CN111557943A

CN111557943A - Pd0332991联合奥希替尼在制备治疗nsclc药物中的应用

Info

Publication number: CN111557943A
Application number: CN202010365470.3A
Authority: CN
Inventors: 陈军; 刘红雨; 李永文; 刘超; 张洪兵; 张子禾; 施睿峰; 刘明辉; 李昕
Original assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Current assignee: Tianjin Medical University General Hospital
Priority date: 2020-04-30
Filing date: 2020-04-30
Publication date: 2020-08-21

Abstract

本发明公开了一种PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用，将PD0332991与奥希替尼联用，可以诱导奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR细胞周期S期阻滞，进而降低奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR的活力和迁移率，有效地逆转了H1975AR细胞株的耐药性。

Description

PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用

技术领域

本发明涉及非小细胞肺癌治疗技术领域，更具体地说是涉及PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用。

背景技术

肺癌是世界上最常见的癌症以及癌症死亡的主要原因，2018年全世界肺癌新发病例和死亡病例占所有恶性肿瘤之首。肺癌主要分为非小细胞肺癌(non-small cell lungcancer,NSCLC)和小细胞肺癌(small cell lung cancer,SCLC)，其中以NSCLC为主，约占所有肺癌的85％。NSCLC包括腺癌、鳞状细胞癌、大细胞癌、腺鳞癌等病理类型，其中以肺腺癌最为常见，约占所有肺癌的30％-35％。目前，肺癌的主要治疗手段包括手术治疗、化学治疗、放射治疗和靶向治疗。虽然肺癌的诊疗技术迅猛发展，但其5年生存率并没有显著提高，依旧低于15％，主要是由于肺癌的复发和转移，使大部分患者失去手术治疗的机会，也影响了化学治疗、放射治疗的效果。靶向药物的出现为肺癌患者带来了曙光，靶向治疗具有特异性强、不良反应轻的特点，成为晚期NSCLC患者最重要的治疗手段，极大地改善了驱动基因阳性NSCLC患者的预后。

靶向药物能够与肿瘤细胞特异性结合，达到杀灭肿瘤细胞的同时又不损伤机体正常细胞的效果。NSCLC最常见的突变是表皮生长因子受体(epidermal growth factorreceptor,EGFR)基因突变，肺腺癌患者EGFR突变率高达52％。EGFR是原癌基因C-ErbB的表达产物，也是上皮源性恶性肿瘤的重要组成分子，与肿瘤的生长、侵袭、转移密切相关。表皮生长因子络氨酸激酶抑制剂(epidermal growth factor receptor tyrosine kinaseinhibitors,EGFR-TKIs)可竞争性结合EGFR酪氨酸激酶区域的三磷酸腺苷结合位点，抑制其酪氨酸激酶活性，从而消灭肿瘤细胞。第一代EGFR-TKIs包括吉非替尼(Gefitinib)及厄洛替尼(Erlotinib)，第二代EGFR-TKIs包括阿法替尼(Afatinib)和达克替尼(Dacomitinib)，第三代EGFR-TKIs主要是奥希替尼(Osimertinib)。第一代EGFR-TKIs对EGFR敏感突变型NSCLC患者疗效显著，多项研究表明EGFR-TKIs作为一线治疗晚期NSCLC的效果比传统化疗更好，但几乎所有患者都难以避免发生获得性耐药，在9-14个月出现疾病进展。获得性耐药是指患者对药物的耐药性逐渐增高，药物的治疗效果下降，肿瘤发生进展。一代EGFR-TKIs获得性耐药的机制有很多种，目前已知的耐药机制有T790M突变、MET基因扩增、K-Ras基因突变、EGFR下游信号分子活化、旁路激活以及表型转化等，其中T790M突变最为常见，50％以上的获得性耐药患者会出现T790M突变。第三代EGFR-TKIs奥希替尼(Osimertinib)主要是针对T790M突变患者。奥希替尼为服用一代EGFR-TKIs药物出现T790M突变获得性耐药的患者带来了新曙光，但仍然无法避免出现耐药，第三代EGFR-TKIs获得性耐药更是无靶向药物可更换。

因此，如何逆转奥希替尼的耐药性是本领域技术人员亟需解决的技术问题。

发明内容

有鉴于此，本发明通过体外实验探索PD033299联合奥希替尼能否增加奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR细胞株对Osimertinib敏感性，逆转其耐药，同时通过建立动物模型进行体内验证，结果表明，PD0332991与奥希替尼联合应用能够克服H1975AR对奥希替尼的耐药作用，联合用药在克服第三代EGFR-TKIs奥希替尼耐药中具有显著的效果。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用。

以上技术方案达到的技术效果是：帕博西尼(Palbociclib,PD0332991)是首个被获批上市的CDK4/6抑制剂，能靶向CDK4/6，有效抑制CDK4/6和cyclin D1活性，将PD0332991与奥希替尼联用，可以诱导奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR细胞周期S期阻滞，进而降低奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR的活力和迁移率，有效地逆转了H1975AR细胞株的耐药性。

作为本发明优选的技术方案，所述PD0332991在药物中的浓度为6-8μmol/L，所述奥希替尼在药物中的浓度为6-8μmol/L。

作为本发明优选的技术方案，可以降低H1975AR细胞中VCAN基因的表达量。

以上技术方案达到的技术效果是：通过对比单独奥西替尼处理组和PD0332991联合奥西替尼处理组RNA-seq高通量数据结果，筛选出来TOP10差异基因，通过Real-time PCR技术在上述两个处理组进行验证，发现，除了VCAN表达量比较高而且差异最为明显外，其他9个差异基因在两组的表达都相对比较低。因此推测VCAN可能在PD0332991联合奥西替尼逆转耐药细胞的耐药性扮演重要作用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开将PD0332991与第三代EGFR-TKIs药物联用，克服了耐药性肺癌细胞的耐药性，为非小细胞肺癌的治疗提供了奠定了基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1-1附图为不同浓度的Osimertinib抑制H1975细胞增殖示意图；

图1-2附图为不同浓度的Osimertinib抑制H1975AR细胞增殖示意图；

图2-1附图为不同浓度的PD0332991抑制H1975细胞增殖示意图。其中PD0332991的浓度范围为0～128μmol/L，处理时间为24h；

图2-2附图为不同浓度的PD0332991抑制H1975AR细胞增殖示意图；

图3附图为PD0332991联合Osimertinib对H1975AR细胞活力的抑制作用示意图；其中Osimertinib的浓度为8μmol/L，PD0332991浓度分别为0μmol/L、4μmol/L、6μmol/L、8μmol/L，处理时间为24h；

图4-1附图为以Osimertinib、PD0332991、PD0332991联合Osimertinib处理H1975AR细胞后，流失细胞仪检测细胞凋亡结果示意图；

图4-2附图为以Osimertinib、PD0332991、PD0332991联合Osimertinib处理H1975AR细胞后，细胞凋亡率结果表征图；

图5-1附图为以Osimertinib、PD0332991、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞后，细胞周期S期阻滞结果示意图；

图5-2附图为以Osimertinib、PD0332991、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞后，细胞周期S期阻滞结果表征图；

图6-1附图为以Osimertinib、PD0332991、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞后H1975AR细胞迁移结果示意图；

图6-2附图为以Osimertinib、PD0332991、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞后H1975AR细胞迁移结果表征图；

图7-1附图为以Osimertinib、PD0332991、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞后H1975AR细胞增殖结果示意图；

图7-2附图为以Osimertinib、PD0332991、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞后H1975AR细胞增殖结果表征图；

图8-1附图为以Osimertinib、PD0332991、PD0332991联合Osimertinib抑制裸鼠体内肿瘤生长结果示意图；

图8-2附图为以Osimertinib、PD0332991、PD0332991联合Osimertinib抑制裸鼠体内肿瘤生长结果表征图。

图9附图为Real-timePCR法验证RNA-seq筛选出来的差异基因在H1975细胞，H1975AR细胞，Osimertinib处理、PD0332991处理、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞中的表达水平图

图10附图为蛋白印迹实验验证H1975AR细胞中siRNA对VCAN的表达沉默效果图

图11附图为VCAN siRNA对H1975AR细胞活性的影响图

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中涉及的单一药品组分均为市售渠道采购，对其品牌不做限定，例如：人肺腺癌细胞H1975购自中国科学院细胞库(中国上海)，奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR为本实验室常规培养细胞株。奥希替尼(Osimertinib，S7279)、PD0332991(Palbociclib，S1579)均购自Selleck公司。RPMIMedium 1640培养基、胎牛血清(Fetal Bovine Serum)、胰蛋白酶均购自GIBCO公司。CCK-8细胞增殖试剂盒、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)均购自Bioind公司。PI/RNase染色液、细胞凋亡试剂盒均购自BD公司。Transwell购自美国Corning公司。

未提及的方法为常规实验方法，例如，统计学方法应用Graphpad prism 8.0软件对数据进行统计学分析并作图，组间数据比较采用独立样本t检验，P值取双侧检验，P<0.05为统计学有差异。未提及的试验设备为常规实验设备，在此不再一一赘述。

实施例1培养细胞

将细胞从-80℃冰箱中取出，在37℃水浴锅中快速复温，1000r/min离心3min，弃掉上清液，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，培养于含10％胎牛血清的RPMI Medium 1640培养基，置于37℃、5％CO₂饱和湿度的培养箱中。待细胞生长至90％左右融合度时，弃掉培养基，用PBS清洗1-2遍，0.25％胰酶-EDTA消化传代。所有实验均采用对数生长期细胞。

CCK8法测定细胞活力：

收集呈对数期稳定生长的H1975细胞以及H1975AR细胞，细胞计数板计数，调整细胞悬液浓度至2.5×10⁴/mL，向96孔板中每孔加入200μL悬液，37℃、5％CO₂培养过夜，待细胞贴壁后，设置Osimertinib、PD0332991浓度梯度为0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L、128μmol/L，每个浓度设4个复孔，每个复孔加入200μL不同浓度的Osimertinib。37℃、5％CO₂孵育48h后，弃掉培养基，每孔加入100μl含10％CCK-8的完全培养基，避光，37℃培养箱中孵育1h，用酶标仪测定在450nm处的吸光度，药物抑制率计算公式：(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％，计算出药物的IC₅₀。以同样的方法测定PD0332991对H1975AR细胞的抑制率及IC₅₀。

Osimertinib按照0μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、8μmol/L、16μmol/L、32μmol/L、64μmol/L、128μmol/L的浓度梯度处理H1975细胞48h后，CCK8法计算出其IC₅₀为1.95μmol/L，如图1-1所示，以相同的方法测得Osimertinib对H1975AR细胞的IC₅₀为10.31μmol/L，如图1-2所示。PD0332991对H1975、H1975AR细胞的IC₅₀分别为14.23μmol/L、18.90μmol/L如图2-1和图2-2所示。

经过多次不同浓度的联合用药实验，如图3所示，与Osimertinib和PD0332991单药处理H1975AR细胞相比，Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞时，细胞活力明显下降，提示PD0332991联合Osimertinib增加其对H1975AR细胞活力的抑制作用。

实施例2细胞凋亡实验：

为了研究Osimertinib与PD0332991联合应用对H1975AR细胞凋亡的影响，我们分别用Osimertinib(8μmol/L)、PD0332991(6μmol/L)、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞48h，流式细胞仪检测细胞凋亡。

将H1975AR细胞接种至96孔板中，加入完全培养基，待细胞汇合率达到70％-80％时，吸去孔内培养基，将各孔分对照组(不做任何处理)、Osimertinib处理组、PD0332991处理组、Osimertinib联合PD0332991处理组，各组分别加入对应的药物2mL，37℃、5％CO₂孵育48h。收集5×10⁵细胞于流式管中，用预冷的PBS清洗细胞，1000r/min离心3min，弃上清，加入100μL 1×Binding Buffer重悬细胞，加入5μL AnnexinV-FITC，37℃培养箱中孵育10min；加入5μL PI Staining Solution，轻轻混匀，避光、室温反应10min；加入400μL1×Binding Buffer，混匀，样品在1h内用流式细胞仪检测。

结果表明：如图4-1和图4-2所示，对照组凋亡细胞占总细胞的比例为(4.47±0.02)％，Osimertinib(8μmol/L)处理组为(28.89±1.02)％，PD0332991(6μmol/L)处理组为(11.03±0.30)％，Osimertinib联合PD0332991处理组为(71.17±0.30)％。与Osimertinib和PD0332991单药处理H1975AR细胞相比，Osimertinib联合PD0332991处理组H1975AR细胞凋亡明显增加(P<0.0001)，提示PD0332991联合Osimertinib诱导H1975AR细胞凋亡。

实施例3细胞周期实验：

为了研究Osimertinib与PD0332991联合应用对H1975AR细胞周期的影响，我们分别用Osimertinib(8μmol/L)、PD0332991(6μmol/L)、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞48h，流式细胞仪检测细胞周期。

将H1975AR细胞接种至96孔板中，加入完全培养基，待细胞汇合率达到70％-80％时，吸去孔内培养基，将各孔分为对照组、Osimertinib处理组、PD0332991处理组、Osimertinib联合PD0332991处理组，各组分别加入对应的药物2mL，37℃、5％CO₂孵育48h。收集1×10⁶细胞于流式管中，用预冷的PBS清洗细胞，1000r/min离心3min，弃上清，逐滴加入1mL-2mL预冷的75％的乙醇，涡旋混匀细胞，4℃避光过夜，2000r/min离心细胞10min，弃上清，PBS清洗细胞2次以去除乙醇，将细胞重悬于0.5mL PI/RNase染色液，室温避光孵育15min，1h之内上流式细胞仪检测。

结果表明：如图5-1和图5-2所示，与Osimertinib和PD0332991单药处理H1975AR细胞相比，Osimertinib联合PD0332991处理组H1975AR细胞凋亡出现明显S期阻滞(P<0.0001)，提示PD0332991联合Osimertinib诱导H1975AR细胞周期S期阻滞。

而在先前的试验中，我们发现PD0332991和吉非替尼联合应用时，可以使肿瘤细胞G1期阻滞；而PD0332991和奥西替尼联合应用时，使肿瘤耐药细胞的S期阻滞。

实施例4Transwell迁移实验：

为了研究Osimertinib与PD0332991联合应用对H1975AR细胞迁移的影响，我们分别用Osimertinib(8μmol/L)、PD0332991(6μmol/L)、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞48h，具体过程为：

将H1975AR细胞接种至96孔板中，加入完全培养基，Osimertinib处理组、PD0332991处理组、Osimertinib联合PD0332991处理组，各组分别加入对应药物2mL，37℃、5％CO₂孵育48h。使用无血清RPMI Medium1640培养基调整各组细胞浓度为1×10⁵/mL，分别取200μL加入上室，于下室加入600μL含10％胎牛血清的RPMI Medium1640培养基，置于37℃、5％CO₂培养箱，培养24h。取出小室后，用棉签轻柔拭去上室细胞，4％多聚甲醛固定15min，结晶紫室温染色25min，并用PBS将多余染色液洗净，显微镜下观察穿过的细胞，每个样本随机选取5个视野进行拍照计数，计算平均值。

结果表明：如图6-1和6-2所示，对照组细胞迁移个数为(266.60±13.02)，Osimertinib(8μmol/L)处理组为(237.60±10.60)，PD0332991(6μmol/L)处理组为(11.80±2.60)，Osimertinib联合PD0332991处理组为0。与对照组相比，Osimertinib(8μmol/L)、PD0332991(6μmol/L)处理组H1975AR细胞迁移无显著变化(P>0.5)，Osimertinib联合PD0332991处理组显著抑制H1975AR细胞迁移(P<0.0001)，提示PD0332991联合Osimertinib抑制H1975AR细胞迁移。

实施例5EDU增殖实验：

为了研究Osimertinib与PD0332991联合应用对H1975AR细胞增殖的影响，我们分别用Osimertinib(8μmol/L)、PD0332991(6μmol/L)、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞48h，用胰酶消化转移至96孔板，每孔细胞数为5×10³个，培养24h后，按照EdU试剂盒说明书对细胞进行不同处理。

如图7-1和图7-2所示，对照组细胞增殖率为(87.80±0.86)％，Osimertinib(8μmol/L)处理组为(55.00±2.63)％，PD0332991(6μmol/L)处理组为(85.60±1.72)％，Osimertinib联合PD0332991处理组为0。与Osimertinib(8μmol/L)、PD0332991(6μmol/L)处理组相比，Osimertinib联合PD0332991处理组显著抑制H1975AR细胞增殖(P<0.0001)，提示PD0332991联合Osimertinib抑制H1975AR细胞增殖。

EdU(5-ethynyl-2-deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在细胞增殖时期代替胸腺嘧啶(T)渗入正在复制的DNA分子中，并能够与

荧光染料发生特异性反应，快速检测细胞DNA合成。

实施例6动物实验

为了研究Osimertinib与PD0332991联合应用在动物体内的作用，我们使用H1975AR细胞在裸鼠上构建动物模型，模拟体内环境。当肿瘤体积达到250mm³的裸鼠随机分为4组：空白对照组、Osimertinib给药组、PD0332991给药组、Osimertinib和PD0332991联合给药组，分别给予药物处理，过程如下：

选用4-5周龄的SPF级雌性BALB/c裸鼠，饲养1周后开始实验。同时，收集呈对数期稳定生长的H1975AR细胞，胰酶消化后,1000r/min离心3min，弃掉上清液，用PBS缓冲液清洗细胞沉淀，1000r/min离心3min，清洗2-3次，细胞计数仪计数，使用生理盐水调整细胞浓度为1×10⁷/ml。裸鼠饲养1周后，用1ml一次性注射器抽取0.2ml活细胞的悬液，接种在裸鼠右腿腹侧皮下，细胞接种量为2×10⁶。之后每隔1天测量一次肿瘤的最长径和垂直最短径，通过公式V(体积)＝最长径×垂直最短径的平方/2，并记录各小鼠的生存时间。当肿瘤体积达到250mm³时，将裸鼠随机分为4组：空白对照组、Osimertinib给药组、PD0332991给药组、Osimertinib和PD0332991联合给药组，每个实验组10只裸鼠，Osimertinib剂量为2.5mg/kg/day，PD0332991剂量为75mg/kg/day，给药量为0.2ml，给药方式为灌胃，给药次数为每日1次，连续给药2周。每隔1天测量一次肿瘤的最长径和垂直最短径,通过公式V(体积)＝最长径×垂直最短径的平方/2计算肿瘤的体积变化，并观察小鼠的状态。

结果显示：如图8-1和图8-2所示，连续给药2周后，与空白对照组相比，PD0332991给药组肿瘤生长速度无显著变化(P>0.5)，Osimertinib给药组肿瘤体积基本处于稳定状，而Osimertinib和PD0332991联合给药组肿瘤体积显著缩小(P<0.0001)，提示PD0332991联合Osimertinib抑制能有效抑制肿瘤生长。

实施例7Real-time PCR实验

常规TRIZOL法提取H1975细胞、H1975AR细胞、Osimertinib处理、PD0332991处理、Osimertinib联合PD0332991处理H1975AR细胞的总RNA，经反转录成cDNA并进行5倍稀释后，取出2μL的cDNA，每种处理下的cDNA取出十份，分到不同的离心管中，并在每个离心管中加入2μL的GOT1、NVF2、PECAM1、CHAC1、ERBB3、PHGDH、SRNG、UHRF1、IL-7R、VCAN引物，以及10μL的

GreenPCRMasterMix和6μL的H₂O，放置在实时定量PCR仪，将反应体系设置为：先50℃反应2min，然后95℃反应10min，最后95℃反应15s，降温至60℃反应1min，如此反复，反应40个循环。通过2-^△△CT法计算出每个cDNA样品中GOT1、NVF2、PECAM1、CHAC1、ERBB3、PHGDH、SRNG、UHRF1、IL-7R、VCAN基因的相对表达，结果如图9所示。

由图9可知，奥西替尼和PD0332991联合应用可以降低H1975AR细胞中VCAN基因的表达量，且差异最为显著，而GOT1、NVF2、CHAC1、ERBB3、PHGDH、PECAM1、SRNG、UHRF1和IL-7R由于其相对表达量都比较低，差异不显著。

实施例8蛋白印迹实验

H1975AR经转染5μmol/L的VCAN siRNA，48h后收集细胞沉淀，应用蛋白免疫印迹实验，观察siRNA对VCAN蛋白表达的沉默效果，结果见图10。

实施例9 CCK8法测定VCAN siRNA对细胞活力的影响

H1975AR经转染5μmol/L的VCAN siRNA，48h后，应用CCK8法测定细胞活力(方法同实施例8)。

由图11可知，H1975AR转染VCAN siRNA后细胞活性明显下调。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims

1.PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用，其特征在于，所述PD0332991在药物中的最低有效浓度为6μmol/L，所述奥希替尼在药物中的最低有效浓度为8μmol/L。

3.根据权利要求1所述的PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用，其特征在于，所述PD0332991联合奥希替尼诱导奥希替尼耐药肺癌细胞株H1975AR细胞周期S期阻滞。

4.根据权利要求1所述的PD0332991联合奥希替尼在制备治疗NSCLC药物中的应用，其特征在于，奥西替尼和PD0332991联合应用能够降低H1975AR细胞中VCAN基因的表达量。