CN1115343C - (1s,4r)-或(1r,4s)-4-(2-氨基-6-氯-9h-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇或其盐的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种用通式I或II表示的(1S,4R)-或(1R,4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇或其盐的制备方法。
Description
本发明涉及用式I或II表示的(1S,4R)-或(1R,4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇或其盐的新颖制备方法以及用通式XVI或XVII表示的光学活性化合物的新颖制备方法。
(1S,4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇是制备2-氨基嘌呤核苷的重要中间体,例如制备(1S,4R)-4-(2-氨基-6-环丙基氨基-9H-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇(WO/95/21 161)或制备1592U89(J.Org.Chem.,1996,61,4192-4193;J.Org.Chem.,1996,61,7963-7966)。
WO/95/21 161中描述了一种由(1S,4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-甲醇制备(1S,4R)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇的方法。该方法的缺点是前体(1S,4R)-4-氨基-2-环戊烯-1-甲醇只能通过被贵重的BOC保护基(叔丁氧羰基保护基)取代的(±)-2-氮杂-双环[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮制得(J.Org.Chem.,1995,60,4602-4616)。
本发明的目的是提供(1S,4R)-或(1R,4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇或其盐的简单、低成本和更经济的制备方法。
本发明的目的已由权利要求1所述的新颖方法达到。
本新颖方法的第一步是将用式III表示的(±)-2-氮杂-双环[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮酰化,产生用通式IV表示的(±)-2-氮杂-双坏[2.2.1.]庚-5-烯3-酮的衍生物,式中R1表示C1-4烷基、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基。
C1-4烷基可被取代或未被取代。下文中,取代的C1-4烷基是指被卤原子取代的C1-4烷基。卤原子可用F、Cl、Br或I。C1-4烷基的实例是甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、叔丁基、异丙基、氯甲基、溴甲基、二氯甲基、二溴甲基。用作C1-4烷基的较好是甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基或氯甲基。
可以用作C1-4烷氧基的例如是甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、叔丁氧基或异丁氧基。优选使用的C1-4烷氧基是叔丁氧基。
可以用作芳基的例如是苯基或苄基,较好是苯基。苄氧基或苯氧基例如可用作芳氧基。
前体(±)-2-氮杂-双环[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮可按EP-A 0508352中揭示的方法制备。
羰基卤化物的实例是:乙酰氯、氯乙酰氯、丁酰氯、异丁酰氯、苯基乙酰氯、氯甲酸苄酯(Cbz-Cl)、丙酰氯、苯甲酰氯、氯甲酸烯丙酯或叔丁氧羰基氟。羧酸酐的实例是:过二碳酸二叔丁酯(di-tert-butyl dicarbonate)、丁酸酐、乙酸酐或丙酸酐。
所述的酰化可在没有溶剂或加入非质子传递溶剂的条件下进行。
酰化宜在非质子传递溶剂中进行。合适的非质子传递溶剂的实例是二异丙醚、吡啶、乙腈、二甲基甲酰胺、三乙胺、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、N-甲基吡咯烷酮或它们的混合物。
酰化宜在-80-50℃,较好0-25℃的温度下进行。
还原宜用碱金属硼氢化物或碱土金属硼氢化物、碱金属铝氢化物或碱土金属铝氢化物或Vitride(二(2-甲氧基乙氧基)二氢铝酸钠)进行。氢化铝钠或氢化铝钾可用作碱金属铝氢化物。硼氢化钠或钾可用作碱金属硼氢化物。硼氢化钙可用作碱土金属硼氢化物。氮化铝例如可用作氮化物。
还原宜在质子传递溶剂中进行。可以使用的质子传递溶剂是低级脂肪醇,如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、仲丁醇、叔丁醇、异丁醇或水,或这些醇与水的混合物。
还原宜在-40-40℃,较好为0-20℃的温度下进行。
本新颖方法的第三步用微生物、具有N-酰氨基醇水解酶活性的酶或青霉素G酰基转移酶将用通式V表示的环戊烯衍生物转化为用式VI或VII表示的(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯,。这种生物转化将酰化的(1S,4R)或(1R,4S)-氨基醇衍生物转化成(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯(通式VI、VII)。
所有能将通式V表示的环戊烯衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物都适合于该生物转化。这些微生物可用常规的微生物学技术从土壤样品、污泥或废水中分离。通过用常规方法在含用通式V表示的环戊烯衍生物式中R1具有上述的含义,
· 作为唯一碳源和氮源
· 作为唯一氮源和合适碳源或
· 作为唯一碳源和合适氮源的营养培养基中培养这些微生物而进行分离。
用通式V表示的合适环戊烯衍生物的实例是:N-乙酰-、N-丙酰-、N-异丁酰-、N-叔丁氧羰基-(N-BOC)、N-丁酰-或N-苯基乙酰-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。
所述的微生物例如可将铵、硝酸盐、氨基酸或脲繁殖基质用作合适的氮源。所述的微生物例如可将糖、糖醇、C2-C4-羧酸或氨基酸繁殖基质用作合适的碳源。葡萄糖之类的己糖或戊糖可用作糖。甘油例如可用作糖醇。乙酸或丙酸例如可用作C2-C4-羧酸。亮氨酸、丙氨酸、天冬酰胺例如可用作氨基酸。
可以使用的选择基和培养基是本领域中普通技术人员常用的培养基(如表1中所述的培养基)或完全培养基(含酵母提取液的培养基)(如营养酵母汤(NYB),较好使用表1中所述的酵母汤)。
在培养和选择过程中,方便地诱导了微生物的活性酶。用通式V表示的环戊烯衍生物可用作酶的诱导物。
培养和选择一般在20-40℃,较好在30-38℃的温度和在5.5-8,较好在6.8-7.8的pH值的条件下进行。
该生物转化宜用将环戊烯衍生物的(1R,4S)异构体用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物进行。
该生物转化较好用产碱杆菌/博代特氏杆菌属、红球菌属、节细菌属、产碱杆菌属、土壤杆菌/根瘤菌属、芽胞杆菌属、假单胞菌属或戈登氏菌属微生物进行,特别是产碱杆菌/博代特氏杆菌属FB 188(DSM 11172)、红串红球菌CB 101(DSM10686)、节细菌属HSZ5(DSM 10328)、红球菌属FB 387(DSM 11291)、木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17(DSM 10329)、土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30、单纯杆菌K2、恶臭假单胞菌K32或戈登氏菌属CB 100(DSM 10687)以及它们功能等同的变异体和突变体。按布达佩斯条约,微生物DSM 10686和10687于20.05.1996保藏在德国微生物保藏和细胞培养股份公司(Mascheroderweg 1b,D38124Braunschweig),微生物DSM 10328和10329于06.11.1995保藏于该公司,微生物DSM 11291于08.10.1996保藏于该公司,微生物DSM 11172于20.09.1996保藏于该公司。
“功能等同的变异体和突变体”是指具有与原微生物基本上相同的性质和功能的微生物。这种变异体和突变体例如可用紫外辐射偶然产生。
产碱杆菌/博代特氏杆菌属FB 188(DSM 11172)分类说明
细胞形状 杆菌
宽度,微米 0.5-0.6
长度,微米 1.0-2.5
能动性 +
鞭毛突出 周毛的
革兰氏反应 -
被3%KOH溶解 +
氨肽酶(Cerny) +
芽胞 -
氧化酶 +
过氧化氢酶 +
ADH(醇脱氢酶) -
来源于NO3的NO2 -
反硝化作用 -
脲酶 -
明胶的水解 -
由下列化合物产生的酸(OF试验)
葡萄糖 -
果糖 -
阿拉伯糖 -
己二酸酯(盐) +
癸二酸酯(盐) +
柠檬酸酯(盐) +
苹果酸酯(盐) +
甘露糖醇 -
红串红球菌CB 101(DSM 10686)的分类说明
1.菌落的形态和颜色:短分支菌丝,老化时,它分裂成杆菌(rods)和球菌,菌落闪光和部分融合,带淡粉红色的原色,RAL 1001;
2.从肽聚糖中检出的氨基酸:内消旋-二氨基庚二酸;
3.霉菌酸:红球菌属霉菌酸;测定霉菌酸的链长(C32-C44)和将该数据与DSM霉菌酸数据库中的数据登记项比较,发现与红串红球菌菌株图谱(pattern)有很大的相似性(相似性:0.588)。
4.脂肪酸图谱:直链、饱和和不饱和脂肪酸和结核硬脂酸。
5.菌株的16S rDNA部分测序时,发现与红串红球菌特定区域的序列高度一致(100%)。
这种鉴定结果是明确的,因为三种相互独立的方法(霉菌酸、脂肪酸、16SrDNA)已确定该菌株是红串红球菌。
戈登氏菌属sp.CB 100(DSM 10687)的分类说明
1.菌落的形态和颜色:短分支菌丝,老化时,它分裂成杆菌和球菌,菌落为淡橙黄色,(RAL 2008);
2.从肽聚糖中检出的氨基酸:内消旋-二氨基庚二酸;
3.甲基萘醌类图谱:MK-9(H2)100%;
4.霉菌酸:戈登氏菌属霉菌酸;用高温气相色谱测定霉菌酸的链长(C50-C60)。该图谱相当于在戈登氏菌属样本中发现的图谱。
5.脂肪酸图谱:直链、饱和和不饱和脂肪酸和结核硬脂酸。
6.菌株的16S rDNA部分测序时,仅发现与深红戈登氏菌特定区域的序列较低的一致性(98.8%)。
根据这些可得的结果(甲基萘醌类图谱、霉菌酸、脂肪酸、16SrDNA),虽然可明确地将此分离物确定为戈登氏菌属,但不能根据这些结果确定它是已知的戈登氏菌属。因此,将菌株DSM10687假定为新的,未曾描述过的戈登氏菌属物种。
木糖氧化产碱菌反硝化亚种HSZ17(DSM 10329)的分类说明
该菌株的性质
细胞形状 杆菌
宽度,微米 0.5-0.6
长度,微米 1.5-3.0
能动性 +
鞭毛突出 周毛的
革兰氏反应 -
被3%KOH溶解 +
氨肽酶(Cerny) +
芽胞 -
氧化酶 +
过氧化氢酶 +
厌氧生长 -
ADH(醇脱氢酶) +
来源于NO3的NO2 +
反硝化作用 +
脲酶 -
明胶的水解 -
Tween 80的水解 -
由下列化合物产生的酸(OF试验)
葡萄糖需氧 -
木糖80 -
基质利用
葡萄糖 -
果糖 -
阿拉伯糖 -
柠檬酸酯(盐) +
苹果酸酯(盐) +
甘露糖醇 -
节细菌属HSZ5(DSM 10328)的分类说明表征鉴定: 具有显著杆菌-球菌生长循环的革兰
氏阳性不规则杆菌;严格需氧;在葡
萄糖中没有形成酸或气体。能动性 -芽胞 -过氧化氢酶 +细胞壁中的内消旋-二氨基庚二酸: 无肽聚糖类型: A3α,L-Lys-L-Ser-L-Thr-L-Ala16S rDNA序列相似性: 用滋养节杆菌,分枝节杆菌和氧化节
杆菌对变异性最大的区域进行测序时
发现的最大值为98.2%
土壤杆菌/根瘤菌属HSZ30的分类说明
细胞形状 多型杆菌
宽度(微米) 0.6-1.0
长度(微米) 1.5-3.0
革兰氏反应 -
被3%KOH溶解 +
氨肽酶 +
芽胞 -
氧化酶 +
过氧化氢酶 +
能动性 +
厌氧生长 -
由硝酸盐产生的亚硝酸盐 -
反硝化作用 -
脲酶 +
明胶的水解 -
从如下物质中产生酸:
L-阿拉伯糖 +
半乳糖 -
松三糖 -
岩藻糖 +
阿糖醇 -
甘露糖醇 -
赤藓醇 -
石蕊汁的碱化 +
酮乳糖 -
16S rDNA的部分测序揭示与土壤杆菌属和根瘤菌属的样本具有较大的相似性,约为96%。明确地将其确定为这些属内物种是不可能的。
单纯杆菌K2的分类说明
细胞形状 杆菌
宽度(微米) 0.8-1.0
长度(微米) 3.0-5.0
芽胞 -
椭圆体 -
圆形体 -
孢子囊 -
过氧化氢酶 +
厌氧生长 -
VP反应 n.g.
最大温度
正生长时温度,℃ 40
负生长时温度,℃ 45
在pH为5.7培养基中的生长 -
NaCl2% +
5% -
7% -
10% -
溶菌酶培养基 +
由下列物质产生酸(ASS)
D-葡萄糖 +
L-阿拉伯糖 +
D-木糖 -
D-甘露糖醇 +
D-果糖 +
由果糖产生的气体 -
卵磷脂酶 -
下列物质的水解
淀粉 +
明胶 +
酪蛋白 -
Tween 80 +
七叶苷 -
利用下列物质
柠檬酸盐 +
丙酸盐 -
由硝酸盐产生的亚硝酸盐 +
吲哚 -
苯丙氨酸脱氨基酶 -
精氨酸脱羟基酶 -
对细胞脂肪酸的分析确定它是芽胞杆菌属。
16S rDNA部分测序表明与单纯芽胞杆菌的相似性为100%。
恶臭假单胞菌K32的分类说明
细胞形状 杆菌
宽度(微米) 0.8-0.9
长度(微米) 1.5-4.0
能动性 +
鞭毛突出 极性>1
革兰氏反应 -
被3%KOH溶解 +
氨肽酶(Cerny) +
芽胞 -
氧化酶 +
过氧化氢酶 +
厌氧生长 -
色素
荧光性的 +
脓青素 -
ADH +
来源于硝酸盐的亚硝酸盐 -
反硝化 -
脲酶 -
明胶的水解 -
基质利用
己二酸酯(或盐) -
柠檬酸酯(或盐) +
苹果酸酯(或盐) +
D-扁桃酸酯(或盐) +
苯基乙酸酯(或盐) +
D-酒石酸酯(或盐) -
D-葡萄糖 +
海藻糖酶 -
甘露糖醇 -
苯甲酰甲酸酯(或盐) -
丙二醇 +
丁胺 +
苄胺 +
色胺 -
乙酰胺 +
马尿酸盐(或酯) +
细胞脂肪酸的分布型是恶臭假单胞菌属特有的。
16S rDNA的部分测序表明与门多萨假单胞菌和产碱假单胞菌的相似性约为98%。与恶臭假单胞菌的相似性为97.4%。
红球菌属sp.FB 387(DSM 11291)的分类说明
1.菌落的形态和颜色:短分支菌丝,老化时,它分裂成杆菌(rods)和球菌,菌落无光泽,淡粉橙红色RAL 2008;
2.从肽聚糖中检出的氨基酸:内消旋-二氨基庚二酸;
3.霉菌酸:红球菌属霉菌酸;
测定霉菌酸的链长(C32-C44)和将该数据与DSMZ霉菌酸数据库中的数据登记项比较表明与红球菌属红菌株图谱仅有很小的相似性(相似性:0.019)。这个相关系数太小,不能用于物种鉴定。
4.脂肪酸图谱:直链、饱和和不饱和脂肪酸和结核硬脂酸。
该脂肪酸图谱对于所有红球菌属样本及其紧密相关物(如分支杆菌属、诺卡氏菌属和戈登氏菌属)的判断是有价值的。为了区分到物种水平,通过计入脂肪酸图谱的定性和定量差别作了尝试。用数值方法将红球菌属sp.FB 387的脂肪酸图谱与数据库中的数据登记项进行比较。由于与上述的红球菌属物种只有小的相似性(0.063),用这种方法无法确认红球菌属sp.FB 387。
5.菌株的16S rDNA部分测序时,96-818由于相关性为97.9%而确认为混浊红球菌。这种顺序一致性远低于分类时明确确定物种所需的99.5%。
根据所得结果,可以假定菌株红球菌属sp.FB 387是一种新的、未曾描述过的红球菌属物种。
在这些微生物的常规初始培养后,生物转化可用休眠细胞(不再需要碳源和能源的非生长细胞)或生长细胞进行。这种生物转化较好用休眠细胞进行。
适于这种生物转化的具有N-酰氨基醇水解酶活性的酶例如可用本领域中常用的破裂法从上述的微生物细胞中分离出来。为此例如可用超声法或弗氏压榨法。较好从红串红球菌CB101(DSM 10686)微生物中分离这些酶。
合适的青霉素G酰基转移酶可从许多微生物中得到,如细菌和放线菌纲;具体地可从如下微生物中得到:大肠杆菌ATCC 9637、巨大芽胞杆菌、淡紫链霉菌ATCC 13664、诺卡氏菌属sp.ATCC13635、雷氏普罗威登斯菌ATCC 9918、粘性节细菌属ATCC 15294、藤黄红球菌ATCC 12975、产裼色链霉菌ATCC21289、无色杆菌属ATCC 23584和玫瑰色微球菌ATCC 416。特别地使用市售的青霉素G酰基转移酶,如来源于大肠杆菌(Boehringer Mannheim)或巨大芽胞杆菌的青霉素G酰基转移酶EC 3.5.1.11。
在优选的实施方式中,使用固定化的青霉素G酰基转移酶。
所述的生物转化可在本领域中常用的培养基中进行,如低摩尔浓度的磷酸盐、柠檬酸盐或Hepes缓冲液、水、营养酵母汁之类或表中所示的完全培养基。该生物转化较好在表1所示的培养基或低摩尔浓度磷酸盐缓冲液中进行。
该生物转化宜在一次或连续加入环戊烯衍生物(式V)使其浓度不超过10%重量,较好不超过2%重量的条件下进行。
生物转化时的pH可以为5-9,较好为6-8。该生物转化时的温度宜为20-40℃,较好为25-30℃。
在第四步中,用式VIII表示的N-(2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺将环戊烯衍生物(式VI或VII)转化为用通式IX或X表示的(1S,4R)-或(1R,4S)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基4-嘧啶基)-氨基]-2-环戊烯1-甲醇。N-(2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺可按WO95/21161中揭示的方法制备。
第四步的反应宜在碱的存在下进行。可以使用有机碱或无机碱。三烷基胺可用作有机碱。所用三烷基胺的实例是三乙胺、三丁胺、三苄胺、吡啶或N-甲基吡咯烷酮。可用无机碱的实例是碱金属碳酸盐或碱土金属碳酸盐、或碱金属碳酸氢盐或碱土金属碳酸氢盐,如碳酸钾和碳酸氢钠。
第四步中的反应宜在质子传递溶剂中进行。低级烷基醇可用作质子传递溶剂,如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇或异丁醇。
进行第四步反应的温度宜为0-150℃,较好为20-100℃。
在第五步中,按WO95/21161中揭示的已知方法将(1R,4S)-或(1S,4R)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)-氨基]-2-环戊烯1-甲醇(式IX、X)环化,产生用式I或II表示的最终产物。
环化一般在浓的含水酸(aqueous acid)存在下溶解在原甲酸三烷基酯中进行。可以使用的原甲酸三烷基酯是原甲酸三甲酯或原甲酸三乙酯。例如盐酸、硫酸或甲磺酸可用作含水酸。
本发明还涉及用通式XVI或XVII表示的光学活性化合物的制备方法,式中R1具有上述的含义。这些化合物可通过用上述的微生物、N-酰氨基醇水解酶或青霉素G酰基转移酶将用通式V表示的环戊烯衍生物式中R1具有上述的含义,转化成用式VI或VII表示的(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯,后者被酰化成用式XVI或XVII表示的化合物。
微生物转化和酰化都在与上述相同的条件下进行。
酰化时的温度宜为20-100℃,较好为0-80℃。
用本方法制备的光学活性化合物的实例是:对映体过量为98%的(1R,4S)-N-叔丁氧羰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯、对映体过量为98%的(1R,4S)-N-乙酰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯、对映体过量为98%的(1R,4S)-N-丁酰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯以及光学活性的(1S,4R)-N-乙酰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯和光学活性的(1S,4R)-N-丁酰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。
在这些化合物中,光学活性的(1R,4S)-N-丁酰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯是文献中还未报道过的化合物。因此,本发明也涉及对映体过量大于0%,较好至少为80%、90%或95%,特别至少为98%的光学活性N-丁酰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。这些光学活性的化合物可用本领域中普通技术人员已知的方法外消旋化,产生文献中还未报道过的外消旋-N-丁酰基-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。
用通式XIII表示的外消旋或光学活性的4-(羟甲基)-2-环戊烯衍生物的制备方法如下式中R1具有上述的含义,在第一步中用通式XI表示的羰基卤化物式中R1和X具有上述的含义,将用通式XIV表示的环戊烯-4-羧酸外消旋体或其光学活性异构体之一酰化形成用通式XV表示的外消旋或光学活性的环戊烯-4-羧酸衍生物,第二步中将后者还原产生用通式XIII表示的所需产物。
光学活性的4-(羟甲基)-2-环戊烯衍生物(通式XIII)和光学活性的环戊烯-4-羧酸衍生物(通式XV)是指相应的(1R,4S)或(1S,4R)异构体。
本方法的第一步(酰化)用通式XI表示的羰基卤化物进行。可以使用的羰基卤化物与上述的相同。优选使用叔丁氧羰基氟。
进行第一步反应的pH宜为8-14,较好为12-14,温度宜为0-50℃,较好为15-25℃。
合适的溶剂是水与醚的混合物。可以使用的醚是二噁烷、四氢呋喃、乙醚、乙二醇二甲醚或乙二醇二乙醚。
本方法的第二步(还原)可用碱金属铝氢化物、硼烷/二C1-4烷基硫醚加成物或硼烷/四氢呋喃加成物进行。氢化铝锂、氢化铝钠或氢化铝钾可用作碱金属铝氢化物。优先使用氢化铝锂。硼烷/二甲硫、硼烷/二乙硫、硼烷/二丙硫或硼烷/二丁硫加成物可用作硼烷/二C1-4烷基硫醚。优选使用硼烷/二甲硫加成物。
第二步中,宜将上述无水醚之一用作溶剂。
第二步反应的温度可为-50-5℃,较好-25至-10℃。
实施例
实施例1
(±)-2-乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
在氮气氛下将100克(±)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(800毫升)和吡啶(161.26毫升)中。12℃时,滴加104.5克乙酰氯,历时2小时。然后在室温下将该混合物搅拌4.5小时。在此混合物中加入800毫升水,真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次,每次400毫升。合并的有机相用1N HCl(400毫升)、水(400毫升)、饱和氯化钠(400毫升)洗涤,用硫酸镁干燥,蒸发至干。将残余物溶解在二氯甲烷中,用硅胶过滤。将滤液浓缩,蒸馏纯化产物。得到107.76克透明液体产物。产率为71%。
沸点(0.07乇):51℃
1H-NMR(CDCl3):6[ppm]400HHz 2.25(AB syst.,2H)
2.8(s,3H)
3.42(m,1H)
5.30(m,1H)
6.89(m,1H)
6.92(m,1H)
实施例2
(±)-2-丁酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
在氮气氛下将100.3克(±)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(720毫升)和吡啶(142毫升)中。12℃时,滴加141.8克丁酰氯,历时1小时。然后在室温下将该混合物搅拌3小时。在此混合物中加入720毫升水并分相,真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次,每次300毫升。合并的有机相用1N HCl(350毫升)、饱和氯化钠(500毫升)和水(400毫升)洗涤,用硫酸镁干燥,完全蒸发。蒸馏纯化产物。得到107.76克透明液体产物。产率为85%。
沸点(0.05乇):70℃
1H-NMR(CDCl3):δ[ppm]400HHz 0.98(t,J=8.5Hz,3H)
1.58-1.65(2H)
2.23(AB syst.,2H)
2.82-2.90(23H)
3.42(m,1H)
5.30(m,1H)
6.62(m,1H)
6.90(m,1H)
实施例3
(±)-2-苯乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
在氮气氛下将33.4克(±)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(240毫升)和吡啶(48.3毫升)中。12℃时,滴加68.6克苯乙酰氯,历时30分钟。然后在室温下将该混合物搅拌3.5小时。在此混合物中加入240毫升水,真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次,每次150毫升。合并的有机相用1N HCl(150毫升)、饱和氯化钠(150毫升)和水(150毫升)洗涤,用硫酸镁干燥,完全蒸发。粗产物用硅胶过滤(己烷∶乙酸乙酯=1∶1)。得到78.34克黄色油粗产物。
实施例4
(±)-2-丙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
在氮气氛下将47克(±)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(325毫升)和吡啶(41毫升)中。12℃时,滴加43.9克丙酰氯,历时1小时。然后在室温下将该混合物搅拌5小时。在此混合物中加入145毫升水,真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取三次,每次115毫升。合并的有机相用1N HCl(140毫升)、饱和碳酸氢钠(40毫升)和氯化钠溶液(40毫升)洗涤,用硫酸钠干燥,完全蒸发。蒸馏纯化残余物。得到55.8克标题产物。放置时固化。产率为81.6%。
沸点(2.8毫巴):75-80℃
熔点:54-56℃1H-NMR(DMSO-d6):6[ppm]400HHz 0.95(t,3H);
2.10(quart.1H);
2.28(quart.1H);
2.64(m,2H);
3.42(s,1H);
5.16(s,1H);
6.78(m,1H);
6.96(m,1H).
实施例5
(±)-2-异丁酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
在氮气氛下将45.1克(±)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙腈(310毫升)和吡啶(39毫升)中。10℃时,滴加54.1克异丁酰氯,历时1小时。然后在室温下将该混合物搅拌5小时。在此混合物中加入140毫升水并分相,真空下蒸掉乙腈。水相用乙酸乙酯萃取四次,每次120毫升。合并的有机相用1N HCl(50毫升)、碳酸氢钠饱和溶液(50毫升)和氯化钠(50毫升)洗涤,用硫酸镁干燥,完全蒸发。将残余物放在已加入活性炭的正己烷(240毫升)中回流沸腾,滤去活性碳,将滤液冷却到0℃,过滤标题化合物。得到54.5克产物。产率为76%。
熔点:41-42℃1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400HHz 0.92(d,3H)
1.06(d,3H)
2.10(m,1H)
2.28(m,1H)
3.40(m,2H)
5.16(s,1H)
6.78(m,1H)
7.92(m,1H)
实施例6
(±)-2-氯乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮的制备
10℃时,在氮气氛下将10.1克(±)-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在二氯甲烷(10毫升)、吡啶(8.4毫升)和0.22克4-N,N-二甲氨基吡啶的混合物中。滴加13.5克氯乙酰氯,历时1小时。将温度升至44℃。然后在室温下将该混合物再搅拌2小时。在此溶液中加入100毫升水。分相后,水相用100毫升二氯甲烷萃取。合并的有机相用硫酸钠干燥,完全蒸发。在1克活性炭存在下将残余物放在100毫升异丙醚中回流沸腾10分钟。热过滤后,将滤液冷却至室温,过滤出固体并加以干燥。得到10.35克标题产物。产率为60%。
熔点为86-88℃
1H-NMR(CDCl3):6[ppm]400HHz 2.28(d,1H);
2.40(d,1H);
3.48(s,1H);
4.56(d,2H);
5.30(s,1H);
6.70(d,1H);
6.94(m,1H).
实施例7
(±)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
氮气氛下将79.56克(±)-2-乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(450毫升)中,冷却到-10℃。分批加入19.8克硼氢化钠,历时45分钟。
在0℃搅拌反应3小时,然后用浓硫酸将pH调节到1.8。在此混合物中加入乙酸乙酯(200毫升),过滤掉固体。然后完全蒸发。将残余物放在水中,用二氯甲烷洗涤,并蒸发。粗产物用硅胶过滤提纯。得到51.83克白色固体产物。按所用的(±)-2-乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮计,产率为64%。1H-NMR(DMSO-d6):5[ppm]400MHz 1.18(m,1H);
1.78(s,3H);
2.29(m,1H);
2.66(m,1H);
3.25(s,2H);
4.58(s,1H);
4.72(m,1H);
5.61(d,1H);
5.85(d,1H);
7.83(d,1H).
实施例8
(±)-1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
氮气氛下将73.87克(±)-2-丁酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(400毫升)中,冷却到-10℃。分批加入15.68克硼氢化钠,历时45分钟。在0℃搅拌反应3小时,然后用浓硫酸将pH调节到1.5。在此混合物中加入乙酸乙酯(200毫升),过滤掉固体。然后完全蒸发。将残余物放在水中,用二氯甲烷洗涤,并在真空下蒸发干燥。得到60.55克产物。按所用的(±)-2-丁酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮计,产率为80%。熔点:71-72℃
1H-NMR(CDCl3):δ[ppm]400MHz 0.98(t,J=8.5Hz,3H);
1.40-1.50(1H);
1.58-1.68(2H);
2.10-2.18(2H);
2.42-2.55(1H);
2.85(m,1H);
3.62(AB syst.,2H);
4.98(m,1H);
5.78-5.82(2H);
6.38(m,1H).
实施例9
(±)-1-苯乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
氮气氛下将77克粗的(±)-2-苯乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在乙醇(450毫升)中,冷却到-10℃。分批加入13.2克硼氢化钠,历时1小时。室温下搅拌反应3.5小时,然后用浓硫酸将pH调节到1.8。该混合物用硅胶过滤法纯化(己烷∶乙酸乙酯=2∶8)。用乙酸乙酯重结晶后,得到15.89克白色固体。按所用的(±)-2-苯乙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮计,产率为80%。1H-NMR(CDCl3):δ[ppm]400MHz 1.28-1.35(1H);
1.40(m,1H);
2.38-2.45(1H);
2.79(m,1H);
3.50(AB syst.,2H);
3.52(s,3H);
4.98(m,1H);
5.75(m,2H);
5.98(m,1H);
7.20-7.38(5H).
实施例10
(±)-1-BOC-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备(BOC=叔丁氧羰基)
室温时,在氮气氛下将15克粗的(±)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐(按J.Org.Chem.1981,46,3268中所述的方法制备)溶解在150毫升水和150毫升二噁烷的混合物中。用1N NaOH将该溶液的pH调节到14,然后加入叔丁氧羰基氟(BOC-F,20%过量)的乙醚溶液,让该混合物在室温下搅拌3小时(BOC-F按Synthesis 1975,599中所述的方法制备)。用浓盐酸将pH调节到2。蒸馏掉有机溶剂后,在残余物中加入50毫升水,用乙酸乙酯对该混合物萃取3次,每次100毫升。将合并的有机相完全蒸发。残余物放在100毫升二异丙醚和80毫升正己烷的混合物中结晶。得到11.95克标题产物。产率为56%。熔点:68-70℃。1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400MHz 1.18(m,1H);
1.38(s,9H);
2.26(m,1H);
2.65(m,1H);
3.33(t,2H);
4.45(m,1H);
4.55(t,1H);
5.62(m,1H);
5.79(m,1H);
6.73(d,1H).
实施例11
(±)-1-丙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
氮气氛下将16.6克(±)-2-丙酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(140毫升)和2-丁醇(66毫升)中,冷却到-5℃。分批加入3克硼氢化钠,历时2小时。在10℃将此混合物搅拌2.5小时,然后用浓盐酸和水的混合物(1∶1)将pH调节到2.2。将此溶液蒸发至40克,用2N NaOH将pH调节至6.2。该混合物用二氯甲烷萃5次,每次50毫升。将合并的有机相完全蒸发,残余物放在甲苯(150毫升)中重结晶。得到11.1克标题产物。产率为65%。
熔点:67-68℃。1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400MHz 0.96(t,3H);
1.16(quint.,1H);
2.04(quart.,2H);
2.26(m,1H);
2.66(m,1H);
3.34(m,2H);
4.58(t,1H);
4.72(m,1H);
5.61(m,1H);
5.84(m,1H);
7.72(d,1H).
实施例12
(±)-1-异丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的制备
氮气氛下将9克(±)-2-异丁酰基-2-氮杂二环[2.2.1]庚-5-烯-3-酮溶解在水(32毫升)和2-丁醇(84毫升)中,冷却到0℃。分批加入1.37克硼氢化钠,历时3.5小时。在20℃将此混合物再搅拌3小时,然后用浓盐酸和水的混合物(1∶1)将pH调节到2.5,然后用2N NaOH中和。将此溶液蒸发至40克。残余物用二氯甲烷萃3次,每次80毫升。将合并的有机相完全蒸发,将产生的固体放在甲苯(25毫升)中结晶。得到6.8克标题产物。产率为73.6%。
熔点: 80-81℃。1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400MHz 0.98(d,3H);
1.16(quint.,1H);
2.30(m,2H);
2.68(m,1H);
3.32(t,2H);
4.58(t,1H);
4.70(m,1H);
5.61(m,1H);
5.82(m,1H);
7.68(d,1H).
实施例13
用青霉素G酰基转移酶制备(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
来源于大肠杆菌的青霉素G酰基转移酶EC 3.5.1.11(Boehringer Mannheim)165U(单位)/克或来源于巨大芽胞杆菌的青霉素G酰基转移酶3.5.1.11被用于生物转化。
为此,在37℃用1%重量非外消旋的1-苯基乙酰氮基-4-羟甲基-2-环戊烯和400毫克合适的青霉素G酰基转移酶在50mM磷酸钠缓冲溶液(pH5-9,4毫升)中温育。
在一定的时间间隔后取样,用薄层色谱(硅胶60,丁醇∶水∶冰醋酸=3∶1∶1;茚三酮检测)、气相色谱(毛细管柱,HP-5,5%苯基甲基硅氧烷)或高压液相色谱(HPLC)进行分析。该酶高活性地除去苯基乙酰基,从而释放出高达40%的相应氨基醇。得到对映体过量为80%的游离氨基醇。
实施例14
用微生物制备(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
14.1 37℃和摇动下将来自Visp的ASA水处理厂的污泥培育在含0.5%重量1-乙酰、1-丙酰、1-异丁酰或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的A+N培养基中(参见表1)。用薄层色谱跟踪(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的生成。
用1%的富集物进行1-3转移,在固体培养基(表1中所示培养基中的平板计数琼脂;20克/升)上进行分离。用这种方法分离微生物产碱杆菌属/博代特氏杆菌属FB 188(DSM 1172)、红球菌属erythropolis CB 101(DSM 10686)、戈登氏菌属sp.CB 100(DSM 10687)和红球菌属sp.FB 387(DSM 11291)。
14.2将用这种方法分离得到的微生物培养在在含0.5%重量1-乙酰、1-丙酰、1-异丁酰或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的培养基中(参见表1)。在24-36小时内它们生长到光学密度(OD)为2-3。将用这种方法获得的细胞在后指数生长期中收集,并用10mM磷酸盐缓冲溶液洗涤。
在含1%重量1-乙酰、1-异丁酰或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的50mM磷酸盐缓冲溶液中(pH4.5-9)进行随后的生物转化。用薄层色谱检测发现,50%的底物被水解成(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。高压液相色谱分析揭示的对映体过量为80-93%。
当1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯用作底物时,并在A+N培养基上进行培育时,菌株DSM 10686的生物转化速率为0.14(g/l/h/OD),当在含1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的NYB(酵母营养汁)培养基上进行培育时,其生物转化速率为0.03(g/l/h/OD)。
当在底物(1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯)浓度为200mM的条件下用菌株DSM 10687进行相同的转化时,生物转化速率为0.161(g/l/h/OD).
表1A+N培养基 MgCl2 0.4克/升CaCl2 0.014克/升FeCl3 0.8毫克/升Na2SO4 0.1克/升KH2PO4 1克/升Na2HPO4 2.5克/升NaCl 3克/升维生素溶液 1毫升/升微量元素溶液 1毫升/升pH7.514.3 30℃时,在6升发酵桶中的将乙酸铵(3克/升)用作碳源和氮源的最低培养基(参见表2)上把红串红球菌DSM 10686培养到OD650>25的细胞密度。在细胞生长过程中,连续加入50%乙酸,作为附加碳源。然后为了诱导酶活性,加入60克(+/-)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯,继续培养几小时。最后再加入40克(+/-)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯,然后再培养10小时。生物转化过程用线上高压液相色谱跟踪。当按所用的外消旋底物计算分析产率为40%,对映体过量达85%时,加入酸使发酵停止。
表2
培养基组成
组分 浓度
酵母萃取物 0.5克/升
胨M66 0.5克/升
KH2PO4 4.0克/升
Na2HPO42H2O 0.5克/升
K2SO4 2.0克/升
乙酸铵 3.0克/升
CaCl2 0.2克/升
MgCl2·6H2O 1.0克/升
微量元素溶液 1.5毫升/升
(见下)
PPG(聚丙二醇) 0.1克/升
微量元素溶液
KOH 15.1克/升
EDTA·Na2·2H2O 100.0克/升
ZnSO4·7H2O 9.0克/升
MnCl2·4H2O 4.0克/升
H3BO3 2.7克/升
CoCl2·6H2O 1.8克/升
CuCl2·2H2O 1.5克/升
NiCl2·6H2O 0.18克/升
Na2MoO4·2H2O 0.27克/升
14.4按类似于实施例14.3的方法,在含或不含1-乙酰、1-丙酰、1-异丁酰或1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯(下文中缩写为氨基醇)的培养基(表1)中的乙酸钠上培养微生物节细菌属sp.HSZ 5(DSM 10328)、红球菌属sp.FB 387(DSM11291)、木糖氧产碱杆菌反硝化亚种HSZ 17(DSM 10329)、土壤杆菌/根瘤菌属HSZ 30、单纯杆菌K2和恶臭假单胞菌K32。
用没有氨基醇存在下培养的指数细胞得到如下结果(高压液相色谱分析):
菌株 速度[mmol/OD.h] ee/转化(%)
HSZ 5(DSM 10328) 0.05 88.7/16
HSZ 17(DSM 10329) 0.005 95/23
K32 0.05 54/1
CB101(DSM 10686) 0.1 84/39
培养和收集菌株K2和K17,并进行60小时生物转化。
菌株 速度[mmol/OD.h] ee/转化
K2 - 92/10
HSZ 30 - 93/3.5
收集各批的指数细胞(exponential cell)和静态细胞(stationary cell),并用作生物转化的休眠细胞(quiescent cell)。根据薄层色谱分析,用氨基醇诱导或不用氨基醇诱导的细胞的初始速度没有明显的区别。
实施例15
从红串红球菌CB 101(DSM 10686)中提纯N-乙酰氨基-醇水解酶
按下述方法提纯酶,直到SDS-PAGE(Pharmacia Phast凝胶,10-15%梯度)只有一个分子量为50kD的蛋白带为止。
红串红球菌CB 101(DSM 10686)细胞用50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH6.2)洗涤,然后浓缩到光学密度OD650nm为190。加入苯基甲磺酰氟(PMSF)到最后浓度为1mM及DNA酶后,用弗氏压榨机处理细胞,以获得粗的提取液。离心产生蛋白浓度为4.8毫克毫升-1的不含细胞的提取液。
将960毫克无细胞提取液装入一根HiLoad 26/10 Q-Sepharose离子交换色谱柱(Pharmacia)中。该色谱柱已用含1mM二硫苏糖醇(DTT)的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)平衡。
该柱用相同的缓冲液洗涤后,蛋白质用线性缓冲液梯度洗脱(linear buffergradient)(1500毫升;梯度:含1mM DTT的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.0)-含1mM DDT和1M NaCl的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH7.0)。该酶在370-430mM NaCl间和pH为7.6处从柱中洗脱。收集活性部分,并浓缩到9毫升。蛋白含量为41毫克。
为进一步提纯,将该蛋白溶液装在HiLoad 26/60 Superdex 75凝胶过滤色谱柱(Pharmacia)中。该柱已用含50mM NaCl和1mM DTT的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液平衡。合并活性部分,总的蛋白含量为10.9毫克。
将该蛋白溶液装在Mono Q HR5/5柱(Pharmacia)中。该柱已用含1mM DTT的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.5)平衡。蛋白质用含1mM DTT的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.5)-含1mM DDT和1M NaCl的50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH8.5)线性梯度(40毫升)洗脱。该酶在390-440mnM NaCl间洗脱。活性部分含1.4毫克蛋白。
在最后的提纯步骤中,使用用相同缓冲液平衡后的相同柱。所用的洗脱梯度是含0-500mM NaCl和pH为7.0-8.5的相同缓冲液。用这种方法可以分离430微克纯酶。
从蛋白印迹直接确定酶的N-末端顺序。得到如下20个氨基酸的顺序:Thr-Glu-Gln-Asn-Leu-His-Trp-Leu-Ser-Ala-Thr-Glu-Met-Ala-Ala-Ser-Val-Ala-Ser-Asn。
这种顺序与已知的蛋白没有同源性。
实施例16
酶的表征
用纯化的酶和已用Sephadex G-25柱(PD-10,Pharmacia)脱盐的无细胞提取液进行酶特性表征。
无细胞提取液中蛋白浓度为7.3毫克毫升-1,纯化酶中的蛋白浓度为135微克毫升-1。在无细胞提取液中不加入PMSF。
16.1Km测定
在无细胞提取液中进行Km测定。底物1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯在pH为7.0和温度为30℃的条件下的反应Km为22.5mM。
16.2最佳pH值
在如下缓冲溶液中,用纯化的酶和无细胞提取液在pH为6.2-9.0的范围内测定1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯(25mM)水解时的最佳pH值。
三羟甲基氨基甲烷缓冲液100mM pH9.0;8.5;8.0;7.5;7.0
柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液100mM pH7.0;6.55;6.2
活性测量进行24小时。
制备1R,4S和1S,4R对映体的反应的最佳pH值为pH7.0-7.5。
无细胞提取液活性的最佳pH值为pH7.0。然而在pH为6.0至7.0之间,选择性更好。
图1表示从红串红球菌CB 101(DSM 10686)提取的N-乙酰氨基醇水解酶(无细胞的提取液)的活性与pH的关系。实施例16.2所示的反应最佳温度为25-30℃。
图2表示从红串红球菌CB 101(DSM 10686)提取的N-乙酰氨基醇水解酶(无细胞的提取液)的活性与温度的关系。
16.4用SDS-PAGE测得的分子量为50kD。
16.5将如下底物水解:1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯、1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯、1-丙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯、1-异丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯。
实施例17
制备(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐
将374.1克(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯溶液(按与实施例14相似的方法制备)蒸发至123.7克。用30%强度的NaOH将含60.2毫摩尔上述化合物(高压液相色谱)的溶液从pH2调节到pH11.7。然后用异丁醇萃取三次,每次70毫升。用氯化氢气体将合并的异丁醇萃取液调节到pH为1,浓缩到65克,过滤(除去固体杂质)。20℃时,在激烈搅拌的滤液中滴加60毫升丙酮。在混浊的混合物中加入标题化合物的晶种,在5℃搅拌1小时。过滤和干燥后得到5.2克产物,产率为58%。
熔点:125-127℃
对映体过量为98%(校准的手性高压液相色谱柱)1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400Mhz 1.44(m,1H)
2.35(m,1H);
2.83(m,1H)p
3.42(m,2H);
4.10(s,1H);
4.80(d,1H);
5.80(d,1H);
6.06(d,1H);
8.13(s,3H).
实施例18
制备(1R,4S)-1-BOC-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
用30%强度的NaOH将75克(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯(按与实施例14相似的方法制备;44.6毫摩尔化合物)溶液调节至pH为8,加入6克碳酸氢钠。将混合物加热至52℃。激烈搅拌下,加入60毫升二异丙醚,然后在2小时内滴加11.12克叔丁氧羰基酸酐在18.2毫升二异丙醚中的溶液。用硅藻土(Celite)过滤该混合物,然后分相。水相用65毫升二异丙醚萃取。合并的有机相用45毫升水洗涤,然后蒸发至37.5克,加热至50℃。在该溶液中滴加31毫升正己烷。然后慢慢冷却到0℃(2小时),过滤出标题产物,用12毫升正己烷/二异丙醚(1/1)洗涤,并干燥。得到6.75克产物。产率为71%。
熔点: 70-71℃
对映体过量为98%(校准的手性高压液相色谱柱)1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400Mhz 1.18(m,1H);
1.27(s,9H);
2.28(m,1H);
2.63(m,1H);
3.33(q,2H);
4.43(m,1H);
4.56(t,1H);
5.62(m,1H);
5.78(m,1H);
6.72(d,3H).
实施例19
制备(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐
将87.8克(1R,4S)-1-BOC-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯溶解在270毫升2N盐酸和1340毫升甲醇中。将此混合物加热回流4.5小时。蒸馏掉甲醇后,将残余物溶解在800毫升水中。该水溶液用乙酸乙酯萃取二次,每次340毫升。完全蒸发水相(50℃/60毫巴)。50℃时将固体真空干燥,将其悬浮在150毫升乙醚中,过滤,并用50毫升乙醚洗涤二次。干燥后产生标题产物,产率为95%(58.4克)。
产物的物理数据和光谱数据与实施例17中相同。
实施例20
制备(1R,4S)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
将25克(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐溶解在182毫升乙酸酐中,0℃时,加入18.25克三乙胺在60毫升乙酸酐中的溶液。80℃时,将此混合物搅拌3小时,然后冷却至室温。过滤掉三乙胺盐酸盐,用120毫升正己烷洗涤。将滤液蒸发。残余物与300毫升甲苯混合,加入5.2克活性炭和13硅藻土后,在室温下搅拌20分钟。过滤和洗涤滤饼后(3×40毫升)甲苯,将溶剂完全蒸发掉。残余物与180毫升甲醇和15.5克碳酸钾混合,在室温下搅拌10小时。过滤悬浮液,并蒸发滤液。将残余物悬浮在750毫升乙酸异丙酯中,加入0.5克活性炭后加热回流1.5小时。过滤掉活性炭后(70-80℃),将滤液在0℃冷却过夜。过滤出标题化合物,用80毫升冷的乙酸异丙酯洗涤,真空干燥。得到17.2克产物。产率为66%。
熔点:77-80℃
对映体过量为98%(校准的手性高压液相色谱柱)1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400MHz 1.15(m,1H)
1.78(s,3H);
2.25(m,1H);
2.66(m,1H);
3.35(m,2H);
4.58(t,1H);
4.70(m,1H);
5.62(m,1H);
5.85(m,1H);
7.80(d,3H).
实施例21
制备(1S,4R)-1-乙酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
用25克(1S,4R)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐原料按实施例18的方法可以制备标题对映体(产率为68%)。产物的光谱数据和物理数据与实施例20相同。
实施例22
制备(1R,4S)-1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
将34.7克(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐和2克4-N,N-二甲氨基吡啶溶解在600毫升二氯甲烷中。将溶液冷却至0℃。然后滴加入52克三乙胺(5分钟)。将此混合物再搅拌30分钟。0℃时,将35.2克丁酰氯溶解在60毫升二氯甲烷中生成的溶液滴加到该混合物中,历时1小时。在0-20℃,将混合物再搅拌1.5小时,然后加入600毫升水。分相后,用600毫升二氯甲烷萃取水相。合并的有机相用10%强度氢氧化钠洗三次,每次500毫升。然后将其完全蒸发。将干燥的固体溶解在120毫升甲醇中。将此溶液与5克碳酸钾混合,在室温下再搅拌2小时。过滤掉无机盐,用20毫升甲醇洗涤。滤液用2N盐酸中和。过滤悬浮液,滤饼用20毫升甲醇洗涤。将滤液完全蒸发。将固体残余物干燥,并放在150毫升甲苯中结晶。得到28.5克标题化合物。产率为67%。
熔点:71-72℃
对映体过量为98%(校准的手性高压液相色谱柱)1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400MHz 0.85(t,3H);
1.15(m,1H);
1.50(q,2H);
2.03(d,2H);
2.28(m,1H);
2.67(m,1H);
3.35(d,2H);
4.62(s,1H);
4.76(m,1H);
5.63(m,1H);
5.85(m,1H);
7.77(d,1H).
实施例23
制备(1S,4R)-1-丁酰氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
用34.7克(1S,4R)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐原料按实施例20的方法可以制备标题对映体(产率为63%)。产物的光谱数据和物理数据与实施例22相同。
实施例24
制备(1R,4S)-1-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)氨基]-4-羟甲基-2-环戊烯
在40毫升异丁醇中将2.07克N-(2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺加热到80℃(白色悬浮液)。在此混合物中加入1.97克(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯盐酸盐、3.8克三乙胺和15毫升异丁醇的溶液。将此混合物在80℃再搅拌13小时。20℃时在此透明溶液中加入10毫升1N氢氧化钠,然后蒸发至干。对残余物进行闪蒸色谱(硅胶60柱、长度8厘米、直径为6.5厘米、洗脱剂为乙酸乙酯/甲醇95/5)。蒸发掉洗脱剂和干燥残余物后,得到2.1克标题产物。产率为74%。
熔点:174-176℃
对映体过量为98%(校准的手性高压液相色谱柱)1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400MHz 1.37(m,1H);
2.35(m,1H);
2.73(m,1H);
3.38(t,2H);
4.68(m,1H);
5.08(m,1H);
5.70(d,1H);
5.85(d,1H);
6.40;6.55和6.65(s,dd,共3H);
7.78和8.10(d和s,共1H);
8.55和8.95(d和s,共1H).
实施例25
制备(1R,4S)-1-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)氨基]-4-羟甲基-2-环戊烯
将145.2毫升(1R,4S)-1-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯的溶液(按与实施例14相似的方法制备)浓缩到25.5毫升,用硅藻土过滤。滤饼用7.5毫升水洗涤。用浓盐酸将含17.7毫摩尔上述的化合物(HPLC)的滤液的pH由6.6调节到1,然后用异丁醇萃取三次,每次20毫升。丢弃有机相。用30%强度的氢氧化钠将水相的pH调节到12,用异丁醇萃取3次,每次10毫升。将合并的有机相蒸发至15毫升,加入2.53克三乙胺。按实施例24中的方法在此混合物中加入2.07克N-(2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺在40毫升乙醇中的溶液。将此混合物在80℃搅拌16小时。按实施例22的方法进行后处理,得到2.4克标题产物。产率为85%。
产物的物理和光谱数据与实施例24相同。
实施例26
制备(±)-1-BOC-氨基-2-环戊烯-4-羧酸
在氮气氛保护下,室温时将16.4克粗的(±)-1-氨基-2-环戊烯-4-羧酸盐酸盐(按J.Org.Chem.1981,46,3268中所述的方法制备)溶解在80毫升水和80毫升二噁烷的混合物中。用1N氢氧化钠将此混合物的pH调节到14,然后加入叔丁氧羰基氟(BOC-F,20%过量)的乙醚溶液(BOC-F按Synthesis 1975,599中所述的方法制备)。室温下将此混合物再搅拌5小时。用浓盐酸将pH调节至2。蒸馏掉有机溶剂后,在残余物中加入50毫升水。该混合物用乙酸乙酯萃取三次,每次100毫升。将有机相蒸发到50毫升,用25毫升甲苯稀释。冷却(0-10℃)后,过滤标题产物,并加以干燥。得到14.3克产物。产率为63%。
熔点:126-127℃1H-NMR(DMSO-d6):δ[ppm]400MHz 1.14(s,9H);
1.70(m,1H);
2.40(m,1H);
3.40(m,1H);
4.47(m,1H);
5.70(t,1H);
4.87(t,1H);
6.88(d,1H);
12.30(d,1H).
实施例27
由(±)-1-BOC-氨基-2-环戊烯-4-羧酸制备(±)-1-BOC-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
将250毫升四氢呋喃和10.02克(0.164摩尔)LiAlH4加入一个500毫升搅拌装置中,在-10℃时,滴加30.0克(0.132摩尔)(±)-1-BOC-氨基-2-环戊烯-4-羧酸在75毫升四氢呋喃中的溶液,历时1小时。然后加入10克水,10克15%强度氢氧化钠溶液和20克水,再进行过滤。残余物用叔丁基甲醚洗两次,每次100毫升,将合并的有机相蒸发至干。加入80毫升己烷和实施例10化合物的晶种后,分离出标题化合物结晶固体。产率为15.84克(56%)。物理数据和光谱数据与实施例10相同。
实施例28
由(1R,4S)-1-BOC-氨基-2-环戊烯-4-羧酸制备(1R,4S)-1-BOC-氨基-4-羟甲基-2-环戊烯
将80毫升四氢呋喃和11.38克(50.07毫摩尔)(1R,4S)-1-BOC-氨基-2-环戊烯-4-羧酸(按Tetrahedron:Asymmetry 1993,4,1117中所述的方法制备)加入500毫升搅拌装置,在-15℃时,滴加5毫升硼烷/二甲硫加成物,历时1小时。然后将此混合物在这温度下搅拌3小时。加入4克氢氧化钠溶解在60毫升水中生成的溶液,温热至室温。用甲苯萃取,用硅胶过滤并随后在乙酸乙酯/正己烷1∶1中结晶产生5.4克标题产物白色结晶固体,相当于产率57%。物理数据和光谱数据与实施例10中相同。对映体过量为99%(相同的手性高压液相色谱柱)。
Claims (10)
1.用式I或II表示的(1S,4R)-或(1R,4S)-4-(2-氨基-6-氯-9H-嘌呤-9-基)-2-环戊烯-1-甲醇或其盐的制备方法,其特征在于第一步中对用通式III表示的(±)-2-氮杂-双环[2.2.1.]庚-5-烯-3-酮进行酰化,产生用通式IV表示的(±)-2-氮杂-双环[2.2.1.]庚-5-烯3-酮的衍生物,式中R1表示C1-4烷基、C1-4烷氧基、芳基或芳氧基,在第二步中将后者还原产生用通式V表示的环戊烯衍生物,式中R1具有上述的含义,在第三步中用能将通式V表示的环戊烯衍生物用作唯一的氮源、唯一的碳源或唯一的碳氮源的微生物、具有N-乙酰氨基醇水解酶活性的酶或青霉素G酰基转移酶将后者转化成用式VI或VII表示的(1R,4S)-或(1S,4R)-1-氨基-4-(羟甲基)-2-环戊烯,在第四步中用式VIII表示的N-(2-氨基-4,6-二氯-5-嘧啶基)甲酰胺将后者转化成用式IX或X表示的(1S,4R)-或(1R,4S)-4-[(2-氨基-6-氯-5-甲酰氨基-4-嘧啶基)-氨基]-2-环戊烯1-甲醇,在第五步中用已知的方法将后者环化产生用式I或II表示的最终产物。
3.如权利要求1或2所述的方法,其特征在于第一步的酰化在非质子传递溶剂中进行。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于第二步中的还原用碱金属或碱土金属硼氢化物、碱金属或碱土金属铝氢化物或二(2-甲氧基乙氧基)二氢铝酸钠进行。
5.如权利要求1或4所述的方法,其特征在于第二步中的还原在质子传递溶剂中进行。
6.如权利要求1所述的方法,其特征在于第三步中的反应用红球菌属、戈登氏菌属、节细菌属、产碱杆菌属、土壤杆菌/根瘤菌属、芽胞杆菌属、假单胞菌属或产碱杆菌/博代特氏杆菌属微生物进行。
7.如权利要求1所述的方法,其特征在于第三步中的反应用来源于巨大芽胞杆菌或大肠杆菌物种的微生物的青霉素G酰基转移酶进行。
8.如权利要求1、6或7所述的方法,其特征在于第三步中的生物转化在温度为20-40℃和pH为5-9的条件下进行。
9.如权利要求1所述的方法,其特征在于第四步中的反应在碱存在下进行。
10.如权利要求1或9所述的方法,其特征在于第四步中的反应在质子传递溶剂中进行。
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