CN111579680A

CN111579680A - 一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN111579680A
Application number: CN202010474858.7A
Authority: CN
Inventors: 成晓亮; 李美娟
Original assignee: Nanjing Pinsheng Medical Technology Co ltd
Current assignee: Nanjing Pinsheng Medical Technology Co ltd
Priority date: 2020-05-29
Filing date: 2020-05-29
Publication date: 2020-08-25

Abstract

本发明公开了一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒及其应用，属于药物分析技术领域。本发明的试剂盒采用LC‑MS/MS法，可检测一次性对10种常用的抗癫痫药物进行检测，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，6 min之内完成抗癫痫药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗癫痫药物的定量分析，为临床上抗癫痫药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

Description

一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒及其应用。

背景技术

癫痫是大脑神经元突发性异常放电，以反复性、发作性、刻板性的中枢神经系统功能失常为特征，导致短暂的大脑功能障碍的一种慢性疾病。癫痫病因复杂多样，包括遗传因素、脑部疾病、全身或系统性疾病等。癫痫是神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症，中国约有900万左右的癫痫患者，其中500～600万是活动性癫痫患者，同时每年新增加癫痫患者约40万，在中国癫痫已经成为神经科仅次于头痛的第二大常见病。癫痫患者发作时，运动和感觉功能、自主神经状态、意识水平等表现出不同程度的障碍，癫痫持续性发作促使大脑神经元严重缺氧，诱发大脑神经元变性、坏死，后期中患者可出现认知功能障碍、如学习记忆减退，另约有少部分患者并发抑郁、焦虑、精神分裂症等精神障碍。因此，及时、有效的控制癫痫发作，将有助于防治癫痫发生发展及其并发症的出现。

临床上常见的抗癫痫药物有左乙拉西坦(LTT)、10-羟卡马西平(HCBZ)、卡马西平(CBZ)、奥卡西平(OCP)、苯妥英(PHT)、拉莫三嗪(LMT)、丙戊酸(VPA)、苯巴比妥(PBB)、托吡酯(TPM)、氯硝西泮(CNP)等。由于癫痫需长期维持治疗，但抗癫痫药物有效血药浓度范围较窄，体内代谢过程存在较大的个体差异，较易发生药物毒害事件，且药动学特性与抗癫痫效果、药物不良反应发生有相关关系，因此，对其血液中药物浓度的监测以实现个体化给药，减少不良反应并避免用药恶性循环的重要参考，在临床用药中具有重大意义。

目前国内外测定抗癫痫药物血药浓度的方法主要采用高效液相色谱法和免疫法，文章“Simple and Accurate Quantitative Analysis of Ten Antiepileptic Drugs inHuman Plasma by Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometry”中报道同时检测十种抗癫痫药物方法，十种物质仅采用两种同位素内标，基质干扰会比较大，样品采集时间比较长，每针需要10分钟以上；文章“Development,validation and clinicalapplication of an online-SPE-LC-HRMS/MS for simultaneous quantifification ofphenobarbital,phenytoin,carbamazepine,and its active metabolite carbamazepine10,11-epoxide”介绍了在线固相萃取处理样本，配置要求高，样本采集时间长等。专利CN101093214 A公开了一种测定抗癫痫药物血药浓度的方法，专利CN 101093214 A公开了一种同时测定多种抗癫痫药物血药浓度的方法，前者采用高效液相色谱法检测了四种抗癫痫药物，后者采用高效液相色谱法检测了六种抗癫痫药物，高效液相色谱法的选择性差，检测药物种类比较有限，且流速高，所需溶剂成本高，分析时间长，前者9min检测4种抗癫痫药物，后者20min检测6种抗癫痫药物，而本发明只需6min就能检测10种抗癫痫药物，更适用于临床血药浓度监测。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒。

本发明的另一个目的是提供上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒，所述抗癫痫药物包括：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮；

该试剂盒包括：流动相、校准品溶液、混合内标溶液、蛋白质沉淀剂和质控品；

所述流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A为甲酸-甲酸铵水溶液、流动相B为乙腈；

所述校准品溶液包括系列浓度已知的由空白血清配制的左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的混合溶液；

所述混合内标溶液为浓度已知的由甲醇水溶液配制的左乙拉西坦-d3、10-羟卡马西平-d4、卡马西平-d2,15N、奥卡西平-d4、苯妥英-d10、拉莫三嗪-13C3、丙戊酸-d6、苯巴比妥-d5、托吡酯-d12、氯硝西泮-d4的混合溶液；

所述质控品包括浓度已知的由空白血清配制的左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的混合溶液。

进一步地，所述流动相A为0.01％～0.2％甲酸-0.1mM～10mM甲酸铵水溶液，优选为0.1％甲酸-2mM甲酸铵水溶液。

进一步地，所述校准品溶液包括7种浓度配比的混合液。

进一步地，所述混合内标溶液中左乙拉西坦-d3、10-羟卡马西平-d4、卡马西平-d2,15N、奥卡西平-d4、苯妥英-d10、拉莫三嗪-13C3、丙戊酸-d6、苯巴比妥-d5、托吡酯-d12、氯硝西泮-d4的浓度分别为LTT-d3 20000ng/mL、HCBZ-d4 5000ng/mL、CBZ-d2,15N10000ng/mL、OCP-d4 20000ng/mL、PHT-d10 20000ng/mL、VPA-d6 100000ng/mL、TPM-d1220000ng/mL、CNP-d4 500ng/mL、LMT-13C3 5000ng/mL、PBB-d5 1000ng/mL。

进一步地，所述蛋白质沉淀剂为甲醇和乙腈的混合液，甲醇与乙腈的体积比1:1～5；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:3。

进一步地，所述质控品包括低、中、高三种浓度配比的混合液。

上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物中的应用。

有益效果：

采用本发明的试剂盒检测血清中抗癫痫药物时，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，6min之内完成抗癫痫药物的分离和检测，准确度与精密度基本满足要求，可用于临床上抗癫痫药物的定量分析，为临床上抗癫痫药物的治疗浓度监测提供一种可靠的检测方法。

附图说明

图1为实施例1中抗癫痫药物标准品的提取离子流谱图。

图2为实施例1中血清中抗癫痫药物提取离子流谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒，所述抗癫痫药物包括：左乙拉西坦(LTT)、10-羟卡马西平(HCBZ)、卡马西平(CBZ)、奥卡西平(OCP)、苯妥英(PHT)、拉莫三嗪(LMT)、丙戊酸(VPA)、苯巴比妥(PBB)、托吡酯(TPM)和氯硝西泮(CNP)。

针对上述抗癫痫药物选择的对应同位素内标物分别为：左乙拉西坦-d3(LTT-d3)、10-羟卡马西平-d4(HCBZ-d4)、卡马西平-d2,15N(CBZ-d2,15N)、奥卡西平-d4(OCP-d4)、苯妥英-d10(PHT-d10)、拉莫三嗪-13C3(LMT-13C3)、丙戊酸-d6(VPA-d6)、苯巴比妥-d5(PBB-d5)、托吡酯-d12(TPM-d12)和氯硝西泮-d4(CNP-d4)。

所述的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：0.01％～0.2％甲酸0.1mM～10mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；

(2)校准品溶液：

将混合标准品溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

LTT/PHT/OCP/TPM：100ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、2500ng/mL、5000ng/mL、25000ng/mL、50000ng/mL

CBZ：50ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL、12500ng/mL、25000ng/mL

HCBZ/LMT：20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL

CNP：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mL

VPA：500ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL、12500ng/mL、25000ng/mL、125000ng/mL、250000ng/mL

PBB：200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、50000ng/mL、100000ng/mL；

(3)混合内标溶液：

包含有LTT-d3 20000ng/mL、HCBZ-d4 5000ng/mL、CBZ-d2,15N 10000ng/mL、OCP-d420000ng/mL、PHT-d10 20000ng/mL、VPA-d6 100000ng/mL、TPM-d12 20000ng/mL、CNP-d4500ng/mL、LMT-13C3 5000ng/mL、PBB-d51000 ng/mL的甲醇水溶液；

(4)蛋白质沉淀剂：

甲醇与乙腈混合溶液；

(5)质控品：

含有抗癫痫药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，

QC(L)为QC(M)用空白血清基质稀释至10倍；

QC(M)为上述混合标准溶液用空白血清基质稀释至500倍；

QC(H)为上述混合标准溶液用空白血清基质稀释至50倍。

在一种优选方案中，上述流动相A为0.01％～0.2％甲酸0.1mM～10mM甲酸铵水溶液，优选为0.1％甲酸2mM甲酸铵水溶液。

在一种方案中，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1～5；优选地，蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:3。

本发明提及的混合标准溶液按照如下方法制备：分别将抗癫痫药物LTT 20mg/mL、CBZ 10mg/mL、PHT 20mg/mL、LMT 10mg/mL、CNP 1mg/mL、HCBZ 5mg/mL、OCP 5mg/mL、VPA50mg/mL、PBB 10mg/mL、TPM 20mg/mL母液用甲醇配制成含LTT 1000000ng/mL、CBZ500000ng/mL、PHT 1000000ng/mL、LMT 200000ng/mL、CNP 5000ng/mL、HCBZ 200000ng/mL、OCP 1000000ng/mL、VPA 5000000ng/mL、PBB 2000000ng/mL、TPM 1000000ng/mL标准品溶液。

本发明提及的混合内标溶液按照如下方法制备：将含有LTT-d3 1mg/mL、HCBZ-d41mg/mL、CBZ-d2,15N 1mg/mL、OCP-d4 2mg/mL、PHT-d10 1mg/mL、VPA-d6 5mg/mL、TPM-d121mg/mL、CNP-d4 0.1mg/mL、LMT-13C3 1mg/mL、PBB-d5 1mg/mL母液用甲醇水溶液配制成包含LTT-d3 20000ng/mL、HCBZ-d4 5000ng/mL、CBZ-d2,15N 10000ng/mL、OCP-d4 20000ng/mL、PHT-d10 20000ng/mL、VPA-d6 100000ng/mL、TPM-d12 20000ng/mL、CNP-d4 500ng/mL、LMT-13C3 5000ng/mL、PBB-d5 1000ng/mL的同位素混合内标溶液。

在制备混合标准溶液和混合内标溶液时，采用的甲醇水溶液为50％～95％甲醇水溶液；优选为70％～90％甲醇水溶液；更优选为80％甲醇水溶液。

在制备混合标准溶液，空白血清基质为无抗癫痫药物的空白血清。

本发明提及的甲醇水溶液浓度一般指体积浓度。

本发明提及的血清为人或动物的血清。

在一种优选方案中，超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：含0.01％～0.2％甲酸0.1mM～10mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；

(2)校准品溶液：

分别将抗癫痫药物母液，浓度分别为LTT 20mg/mL、CBZ 10mg/mL、PHT 20mg/mL、LMT 10mg/mL、CNP 1mg/mL、HCBZ 5mg/mL、OCP 5mg/mL、VPA 50mg/mL、PBB 10mg/mL、TPM20mg/mL，用甲醇配制成含LTT 1000000ng/mL、CBZ 500000ng/mL、PHT 1000000ng/mL、LMT200000ng/mL、CNP 5000ng/mL、HCBZ 200000ng/mL、OCP 1000000ng/mL、VPA 5000000ng/mL、PBB 2000000ng/mL、TPM 1000000ng/mL标准品溶液。将所述混合标准溶液以无抗癫痫药物的空白血清配制成七个不同浓度点的校准品溶液；

(3)混合内标溶液：

将含有LTT-d3 1mg/mL、HCBZ-d4 1mg/mL、CBZ-d2,15N 1mg/mL、OCP-d4 2mg/mL、PHT-d10 1mg/mL、VPA-d6 5mg/mL、TPM-d12 1mg/mL、CNP-d4 0.1mg/mL、LMT-13C3 1mg/mL、PBB-d5 1mg/mL母液用甲醇水溶液配制成包含LTT-d3 20000ng/mL、HCBZ-d4 5000ng/mL、CBZ-d2,15N 10000ng/mL、OCP-d4 20000ng/mL、PHT-d10 20000ng/mL、VPA-d6 100000ng/mL、TPM-d12 20000ng/mL、CNP-d4 500ng/mL、LMT-13C3 5000ng/mL、PBB-d5 1000ng/mL的同位素混合内标溶液。

(4)蛋白质沉淀剂：

甲醇与乙腈的体积比1:1～5。

(5)质控品：

取上述混合标准溶液以无抗癫痫药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)。

在一种更优选方案中，超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物的试剂盒包含如下试剂：

(1)流动相：

流动相A：0.1％甲酸0.1mM～10mM甲酸铵水溶液；流动相B：乙腈；

(2)校准品溶液：

分别将抗癫痫药物母液，浓度分别为LTT 20mg/mL、CBZ 10mg/mL、PHT 20mg/mL、LMT 10mg/mL、CNP 1mg/mL、HCBZ 5mg/mL、OCP 5mg/mL、VPA 50mg/mL、PBB 10mg/mL、TPM20mg/mL，用80％甲醇配制成含LTT 1000000ng/mL、CBZ 500000ng/mL、PHT 1000000ng/mL、LMT 200000ng/mL、CNP 5000ng/mL、HCBZ 200000ng/mL、OCP 1000000ng/mL、VPA5000000ng/mL、PBB 2000000ng/mL、TPM 1000000ng/mL标准品溶液，将所述混合标准溶液以无抗癫痫药物的空白血清配制成七个不同浓度点的校准品溶液；

(3)混合内标溶液：

将含有LTT-d3 1mg/mL、HCBZ-d4 1mg/mL、CBZ-d2,15N 1mg/mL、OCP-d4 2mg/mL、PHT-d10 1mg/mL、VPA-d6 5mg/mL、TPM-d12 1mg/mL、CNP-d4 0.1mg/mL、LMT-13C3 1mg/mL、PBB-d5 1mg/mL母液用80％甲醇水溶液配制成包含LTT-d3 20000ng/mL、HCBZ-d45000ng/mL、CBZ-d2,15N 10000ng/mL、OCP-d4 20000ng/mL、PHT-d10 20000ng/mL、VPA-d6100000ng/mL、TPM-d12 20000ng/mL、CNP-d4 500ng/mL、LMT-13C3 5000ng/mL、PBB-d51000ng/mL的同位素混合内标溶液；

(4)蛋白质沉淀剂：

甲醇与乙腈的体积比1:3；

(5)质控品：

QC(L)为QC(M)用空白血清基质稀释至10倍；

QC(M)为上述混合标准溶液用空白血清基质稀释至500倍；

QC(H)为上述混合标准溶液用空白血清基质稀释至50倍。

取上述混合标准溶液以无抗癫痫药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，其中，QC(L)，QC(M)，QC(H)中抗癫痫药物质控品对应浓度见表1；

表1抗癫痫药物质控品对应浓度(单位:ng/mL)

QC(L)中包含：LTT/PHT/OCP/TPM 200ng/mL、CBZ 100ng/mL、LMT/HCBZ 40ng/mL、CNP 1ng/mL、VPA 1000ng/mL、PBB 400ng/mL

QC(M)中包含：LTT/PHT/OCP/TPM2000 ng/mL、CBZ1000 ng/mL、LMT/HCBZ 400ng/mL、CNP10 ng/mL、VPA10000 ng/mL、PBB4000 ng/mL

QC(H)中包含：LTT/PHT/OCP/TPM 20000ng/mL、CBZ 10000ng/mL、LMT/HCBZ4000ng/mL、CNP 100ng/mL、VPA 100000ng/mL、PBB 40000ng/mL。

在一种更优选方案中，混合内标溶液按照如下方法制备：

分别准确移取一定体积的抗癫痫药物同位素内标母液，加入80％甲醇水溶液884μL，混匀得到1mL同位素内标溶液。建议分装冻存在-80℃冰箱，即取即用。浓度参见下表2。

表2混合内标溶液的配制

在一种更优选方案中，校准品溶液按照如下方法制备：

分别准确移取一定体积的抗癫痫药物标准母液，加入80％甲醇水溶液785μL，充分混匀得到1mL混合标准溶液，浓度参下表3。

表3混合标准溶液

采用梯度稀释法进行标曲配制，从-20℃冰箱取出标准溶液后，涡旋10s，2min内使用标准溶液配制标曲最高浓度点，配制好后-80℃保存。具体过程如下表4(单位：ng/mL)：

表4标曲配制

上述试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物的应用也在本发明的保护范围之内。

具体检测方法如下：

超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物的方法，

所述抗癫痫药物分别为：左乙拉西坦(LTT)、10-羟卡马西平(HCBZ)、卡马西平(CBZ)、奥卡西平(OCP)、苯妥英(PHT)、拉莫三嗪(LMT)、丙戊酸(VPA)、苯巴比妥(PBB)、托吡酯(TPM)、氯硝西泮(CNP)

上述抗癫痫药物对应的同位素内标物分别为：左乙拉西坦-d3(LTT-d3)、10-羟卡马西平-d4(HCBZ-d4)、卡马西平-d2,15N(CBZ-d2,15N)、奥卡西平-d4(OCP-d4)、苯妥英-d10(PHT-d10)、拉莫三嗪-13C3(LMT-13C3)、丙戊酸-d6(VPA-d6)、苯巴比妥-d5(PBB-d5)、托吡酯-d12(TPM-d12)、氯硝西泮-d4(CNP-d4)

采用超高效液相色谱串联质谱技术检测经过预处理的血清中的上述抗癫痫药物，先利用超高效液相色谱将目标待测物与血清基质中的干扰组分进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为X轴，标准品与内标物的峰面积比为Y轴，建立校准曲线，计算血清中抗癫痫药物的含量，具体色谱条件为：

(1)超高效液相色谱条件：

色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；

采用流动相A和流动相B为混合流动相进行梯度洗脱的方式，流动相A和流动相B的初始比例为92:8，在0-3.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由92:8匀速渐变至35:65；在3.0-3.5分钟内，流动相A和流动相B的体积比由35:65匀速渐变至2:98；在3.5-6.0分钟内，流动相A和流动相B的体积比由2:98变至92:8，流速为0.3mL/min，每个样品采集时间为6.0min，柱温为45℃，进样体积为1μL；

(2)质谱条件：

在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负离子切换扫描；喷雾电压ESI+(3.0kV)，ESI-(2.5kV)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了各目标物及其对应同位素内标。

为了改善色谱分离选择性，可以考虑调节流动相的极性。本发明在流动相A中添加了甲酸和甲酸铵，可有效提高某些目标化合物的离子化效率，在其他条件的配合下，较现有技术中采用LC-MS/MS方法检测血清中抗癫痫药物的灵敏度更高，前处理过程简单，成本低，且灵敏度高、特异性强，5min之内完成抗癫痫药物的分离和检测。在不影响本发明效果的情况下，在一种优选方案中，流动相A为0.01％～0.2％甲酸0.1mM～10mM甲酸铵水溶液。在一种更优选方案中，流动相A为0.1％甲酸2mM甲酸铵水溶液。

在色谱法中，色谱柱的选择十分重要，对色谱柱的要求：柱效高、选择性好，分析速度快等。本发明采用0.01％～0.2％甲酸0.1mM～10mM甲酸铵水溶液和乙腈作为流动相，色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)，在其他条件的配合下，内源性物质不干扰样品的测定，灵敏度高、特异性强、成本低且前处理过程简单，6.0min之内可完成分离和检测，精密度及准确度均满足要求。

在采用内标法时，内标物的选择是一项十分重要的工作。理想的内标物应当能以准确、已知的量加到样品中去，和被分析的样品有基本相同或尽可能一致的物理化学性质、色谱行为和响应特征；在色谱分析条件下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。本发明分别采用左乙拉西坦-d3(LTT-d3)、10-羟卡马西平-d4(HCBZ-d4)、卡马西平-d2,15N(CBZ-d2,15N)、奥卡西平-d4(OCP-d4)、苯妥英-d10(PHT-d10)、拉莫三嗪-13C3(LMT-13C3)、丙戊酸-d6(VPA-d6)、苯巴比妥-d5(PBB-d5)、托吡酯-d12(TPM-d12)、氯硝西泮-d4(CNP-d4)作为内标，氘代内标和待测物具有相同的保留时间、化学性质和基质效应，测定血清中抗癫痫药物时的重现性、准确度均较好。

在一种方案中，流速为0.1～0.4mL/min，优选为0.3mL/min。

进一步地，柱温为35～50℃，优选为45℃。

更进一步地，进样体积为1～5μL，优选为1μL。

在一种优选方案中，采用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物时，具体色谱条件为：

(1)高效液相色谱条件：

流动相A：0.1％甲酸2mM甲酸铵-水溶液；

流动相B：乙腈；

色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)；

采用梯度洗脱的方式，见表5；流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL；

表5流动相梯度洗脱参数

时间(min)	流速(mL/min)	％A	％B	Curve
					0.0	0.3	92	8	-
3.0	0.3	35	65	6
					3.5	0.3	2	98	6
6.0	0.3	92	8	1

(2)质谱条件：

在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负离子切换扫描；喷雾电压ESI+(3.0kV)，ESI-(2.5kV)；源温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测了抗癫痫药物及其对应同位素内标，各目标待测物的质谱采集参数见表6。

表6抗癫痫药物质谱参数

本发明提及的血清为人或动物血清。

在一种方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：向血清中加入含内标的蛋白沉淀剂，再振荡离心后取上清液；所述含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成。蛋白质沉淀剂为甲醇与乙腈混合溶液；优选地，甲醇与乙腈混合溶液中甲醇与乙腈的体积比为1:1～5。

在一种优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂，高速振荡(最大振速)5min；在12000～15000r/min，1～5℃离心4～10min后，取60μL上清液，待进样。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂体积比为0.1～0.3：19.7～19.9。

在一种更优选方案中，经过预处理的血清按照如下方法制备：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:3)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。其中含内标的蛋白沉淀剂是由混合内标溶液与蛋白沉淀剂混合配制而成，混合内标溶液与蛋白沉淀剂体积为0.2：19.8，下同。

在一种方案中，含内标的蛋白沉淀剂按照如下方法制备：

将含有LTT-d3 1mg/mL、HCBZ-d4 1mg/mL、CBZ-d2,15N 1mg/mL、OCP-d4 2mg/mL、PHT-d10 1mg/mL、VPA-d6 5mg/mL、TPM-d12 1mg/mL、CNP-d4 0.1mg/mL、LMT-13C3 1mg/mL、PBB-d5 1mg/mL母液用80％甲醇水溶液配制成包含LTT-d3 20000ng/mL、HCBZ-d4 5000ng/mL、CBZ-d2,15N 10000ng/mL、OCP-d4 20000ng/mL、PHT-d10 20000ng/mL、VPA-d6100000ng/mL、TPM-d12 20000ng/mL、CNP-d4 500ng/mL、LMT-13C3 5000ng/mL、PBB-d51000ng/mL的混合内标溶液。取200μL上述混合内标溶液加入至19.8mL蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:3)中，即得含内标的蛋白沉淀剂。

在一种方案中，标准品溶液按照如下方法制备：

分别将抗癫痫药物母液，浓度分别为LTT 20mg/mL、CBZ 10mg/mL、PHT 20mg/mL、LMT 10mg/mL、CNP 1mg/mL、HCBZ 5mg/mL、OCP 5mg/mL、VPA 50mg/mL、PBB 10mg/mL、TPM20mg/mL，用80％甲醇配制成含LTT 1000000ng/mL、CBZ 500000ng/mL、PHT 1000000ng/mL、LMT 200000ng/mL、CNP 5000ng/mL、HCBZ 200000ng/mL、OCP 1000000ng/mL、VPA5000000ng/mL、PBB 2000000ng/mL、TPM 1000000ng/mL标准品溶液。

将上述混合标准品溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液，所述校准品溶液的七个浓度点为：

CNP：0.5ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、12.5ng/mL、25ng/mL、125ng/mL、250ng/mLVPA：500ng/mL、1250ng/mL、2500ng/mL、12500ng/mL、25000ng/mL、125000ng/mL、250000ng/mL

PBB：200ng/mL、500ng/mL、1000ng/mL、5000ng/mL、10000ng/mL、50000ng/mL、100000ng/mL。

每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:3)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

在一种方案中，质控品按照如下方法制备：取上述混合标准溶液以无抗癫痫药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)：

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

一、实验材料与仪器

1.材料

试剂盒研究实验的样本来自上海中山医院2019年11月份门诊收集的血清样本。

(1)仪器：Xevo TQ-S三重四级杆质谱仪(Waters Corporation)；UPLC I-Class超高效液相色谱系统(配自动进样器，Waters Corporation)；SCILOGEX D2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(ELGA LabWater，英国)；多管涡旋混合仪(Vortex genie2，美国)；可调移液器(Eppendorf 0.5～10μL，10～100μL，100～1000μL)；玻璃仪器、量筒等。

(2)试剂耗材：MS级甲醇(Fisher，美国)；MS级乙腈(Fisher，美国)；HPLC级乙腈(Honeywell，美国)；MS级甲酸(Fisher，美国)；HPLC级甲醇(Honeywell，美国)；色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)。

(3)标准品：标准品及其对应的内标物，见下表7。

表7标准品和内标

序号	中文名称	厂家
			1	左乙拉西坦	TRC
2	左乙拉西坦-d3	TRC
			3	10-羟卡马西平	TRC
4	10-羟卡马西平-d4	TRC
			5	卡马西平	Dr.Ehrenstorfer
6	卡马西平-d2,15N	TRC
			7	奥卡西平	TRC
8	奥卡西平-d4	TRC
			9	苯妥英	Dr.Ehrenstorfer
10	苯妥英-d10	TRC
			11	拉莫三嗪	百灵威
12	拉莫三嗪-13C3	TRC
			13	丙戊酸	TRC
14	丙戊酸-d6	TRC
			15	苯巴比妥	Cerilliant
16	苯巴比妥-d5	TRC
			17	托吡酯	TRC
18	托吡酯-d12	TRC
			19	氯硝西泮	Cerilliant
20	氯硝西泮-d4	Sigma

(4)质控品：含有抗癫痫药物的空白血清基质，分为低、中、高三个浓度，分别为QC(L)、QC(M)、QC(H)，如表1所示。

试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相A和B，左下方分别放置11个安瓿瓶，分别为标准液、质控品和混合内标溶液；右边放置25mL蛋白沉淀剂。

二、液质条件

(1)色谱条件：流动相A：0.1％甲酸2mM甲酸铵-水溶液；流动相B：乙腈。色谱柱型号：ACQUITY UPLC BEH C18(2.1×50mm，1.7μm)，采用梯度洗脱的方式，详见表5。流速为0.3mL/min，柱温为45℃，进样体积为1μL。

(2)质谱条件：在电喷雾电离(ESI)模式下，采用多反应监测(MRM)进行正负离子切换扫描；喷雾电压ESI+(3.0kV)，ESI-(2.5kV)；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800L/h，锥孔气流速为150L/h；同时监测各目标物以及同位素内标。各目标待测物的质谱采集参数见表6。

三、实验过程

(1)标准品配制：

分别将抗癫痫药物母液，浓度分别为LTT 20mg/mL、CBZ 10mg/mL、PHT 20mg/mL、LMT 10mg/mL、CNP 1mg/mL、HCBZ 5mg/mL、OCP 5mg/mL、VPA 50mg/mL、PBB 10mg/mL、TPM20mg/mL，用80％甲醇配制成含LTT 1000000ng/mL、CBZ 500000ng/mL、PHT 1000000ng/mL、LMT 200000ng/mL、CNP 5000ng/mL、HCBZ 200000ng/mL、OCP 1000000ng/mL、VPA5000000ng/mL、PBB 2000000ng/mL、TPM 1000000ng/mL标准品溶液。(详见表3)。

将上述混合标准品溶液以空白血清基质配制成七个不同浓度点的校准品溶液(详见表4)，各标曲点的浓度如表4中所列，所述校准品溶液的七个浓度点为：

(2)混合内标溶液配制

将含有LTT-d3 1mg/mL、HCBZ-d4 1mg/mL、CBZ-d2,15N 1mg/mL、OCP-d4 2mg/mL、PHT-d10 1mg/mL、VPA-d6 5mg/mL、TPM-d12 1mg/mL、CNP-d4 0.1mg/mL、LMT-13C3 1mg/mL、PBB-d5 1mg/mL母液用80％甲醇水溶液配制成包含LTT-d3 20000ng/mL、HCBZ-d45000ng/mL、CBZ-d2,15N 10000ng/mL、OCP-d4 20000ng/mL、PHT-d10 20000ng/mL、VPA-d6100000ng/mL、TPM-d12 20000ng/mL、CNP-d4 500ng/mL、LMT-13C3 5000ng/mL、PBB-d51000ng/mL的同位素混合内标溶液。(详见表2)。

(3)质控品配制：

取上述混合标准溶液以无抗癫痫药物的空白血清配制成三个不同浓度QC(L)、QC(M)、QC(H)，详见表1。

QC(M)中包含：LTT/PHT/OCP/TPM 2000ng/mL、CBZ1000 ng/mL、LMT/HCBZ 400ng/mL、CNP10 ng/mL、VPA10000 ng/mL、PBB4000 ng/mL

(4)样品处理

1)标准品前处理：每个浓度点样品取50μL于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1：3)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

2)血清样品前处理：取50μL血清于1.5mL离心管中，向其中加入200μL含内标的蛋白沉淀剂(甲醇与乙腈的体积比1:3)，高速振荡(最大振速)5min；在14000r/min，4℃离心5min；转移EP管中的上清液60μL至塑料内衬管中，进样量1μL。

3)质控品前处理：分别取质控品溶液QC(L)、QC(M)、QC(H)各50μL于1.5mL离心管中，然后与血清样品前处理一致，此处不再赘述。

分析试剂盒中各组分见表8。

表8抗癫痫药物分析试剂盒组分的制备(100人份)

四、方法验证

1.提取离子流色谱图：抗癫痫药物的标准品和血清样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为抗癫痫药物标准品的提取离子流谱图；图2为血清样本中抗癫痫药物的提取离子流色谱图。

2.校准曲线：采用同位素内标定量法，利用TargetLynx软件以标准物与内标物的浓度比为X轴，标准物与内标物峰面积比为Y轴，建立校准曲线，并计算出血清中待测物的浓度。抗癫痫药物在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.99以上，满足定量要求，见表9。

表9抗癫痫药物线性回归方程及线性相关系数

序号	化合物	保留时间(min)	线性范围(ng/mL)	线性方程	相关系数(r)
						1	LTT	1.5	100-50000	Y＝0.000757509X+0.00994791	0.999
2	HCBZ	2.29	20-10000	Y＝0.000142015X-0.000604281	0.990
						3	CBZ	2.88	50-25000	Y＝4.99326e-005X+0.000147965	0.998
4	OCP	2.6	100-50000	Y＝0.000135441X+3.31354e-005	0.998
						5	PHT	2.87	100-50000	Y＝0.000364933X+0.0119435	0.998
6	LMT	1.77	20-10000	Y＝0.000632911X+0.00193997	0.999
						7	VPA	3.47	500-250000	Y＝0.000135112X+0.00110046	0.996
8	PBB	2.49	200-100000	Y＝0.000905464X-0.039066	0.999
						9	TPM	2.72	100-50000	Y＝5.11742e-005X-0.000496442	0.992
10	CNP	3.09	0.5-250	Y＝2.57054X+0.16262	0.999

3.准确度考察：采用加标回收率试验评估方法的准确性。准备一混合空白血清样品，分别加入低、中、高3个浓度的混合标准品，以相同步骤重复处理测定5次，结果显示，抗癫痫药物的加标回收率在87.69％-107.64％之间，5次重复试验的RSD在1.7％-8.01％范围，统计结果见表10。

表10抗癫痫药物加标回收率结果

4.精密度试验：取无干扰空白血清样本，加入不同浓度抗癫痫药物标准品，得到低、中、高三个浓度血清样本，一天内重复处理6批，连续处理三天，以同位素内标法定量测定抗癫痫药物的浓度，批内精密度为1.37-13.12％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.74-12.73％，结果见表11。

表11批内批间精密度测试结果

本发明建立了ID-UPLC-MS/MS一同测定人体血清中抗癫痫药物的方法。血清用量少(仅需50μL)且前处理简单，且一针分析多种物质只需6min，简单快速。

采用同位素内标法定量不仅可以极大消除基质干扰，而且结果不受前处理过程、仪器响应波动等条件的影响，能够达到准确定量。以加标回收率试验评估方法的准确性，结果显示，抗癫痫药物的加标回收率为87.69％-107.64％之间，5次重复试验的RSD在1.7％-8.01％范围，准确度良好。

方法的重现性结果表明，抗癫痫药物批内精密度为1.37-13.12％，三日内分3批处理，计算批间精密度为2.74-12.73％，方法的重现性良好。

总之，该方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程简单，6min之内完成化合物的分离和检测，准确度及精密度满足要求，可用于临床上血清抗癫痫药物的定量分析，为相关的药物浓度监测提供一种可靠的检测方法。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可能对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims

1.一种血清中抗癫痫药物的检测试剂盒，其特征在于：所述抗癫痫药物包括：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮；

所述质控品包括浓度已知的由空白血清配制的左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的混合溶液；

所述蛋白质沉淀剂为甲醇和乙腈的混合液。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.01%~0.2%甲酸-0.1mM~10mM甲酸铵水溶液。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述流动相A为0.1%甲酸-2mM甲酸铵水溶液。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述校准品溶液包括以下7种混合液：

混合液1：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦100 ng/mL、10-羟卡马西平20ng/mL、卡马西平50 ng/mL、奥卡西平100 ng/mL、苯妥英100 ng/mL、拉莫三嗪20 ng/mL、丙戊酸500 ng/mL、苯巴比妥200 ng/mL、托吡酯100 ng/mL和氯硝西泮0.5 ng/mL；

混合液2：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦250 ng/mL、10-羟卡马西平50ng/mL、卡马西平125 ng/mL、奥卡西平250 ng/mL、苯妥英250 ng/mL、拉莫三嗪50 ng/mL、丙戊酸1250 ng/mL、苯巴比妥500 ng/mL、托吡酯250 ng/mL和氯硝西泮1.25 ng/mL；

混合液3：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦500 ng/mL、10-羟卡马西平100ng/mL、卡马西平250 ng/mL、奥卡西平500 ng/mL、苯妥英500 ng/mL、拉莫三嗪100 ng/mL、丙戊酸2500 ng/mL、苯巴比妥1000 ng/mL、托吡酯500 ng/mL和氯硝西泮2.5 ng/mL；

混合液4：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦2500 ng/mL、10-羟卡马西平500 ng/mL、卡马西平1250 ng/mL、奥卡西平2500 ng/mL、苯妥英2500 ng/mL、拉莫三嗪500ng/mL、丙戊酸12500 ng/mL、苯巴比妥5000 ng/mL、托吡酯2500 ng/mL和氯硝西泮12.5 ng/mL；

混合液5：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦5000 ng/mL、10-羟卡马西平1000 ng/mL、卡马西平2500 ng/mL、奥卡西平5000 ng/mL、苯妥英5000 ng/mL、拉莫三嗪1000 ng/mL、丙戊酸25000 ng/mL、苯巴比妥10000 ng/mL、托吡酯5000 ng/mL和氯硝西泮25ng/mL；

混合液6：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦25000 ng/mL、10-羟卡马西平5000 ng/mL、卡马西平12500 ng/mL、奥卡西平25000 ng/mL、苯妥英25000 ng/mL、拉莫三嗪5000 ng/mL、丙戊酸125000 ng/mL、苯巴比妥50000 ng/mL、托吡酯25000 ng/mL和氯硝西泮125 ng/mL；

混合液7：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦50000 ng/mL、10-羟卡马西平10000 ng/mL、卡马西平25000 ng/mL、奥卡西平50000 ng/mL、苯妥英50000 ng/mL、拉莫三嗪10000 ng/mL、丙戊酸250000 ng/mL、苯巴比妥100000 ng/mL、托吡酯50000 ng/mL和氯硝西泮250 ng/mL。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述混合内标溶液中左乙拉西坦-d3、10-羟卡马西平-d4、卡马西平-d2,15N、奥卡西平-d4、苯妥英-d10、拉莫三嗪-13C3、丙戊酸-d6、苯巴比妥-d5、托吡酯-d12、氯硝西泮-d4的浓度分别为左乙拉西坦-d3 20000 ng/mL、10-羟卡马西平-d4 5000 ng/mL、卡马西平-d2,15N 10000 ng/mL、奥卡西平-d4 20000 ng/mL、苯妥英-d10 20000 ng/mL、丙戊酸-d6 100000 ng/mL、托吡酯-d12 20000 ng/mL、氯硝西泮-d4 500 ng/mL、拉莫三嗪-13C3 5000 ng/mL、苯巴比妥-d5 1000 ng/mL。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:1~5。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白质沉淀剂中甲醇与乙腈的体积比1:3。

8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述质控品包括以下3种浓度配比的混合液：

低浓度质控品溶液：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦200 ng/mL、10-羟卡马西平40 ng/mL、卡马西平100 ng/mL、奥卡西平200 ng/mL、苯妥英200 ng/mL、拉莫三嗪40ng/mL、丙戊酸1000 ng/mL、苯巴比妥400 ng/mL、托吡酯200 ng/mL和氯硝西泮1 ng/mL；

中浓度质控品溶液：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦2000 ng/mL、10-羟卡马西平400 ng/mL、卡马西平1000 ng/mL、奥卡西平2000 ng/mL、苯妥英2000 ng/mL、拉莫三嗪400 ng/mL、丙戊酸10000 ng/mL、苯巴比妥4000 ng/mL、托吡酯2000 ng/mL和氯硝西泮10ng/mL；

高浓度质控品溶液：左乙拉西坦、10-羟卡马西平、卡马西平、奥卡西平、苯妥英、拉莫三嗪、丙戊酸、苯巴比妥、托吡酯和氯硝西泮的浓度分别为：左乙拉西坦20000 ng/mL、10-羟卡马西平4000 ng/mL、卡马西平10000 ng/mL、奥卡西平20000 ng/mL、苯妥英20000 ng/mL、拉莫三嗪4000 ng/mL、丙戊酸100000 ng/mL、苯巴比妥40000 ng/mL、托吡酯20000 ng/mL和氯硝西泮100 ng/mL。

9.权利要求1所述的试剂盒在利用超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗癫痫药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述混合内标溶液先和蛋白沉淀剂混合制成含内标的蛋白沉淀剂后再用于检测，混合内标溶液和蛋白沉淀剂的体积比为0.1~0.3：19.7~19.9。