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CN111533806B - 一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用 - Google Patents

一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用 Download PDF

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CN111533806B CN202010666417.7A CN202010666417A CN111533806B CN 111533806 B CN111533806 B CN 111533806B CN 202010666417 A CN202010666417 A CN 202010666417A CN 111533806 B CN111533806 B CN 111533806B
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Yeasen Biological Technology Shanghai Co ltd
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Abstract

本发明公开了一种Pfu的突变体聚合酶3’‑5’外切酶活性封闭单克隆抗体，其包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：7所示，所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：8所示，所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：9所示。本发明还公开了所述的单克隆抗体的应用。本发明的单克隆抗体的封闭效果好，封闭率达到近100%。

Description

一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及 其应用
技术领域
本发明属于生物工程技术领域， 具体地说，是关于一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用。
背景技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是体外合成双链DNA的一种方法，其原理类似于天然DNA的复制过程，其特异性主要依赖于其目的片段两端互补的特异性引物。典型的PCR反应有三个步骤：变性，退火，延伸，经过多次循环反应，获得目的片段。
目前，提高PCR扩增特异性的方法有很多，最简单的方法就是采用热启动酶扩增。普通的DNA聚合酶最适温度是72℃，此时酶的活性最佳，小于此温度，酶具有较弱活性，5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性均可发挥作用。Canace 3’-5’外切酶活性可以作用于单链引物和双链DNA模板。Characterization and Application to Hot Start PCR ofNeutralizing Monoclonal Antibodies Against KOD DNA Polymerase H Mizuguchi, MNakatsuji, S Fujiwara, M Takagi, T Imanaka doi: 10.1093/oxfordjournals.jbchem.a022514中公开了，在PCR反应之前单独封闭掉3’-5’外切酶活性，可以提高聚合酶的扩增效果，特别是对长片段的扩增能力有了很大提高。
鉴于单克隆抗体与抗原结合的高亲和力特性，可以利用单克隆抗体封闭聚合酶的聚合酶活性。抗体法热启动酶（聚合酶活性封闭）中加入3’-5’外切酶活性封闭抗体可以进一步提高PCR扩增的特异性，提高PCR产物的产量，增加长片段的检出率。
聚合酶是生命科学研究的基本工具，在高校、研究所等科研机构和生物技术公司应用极其广泛。成本低廉地生产封闭抗体将大大降低抗体法热启动聚合酶的成本。目前市场上有抗体法热启动Pfu聚合酶，如来自GENE公司，Thermo Fisher scientific公司。
Pfu的突变体聚合酶，命名为Canace, 是一种高保真DNA聚合酶，是基于Pyrococcus Furiosis DNA Polymerase,是经基因工程改造而成，其3’-5’外切酶结构域经改造后，大幅度提升了酶的保真性。Pfu的突变体聚合酶可购自于上海翊圣生物科技有限公司（例如：型号为10135ES10、10136ES01、10148ES10等）。Pfu的突变体聚合酶比野生型Pfu具有更好的扩增效果。
目前，市面上还未发现有Pfu的3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体售卖，也没有针对Pfu的突变体聚合酶的热启动封闭性抗体。而本公司的Pfu的突变体聚合酶市场大，急需开发一种3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体提高Pfu的突变体聚合酶的产品品质。
发明内容
本发明采取杂交瘤技术制备抗Canace的单克隆抗体，筛选到可以完全封闭Canace3’-5’外切酶活性的单克隆体，获得分泌高质量抗体的杂交瘤后，通过小鼠腹水大量生产抗体，这使得抗体的生产简单、成本低廉。本发明制备的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体，可以应用到制备Canace热启动酶和Canace热启动双封闭酶（封闭5’-3’聚合酶活性和3’-5’外切酶活性）。
因此，本发明的第一个目的在于提供一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体。本发明的第二个目的在于提供一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体的应用。本发明的第三个目的是提供一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体的制备方法。采用该方法制备出分泌Pfu的突变体聚合酶 3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体的杂交瘤可利用为低成本大规模抗体生产。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
作为本发明的第一个方面，一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体，包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区，其中，
所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，
所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，
所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，
所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：7所示，
所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：8所示，
所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：9所示。
根据本发明，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
作为本发明的第二个方面，一种产生上述所述的单克隆抗体的杂交瘤细胞。
作为本发明的第三个方面，上述所述的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体在PCR反应中的应用。
进一步的，所述Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体用于封闭Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性。
作为本发明的第四个方面，一种上述所述的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体在制备Canace热启动酶中的应用。
作为本发明的第五个方面，一种上述所述的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体在制备Canace热启动双封闭酶中的应用。
作为本发明的第六个方面，一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：
步骤一、将重组表达载体pET-28a-Canace转入Rosseta大肠杆菌，诱导表达Canace蛋白；
步骤二、镍柱亲和层析纯化Canace蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯化效果；
步骤三、以纯化的Canace蛋白作为免疫原，取雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫后的小鼠效价；
步骤四、取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株；
步骤五、将筛选出的阳性杂交瘤细胞株经过多次亚克隆，得到抗Canace特异性杂交瘤细胞株；抗Canace特异性杂交瘤细胞株制备腹水，并用Protein G亲和层析纯化出抗体；
步骤六、对获得的抗体进行Canace的3’-5’外切酶活性封闭性能筛选。
根据本发明，步骤六的Canace的3’-5’外切酶活性封闭性能筛选，包括：
合成一条单链DNA引物，3’末端为dATP，DNA中所有dATP为带3H放射性标记。
本发明的有益效果是：
1、本发明的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体，其封闭效果好，封闭率达到近100%，且封闭1 U的3’-5’外切酶活性需要的抗体量不高于0.1 μg。可以用于制备Canace热启动酶。从而使国产高保真DNA聚合酶的品质得到改善，可实现国产高保真热启动酶替代进口的Pfu热启动酶。
2、本发明中的单克隆抗体采用杂交瘤的方式，可以使封闭抗体的生产变得十分便利。
附图说明
图1为纯化后的Canace蛋白SDS-PAGE分析图。
图2为本发明的抗Canace单克隆抗体SDS-PAGE图。
图3 为本发明的单克隆抗体封闭Canace 3’-5’外切酶活性封闭效率图。
图4 为用本发明的单克隆抗体配制的热启动PCR效果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或厂商提供的条件进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径得到。
本发明设计采用分子生物学方法表达一种聚合酶，采用细胞生物学方法制备杂交瘤，筛选到一株分泌完全封闭Canace的3’-5’外切酶活性的单克隆抗体的杂交瘤，该发明杂交瘤制备的单克隆抗体可以应用到热启动PCR聚合酶的生产。
1、生物材料
雌性Balb/c（6至10周龄）小鼠，北京维通利华有限公司；
SP2/0骨髓瘤细胞，中科院细胞库；
Rosetta大肠杆菌感受态，上海翌圣生物科技有限公司；
质粒pET-28a-Canace，上海翌圣生物科技有限公司。
2、实验试剂与耗材
LB培养基粉末，IPTG，镍亲和层析填料，10×PBS，咪唑，SDS-PAGE蛋白预制胶，SDS-PAGE蛋白上样Buffer，考马斯亮蓝染液，蛋白Marker，透析袋，弗式不完全佐剂，弗式完全佐剂，RPMI1640培养基，青链霉素，胎牛血清，L-谷氨酰胺，DMSO，HAT和HT培养基添加利，PEG1450，可溶性单组份TMB底物溶液，脱脂奶粉，96孔酶标板，96孔细胞培养板，24孔细胞培养板，6孔细胞培养板，细胞培养皿，24：1氯仿/异戊醇，核酸沉淀溶液（TCA法）。
3、Canace蛋白序列
MILDADYITEEGKPVIRLFKKENGVFKIEHDRTFRPYIYALLKDDSKIEEVKKITIERHGKIVRIVDKEKVEKKFLGVPITVWELYIEHPQDVPTIREKNREHFAVVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADEVEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLEIIREKDPDIIDTYNGDSFDGPYLAKRAEKLGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVINRTINLPTYTLEAVYEAIFGKPKEKVYADEIAKAWERGEELERVAKYSMEDAKATYELGKEFVPMELQLSRLVGQPLWDVSRSSTGNLVEWFLLRKAYERNEKAPNKPYEKEYLRRLRESYVGGFVKEPEKGLWENIVKLDFRALYPSIIITHNVSPDTLNREGCDNYDLAPPVGHKFCKDNPGFIPSLLVPLLDERQKIKTKMKKFQDPIEKIALDYRQEAIKDLANSDYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGREYIEIVWKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGKSEEIKKKALEFVYYINEKLPGLLELEYEGFYKMGFFDTKKRYAEIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLEPILKHGLVEEAVRIVKEVEQKLDIYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKPLAAKGVKIKPGMVIGYIVLRGDGPISNRAILAEEYDPEKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRGQKTDQEGLTSWLNIKKS （SEQ ID NO:1）
实施例1 重组蛋白的诱导表达和亲和纯化
（1）将重组表达载体pET-28a-Canace转化Rosetta大肠杆菌菌株中，诱导表达Canace蛋白。
挑取单克隆Rosetta菌落于5 mL卡那霉素抗性的LB培养基中，过夜培养后，扩大至1 L卡那霉素抗性的LB中培养，培养至OD600为0.8至1.0，加400 μL的1 M IPTG，37℃诱导4h。菌液放入1 L离心杯中，4000r/min，15 min。弃上清，加入20 mL PBS重悬菌体，冻于-80℃冰箱。
（2）镍柱亲和层析纯化Canace蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯化效果。
常温水浴解冻冻存的菌液，超声破碎300 W，5s/5s，1 h。将破碎后菌液转入高速离心管，15000r/min，离心30min，收集上清与平衡好的镍亲和填料孵育1h。重力层析柱纯化，分别用PBS、含有30 mM 咪唑的PBS、含有50 mM的PBS洗涤杂蛋白，含250 mM咪唑的PBS洗脱杂蛋白，对洗下的蛋白跑SDS-PAGE。结果如图1所示。其分子量为100KDa，与理论值一致。对含有高纯度的目的蛋白的样品进行超滤浓缩，PBS透析换液。
实施例2 小鼠免疫和血清效价测定
以纯化的Canace蛋白作为免疫原，取6周龄的Balb/c雌性小鼠，按照免疫程序进行免疫，间接酶联免疫吸附实验（ELISA）检测免疫后的小鼠效价。具体做法是：
免疫3只六周龄的Balb/c小鼠，首次免疫用弗式完全佐剂乳化Canace蛋白，后面的免疫均用弗式非完全佐剂乳化Canace蛋白，免疫剂量均为每只小鼠100 μg蛋白，每周免疫一次，免疫两个月，采用皮下多点注射的方式。第三次免疫后每次免疫前眼眶采血，用酶联免疫吸附实验（ELISA）检测血清的效价。更具体做法是用1 μg/mL的Canace蛋白（溶于PBS）包板，5 %脱脂奶粉封闭，用PBS梯度稀释血清，HRP标记羊抗鼠IgG作为二抗，TMB显色，OD450值是阴性对照的2.1倍视为阳性。细胞融合前三天对小鼠效价达到10万的小鼠进行冲击免疫，100 μg Canace（溶于PBS）注入小鼠腹腔。
实施例3 细胞融合和杂交瘤筛选
取免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合，ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株。具体做法是：
提前培养足够量的SP2/0，不少于108个，保证细胞处于对数生长期。收集SP2/0，用无血清的RPMI1640培养基洗三次。取经冲击免疫的小鼠的脾脏，研磨得到脾细胞，用RPMI1640培养基洗脾细胞三次。脾细胞与SP2/0的细胞数以2：1至5：1的比例混合。1000r/min，10 min，去培养基，于1min内加1 mL PEG1450入细胞中，边加边轻轻搅拌。加完PEG1450后两min内，匀速加入2 mL RPMI1640培养液终止PEG1450的作用，之后2min内加RPMI1640培养基至50 mL体积。1000r/min，10 min，离心去上清。加入含有20% FBS、终浓度为1×HAT的RPMI1640培养液200 mL吹起细胞，将含有细胞的培养液分至10块96孔细胞培养板，放入37℃细胞培养箱中培养。
融合细胞培养4天后，用含有20% FBS、终浓度为1×HAT的1640培养液进行半换液。融合后7至10天后，ELISA检测前一天早晚用含有20% FBS、终浓度为1×HT的1640培养液各进行一次全换液。用1 µg/mL的Canace蛋白包板，间接ELISA检测融合板细胞培养基，每孔取50 μL培养基检测。筛选出阳性杂交瘤细胞株。检测后将阳性孔中的细胞转入到24孔板中培养，培养基含HT（次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的混合剂）。
实施例4 杂交瘤单克隆化
24孔板中细胞培养两天后进行ELISA检测，对阳性孔中细胞计数，取200个细胞入96孔板中培养。培养一周左右，挑取只有1至3个克隆的孔进行ELISA检测，阳性孔细胞转移到24孔培养。这为一次单克隆化，如此重复，进行四次单克隆化。获得28株抗Canace特异性杂交瘤细胞株，分别命名为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7 、B8、B9、B10、B11、B12、B13、B14、B15、B16、B17、B18、B19、B20、B21、B22、B23、B24、B25、B26、B27、B28。初次单克隆化用含HT的培养基，以后换为不含HT的培养基。
实施例5 小鼠腹水制备和抗体亲和纯化
将经过四次单克隆化的28株抗Canace特异性细胞株在24孔板、6孔板、培养皿中依次扩大培养，收集细胞离心，用PBS重悬至2×106个/mL，每只小鼠注射106个细胞。注射细胞前一周给每只小鼠腹腔注射1 mL石蜡油。7至10天后小鼠腹水形成，处死小鼠，用注射器抽取腹水。低速离心腹水10min，取中间层，弃下层细胞沉淀和上层油脂。
用十倍腹水体积的PBS稀释腹水，0.4 μm的滤膜过滤。将过滤后的样品与平衡好的Protein G填料孵育1h。重力层析柱纯化，用PBS洗涤杂蛋白，pH2.7的甘氨酸缓存液洗脱目的蛋白，用 pH8.5的 1 M Tris-HCl将洗脱后的样品的pH值调到中性。获得28株抗体,分别命名为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7 、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、C26、C27、C28。OD280测抗体浓度，超滤管浓缩，PBS透析换液，SDS-PAGE检测抗体纯度。结果如图2所示。50%甘油冻存于-20℃。
实施例6 28株抗体封闭Canace的3’-5’外切酶活性的性能检测
（1）合成一条单链DNA引物atgcatgctga（ SEQ ID NO：10），3’末端为dATP，DNA中所有dATP为带3H放射性标记。反应体积（Canace，DNA引物，加与不加抗体）在37℃反应40 min。之后用等体积的24：1氯仿/异戊醇颠倒充分混匀，4℃高速离心5 min，回收上层水相。在回收的水相中加入等体积的核酸沉淀溶液（TCA法），颠倒混匀，温育。4℃高速离心10 min。取上清去沉淀，测定放射性含量。先检测1µg的抗体封闭1U的Canace的封闭活性。结果如表1所示。
结果显示，C7的封闭率达到99%。
表1 不同抗体封闭性检测结果
Figure 218302DEST_PATH_IMAGE001
（2）针对高封闭活性的抗体（C7），封闭1 U的Canace 3’-5’外切酶活性单克隆抗体用量梯度设置为0.4 µg，0.2 µg，0.1 µg，0.05 µg，0.025 µg，0。结果附图3所示。
图3结果显示， 当封闭1 U的Canace 3’-5’外切酶活性单克隆抗体用量为0.1 µg时，实施例5获得的Pfu的突变体聚合酶的3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体C7的封闭率可以达到99%。
实施例7 Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体的氨基酸序列测序及分析
将筛选到的最终用于抗体生产的杂交瘤B7交于抗体序列测序服务公司测得抗体的氨基酸序列。单克隆抗体C7的具体序列如下：
轻链可变区序列为：
DIEMTQSPASLAVSLGQRATISCRASEPKSVSYIYEIHWYQHKPGQPPKLLIYLEDNKASGVPARFSGSGSRT
DFTLTIDPVEANDGAEYYCQASQHVPWTFGEGTKIELRKADA （SEQ ID NO：2）
轻链可变区CDR1氨基酸序列为：EPKSVSYIYE （SEQ ID NO：3）
轻链可变区CDR2氨基酸序列为：LED （SEQ ID NO：4）
轻链可变区CDR3氨基酸序列为：QASQHVPWT （SEQ ID NO：5）
重链可变区氨基酸序列为：
EVQLVESGGELVKPGGSLKLSCAASGFTFSEYDMSWVRQTPEKELEWVASISSGGSDYYPDSVKGRFTISRDN
ARNILYLQMSSLRSEDTADYYCGRDEVHEDVKE (SEQ ID NO：6)
重链可变区CDR1氨基酸序列为：GFTFSEYD （SEQ ID NO：7）
重链可变区CDR2氨基酸序列为：ISSGGSD （SEQ ID NO：8）
重链可变区CDR3氨基酸序列为：GRDEVHEDVKE （SEQ ID NO：9）
实施例8 实例验证
以本发明制备的单克隆抗体C7配制热启动酶检测该抗体对PCR效果的改善。
选取Mouse基因组（GeneID:11816）中4k bp长度的基因组为模板，用Canace酶扩增无法扩出目的条带。用本发明的单克隆抗体C7配制热启动酶（实验组），如表2的方式配制PCR反应体系，98℃ 3min预变性，98℃ 10sec、68℃ sec/kb 35个循环，72℃ 5min扩增， 跑0.7%琼脂糖胶鉴定。结果见图4。其中，图4的第1道孔上样为不加抗体的扩增产物，第2道孔上样为加抗体的热启动酶扩增产物。
其中，对照组：不加抗体，仅含Canace ；
实验组：加抗体C7的热启动Canace 。
表2 PCR反应体系
Figure 745099DEST_PATH_IMAGE002
其中，引物是以GeneID:11816上的序列为模板设计的。
结果显示，加抗体C7的热启动酶可以扩增出明显的目的条带产物，而不加抗体的酶不能扩增出目的产物。可见本发明制备的抗体C7可以有效的提高长片段的检出率。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 翌圣生物科技（上海）有限公司
<120> 一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体及其应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 775
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ile Leu Asp Ala Asp Tyr Ile Thr Glu Glu Gly Lys Pro Val Ile
1 5 10 15
Arg Leu Phe Lys Lys Glu Asn Gly Val Phe Lys Ile Glu His Asp Arg
20 25 30
Thr Phe Arg Pro Tyr Ile Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Lys Ile
35 40 45
Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ile Glu Arg His Gly Lys Ile Val Arg
50 55 60
Ile Val Asp Lys Glu Lys Val Glu Lys Lys Phe Leu Gly Val Pro Ile
65 70 75 80
Thr Val Trp Glu Leu Tyr Ile Glu His Pro Gln Asp Val Pro Thr Ile
85 90 95
Arg Glu Lys Asn Arg Glu His Phe Ala Val Val Asp Ile Phe Glu Tyr
100 105 110
Asp Ile Pro Phe Ala Lys Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Ile Pro
115 120 125
Met Glu Gly Glu Glu Glu Leu Lys Ile Leu Ala Phe Asp Ile Glu Thr
130 135 140
Leu Tyr His Glu Gly Glu Glu Phe Gly Lys Gly Pro Ile Ile Met Ile
145 150 155 160
Ser Tyr Ala Asp Glu Val Glu Ala Lys Val Ile Thr Trp Lys Asn Ile
165 170 175
Asp Leu Pro Tyr Val Glu Val Val Ser Ser Glu Arg Glu Met Ile Lys
180 185 190
Arg Phe Leu Glu Ile Ile Arg Glu Lys Asp Pro Asp Ile Ile Asp Thr
195 200 205
Tyr Asn Gly Asp Ser Phe Asp Gly Pro Tyr Leu Ala Lys Arg Ala Glu
210 215 220
Lys Leu Gly Ile Lys Leu Thr Ile Gly Arg Asp Gly Ser Glu Pro Lys
225 230 235 240
Met Gln Arg Ile Gly Asp Met Thr Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile
245 250 255
His Phe Asp Leu Tyr His Val Ile Asn Arg Thr Ile Asn Leu Pro Thr
260 265 270
Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Ile Phe Gly Lys Pro Lys Glu
275 280 285
Lys Val Tyr Ala Asp Glu Ile Ala Lys Ala Trp Glu Arg Gly Glu Glu
290 295 300
Leu Glu Arg Val Ala Lys Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Ala Thr Tyr
305 310 315 320
Glu Leu Gly Lys Glu Phe Val Pro Met Glu Leu Gln Leu Ser Arg Leu
325 330 335
Val Gly Gln Pro Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu
340 345 350
Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Lys Ala
355 360 365
Pro Asn Lys Pro Tyr Glu Lys Glu Tyr Leu Arg Arg Leu Arg Glu Ser
370 375 380
Tyr Val Gly Gly Phe Val Lys Glu Pro Glu Lys Gly Leu Trp Glu Asn
385 390 395 400
Ile Val Lys Leu Asp Phe Arg Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr
405 410 415
His Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Asp Asn Tyr
420 425 430
Asp Leu Ala Pro Pro Val Gly His Lys Phe Cys Lys Asp Asn Pro Gly
435 440 445
Phe Ile Pro Ser Leu Leu Val Pro Leu Leu Asp Glu Arg Gln Lys Ile
450 455 460
Lys Thr Lys Met Lys Lys Phe Gln Asp Pro Ile Glu Lys Ile Ala Leu
465 470 475 480
Asp Tyr Arg Gln Glu Ala Ile Lys Asp Leu Ala Asn Ser Asp Tyr Gly
485 490 495
Tyr Tyr Gly Tyr Ala Lys Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu
500 505 510
Ser Val Thr Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Glu Ile Val Trp Lys Glu
515 520 525
Leu Glu Glu Lys Phe Gly Phe Lys Val Leu Tyr Ile Asp Thr Asp Gly
530 535 540
Leu Tyr Ala Thr Ile Pro Gly Gly Lys Ser Glu Glu Ile Lys Lys Lys
545 550 555 560
Ala Leu Glu Phe Val Tyr Tyr Ile Asn Glu Lys Leu Pro Gly Leu Leu
565 570 575
Glu Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Met Gly Phe Phe Asp Thr Lys
580 585 590
Lys Arg Tyr Ala Glu Ile Asp Glu Glu Gly Lys Val Ile Thr Arg Gly
595 600 605
Leu Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln
610 615 620
Ala Arg Val Leu Glu Pro Ile Leu Lys His Gly Leu Val Glu Glu Ala
625 630 635 640
Val Arg Ile Val Lys Glu Val Glu Gln Lys Leu Asp Ile Tyr Glu Ile
645 650 655
Pro Pro Glu Lys Leu Ala Ile Tyr Glu Gln Ile Thr Arg Pro Leu His
660 665 670
Glu Tyr Lys Ala Ile Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Pro Leu Ala
675 680 685
Ala Lys Gly Val Lys Ile Lys Pro Gly Met Val Ile Gly Tyr Ile Val
690 695 700
Leu Arg Gly Asp Gly Pro Ile Ser Asn Arg Ala Ile Leu Ala Glu Glu
705 710 715 720
Tyr Asp Pro Glu Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn
725 730 735
Gln Val Leu Pro Ala Val Leu Arg Ile Leu Glu Gly Phe Gly Tyr Arg
740 745 750
Lys Glu Asp Leu Arg Gly Gln Lys Thr Asp Gln Glu Gly Leu Thr Ser
755 760 765
Trp Leu Asn Ile Lys Lys Ser
770 775
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Glu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Pro Lys Ser Val Ser
20 25 30
Tyr Ile Tyr Glu Ile His Trp Tyr Gln His Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Glu Asp Asn Lys Ala Ser Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asn Asp Gly Ala Glu Tyr Tyr Cys Gln Ala Ser Gln
85 90 95
His Val Pro Trp Thr Phe Gly Glu Gly Thr Lys Ile Glu Leu Arg Lys
100 105 110
Ala Asp Ala
115
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Glu Pro Lys Ser Val Ser Tyr Ile Tyr Glu
1 5 10
<210> 4
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Leu Glu Asp
1
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Ala Ser Gln His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 6
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Glu Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr
20 25 30
Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Glu Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Asp Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Arg Asn Ile Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly
85 90 95
Arg Asp Glu Val His Glu Asp Val Lys Glu
100 105
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr Asp
1 5
<210> 8
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Ser Ser Gly Gly Ser Asp
1 5
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Gly Arg Asp Glu Val His Glu Asp Val Lys Glu
1 5 10
<210> 10
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atgcatgctg a 11

Claims (5)

1.一种Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体，其特征在于，包含含LCDR1、LCDR2和LCDR3序列的轻链可变区和含HCDR1、HCDR2和HCDR3序列的重链可变区， Pfu的突变体聚合酶为Canace蛋白，所述Canace蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示；
所述LCDR1的序列如SEQ ID NO：3所示，
所述LCDR2的序列如SEQ ID NO：4所示，
所述LCDR3的序列如SEQ ID NO：5所示，
所述HCDR1的序列如SEQ ID NO：7所示，
所述HCDR2的序列如SEQ ID NO：8所示，
所述HCDR3的序列如SEQ ID NO：9所示。
2.如权利要求1所述的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，重链可变区的氨基酸序列如SEQID NO：6所示。
3.一种如权利要求1或2所述的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体在PCR反应中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体用于封闭Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性。
5.一种如权利要求1或2所述的Pfu的突变体聚合酶3’-5’外切酶活性封闭单克隆抗体在制备Canace热启动酶中的应用。
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