CN111534602A - 一种基于高通量测序分析人类血型基因型的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于高通量测序分析人类血型基因型的方法，属于生物信息学领域。本发明首先获得人类血样样本DNA的高通量测序数据，进一步通过序列比对、变异检测、基因注释对测序数据进行处理，完成血型基因型的分析和验证。本发明首次建立全基因测序血型分型云平台，采用NGS技术来揭示人类GPA、GPB、GPE的分子机制，对复杂的GP(A‑B‑A)、GP(B‑A‑B)、GP(A‑B)片段进行测序分析，通过BWA/GATK等生物信息学软件详细分析糖蛋白杂合基因的多态性特征并确定对应的糖蛋白分子型别，将突变基因进行过表达并验证MNS系统的抗原型别，解决由杂合型糖蛋白多态性分子引起的临床输血反应、免疫性疾病的诊断与治疗的疑难问题。

Description

一种基于高通量测序分析人类血型基因型的方法及其应用

技术领域

本发明属于生物信息学领域，具体地，涉及一种基于高通量测序分析人类血型基因型的方法及其应用。

背景技术

人类红细胞血型糖蛋白：GPA、GPB和GPE均属于红细胞跨膜糖蛋白，对应编码基因按照5'-GYPA-GYPB-GYPE-3'的顺序排列在4号染色体上，三者具有95%的同源性，在遗传过程中相互间的交换、融合、重组、缺失等突变均会在红细胞表面产生新的抗原决定簇，三条基因的碱基序列决定着人类红细胞 MNS血型系统抗原的多态性。MNS血型系统是继ABO血型后被人类发现的第二个血型系统，MNS血型与临床输血、免疫性溶血性疾病密切相关，在器官移植、法医学鉴定与人类群体遗传学方面具有重要意义。红细胞作为血液的主要成份，血液作为一种特殊的药物，输血不良反应比药品不良反应发生频率更高、危害更大，致死率和致病率更高。目前MNS血型系统的抗原被人们所认识的只有46种，这当中至少有16种来自遗传重组，还有很多由杂合型糖蛋白如GP(A-B)、GP(B-A)、GP(A-B-A)或GP(B-A-B)等决定的MNS血型抗原特异性未被明确鉴定，而这些还未被确认型别的抗原会引起的异型输血反应、异体间器官移植排斥反应、胎儿宫内溶血与新生儿同种免疫性疾病诊断的困难，严重威胁着人类健康。

杂合型糖蛋白表达的MNS血型抗原型别鉴定与抗体特异性的确认一直困扰着临床输血与溶血性疾病的诊断与治疗。目前对MNS血型系统的检测方法主要以血清学方法、简单的PCR-SSP法、一代测序法、DNA探针比色检测等方法，这些方法均无法对MNS血型基因的变异与对应抗原进行准确鉴定，还有很多的变异抗原未能确认，同时由于MNS血型系统抗体试剂的不足，各实验室对于该血型的血清学检测都无法完整进行，造成临床输血与免疫性疾病诊断与治疗的困难。

发明内容

本发明的目的是全基因测序血型分型云平台，采用NGS技术来揭示人类GPA、GPB、GPE的分子机制，对复杂的GP(A-B-A)、GP(B-A-B)、GP(A-B)的基因进行测序分析以确定杂合型糖蛋白分子多态性，解决由MNS血型引起的临床输血与免疫性疾病诊断的疑难问题。

为此，本发明的第一方面提供一种基于高通量测序分析人类血型基因型的方法及其应用，包括以下步骤：

S1，获取或采集人血液样本的基因组DNA；

S2，对所述基因组DNA进行高通量测序；

S3，对测序数据进行预处理后利用序列比对软件进行比对，并利用变异检测软件进行变异检测；

S4，克隆得到突变基因，并导入到K562细胞中进行过表达再用Western-Blot验证抗原型别；

S5，通过关联分析得到血型基因型分析数据。

在本发明的一些实施方案中，步骤S2中利用包括但不限于Illumina HiSeq测序平台进行高通量测序。

在本发明的一些实施方案中，步骤S3中所述序列比对软件为BWA。

在本发明的一些实施方案中，步骤S3中所述变异检测软件为GATK4。

在本发明的一些实施方案中，所述变异选自SNP、CNV、Indel和SV中的至少一种。

在本发明的一些实施方案中，所述血型基因型是指MNS血型基因型。

在本发明的一些实施方案中，步骤S3中所述比对是针对GYPA、GYPB、GYPE基因进行的。

在本发明的一些实施方案中，步骤S4中进一步包括利用Blood Typer软件对测序结果进行GPA、GPB、GPE融合分子表型相关抗原进行预测的步骤。

在本发明的一些实施方案中，步骤S3中还包括对融合基因GYP(A-B-A)、GYP(B-A- B)、GYP(A-B)、GYP(A-B)的全长序列进行比对和变异检测。

在本发明的一些具体实施方案中，所述全长序列包括外显子、内含子以及UTR区域序列。由此，可分析糖蛋白杂合基因的多态性特征并确定对应的糖蛋白分子型别，将突变基因进行过表达并验证MNS系统的抗原型别。

在本发明的一些实施方案中，在步骤S3前进一步包括对测序序列进行质量控制的步骤。

在本发明的一些具体实施方案中，进行SOAPnuke进行所述质量控制。

在本发明中，利用case-control对变异碱基确认及对数据进行关联分析：对所有样本的GPA、GPB、GPE对应编码区基因、非编码区基因、调控基因及潜在关联基因等进行关联分析，并使用千人基因组的中国汉族人群数据进行人群种族特异性过滤，排除因种族特异导致的关联位点。

本发明的第二方面提供本发明第一方面所述方法使用的试剂在制备用于分析人类血型基因型的试剂盒中的应用。

本发明的第三方面提供一种基于高通量测序分析人类血型基因型的系统，所述系统包括：

数据存储元件，用于存储测序数据；

数据处理元件，与数据存储元件连接，用于对测序数据进行包括序列比对、变异检测、基因注释的处理；

血型基因型数据库元件，与数据处理元件连接，用于存在血型基因型数据，

其中，当数据处理元件发现新的血型基因型时，将该血型基因型上传至血型基因型数据库元件，完成血型基因型数据库的更新。

在本发明的一些实施方案中，所述血型基因型数据库是指MNS血型基因型数据库。

本发明的详细技术方案如下：

获取随机人群血样的GPA、GPB、GPE分子对应基因全长序列多态性及等位基因频率分布情况：本发明随机选取血液中心无偿献血者血样，用血型血清学鉴定MNS 血型并检测红细胞上MNS抗原的剂量效应，挑选其中具有代表性的标本以高通量测序（NGS）技术分析MNS血型基因GYPA、GYPB、GYPE的全长序列，应用PE150（Illumina平台）对插入片段进行测序分析，获得基因检测数据后，使用SOAPnuke软件对下机数据进行质量控制分析，通过BWA软件进行序列比对，阐明人类红细胞GPA、GPB、GPA分子特征。

分析GPA、GPB、GPE分子多态性与MNS抗原表达免疫原性的相关性：

分析样本的GYPA、GYPB、GYPE的全长序列中核苷酸变异与抗原表达的内在关系、遗传特征，结合其在临床输血、胎儿及新生儿同种免疫的致病性，判断GYPA、GYPB、GYPE基因与MNS血型抗原、免疫性抗体的相关性。

重组验证：

把突变基因导入到K562细胞中进行过表达并以Western-Blot验证：把新基因导入K562细胞进行过表达，提取表达的抗原蛋白免疫动物并制备抗体血清，验证抗原的型别。

全基因组数据血型分型的云平台进行人类红细胞血型数据库的建设：

运用申请人在全国血站系统中首次建立的全基因测序血型分型云平台，可以对所有人类血型基因进行筛查，可以应用全基因测序数据建设稀有血型资料库以解决临床输血与免疫性疾病诊断与治疗的疑难问题。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

（1）通过精确分子分型准确识别糖蛋白的型别与由其免疫产生的抗体，结合高通量测序技术和云平台来鉴定红细胞血型糖蛋白GPA、GPB、GPE相关基因的结构与序列特征，明确GYPA/GYPB/GYPE基因对应的抗原型别，解决由糖蛋白GPA、GPB、GPE抗原引起的临床输血与同种免疫性疾病诊断等一系列疑难问题

（2）本发明可以用于揭示人类红细胞杂合型糖蛋白的相关基因与红细胞上MNS血型抗原免疫原的相关性。

（3）本发明通过建立全基因测序血型分型云平台，采用NGS技术来揭示人类GPA、GPB、GPE的分子机制，对复杂的GP(A-B-A)、GP(B-A-B)、GP(A-B)的基因进行测序分析以确定杂合型糖蛋白分子多态性，解决由MNS血型引起的临床输血与免疫性疾病诊断的疑难问题。

（4）本发明运用高通量测序技术进行人类血型全基因组测序，相关技术应用到稀有血型数据库的建设，为临床输血安全、免疫性溶血性疾病的预防、诊断与治疗提供有力的技术支持。

附图说明

图1示出了本发明的一个实施例的技术路线图。

图2示出了全基因组高通量测序对全血型系统相关基因的覆盖情况。

图3示出了全基因组分析流程，包括对测序的数据质控、比对统计、变异检测及变异位点注释等分析。

图4示出了30×全基因组测序数据分析结果。

图5示出了其中一个样本（Sample_1样本）的GYPA基因区间部分位点的SNP和INDEL基因注释信息，注：椭圆圈标注了突变的碱基，箭头所示变异位点的是否引起错义突变，横线表示变异位点所影响的基因区（如蛋白编码区，启动子区等）。

图6示出了Sample_1样本全基因组SNV变异检测及注释结果汇总。

图7示出了49例样本的变异碱基分析，共得到10782324个变异。

图8示出了49例样本共同存在的组合型突变。

图9示出了核酸序列分析平台的存储、服务器、数据库架构。

图10示出了36种血型近60个血型基因及相关基因检测的覆盖度及深度。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例 1

本实施例的的技术路线如图1所示。具体实施如下：

随机选取无偿献血者血液样本3000人份与平时积累的具代表性样本175例和家系调查样本，先以血型血清学检测红细胞糖蛋白对应的MNS血型抗原的型别以及红细胞表面抗原的剂量（与抗体血清的凝集强度），选取血清学具有代表性的样本采集DNA进行高通量全基因组测序。

应用高通量测序技术（NGS）对所选样本的基因组DNA进行随机打断，电泳回收所需长度的DNA片段（0.2～5kb），末端修复-加腺苷酸脱氧核糖核苷酸，接头连接，聚合酶链式反应，单链环化，制备Nanoball-加载芯片，利用PE100（BGISEQ）平台的方法对插入片段进行测序，一个样本的测序结果全基因组覆盖率如图2所示，全基因组覆盖率达到95%，20×覆盖率80%，全基因组覆盖率较好。

获得30×全基因组测序（WGS）数据，使用SOAPnuke软件对下机数据进行质量控制分析，过滤低质量的Reads，获得Q20合格Reads比例不低于90%，Q30合格Reads比例85%。重点剖析GPA、GPB、GPE分子对应的GYPA、GYPB、GYPE基因与融合基因GYP(A-B-A)、GYP(B-A-B)、 GYP(A-B)、GYP(A-B)的全长序列包括外显子、内含子以及UTR区域序列的所有信息，如图3所示。发明人测试了30×全基因组测序数据，血型基因检测率为100％，平均深度为30.3×，平均覆盖率为每个基因100％。MNS血型相关基因GYPA/GYPB/GYPE的覆盖率为98.3％，平均深度为25×，如图4所示。可以满足人类血型糖蛋白分子多态性即MNS血型疑难血型研究的需要。

通过BWA软件进行GYPA/GYPB/GYPE序列比对，GATK检测个体GPA、GPB、GPE分子对应基因的SNP、CNV、Indel、SV等变异。通过生物信息手段，注释变异位点，分析不同个体的GPA、GPB、GPE分子基因的变异类型。一个样本的检测结果如图5所示，注释信息如图6所示。

对突变区域克隆测序分析，应用Blood Typer软件对测序结果进行GPA、GPB、GPE融合分子表型（即MNS血型）相关抗原的预测，把新基因导入K562细胞进行过表达与验证，结合临床输血反应、同种免疫性疾病的预防与诊断及跟踪调查进行总结与归类。

剖析GPA/GPB/GPE融合基因与红细胞上糖蛋白分子表达之间的机理，阐明人类杂交血型糖蛋白的分子机制与临床同种免疫的相关性。

发明人通过建立人类血型全长基因序列分析的云平台与WGS系统等现代细胞生物学和分子生物学实验技术，完成了49例MNS血型抗原具有剂量效应的样本的全长基因检测，并完成了该49例样本的相关基因GYPA/GYPB/GYPE全长序列，使用case-control对变异碱基确认、数据的关联分析：对所有样本的GPA、GPB、GPE对应编码区基因、非编码区基因、调控基因及潜在关联基因等进行了关联分析，并使用千人基因组的中国汉族人群数据进行人群种族特异性过滤，排除因种族特异导致的关联位点，首次发现了49例M抗原具有剂量效应的样本均存在同样的组合型突变（如图7、图8所示）。

实施例2 云平台建立

如图9所示，发明人建立了用于全基因组测序血型分型的云平台同，包括OSS云存储模块、ESC云服务模块和RDS云数据模块。

OSS云存储模块单元，存储容量10T，用于测序数据存储，可供数据的长期保存和读写。

ECS云数据模块，为云服务器，配置了24核96GB运行内存，500GB高效SSD硬盘，具备多个全基因组并行计算能力，满足序列比对、变异检测、基因注释等多种生物信息计算需求。

RDS云数据库将对已研究及新发的血型遗传信息归档建库，建立血型信息数据库。

现有技术使用全基因组测序分型算法BloodTyper预测了12个血型的38个红细胞抗原表型，其准确性与初始的血清学和SNP结果一致性为99.5％。该方法能解决已知的核酸多态性和拷贝数变异的血型分型预测。对于新发现、疑难血型等尚不能满足分型预测需求，尤其是不能有效对疑难、未知的MNS型高同源基因区（GYPA/GYPB/GYPE）进行分型。

发明人对10×全基因组测序数据进行测试分析，血型基因检测率高达98%（56/57），平均深度4.6×，每个基因的平均覆盖度高达94%。其中MNS血型相关基因GYPA/GYPB/ GYPE的覆盖度达98.3%，平均深度4.4×，如图10所示。。

最终，通过结合最新的国际ISBT血型亚型数据，并结合千人基因组等多个组学项目人类基因组多样性血型亚型模式，产生的最全的血型基因数据库，包括MNS，ABO，RH等39种血型基因分型数据。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种基于高通量测序分析人类血型基因型的方法，特征在于，包括以下步骤：

S1，获取或采集人血液样本的基因组DNA；

S2，对所述基因组DNA进行高通量测序；

S3，对测序数据进行预处理后利用序列比对软件进行比对，并利用变异检测软件进行变异检测；

S4，克隆得到突变基因，并导入到K562细胞中进行过表达再用Western-Blot验证抗原型别；

S5，通过关联分析得到血型基因型分析数据。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述变异选自SNP、CNV、Indel和SV中的至少一种。

3.根据权利要求2任一所述的方法，其特征在于，步骤S3中所述比对是针对GYPA、GYPB、GYPE基因进行的。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤S4中进一步包括利用Blood Typer软件对测序结果进行GPA、GPB、GPE融合分子表型相关抗原进行预测的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤S3中还包括对融合基因GYP(A-B-A)、GYP(B-A-B)、GYP(A-B)、GYP(A-B)的全长序列进行比对和变异检测。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述全长序列包括外显子、内含子以及UTR区域序列。

7.根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，在步骤S3前进一步包括对测序序列进行质量控制的步骤。

8.权利要求1所述方法使用的试剂在制备用于分析人类血型基因型的试剂盒中的应用。

9.一种基于高通量测序分析人类血型基因型的系统，其特征在于，所述系统包括：

数据存储元件，用于存储高通量测序数据；

数据处理元件，与数据存储元件连接，用于对高通量测序数据进行包括序列比对、变异检测、基因注释的处理；

血型基因型数据库元件，与数据处理元件连接，用于存在血型基因型数据，

其中，当数据处理元件发现新的血型基因型时，将该血型基因型上传至血型基因型数据库元件，完成血型基因型数据库的更新。

10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述血型基因型数据库是指MNS血型基因型数据库。

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