更具体而言，优选在5℃～30℃左右的温度下制造。
(无菌填充)
无菌过滤后得到的脂质体组合物优选作为医疗用途而进行无菌填充。无菌填充的方法能够应用公知的方法。通过向容器无菌地填充而能够制备作为医疗用而适宜的脂质体组合物。
(肿瘤治疗药)
本发明的肿瘤治疗药可以包含通常用于制剂化的赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、乳化剂、表面活性剂、助溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂及吸收促进剂等添加剂。
本发明的肿瘤治疗药可以是包含在脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物及紫杉烷系抗肿瘤药的1剂型制剂，也可以是脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物与紫杉烷系抗肿瘤药这2剂型制剂。优选为将脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物与紫杉烷系抗肿瘤药作为单独制剂的2剂型制剂。
当使用脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物与紫杉烷系抗肿瘤药由单独制剂构成的肿瘤治疗药时，各制剂能够同时、分别、连续或隔开间隔而向对象给药。
作为本发明的肿瘤治疗药的给药途径，例如可举出静脉内、动脉内、直肠内、腹腔内、肌肉内、肿瘤内或膀胱内注射的方法、口服给药、透皮给药及栓剂等方法。
作为脂质体组合物的给药途径，优选非口服给药。例如，能够举出点滴等静脉内注射(静注)、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射及髓腔内注射。作为给药方法，可举出基于注射器或点滴的给药。
作为紫杉烷系抗肿瘤药的给药途径，优选口服给药。
本发明的肿瘤治疗药中，例如能够将脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物进行非口服给药，并将紫杉烷系抗肿瘤药进行口服给药。
关于脂质体组合物中所含有的吉西他滨或其盐的给药量及给药次数，能够每天将1～4mg/kg分为1次至多次进行给药。例如，关于注射剂，对于人(患者；作为体重60kg)，优选每天通过静脉注射给与60mg～240mg，优选120mg～240mg，更优选180mg～240mg。但是，这些给药量及给药次数并无限制。
关于紫杉烷系抗肿瘤药的给药量及给药次数，例如，对于成人而言，能够每天将0.01mg/kg～1000mg/kg分1次至多次进行给药。
作为本发明的肿瘤治疗药的剂型的例，可举出片剂、胶囊剂、悬浮剂、乳剂、液剂、滴眼剂、滴鼻剂、滴耳剂及注射剂等。
能够有效地使用本发明的肿瘤治疗药的肿瘤只要是癌及肉瘤则并无特别限定，例如可举出乳腺癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌，优选胰腺癌。
(试剂盒)
本发明的试剂盒为组合(a)内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物及(b)紫杉烷系抗肿瘤药而成的试剂盒。
本发明的试剂盒中，能够将(a)内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物及(b)紫杉烷系抗肿瘤药分别设定为公知的各种制剂形态，且根据该制剂形态而容纳于通常所使用的各种容器中。
本发明的试剂盒中，可以将(a)内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物及(b)紫杉烷系抗肿瘤药分别容纳于不同的容器中，也可以进行混合而容纳于相同的容器中。优选(a)内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物及(b)紫杉烷系抗肿瘤药分别容纳于不同的容器中。
(抗肿瘤效果增强剂)
本发明的抗肿瘤效果增强剂可以包含通常用于制剂化的赋形剂、粘合剂、润滑剂、崩解剂、着色剂、调味剂、乳化剂、表面活性剂、助溶剂、悬浮剂、等渗剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧化剂、稳定剂及吸收促进剂等添加剂。
本发明的抗肿瘤效果增强剂能够与紫杉烷系抗肿瘤药同时、分别、连续或隔开间隔而向对象给药。
作为本发明的抗肿瘤效果增强剂的给药途径，优选非口服给药。例如，能够举出点滴等静脉内注射(静注)、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、眼内注射及髓腔内注射。作为给药方法，可举出基于注射器或点滴的给药。
关于本发明的抗肿瘤效果增强剂中所含有的吉西他滨或其盐的给药量及给药次数，能够每天将1mg/kg～4mg/kg分为1次至多次进行给药。例如，关于注射剂，对于人(患者；作为体重60kg)，优选每天通过静脉注射给与60～240mg，优选120mg～240mg，更优选180mg～240mg。但是，本发明的抗肿瘤效果增强剂中，这些给药量及给药次数并无限制。
能够有效地使用本发明的抗肿瘤效果增强剂的肿瘤只要是使用紫杉烷系抗肿瘤药的癌及肉瘤则并无特别限定，例如可举出乳腺癌、子宫体癌、卵巢癌、前列腺癌、肺癌、胃(胃腺)癌、非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部鳞状细胞癌、食道癌、膀胱癌、黑色素瘤、大肠癌、肾细胞癌、非霍奇金淋巴瘤及尿路上皮癌等，优选胰腺癌。
实施例
以下，通过实施例对本发明进行详细说明。但是，本发明并不限定于实施例。
关于平均粒径，通过1×PBS(NIPPON GENE CO.,LTD.制)将试样稀释成1000倍质量，利用NANOTRAC UPA-UT(Nikkiso Co.,Ltd.制)，并通过动态光散射法测定了体积平均粒径。
关于肿瘤体积，用卡尺测定肿瘤长径(a)及短径(b)，并通过以下式计算。
式：(a×b2)×0.5(式中，“a”为长径，“b”为短径。)
(参考例1)
a)油相的制备
以成为76/19/5的摩尔比的方式将氢化大豆磷脂酰胆碱、胆固醇及N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐(以下，还称为DSPE-PEG)分别取16.6g、2.0g、4.3g，接着加入有机溶剂(乙醇/乙酸乙酯＝3/1)405ml并加热至70℃而溶解脂质来作为油相。
b)水相的制备
制备4mM磷酸缓冲液(pH7.78)来作为水相。
c)未内含药物的脂质体的制备
将水相加热至70℃，以成为水相/油相＝8/3的容积比的方式添加油相之后，通过旋转搅拌型乳化机，以圆周速度20m/s、13000rpm混合了30分钟。然后，加热至相转变温度以上的同时输送氮来使有机溶剂与水蒸发，直至相对于乳化前的容积成为约1/10的体积进行浓缩，从而得到了未内含药物的脂质体。此时的平均粒径为68.0nm。
d)未内含药物的脂质体的批量混合
混合了两批在上述c)中制备的未内含药物的脂质体。
e)药物内含脂质体的制备
作为药物，使用了吉西他滨盐酸盐。吉西他滨盐酸盐是从TEVA公司购买的。用注射用水948g溶解氯化钠81.63g、磷酸氢二钠十二水合物29.01g、磷酸二氢钠二水合物2.29g来作为PBS。在两个容器中分别混合吉西他滨盐酸盐12.98g、PBS54.01g、日本药典注射用水75.74g、8M氢氧化钠2.71mL来作为药物溶液。向各自的药物溶液加入未封入药物的脂质体141.4mL、8M氢氧化钠2.71mL并混合。该液的渗透压为1039mOsm/L，且其成为所完成的脂质体组合物的内水相的渗透压。接着，在70℃下将该溶液加热10分钟之后冷却至40℃，并用1016mM蔗糖/37mM组氨酸溶液稀释。希釈后，统合成一个来作为药物加载液。作为基于透析的脂质体组合物的完成透析液，制备了275mM蔗糖/10mM组氨酸水溶液。根据该溶液的溶质摩尔浓度求出的渗透压为285mOsm/L。使用该透析液在室温下进行透析，去除存在于药物加载液的外水相的未封入的吉西他滨盐酸盐和各溶质，并用透析液置换了外水相。通过以上的工序，得到了吉西他滨盐酸盐浓度0.81mg/mL、平均粒径74.9nm、内水相渗透压1039mOsm/L、外水相渗透压285mOsm/L、内水相相对于外水相的渗透压为3.6倍的吉西他滨内含脂质体组合物。相对于构成脂质体的脂质的合计量的胆固醇类的含有率为19.3mol％。
另外，渗透压是从溶质摩尔浓度计算出的。
(参考例2)
血浆中的释放速度的测定
用小鼠血浆将脂质体组合物50μL稀释(体积)20倍，在37℃下温育24小时，且在24小时的时点采集了100μL。接着，使用超滤过滤器(Amicon Ultra-0.5 10kDa、Millipore公司制)在7400×g、30分钟、4℃的条件下进行了离心过滤。通过HPLC对所回收的滤液中所含有的药物量进行定量，并通过以下式计算了释放速度。
式：释放速度(％/24hr)＝(温育24小时后的滤液中的药物量)×20÷脂质体组合物的所有相中所含有的药量×100
结果为24％/24hr。
(实施例1)
Capan-1皮下移植荷瘤模型在小鼠上的药效试验
作为受检体，使用了吉西他滨(以下，还称为Gem)、紫杉醇纳米制剂(以下，还称为Abx)及吉西他滨内含脂质体组合物(以下，还称为组合物A)。
Gem使用了将吉西他滨盐酸盐(TEVA公司制)溶解在生理盐水而成的物质。Abx使用了将紫杉醇纳米制剂(Celgene公司制)溶解在生理盐水而成的物质。吉西他滨内含脂质体组合物使用了在参考例1中制作的物质。
将作为人胰腺癌细胞株的Capan-1细胞1×107个移植到雌性裸鼠的侧腹皮下而形成了皮下肿瘤。以肿瘤体积为指标，评价了Abx及组合物A的并用给药中的皮下肿瘤的抑制效果。作为受检体，组1使用了蔗糖溶液，组2使用了Gem，组3使用了组合物A，组4及组5使用了Abx及Gem，组6及组7使用了Abx及组合物A。组1～5为比较例，组6及组7为实施例。受检体均在移植后第17天起进行了合计3周(每周1次)的尾静脉给药。
另外，各药剂的给药量以将体重减少率不超过20％的量作为如下用量来设定，该用量是认为未达到无法确认到MTD(最大耐受量)恢复那样的严重的最低体重的用量。
将组结构及给药量示于表1。
[表1]
Figure BDA0002512956520000221
将肿瘤体积的变化示于图1。
将移植后第38天的肿瘤体积平均值、移植后第38天的肿瘤体积标准偏差、给药开始时的肿瘤消退率及直至肿瘤体积平均值2000mm3为止的到达天数示于表2。
作为统计学解析，实施Tukey的多重比较测试(Tukey’s multiple comparisonstest)，在组之间P值小于5％时判定为在统计学上有差异。数据处理中使用了GraphpadPrism version 5.03。
表2中，a表示通过与组1的比较为P＜0.001的值，b表示通过与组2的比较为P＜0.001的值，c表示通过与组4的比较为P＜0.05的值，N.R.表示无退缩。
[表2]
Figure BDA0002512956520000231
a)P＜0.001与组1的比较，b)P＜0.001与组2的比较，c)P＜0.05与组4的比较
N.R.表示无退缩
组6或组7中，与组4或组5相比在移植后第38天，肿瘤体积较小，组6中示出，对于组4在统计学上有意义的差(P＜0.05)。并且，关于从给药开始时的肿瘤消退率，未发现在组4中的肿瘤消退，在组5中的肿瘤消退率为31％。相对于此，在组6中的肿瘤消退率为47％，在组7中的肿瘤消退率为86％，组6及组7示出优异的肿瘤消退效果。进而，直至肿瘤体积平均2000mm3为止的到达天数在组4中为移植后第69天，在组5中为移植之后第80天，相对于此，组6及组7中为＞87，且延迟。
从以上结果，组合物A具有在与Abx的并用中移植到裸鼠的皮下的Capan-1肿瘤细胞的增殖抑制效果，该增殖抑制效果表示大于Gem与Abx的并用。

Claims (8)

1.一种用来作为肿瘤治疗药使用的脂质体组合物的制造方法，其是在脂质体中内含吉西他滨或其盐的脂质体组合物的制造方法，其包括：
将有机溶剂中溶解有至少1种脂质的油相与水相混合并搅拌包含脂质的水溶液的工序；和
使有机溶剂从搅拌的工序中得到的包含脂质体的水溶液中蒸发的工序；
其中，有机溶剂为水溶性有机溶剂及酯系有机溶剂的混合溶剂。
2.根据权利要求1所述的制造方法，其中，
酯系有机溶剂为选自乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸异丙酯、乙酸叔丁酯及丙酸甲酯中的至少1种。
3.根据权利要求1所述的制造方法，其中，
酯系有机溶剂为乙酸乙酯。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的制造方法，其中，
水溶性有机溶剂为醇类。
5.根据权利要求4所述的制造方法，其中，
醇为选自乙醇、甲醇、2-丙醇及叔丁醇中的至少1种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的制造方法，其中，
水溶性有机溶剂与酯系有机溶剂的质量比为90:10～30:70。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的制造方法，其中，
在搅拌的工序中，对包含脂质的水溶液赋予圆周速度20m/sec以上的剪切。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的制造方法，其中，
在使有机溶剂蒸发的工序中，通过对有机溶剂进行加热而使其蒸发。
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