CN111560055B

CN111560055B - 水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用

Info

Publication number: CN111560055B
Application number: CN202010396017.9A
Authority: CN
Inventors: 徐汉虹; 陈荣华; 林菲; 余迪雅
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2020-05-12
Filing date: 2020-05-12
Publication date: 2021-06-25
Anticipated expiration: 2040-05-12
Also published as: CN111560055A

Abstract

本发明公开了水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用。本发明发明人发现敲除水稻基因OsLAT3可抑制水稻对敌草快的吸收累积，降低水稻中敌草快含量，提高水稻对敌草快的抗性；也可以从遗传上调节水稻品种的对敌草快的吸收累积，选育抗敌草快水稻品种。

Description

水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用。

背景技术

水稻作为一种主要的经济作物，是全球人口的主要粮食，全世界约有22亿人以水稻为食。我国种植水稻历史悠久，地域广阔，是世界稻米主产国之一。在我国稻作区的水稻田中，杂草危害十分严重，它不仅干扰了水稻的正常生长，还诱导和传播水稻病虫害，影响着水稻产量和品质。传统人工除草方式耗时耗力、功效低，不适用于大面积水稻田除草；施用除草剂仍然是现在最省时省力有效防除稻田杂草的方法。因此，抗除草剂水稻的培育有巨大应用空间，目前，抗除草剂作物的获得主要是通过外源导入除草剂抗性基因实现，但存在着研发周期长、效率偏低、基因污染的问题。

敌草快，作为灭生性除草剂领域非常重要的品种之一，被广泛应用于大田、果园、非耕地除草。分离克隆控制水稻的敌草快吸收和转运基因和蛋白，通过基因编辑技术获得敌草快吸收功能缺失的敌草快抗性水稻品种，既能利用敌草快广谱见效快的特点来降低除草成本、提高除草简便性以及延长除草适期，又能利用敌草快遇土壤钝化的特点而减少对环境、地下水的污染，还能避免转基因抗除草剂作物的不足，更重要的是在保证除草效果的同时减少水稻中敌草快的残留量，降低对生物体的健康风险。因此，具有重要的经济价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用。

本发明的另一目的在于提供水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用，是基于本发明发明人发现敲除OsLAT3基因可以抑制水稻对敌草快的吸收累积，降低水稻中敌草快含量，提高水稻对敌草快的抗性。

所述的水稻基因OsLAT3编码的蛋白质，其氨基酸序列为下列A、B或C：

A.如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

B.以上A经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加(不超过10个)而获得的仍具有相同功能的衍生蛋白质的氨基酸序列；

C.以上A或B蛋白质的N段和/或C端连接标签得到的融合蛋白质的氨基酸序列。

所述的水稻基因OsLAT3，其核苷酸序列为下列D、E或F中的任意一种：

D.如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

E.与D所限定的核苷酸序列至少具有70％以上同源性，且编码如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸的核苷酸序列；

F.严格条件下与D所限定的核苷酸杂交，且编码如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸的核苷酸序列。

水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用。

A.如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

D.如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列；

所述的水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用，具体通过抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT3的表达量和/或活性，得到抗敌草快水稻品种。

所述的抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT3的表达量和/或活性的方法为基因定点编辑、RNA干扰、同源重组、基因敲除等本领域常规方法。

所述的基因敲除具体可为使出发植物含有CRISPR-Cas9系统，系统中含有识别靶标为出发植物的OsLAT3基因的sgRNA。

所述的靶标的序列如SEQ ID NO：5所示。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.敲除水稻基因OsLAT3可以抑制水稻对除草剂敌草快的吸收累积，减少水稻植株中敌草快的含量，降低对人体的健康风险。

2.敲除水稻基因OsLAT3可以从遗传上调节水稻对敌草快的吸收累积，提高水稻对敌草快的抗性，选育抗敌草快水稻品种。

3.本申请将敌草快吸收累积和抗性机理结合的手段为抗除草剂作物的研究提供一个很好的选择。

附图说明

图1为中花11和OsLAT3基因的突变体的序列比对结果图。

图2为中花11和OsLAT3基因的突变体的叶片离体浸泡敌草快后的表型图。

图3为中花11和OsLAT3基因的突变体的叶片中叶绿素总含量检测结果图。

图4为中花11和OsLAT3基因的突变体的叶片中敌草快含量的检测结果图。

图5为5mmol/L敌草快喷雾处理中花11后，不同时间OsLAT3基因的实时荧光定量PCR检测结果图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为从商业途径得到的试剂和材料。实施例中所使用的化学试剂均为进口或国产分析纯。

实施例中大肠杆菌DH5α和农杆菌EHA105为常用的菌株，可商业上购买得到；水稻品种为野生型中花11(公开使用的水稻品种，市售)。实施例中所使用的引物由深圳华大基因公司合成，测序在深圳华大基因公司进行。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1：CRISPR敲除构建OsLAT3突变体植株

1、利用CRISPR/Cas9系统，根据OsLAT3的外显子序列选择靶标序列

利用简单、高效的CRISPR/Cas9系统，根据OsLAT3外显子序列选择特异的靶标序列，靶标序列：5’-GCGCCGAGCAGGCCGTGAGCG-3’。靶标序列针对OsLAT3基因，特异的使OsLAT3蛋白失活。

2、构建含上述靶标序列片段的pCRISPR/Cas9重组载体

1)根据靶标序列，设计带粘性末端的接头引物

将设计的靶序列添加pCRISPR/Cas9系统的特异粘性末端接头，并合成完整的接头引物。

F1：5’-TGTGTGCGCCGAGCAGGCCGTGAGC-3’；

R1：5’-AAACGCTCACGGCCTGCTCGGCGCA-3’。

2)将带粘性末端的接头引物退火互补形成带粘性末端的双链小片段

将F1引物和R1引物稀释成浓度为10μM的溶液，各取10μL混匀，在PCR仪中进行退火反应，从98℃降至22℃，使F1引物和R1引物互补形成带粘性末端的双链小片段。

3)酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA(TAKARA Cat#632640)

用限制性内切酶BsaⅠ酶切包含sg-RNA的原始载体pOs-sgRNA，产生可以和靶标序列粘性末端互补的粘性末端。用BsaⅠ酶切pOs-sgRNA原始载体的体系为：10×buffer 2μL、BsaⅠ酶1μL、pOs-sgRNA载体4μg、ddH₂O补足至20μL，37℃酶切12h。酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳核查条带大小后，试剂盒(OMEGA Cat#D2500-02)过柱回收纯化酶切产物，得到酶切过的pOs-sgRNA载体，加入灭菌的ddH₂O溶解，测定浓度后待用。

4)将带粘性末端的双链小片段连接到酶切过的pOs-sgRNA载体上，形成包含靶标序列和sg-RNA的重组载体

用T4连接酶将步骤2)中的双链小片段和步骤3)中酶切过的pOs-sgRNA载体连接，形成完整的包含针对OsLAT3蛋白的靶序列和sg-RNA的重组载体。15μL连接体系为：10×T4ligation buffer 1.5μL、双链小片段4μL、酶切过的pOs-sgRNA载体3μL、T4 DNA ligase 1μL、ddH₂O补足至15μL，16℃连接12小时。连接产物转化大肠杆菌DH5α，卡那抗性LB平板过夜培养(含卡那霉素10mg/L)，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含靶标序列和sg-RNA的重组载体。

5)用LR mix将包含靶标序列和sg-RNA的重组载体与包含Cas9的载体pH-Ubicas9-7进行LR反应重组，形成包含靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体

用LR mix(上海北诺生物科技有限公司)将步骤4)得到的重组载体和包含Cas9的载体pH-Ubi-cas9-7(百格基因科技有限公司提供)进行LR反应重组。LR反应体系：包含靶标序列和sg-RNA的重组载体25-50ng、pH-Ubi-cas9-7载体75ng、5×LR Clonase TM buffer 1μL、TE Buffer(pH8.0)补充到4.5μL、LR ClonaseTM 0.5μL。将体系于25℃下温育2h，反应后加2μL 2μg/μL的Proteinase K，在37℃下处理10min，再将2μL反应产物转入大肠杆菌DH5α，庆大霉素抗性LB平板37℃过夜培养，挑选阳性菌株进行测序，得到测序正确的包含OsLAT3蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整pCRISPR/Cas9-OsLAT3重组表达载体。

3、将所获得的包含OsLAT3蛋白靶标序列-sg-RNA+Cas9的完整重组载体导入水稻愈伤组织中得到转基因植株

1)将步骤2获得的重组表达载体pCRISPR/Cas9-OsLAT3电击转入农杆菌EHA105中(Olivia C.D,2019)，得到重组菌AGL1/pCRISPR/Cas9-OsLAT3。

2)将重组菌AGL1/pCRISPR/Cas9-OsLAT3用农杆菌介导的方法转化中花11水稻愈伤组织，具体如下：

挑取AGL1/pCRISPR/Cas9-OsLAT3单菌落，接种于10mL的农杆菌培养基中(含卡那霉素50mg/L、利福平50mg/L)，28℃，180rpm摇床培养2-3天。取4mL菌液，4000rpm离心3min，倒去上清液，加入少量AAM培养基重新悬浮细胞，然后加入20mL的AAM培养基(含0.1mM乙酰丁香酮As)，28℃、150rpm摇床避光培养1-2h，培养至OD₆₀₀＝0.4左右。挑选生长状态良好、颗粒状中花11(以下也称为野生型水稻)水稻愈伤组织浸入农杆菌培养液(不含琼脂的YEP)中，28℃、150-200rpm摇20min，将愈伤组织倒出，用无菌滤纸吸干多余菌液，将愈伤组织平铺在含多层滤纸的无菌平皿中，超净台上吹干(愈伤分散不结块)，然后将愈伤组织转移到共培养培养基上，黑暗条件下培养2-3天。将愈伤转至含有100mg/L的潮霉素和400mg/L头孢霉素的NB基本培养基上筛选3-4周(一筛)。将成活的愈伤组织转入二筛培养基(含100mg/L潮霉素及200mg/L头孢霉素的NB基本培养基)上筛选3周。将抗性愈伤组织转入分化培养基(含100mg/L潮霉素)上进行分化，再生植株在含100mg/L潮霉素的壮苗培养基上生根后(约3-4周)转移至温室中，在T0代植株中就可以得到OsLAT3蛋白完全失活的转基因植株。

上述转化中所用的培养基如下：

共培养培养基(北京华越洋生物科技有限公司)：诱导愈伤及继代培养基+As(0.1mmol/L)+葡萄糖(10g/L)，pH 5.2。

农杆菌侵染水稻愈伤组织培养基(AAM培养基，北京华越洋生物科技有限公司)：AA大量元素+AA微量元素+AA氨基酸+MS维生素+水解酪蛋白(500mg/L)+蔗糖(68.5g/L)+葡萄糖(36g/L)+As(0.1mM)，pH 5.2。

NB基本培养基(北京华越洋生物科技有限公司)：N6大量元素+B5微量元素+B5有机成分+铁盐+水解酪蛋白(300mg/L)+脯氨酸(500mg/L)+蔗糖(30g/L)+琼脂(8g/L)，pH 5.8。

诱导愈伤及继代培养基：NB基本培养基+2，4-D(2mg/L)。

分化培养基：NB基本培养基+6-BA(3mg/L)+NAA(1mg/L)。

壮苗培养基：1/2MS培养基+NAA(0.5mg/L)+MET(0.25mg/L)。

农杆菌培养基(YEP)：10g/L胰化蛋白胨+10g/L酵母提取物+5g/L氯化钠+15g/L琼脂。

4、筛选转基因植株中的转基因阳性植株

将步骤3移栽的转基因植株(T₀代)提取DNA(OMEGA Cat#D3485-02)，进行靶序列位点检测，共检测到15株阳性植株。

5、利用转基因阳性植株获得突变体植株

1)突变位点的鉴定

将移栽的步骤4的阳性植株提取DNA(OMEGA Cat#D3485-02)，针对含靶标位点的500bp以内的DNA片段，设计特异性引物F2和R2，扩增含靶标位点的DNA片段，扩增得到的283bp PCR产物经纯化后送公司测序，测序结果与野生型植株序列比对，筛选出突变体植株。

F2:5’-AGATGATGAACAGCAAGGGC-3’；

R2:5’-GACGAAGCCGCCGTTCCCCG-3’。

2)将突变体植株进行繁种，于T1代转基因分离群体中检测不含潮霉素、Cas9等转基因元件的植株单株收种子，得到功能缺失突变体，分别命名为Crispr-1、Crispr-2和Crispr-3。功能缺失突变体与野生型植株的突变分析结果如图1所示。

实施例2：水稻对敌草快抗性试验

为了检测实施例1得到的功能缺失突变体水稻对敌草快的抗性，挑选在水稻培养箱生长30天的植株，剪取同等长度的叶片浸泡于20mL 0.1％(v/v)Silwet L-77(北京博奥拓达科技有限公司)溶液中(含5mmol/L敌草快)，静置于人工气候培养箱培养36h。36h后将水稻取出，用纯水清洗叶片4遍，确保完全清除叶片表面附着的药物，用滤纸擦干表面水分，观察表型并拍照后，用于后续试验。

测叶绿素含量的实验条件和方法按照文献(周勇，范晓磊，林拥军，陈浩.(2018).水稻叶绿素含量的测定.Bio-101e1010147.)。

测敌草快含量：称重记录，随后放入研钵中加液氮磨碎，加入5mL提取液(甲醇和1mol/L甲酸溶液按照体积比1:9配比)提取，涡旋5min，超声10min，4000rpm离心10min，吸取上清液过0.22μm的针头微孔滤膜除去杂质后，取500μL浓缩，定容(用100μL体积比为1:9的甲醇和1mol/L甲酸溶液的混合液)，装入进样瓶中，采用Waters ACQUITY TQD串联四极杆液质联用仪检测。

结果表明，浸泡敌草快后突变体植株叶片正常，而野生型叶片逐渐失绿发黄(图2)，突变体叶片的叶绿素含量比野生型中花11高(图3)，而敌草快的含量比野生型中花11明显降低(图4)。

实施例3敌草快处理水稻后的实时荧光定量试验

配制0.1％(v/v)Silwet L-77(北京博奥拓达科技有限公司)溶液(含5mmol/L敌草快)，对生长25天的野生型品种中花11植株进行喷雾处理，以0.1％(v/v)Silwet L-77溶液(不含药)处理作为对照。处理后分别提取0、2、4、9h的地上部分(茎和叶)RNA(OMEGA Cat#R6827-02)，反转录(Takara,PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser)后进行实时荧光定量PCR以检测OsLAT3基因的表达。实验设三次重复，结果取平均值。

实时荧光定量PCR使用Bio-Rad CFX96进行。PCR反应体系(20μL)按照产品使用说明书SYBR Green Real-Time PCR Master Mix reagent(Takara)进行，具体体系如下：10μLSYBR Green Real-Time PCR Master Mix、2μL上下游引物混合物(上下游引物浓度均为10μM)、7μL RNase-free water、1μL cDNA模板。具体反应程序如下：酶热激活95℃、30s，1个循环；变性95℃、5s，延伸60℃、30s，共40个循环。

扩增OsLAT3基因的引物序列为：

F3：5’-TGATGAACAGCAAGGGCACC-3’；

R3：5’-AGAAGACGAGCGGGAGTAGC-3’。

以UBQ2作为内参基因，扩增内参UBQ2的引物序列为：

F4：5’-TGCTATGTACGTCGCCATCCAG-3’；

R4：5’-AATGAGTAACCACGCTCCGTCA-3’。

数据的处理采用Comparative Ct的方法，即Ct值为PCR管中荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数，ΔCt＝Ct(OsLAT3)-Ct(ACTIN1)，以2^－△△Ct的值衡量基因转录水平，对样品中OsLAT3基因的表达进行分析比较。

结果如图5所示，在敌草快处理条件下，水稻地上部分(茎和叶)中OsLAT3基因的特异性表达受到诱导，且随着时间的推移上调愈发强烈。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 526

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Glu Leu Thr Met Asp Gln Glu Ile Gln Leu Asn Gln Arg Pro

1 5 10 15

Ser Pro Gln Arg Gln Gln Gln Ala Gln Glu His Gly Gly Ala Thr Ala

20 25 30

Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Gln Asp Asp Glu Gln Gln Gly His

35 40 45

Gln Ala Ala Val Ala Arg His Gly Cys Gly Gly Ala Thr Ala Glu Arg

50 55 60

His His Gln Thr Lys Leu Thr Leu Leu Pro Leu Val Phe Phe Ile Tyr

65 70 75 80

Phe Glu Val Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Ala Glu Gln Ala Val Ser Ala

85 90 95

Ala Gly Pro Leu Phe Ala Leu Leu Gly Phe Leu Ala Phe Pro Phe Ala

100 105 110

Trp Gly Val Pro Val Ser Leu Val Thr Ala Glu Leu Ala Ala Ala Leu

115 120 125

Pro Gly Asn Gly Gly Phe Val Val Trp Ala Asp Arg Ala Phe Gly Pro

130 135 140

Leu Ala Gly Ser Leu Leu Gly Thr Trp Lys Tyr Leu Ser Cys Val Ile

145 150 155 160

Asn Leu Ala Ala Phe Pro Ala Leu Val Ala Asp Tyr Leu Gly Arg Val

165 170 175

Ala Pro Ala Val Ala Val Pro Gly Ser Arg Ala Arg Thr Gly Thr Val

180 185 190

Leu Gly Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Leu Asn Leu Gly Gly Leu Ser

195 200 205

Ile Val Gly Trp Gly Ala Val Ala Leu Gly Phe Val Ser Leu Ala Pro

210 215 220

Phe Val Leu Met Thr Ala Met Ala Ala Pro Arg Thr Arg Pro Arg Arg

225 230 235 240

Trp Ala Ala Arg Val Gln Val Lys Gly Lys Arg Asp Trp Arg Leu Phe

245 250 255

Phe Asn Thr Leu Phe Trp Asn Leu Asn Tyr Trp Asp Ser Ala Ser Thr

260 265 270

Met Ala Gly Glu Val Glu Arg Pro Glu Arg Thr Phe Pro Arg Ala Leu

275 280 285

Ala Val Ala Val Val Leu Ile Ala Val Ser Tyr Leu Leu Pro Leu Met

290 295 300

Ala Ala Val Gly Ala Thr Asp Ala Pro Pro Glu Ala Trp Glu Asn Gly

305 310 315 320

Tyr Leu Ala Asp Ala Ala Gly Ile Ile Gly Gly Arg Trp Leu Lys Tyr

325 330 335

Trp Thr Glu Ala Gly Ala Val Leu Ser Ser Val Gly Leu Phe Glu Ala

340 345 350

Gln Leu Ser Ser Gly Ala Phe Gln Leu Leu Gly Met Ala Glu Leu Gly

355 360 365

Leu Leu Pro Ser Val Phe Ala Arg Arg Gly Pro Gly Arg Ser Ala Thr

370 375 380

Pro Trp Val Ala Val Ala Ala Ser Ala Ala Val Ser Val Ala Val Ser

385 390 395 400

Phe Leu Gly Phe Asp Asp Val Val Ala Thr Ala Asn Leu Leu Tyr Ser

405 410 415

Leu Gly Ala Leu Leu Glu Phe Ala Ala Phe Leu Arg Leu Arg Ala Arg

420 425 430

Glu Glu Ser Pro Ser Ser Leu Lys Arg Pro Tyr Arg Val Pro Leu Pro

435 440 445

Leu Pro Ala Leu Ala Ala Met Cys Leu Val Pro Ser Ala Phe Leu Ala

450 455 460

Tyr Val Val Ala Val Ala Gly Trp Arg Val Ser Ala Val Ala Ala Ala

465 470 475 480

Leu Thr Ala Leu Gly Val Gly Trp His Gly Ala Met Arg Val Cys Arg

485 490 495

Ser Arg Lys Trp Leu Arg Phe Asn Thr Ala Val Ala Ala Asp His Arg

500 505 510

Leu Gln Leu Gln Asp Ala Pro Pro Pro Pro Ala Gly Arg Val

515 520 525

<210> 2

<211> 547

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ser Glu Leu Thr Met Asp Gln Glu Ile Gln Leu Asn Gln Arg Pro

1 5 10 15

Ser Pro Gln Arg Gln Gln Gln Ala Gln Glu His Gly Gly Ala Thr Ala

20 25 30

Pro Ala Pro Ala Pro Ala Thr Pro Gln Asp Asp Glu Gln Gln Gly His

35 40 45

Gln Ala Ala Val Ala Arg His Gly Cys Gly Gly Ala Thr Ala Glu Arg

50 55 60

His His Gln Thr Lys Leu Thr Leu Leu Pro Leu Val Phe Phe Ile Tyr

65 70 75 80

Phe Glu Val Ala Gly Gly Pro Tyr Gly Ala Glu Gln Ala Val Ser Ala

85 90 95

Ala Gly Pro Leu Phe Ala Leu Leu Gly Phe Leu Ala Phe Pro Phe Ala

100 105 110

Trp Gly Val Pro Val Ser Leu Val Thr Ala Glu Leu Ala Ala Ala Leu

115 120 125

Pro Gly Asn Gly Gly Phe Val Val Trp Ala Asp Arg Ala Phe Gly Pro

130 135 140

Leu Ala Gly Ser Leu Leu Gly Thr Trp Lys Tyr Leu Ser Cys Val Ile

145 150 155 160

Asn Leu Ala Ala Phe Pro Ala Leu Val Ala Asp Tyr Leu Gly Arg Val

165 170 175

Ala Pro Ala Val Ala Val Pro Gly Ser Arg Ala Arg Thr Gly Thr Val

180 185 190

Leu Gly Met Thr Val Phe Leu Ser Phe Leu Asn Leu Gly Gly Leu Ser

195 200 205

Ile Val Gly Trp Gly Ala Val Ala Leu Gly Phe Val Ser Leu Ala Pro

210 215 220

Phe Val Leu Met Thr Ala Met Ala Ala Pro Arg Thr Arg Pro Arg Arg

225 230 235 240

Trp Ala Ala Arg Val Gln Val Lys Gly Lys Arg Asp Trp Arg Leu Phe

245 250 255

Phe Asn Thr Leu Phe Trp Asn Leu Asn Tyr Trp Asp Ser Ala Ser Thr

260 265 270

Met Ala Gly Glu Val Glu Arg Pro Glu Arg Thr Phe Pro Arg Ala Leu

275 280 285

Ala Val Ala Val Val Leu Ile Ala Val Ser Tyr Leu Leu Pro Leu Met

290 295 300

Ala Ala Val Gly Ala Thr Asp Ala Pro Pro Glu Ala Trp Glu Asn Gly

305 310 315 320

Tyr Leu Ala Asp Ala Ala Ala Thr Lys Leu Val Arg Asn Leu Lys Gly

325 330 335

Pro Ala Thr Ser Ile Pro Leu Tyr Gln Asn Tyr Asn Ser Leu His His

340 345 350

Arg Arg Ala Val Ala Gln Val Leu Asp Gly Gly Arg Arg Gly Ala Leu

355 360 365

Leu Arg Arg Val Val Arg Ser Ala Ala Glu Gln Arg Arg Val Pro Ala

370 375 380

Pro Arg His Gly Gly Ala Gly Pro Pro Pro Leu Arg Leu Arg Pro Pro

385 390 395 400

Arg Pro Arg Thr Ile Arg His Pro Val Gly Arg Arg Arg Arg Leu Arg

405 410 415

Arg Arg Leu Gly Arg Arg Leu Leu Pro Arg Leu Arg Arg Arg Arg Arg

420 425 430

His Arg Gln Pro Ala Leu Gln Pro Arg Arg Ala Ala Arg Val Arg Arg

435 440 445

Leu Pro Pro Ala Pro Arg Glu Gly Gly Glu Pro Leu Leu Ala Gln Ala

450 455 460

Pro Leu Pro Arg Pro Ala Ala Ala Pro Arg Ala Arg Arg His Val Pro

465 470 475 480

Arg Ala Val Gly Val Pro Gly Val Arg Gly Arg Arg Arg Arg Val Glu

485 490 495

Gly Leu Arg Arg Arg Arg Arg Ala His Gly Pro Arg Arg Arg Leu Ala

500 505 510

Arg Arg His Glu Gly Val Gln Val Gln Glu Val Ala Gln Val Gln His

515 520 525

Arg Gly Cys Arg Arg Pro Ser Ser Ala Thr Thr Arg Cys Ser Ser Ser

530 535 540

Ser Cys Trp

545

<210> 3

<211> 1581

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagtgagc tcaccatgga ccaagaaatc caactgaacc agaggccatc gccgcagcga 60

cagcaacaag cacaagaaca tggcggcgcc accgcaccgg cgccggcgcc ggcgacgcca 120

caagatgatg aacagcaagg gcaccaagca gctgtcgcca ggcatggctg cggcggcgcg 180

acagccgaac gccaccacca gaccaagctc acgctactcc cgctcgtctt cttcatctac 240

ttcgaggtgg ccggcggccc gtacggcgcc gagcaggccg tgagcgcggc gggcccgctg 300

ttcgcgctgc tcggcttcct cgccttcccc ttcgcgtggg gcgtcccggt gtcgctcgtc 360

accgcagagc tcgccgccgc gctcccgggg aacggcggct tcgtcgtctg ggccgaccgc 420

gccttcggcc cgctcgccgg ctccctgctc ggcacgtgga agtacctcag ctgcgtcatc 480

aacctcgccg cgttcccggc cctcgtcgcc gactacctcg gccgcgtcgc cccggcggtc 540

gccgtcccgg gaagcagggc gcgcacgggc acggtgctcg gcatgaccgt cttcctctcc 600

ttcctcaact tgggcggcct aagcattgtc gggtggggcg cggtggccct ggggttcgtg 660

tcgctggcgc cgttcgtgct gatgacggcg atggcggcgc cgaggacgcg gccgcggcgg 720

tgggcggcgc gggtgcaggt gaaggggaag agagactgga ggctcttctt caacacgctc 780

ttctggaacc tcaactactg ggacagcgcg agcaccatgg ccggcgaggt ggagcggccg 840

gagcggacgt tcccgcgggc gctcgcggtg gcggtggtgc tcatcgccgt cagctacctg 900

ctgccgctca tggcggcggt cggcgccacg gacgcgccgc cggaggcgtg ggagaacggc 960

tacttggctg acgcagcagg catcatcggc gggcggtggc tcaagtactg gacggaggcc 1020

ggcgcggtgc tctcctccgt cgggttgttc gaagcgcagc tgagcagcgg cgcgttccag 1080

ctcctcggca tggcggagct gggcctcctc ccctccgtct tcgcccgccg cggccccgga 1140

cgatccgcca ccccgtgggt cgccgtcgcc gcctccgccg ccgtctcggt cgccgtctcc 1200

ttcctcggct tcgacgacgt cgtcgccacc gccaacctgc tctacagcct cggcgcgctg 1260

ctcgagttcg ccgccttcct ccggctccgc gcgagggagg agagcccctc ctcgctcaag 1320

cgcccctacc gcgtcccgct gccgctcccc gcgctcgccg ccatgtgcct cgtgccgtcg 1380

gcgttcctgg cgtacgtggt cgccgtcgcc gggtggaggg tctccgccgt cgccgccgcg 1440

ctcacggccc tcggcgtcgg ctggcacggc gccatgaggg tgtgcaggtc caggaagtgg 1500

ctcaggttca acaccgcggt tgccgccgac catcgtctgc aactacaaga tgctcctcct 1560

cctcctgctg gtagagtctg a 1581

<210> 4

<211> 1644

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgagtgagc tcaccatgga ccaagaaatc caactgaacc agaggccatc gccgcagcga 60

cagcaacaag cacaagaaca tggcggcgcc accgcaccgg cgccggcgcc ggcgacgcca 120

caagatgatg aacagcaagg gcaccaagca gctgtcgcca ggcatggctg cggcggcgcg 180

acagccgaac gccaccacca gaccaagctc acgctactcc cgctcgtctt cttcatctac 240

ttcgaggtgg ccggcggccc gtacggcgcc gagcaggccg tgagcgcggc gggcccgctg 300

ttcgcgctgc tcggcttcct cgccttcccc ttcgcgtggg gcgtcccggt gtcgctcgtc 360

accgcagagc tcgccgccgc gctcccgggg aacggcggct tcgtcgtctg ggccgaccgc 420

gccttcggcc cgctcgccgg ctccctgctc ggcacgtgga agtacctcag ctgcgtcatc 480

aacctcgccg cgttcccggc cctcgtcgcc gactacctcg gccgcgtcgc cccggcggtc 540

gccgtcccgg gaagcagggc gcgcacgggc acggtgctcg gcatgaccgt cttcctctcc 600

ttcctcaact tgggcggcct aagcattgtc gggtggggcg cggtggccct ggggttcgtg 660

tcgctggcgc cgttcgtgct gatgacggcg atggcggcgc cgaggacgcg gccgcggcgg 720

tgggcggcgc gggtgcaggt gaaggggaag agagactgga ggctcttctt caacacgctc 780

ttctggaacc tcaactactg ggacagcgcg agcaccatgg ccggcgaggt ggagcggccg 840

gagcggacgt tcccgcgggc gctcgcggtg gcggtggtgc tcatcgccgt cagctacctg 900

ctgccgctca tggcggcggt cggcgccacg gacgcgccgc cggaggcgtg ggagaacggc 960

tacttggctg acgcagcagc gacgaagctt gtgaggaatc tcaagggacc agctacaagt 1020

attccactct accaaaacta caattcactg catcatcggc gggcggtggc tcaagtactg 1080

gacggaggcc ggcgcggtgc tctcctccgt cgggttgttc gaagcgcagc tgagcagcgg 1140

cgcgttccag ctcctcggca tggcggagct gggcctcctc ccctccgtct tcgcccgccg 1200

cggccccgga cgatccgcca ccccgtgggt cgccgtcgcc gcctccgccg ccgtctcggt 1260

cgccgtctcc ttcctcggct tcgacgacgt cgtcgccacc gccaacctgc tctacagcct 1320

cggcgcgctg ctcgagttcg ccgccttcct ccggctccgc gcgagggagg agagcccctc 1380

ctcgctcaag cgcccctacc gcgtcccgct gccgctcccc gcgctcgccg ccatgtgcct 1440

cgtgccgtcg gcgttcctgg cgtacgtggt cgccgtcgcc gggtggaggg tctccgccgt 1500

cgccgccgcg ctcacggccc tcggcgtcgg ctggcacggc gccatgaggg tgtgcaggtc 1560

caggaagtgg ctcaggttca acaccgcggt tgccgccgac catcgtctgc aactacaaga 1620

tgctcctcct cctcctgctg gtag 1644

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 靶标序列

<400> 5

gcgccgagca ggccgtgagc g 21

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F1

<400> 6

tgtgtgcgcc gagcaggccg tgagc 25

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R1

<400> 7

aaacgctcac ggcctgctcg gcgca 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F2

<400> 8

agatgatgaa cagcaagggc 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R2

<400> 9

gacgaagccg ccgttccccg 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F3

<400> 10

tgatgaacag caagggcacc 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R3

<400> 11

agaagacgag cgggagtagc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> F4

<400> 12

tgctatgtac gtcgccatcc ag 22

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> R4

<400> 13

aatgagtaac cacgctccgt ca 22

Claims

1.水稻基因OsLAT3在调节敌草快的吸收累积中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsLAT3编码的蛋白质，其氨基酸序列为下列A；所述的水稻基因OsLAT3，其核苷酸序列为下列D；

A.如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；

D.如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

2.水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的水稻基因OsLAT3编码的蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如权利要求1所述。

3.根据权利要求2所述的水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，具体通过抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT3的表达量和/或活性，得到抗敌草快水稻品种。

4.根据权利要求3所述的水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的抑制出发植物水稻中蛋白质OsLAT3的表达量和/或活性的方法为本领域常规方法基因定点编辑、RNA干扰、同源重组、基因敲除。

5.根据权利要求4所述的水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的基因敲除具体为使出发植物含有CRISPR-Cas9系统，系统中含有识别靶标为出发植物的OsLAT3基因的sgRNA。

6.根据权利要求4所述的水稻基因OsLAT3在培育抗敌草快水稻品种中的应用，其特征在于，所述的靶标的序列如SEQ ID NO：5所示。