CN111527073B - 一种4-(萘-1-基)-4h-1,2,4-三唑类类化合物的晶型、盐型及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种4‑(萘‑1‑基)‑4H‑1,2,4‑三唑类化合物晶型及其制备方法，还包括所述晶型在制备治疗与尿酸水平异常相关疾病药物中的应用。

Description

一种4-(萘-1-基)-4H-1,2,4-三唑类类化合物的晶型、盐型及 其制备方法

相关申请的引用

本申请主张如下优先权：

CN201711352291.0，申请日2017-12-15

CN201711376759.X，申请日2017-12-19

技术领域

本发明涉及一种4-(萘-1-基)-4H-1,2,4-三唑类化合物晶型及其制备方法，还包括所述晶型在制备治疗与尿酸水平异常相关疾病药物中的应用。

背景技术

近年来，随着人们生活习惯的改变，高尿酸血症和痛风疾病的发作呈现逐年上升态势。在欧美，流行病学研究表明痛风性关节炎的发病人数占总人口的1-2％，是成年男性最主要的关节炎类型。彭博社预估在2021年将有1770万痛风患者。在中国，调查显示在20至74年龄段人口中，25.3％人口血尿酸含量偏高，0.36％人口患有痛风疾病。目前，临床治疗药物主要包括1)抑制尿酸生成类药物，比如黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇和非布索坦；2)促尿酸排泄类药物，比如丙磺舒和苯溴马隆；3)炎症抑制剂，比如秋水仙碱等。这些药物在治疗上都有一定的缺陷，疗效差，副作用大，花费大是其临床应用的一些主要瓶颈。据报道，40％-70％患者在接受标准流程治疗后，血尿酸的含量没有达到预期治疗目标(<6mg/dL)。

URAT1是一个重要的肾脏阴离子转运体，位于肾小管的上皮细胞刷状缘膜上，特异性地从肾小管中转运尿酸到上皮细胞，是尿酸在肾小管中重吸收的主要动力。因此，如果能显著抑制尿酸盐转运体URAT1，将会增加体内尿酸的排泄，从而降低血尿酸水平，降低痛风发作的可能性。

2015年12月，美国FDA批准了阿斯利康第一个靶向性URAT1抑制剂Lesinurad，如下图，并批准了其200mg/day剂量与黄嘌呤氧化酶抑制剂XOI(如Febuxostat等)联用用于高尿酸血症和痛风性关节炎的治疗，但是联合用药与黄嘌呤氧化酶抑制剂单独用药对比，其附加效应并不十分显著。同时，Lesinurad400mg/day剂量未获批准，原因在于高剂量下观察到的显著增加的毒副作用(肾相关的不良事件发生率特别是肾结石的发病率较高)，尽管高剂量下联合用药展现出较高的附加效应。因此，FDA要求Lesinurad标签加注黑框警告，警示医务人员Lesinurad引起急性肾衰竭的风险，特别是在不与XOI联用的情况下更常见，如果超批准剂量使用Lesinurad，引起肾衰竭的风险更高。同时，FDA要求Lesinurad上市后，阿斯利康继续进行对肾脏和心血管安全性的考察。对于一个代谢类疾病的长期用药，药物的安全问题就显得特别重要。因此，开发一种安全的降血尿酸药物成为该领域的强烈需求。

阿斯利康在披露的新药申报报告中详细报道了化合物Lesinurad在体外多种属动物肝微粒体和肝细胞代谢产物鉴定实验的结果。数据表明：Lesinurad在猴和人肝细胞中代谢时显著地被检测到了M3和M4两个主要代谢产物，但是在狗和大鼠肝细胞中上未能检测到M3和M4，如下表-a所示。

表-a

同时，阿斯利康也报道了Lesinurad在多种属动物体内给药后的主要代谢产物和代谢途径，其中双羟基代谢产物M4在人体代谢产物中被特异性地检测到：

这点和Lesinurad在人临床上的数据相一致。实验数据表明，M3,M4是人临床中发现的最主要代谢产物，如下表-b所示。

表-b

M4代谢产物的产生途径，经过研究可以确定为细胞色素CYP2C9和灵长类动物环氧化物水解酶mEH共作用的结果。该mEH代谢途径是灵长类属种所特有的，这点解释了在大鼠和狗上未观察到M4的原因：

发明内容

本发明提供了化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：7.16±0.2°、17.98±0.2°、22.30±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：7.16±0.2°，12.50±0.2°，14.61±0.2°，17.98±0.2°，19.62±0.2°，22.30±0.2°，24.63±0.2°，26.37±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：7.16±0.2°，9.56±0.2°，11.30±0.2°，12.50±0.2°，14.61±0.2°，17.98±0.2°，18.72±0.2°，19.62±0.2°，22.30±0.2°，24.63±0.2°，26.37±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其XRPD图谱如图1所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其XRPD图谱解析如表1所示。

表1：化合物1的A晶型XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其差示扫描量热曲线在167.42℃±2℃处具有吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其DSC图谱如图2所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，热重分析曲线在143.64±3℃处失重达0.3708％。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其TGA图谱如图3所示。

本发明还提供了化合物1的无定形Ⅰ，其X射线粉末衍射图谱如图4所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1的无形性Ⅰ，其DSC图谱如图5所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1的无形性Ⅰ，热重分析曲线在116.02±3℃处失重达0.8970％。

本发明的一些方案中，上述化合物1的A晶型，其TGA图谱如图6所示。

本发明还提供了化合物1a的B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：17.34±0.2°、20.36±0.2°、27.12±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.77±0.2°，15.53±0.2°，17.34±0.2°，18.76±0.2°，20.36±0.2°，21.31±0.2°，23.10±0.2°，27.12±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，其XRPD图谱如图7所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，其XRPD图谱解析如表2所示。

表2：化合物1a的B晶型XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，其差示扫描量热曲线在140.76℃±2℃处具有吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，其DSC图谱如图8所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，热重分析曲线在128.08℃±3℃处失重达0.4590％。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，其TGA图谱如图9所示。

本发明还提供了化合物1a的无定形Ⅱ，其X射线粉末衍射图谱如图10所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的B晶型，其差示扫描量热曲线在91.38℃±2℃处具有放热峰的起始点，在138.32℃±2℃具有吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的无定形Ⅱ，其DSC图谱如图11所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的无定形Ⅱ，热重分析曲线在101.34℃±3℃处失重达1.821％，在129.17℃±3℃处失重达3.629％。

本发明的一些方案中，上述化合物1a的无定形Ⅱ，其TGA图谱如图12所示。

本发明还提了化合物1b的C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：17.24±0.2°、18.68±0.2°、20.26±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.06±0.2°，13.69±0.2°，15.46±0.2°，17.24±0.2°，18.68±0.2°，20.26±0.2°，21.23±0.2°，27.04±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：10.65±0.2°，12.06±0.2°，13.69±0.2°，15.46±0.2°，15.97±0.2°，17.24±0.2°，18.68±0.2°，20.26±0.2°，21.23±0.2°，23.01±0.2°，27.04±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，其XRPD图谱如图13所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，其XRPD图谱解析如表3所示。

表3：化合物1b的C晶型XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，其差示扫描量热曲线在140.13℃±2℃处具有吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，其DSC图谱如图14所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，热重分析曲线在134.98℃±3℃处失重达0.6612％。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的C晶型，其TGA图谱如图15所示。

本发明还提供了化合物1b的无定形Ⅲ，其X射线粉末衍射图谱如图16所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的无定形Ⅲ，其差示扫描量热曲线在103.05℃±2℃处具有放热峰的起始点，在139.07℃±2℃具有吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的无定形Ⅲ，其DSC图谱如图17所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的无定形Ⅲ，热重分析曲线在67.14℃±3℃处失重达1.035％，在104.04℃±3℃处失重达1.647％，在139.58℃±3℃处失重达4.137％。

本发明的一些方案中，上述化合物1b的无定形Ⅲ，其TGA图谱如图18所示。

本发明提供了化合物1的D晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.19±0.2°，14.41±0.2°，19.95±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.19±0.2°，10.87±0.2°，11.63±0.2°，13.72±0.2°，14.41±0.2°，16.90±0.2°，19.95±0.2°，22.22±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：9.19±0.2°，10.87±0.2°，11.63±0.2°，13.72±0.2°，14.41±0.2°，16.90±0.2°，19.95±0.2°，22.22±0.2°，26.11±0.2°。

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，其XRPD图谱如图19所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，其XRPD图谱解析如表4所示。

表4：化合物1的D晶型XRPD图谱解析数据

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，其差示扫描量热曲线在183.17℃±2℃处具有吸热峰的起始点。

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，其DSC图谱如图20所示。

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，热重分析曲线在130.95℃±3℃处失重达0.2658％。

本发明的一些方案中，上述化合物1的D晶型，其TGA图谱如图21所示。

本发明还提供了化合物1的晶型A、化合物1的晶型D、化合物1的无定形Ⅰ、化合物1a的晶型B、化合物1a的无定形Ⅱ、化合物1b的晶型C、化合物1b的无定形Ⅲ在制备治疗尿酸水平异常相关病症的药物上的应用。

本发明的一些方案中，上述病症为高尿酸血症、痛风性关节炎、肾结石、尿路结石或高血压。

技术效果

化合物1(A晶型)，1a(B晶型)，1b(C晶型)，均为化合物的稳定晶型，展现了较好的稳定性。同时，化合物1a(B晶型)，化合物1b(C晶型)，化合物1(A晶型)以及(±)-Lesinurad在食蟹猴体内展现了不同的药代动力学表现。在相同剂量，相同PO方式给药时，相比(±)-Lesinurad，化合物1a(B晶型)，化合物1b(C晶型)，化合物1(A晶型)展现了更高的血浆暴露量，总体药代动力学表现更优。相比(±)-Lesinurad，化合物1a(B晶型)和化合物1(A晶型)，也展现了更更高的尿液化合物浓度对靶点的有效覆盖率(0-24h)。

定义和说明

除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在含有下列含义。一个特定的短语或术语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文出现商品名时，旨在指代其对应的商品或其活性成分。

本发明的中间体化合物可以通过本领域技术人员所熟知的多种合成方法来制备，包括下面列举的具体实施方式、其与其他化学合成方法的结合所形成的实施方式以及本领域技术上人员所熟知的等同替换方式，优选的实施方式包括但不限于本发明的实施例。

本发明具体实施方式的化学反应是在合适的溶剂中完成的，所述的溶剂须适合于本发明的化学变化及其所需的试剂和物料。为了获得本发明的化合物，有时需要本领域技术人员在已有实施方式的基础上对合成步骤或者反应流程进行修改或选择。

下面会通过实施例具体描述本发明，这些实施例并不意味着对本发明的任何限制。

本发明所使用的所有溶剂是市售的，无需进一步纯化即可使用。

本发明采用下述缩略词：DMF代表二甲基甲酰胺；MsOH代表甲磺酸；EtOH代表乙醇；NaOH代表氢氧化钠。

化合物经手工或者

软件命名，市售化合物采用供应商目录名称。

本发明粉末X-射线衍射(X-ray powder diffractometer,XRPD)方法

仪器型号：布鲁克D8 advance X-射线衍射仪

测试方法：大约10～20mg样品用于XRPD检测。

详细的XRPD参数如下：

光管：Cu,kα,

光管电压：40kV，光管电流：40mA

发散狭缝：0.60mm

探测器狭缝：10.50mm

防散射狭缝：7.10mm

扫描范围：4-40deg

步径：0.02deg

步长：0.12秒

样品盘转速：15rpm

本发明差热分析(Differential Scanning Calorimeter,DSC)方法

仪器型号：TA Q2000差示扫描量热仪

测试条件：取样品(～1mg)置于DSC铝锅内进行测试，方法为：25℃-350℃，升温速率为10℃/min。本发明热重分析(Thermal Gravimetric Analyzer,TGA)方法

仪器型号：TA Q5000IR热重分析仪

测试条件：取样品(2～5mg)置于TGA铂金锅内进行测试，方法为：室温-350℃，升温速率为10℃/min。

附图说明

图1为化合物1的A晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图2为化合物1的A晶型的DSC谱图；

图3为化合物1的A晶型的TGA谱图；

图4为化合物1的无定形Ⅰ的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图5为化合物1的无定形Ⅰ的DSC谱图；

图6为化合物1的无定形Ⅰ的TGA谱图；

图7为化合物1a的B晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图8为化合物1a的B晶型的DSC谱图；

图9为化合物1a的B晶型的TGA谱图；

图10为化合物1a的无定形Ⅱ的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图11为化合物1a的无定形Ⅱ的DSC谱图；

图12为化合物1a的无定形Ⅱ的TGA谱图；

图13为化合物1b的C晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图14为化合物1b的C晶型的DSC谱图；

图15为化合物1b的C晶型的TGA谱图；

图16为化合物1b的无定形Ⅲ的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图17为化合物1b的无定形Ⅲ的DSC谱图；

图18为化合物1b的无定形Ⅲ的TGA谱图。

图19为化合物1的D晶型的Cu-Kα辐射的XRPD谱图；

图20为化合物1的D晶型的DSC谱图；

图21为化合物1的D晶型的TGA谱图；

具体实施方式

为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例来做进一步的说明，但具体的实施方式并不是对本发明的内容所做的限制。

实施例1：化合物1a((-)-WX001)和化合物1b((+)-WX002)的制备

合成路线:

步骤1:化合物2的合成

将化合物1-1(500.00mg,2.73mmol,1.00eq)和N-氯代丁二酰亚胺(364.34mg,2.73mmol,1.00eq)加入到醋酸(5.00mL)中，20℃搅拌反应16小时。反应完成后，反应液直接浓缩除去醋酸，加硅胶1.0g拌样并经自动过柱机(乙酸乙酯/石油醚＝0-10％)纯化得到棕色固体化合物2(383.00mg,1.76mmol,收率：64.47％)，¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.41-8.35(m,1H),7.85-7.80(m,1H),7.57-7.52(m,2H),7.19(d,J＝0.8Hz,1H),4.43(s,2H),2.26-2.17(m,1H),1.07-0.97(m,2H),0.74-0.67(m,2H).

步骤2:化合物3的合成

将化合物2(360.00mg,1.65mmol,1.00eq)，三乙胺(502.02mg,4.96mmol,687.70μL,3.00eq)溶于二氯甲烷(5.00mL)中，降温到0℃后滴加硫光气(228.17mg,1.98mmol,152.12μL,1.20eq)，反应液在0℃反应0.5小时。用稀盐酸(1mol/L，20mL)将反应淬灭，再用二氯甲烷(10mL×3)萃取。有机相合并后用饱和食盐水(30mL)洗涤，再用无水硫酸钠干燥。过滤，滤液浓缩得到黑色液体粗品化合物3(520.00mg,粗品)，粗品直接用于下一步反应。

步骤3:化合4的合成

将粗品化合物3(520.00mg,2.00mmol,1.00eq)，水合肼(100.12mg,2.00mmol,97.20μL,1.00eq)和N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛(285.98mg,2.40mmol,317.76μL,1.20eq)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5.00mL)中20℃搅拌反应16小时。将反应液浓缩除去N,N-二甲基甲酰胺，剩余混合物用乙酸乙酯(20mL)溶解，加硅胶(2g)拌样并经自动过柱机(乙酸乙酯/石油醚＝0-35％)纯化得到白色固体化合物4(813.00mg,粗品)。¹HNMR(400MHz,Methanol-d₄)δ:8.58(d,J＝8.0Hz,1H),8.37(s,1H),7.73-7.67(m,1H),7.67-7.62(m,1H),7.48-7.45(m,1H),7.38-7.34(m,1H),2.59-2.49(m,1H),1.25-1.18(m,2H),0.96-0.84(m,2H)

步骤4:化合5的合成

化合物4(813.00mg,2.69mmol,1.00eq)，2-溴乙酸乙酯(539.86mg,3.23mmol,357.53μL,1.20eq)和碳酸铯(1.76g,5.39mmol,2.00eq)加入到N,N-二甲基甲酰胺(5.00mL)中，所得反应液在20℃搅拌反应16小时。反应完成后用油泵浓缩得到黄色油状物与白色固体的混合物，向混合物中加入乙腈(20mL)并搅拌2分钟，过滤，滤饼用乙腈(20ml)淋洗，滤液合并浓缩得到棕黄色油状粗品化合物5(1.10g,粗品)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:8.49(d,J＝8.4Hz,1H),8.24(s,1H),7.68-7.63(m,1H),7.62-7.59(m,1H),7.39-7.37(m,1H),7.22(d,J＝8.0Hz,1H),4.19-4.17(m,2H),4.16-4.15(m,2H),2.46-2.39(m,1H),1.22-13.18(m,2H),1.06(t,J＝7.2Hz,3H),0.90-0.85(m,2H).MS m/z:388.0[M+H]⁺

步骤5:化合物6的合成

将粗品化合物5(1.10g,粗品)，N-溴代丁二酰亚胺(505.46mg,2.84mmol,1.00eq)加入到乙腈(10.00mL)中在18℃搅拌反应2小时。反应完成后将反应液直接浓缩拌样，并经自动过柱机(乙酸乙酯/石油醚＝0-25％)纯化得到棕色油状粗品。粗品经制备HPLC分离得到白色固体化合物6(201.1mg,430.82μmol)。¹H NMR(400MHz,Methanol-d₄)δ:8.64(d,J＝8.0Hz,1H),7.79-7.74(m,1H),7.74-7.69(m,1H),7.52(d,J＝0.8Hz,1H),7.27-7.22(m，1H),4.17-4.09(m,2H),4.08-3.96(m,2H),2.63-2.52(m,1H),1.28-1.23(m,5H),0.97-0.90(m,2H).MS m/z:468.0[M+H+2]⁺

步骤6:化合物6A&6B的合成

化合物6(201.1mg,430.82μmol,1.00eq)经超临界流体色谱SFC(手性柱:Chiralpak AD(250mm×30mm,5μm)；流动相:超临界CO₂/乙醇(0.1％氨水)＝30％-30min；流速:60mL/min；检测波长:220nm)分离得到无色透明油状化合物6A(50.30mg,107.76μmol)和无色透明油状化合物6B(52.60mg,112.69μmol)。

化合物6A：SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(100mm×4.6mm,3μm)；流动相:乙醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，4.5min；40％，2.5min；5％，1min；流速:2.8mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)R_t＝3.513min。轴手性异构体过量99.69％。

化合物6B：SFC(手性柱:Chiralpak AD-3(100mm×4.6mm,3μm)；流动相:乙醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，4.5min；40％，2.5min；5％，1min；流速:2.8mL/min；检测波长:220nm；柱温:40℃)R_t＝3.911min。轴手性异构体过量99.87％。

步骤7:化合物(-)-WX001和(+)-WX002的合成

将化合物6A(50.00mg,107.12μmol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(22.47mg,535.60μmol,5.00eq)加入到乙醇(2.00mL)/水(2.00mL)中，所得反应液在20℃搅拌反应16小时。将反应液浓缩除去乙醇，剩余水相用稀盐酸(2mol/L)调到pH＝2，有白色固体析出，过滤，滤饼用水(5mL)淋洗，然后滤饼用乙醇(1mL)溶解，加水(20mL)冻干得到(-)-WX001即为化合物1a的无定形Ⅱ(36.30mg,82.74μmol,收率：77.24％)。¹H NMR(400MHz,Methanol-d₄)δ:8.52(d,J＝8.4Hz,1H),7.67-7.55(m,2H),7.39(s,1H),7.13(d,J＝8.0Hz,1H),4.56(s,1H),3.95-3.79(m,2H),2.53-2.39(m,1H),1.18-1.10(m,2H),0.85-0.76(m,2H).MS m/z:439.9[M+H+2]⁺SFC(手性柱:Chiralpak AS-3(150mm×4.6mm,3μm)；流动相:甲醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5min；40％，2.5min；5％，2.5min；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:35℃)R_t＝3.548min。轴手性异构体过量100％。[α]²⁵ _D＝-0.350(c＝5.0mg/mL甲醇溶液)。

将化合物6B(52.00mg,111.40μmol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(23.37mg,557.00μmol,5.00eq)加入到乙醇(2.00mL)/水(2.00mL)中，所得反应液在20℃搅拌反应16小时。将反应液浓缩除去乙醇，剩余水相用稀盐酸(2mol/L)调到pH＝2，有白色固体析出，过滤，滤饼用水(5mL)淋洗，然后滤饼用乙醇(1mL)溶解，加水(20mL)冻干得到(+)-WX002即为化合物1b的无定形Ⅲ(36.80mg,83.88μmol,收率：75.29％)。¹H NMR(400MHz,Methanol-d₄)δ:8.64(d,J＝8.4Hz,1H),7.81-7.67(m,2H),7.51(s,1H),7.26(d,J＝8.0Hz,1H),4.14-3.93(m,2H),2.63-2.53(m,1H),1.30-1.23(m,2H),0.97-0.90(m,2H).MS m/z:439.9[M+H+2]⁺SFC(手性柱:Chiralpak AS-3(150mm×4.6mm,3μm)；流动相:甲醇(0.05％DEA)/超临界CO₂＝5～40％，5min；40％，2.5min；5％，2.5min；流速:2.5mL/min；检测波长:220nm；柱温:35℃)R_t＝3.774min。轴手性异构体过量99.22％。[α]²⁵ _D＝+1.191(c＝4.6mg/mL甲醇溶液)。

实施例2：化合物1((±)-WX003)的制备

合成路线:

步骤1:化合物1((±)-WX003)的合成

将化合物6(56.30mg,120.61μmol,1.00eq)和一水合氢氧化锂(25.30mg,603.07μmol,5.00eq)加入到乙醇(2.00mL)/水(2.00mL)中20℃反应16小时。反应完成后将反应液浓缩除去乙醇，加水到2mL，然后用稀盐酸(2mol/L)将反应液调到pH＝3，有白色固体析出，过滤，滤饼用水(10mL)淋洗，滤饼用甲醇(1mL)溶解，再向甲醇溶液中加水(20mL)，混合溶液呈白色，无固体析出，冻干得到白色粉末化合物(±)-WX003即为化合物1的无定形Ⅰ(50.30mg,114.65μmol,收率：91.43％)。¹H NMR(400MHz,Methanol-d₄)δ:8.64(d,J＝8.4Hz,1H),7.80-7.67(m,2H),7.52(s,1H),7.26(br d,J＝8.4Hz,1H),4.13-3.95(m,2H),2.63-2.53(m,1H),1.30-1.23(m,2H),0.98-0.90(m,2H).MS m/z:439.6[M+H]⁺.

实施例3:化合物1a的B晶型的制备

将50mg化合物1a的无定形II加入到0.2mL(乙醇：水＝1：1)或者0.2mL(甲醇：水＝1:1)的混合溶剂中搅拌成悬浊液。悬浊液样品置于恒温均匀仪上(40℃)振摇2天(避光)。残留的固体物离心分离，并在30℃真空干燥箱中干燥过夜。XRPD检测其晶型状态，得到终产物晶型为化合物1a的B晶型。

实施例4：化合物1a在不同溶剂中的晶型制备

取适量的化合物1a的无定形II多份，分别加入0.2mL的下表中的单一或混合溶剂，40℃条件下搅拌。搅拌2天后，若样品为溶液状态，自然挥发除去溶剂；若样品仍为混悬液，则离心样品。收集所有样品中的固体，XRPD检测其晶型状态。结果见表5。

表5：化合物:1a在不同溶剂中的晶型制备

序号	溶剂	外观(2天)	结果
				1	甲醇	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形Ⅱ
2	乙醇	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形Ⅱ
				3	丙酮	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形Ⅱ
4	乙腈	混悬液	B晶型
				5	乙酸乙酯	混悬液	B晶型
6	四氢呋喃	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形Ⅱ
				7	水	混悬液	B晶型
8	甲醇:水＝1:1	混悬液	B晶型
				9	乙醇:水＝1:1	混悬液	B晶型
10	丙酮:水＝1:2	混悬液	B晶型

实施例5:化合物1b的C晶型制备

将50mg化合物1b的无定形III加入到0.2mL(乙醇：水＝1：1)或者0.2mL(甲醇：水＝1:1)的混合溶剂中搅拌成悬浊液。悬浊液样品置于恒温均匀仪上(40℃)振摇2天(避光)。残留的固体物离心分离，并在30℃真空干燥箱中干燥过夜。XRPD检测其晶型状态，得到终产物晶型为化合物1b的C晶型。

实施例6:化合物1b在不同溶剂中的晶型制备

取适量的化合物1b的无定形III多份，分别加入0.2mL的下表中的单一或混合溶剂，40℃条件下搅拌。搅拌2天后，若样品为溶液状态，自然挥发除去溶剂；若样品仍为混悬液，则离心样品。收集所有样品中的固体，XRPD检测其晶型状态。结果见表6。

表6：化合物1b在不同溶剂中的晶型制备

序号	溶剂	外观(2天)	结果
				1	甲醇	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形III
2	乙醇	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形III
				3	丙酮	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形III
4	乙腈	混悬液	C晶型
				5	乙酸乙酯	混悬液	C晶型
6	四氢呋喃	自然挥发除去溶剂后析出固体	无定形III
				7	水	混悬液	C晶型
8	甲醇:水＝1:1	混悬液	C晶型
				9	乙醇:水＝1:1	混悬液	C晶型
10	丙酮:水＝1:2	混悬液	C晶型

实施例7：化合物1的A晶型的制备

将100mg化合物1的无定形I加入到玻璃瓶中，然后加入乙醇/水(1:1,1mL)搅拌成悬浊液。将上述悬浊液样品置于恒温混匀仪(40℃)中，在40℃下振摇20小时后过滤，收集样品。将上述样品真空干燥箱中(40℃)干燥过夜，XRPD检测其晶型状态，得到终产物晶型为化合物1的A晶型。

实施例8：化合物1在不同溶剂中的晶型制备

将适量原料化合物1的无定形I多份，分别加入1.0mL的下表中的单一或混合溶剂，40℃条件下搅拌。搅拌1天后，若样品为溶液状态，自然挥发除去溶剂；若样品仍为混悬液，则离心样品。收集所有样品中的固体，XRPD检测其晶型状态。结果见表7。

表7：化合物1在不同溶剂中的晶型制备

实施例8：化合物1的D晶型的制备

将53g化合物1的无定形I加入到玻璃瓶中，然后加入乙醇/水(1:1,350mL)搅拌成悬浊液。将上述悬浊液样品置于恒温混匀仪(40℃)中，在40℃下振摇48小时后过滤，收集样品。将上述样品真空干燥箱中(40℃)干燥过夜，XRPD检测其晶型状态，得到终产物晶型为化合物1的D晶型。

实施例9：化合物1的A晶型的固体稳定性试验

依据《原料药与制剂稳定性试验指导原则》(中国药典2015版四部通则9001)，考察化合物1的A晶型在高温(60℃，敞口)，高湿(室温/相对湿度92.5％，敞口)及强光照(5000lx，密闭)条件下的稳定性。

称取化合物1的A晶型15mg，置于玻璃样品瓶的底部，摊成薄薄一层。高温及高湿条件下放置的样品用铝箔纸封瓶口，并在铝箔纸上扎些小孔，保证样品能与环境空气充分接触；强光照条件下放置的样品用螺纹瓶盖密封。不同条件下放置的样品于第5天，10天取样检测(XRPD和HPLC)，检测结果与0天的初始检测结果进行比较，试验结果见下表8所示：

表8化合物1的A晶型的固体稳定性试验结果

结论：化合物1的A晶型在高温、高湿、强光照条件下具有良好的稳定性。

测试例1：体外评价

1.实验目的：

采用稳定转染URAT-1(尿酸转运蛋白)基因的MDCK(犬肾细胞)细胞系测定化合物抑制尿酸重吸收的IC₅₀值。

2.背景介绍：

痛风是由血液尿酸水平异常升高引起的进行性疾病。URAT-1基因编码存在于肾小管中的尿酸转运蛋白。小分子化合物可以通过抑制该蛋白功能促进尿酸排泄，从而起到防止痛风发作的作用。

3.实验材料:

URAT-1(MDCK)细胞系：稳定转染URAT-1基因的MDCK细胞。

细胞培养液：MEM(低限量Eagle培养基)培养液,加10％FBS(胎牛血清)、1％丙酮酸钠和250μg/mlG418(遗传霉素)。

HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)Hank’s平衡盐缓冲液。

0.1M NaOH溶液。

¹⁴C标记-尿酸溶液。

CO₂培养箱。

液闪计数仪Tri-Carb

4.实验步骤和方法：

4.1细胞接种:

1)吸掉细胞培养的培养上清，用10mL PBS(磷酸缓冲盐溶液)洗细胞。

2)加入预热过的胰酶到洗过的细胞培养瓶中，旋转培养瓶使胰酶均匀覆盖培养瓶底部。室温消化。

3)每个T150培养瓶用10－15mL培养液悬浮细胞，吸取0.1mL用台盼蓝溶液稀释2倍计数细胞。

4)用培养液稀释细胞到2.5×10⁵/mL,将稀释好的细胞加入24孔板(800μL/孔,2×10⁵细胞/孔)。置于37℃,5％CO₂培养箱培养过夜。

4.2细胞准备：

1)细胞接种于24孔板16-18小时后，弃去上清。每孔加入600 1的HBSS缓冲液，清洗两遍。

2)吸掉HBSS缓冲液后，再向每孔加入180μl的HBSS缓冲液。

4.3化合物溶液制备、稀释和加样:

1)将化合物粉剂溶解于100％DMSO。然后对化合物以3倍稀释6个点，或10倍稀释2个点，最高起始浓度为50mM。

2)将步骤1)的5μLDMSO溶液转入120 1HBSS缓冲液，稀释25倍。

3)将步骤2)的10μl稀释液加入24孔细胞板，置于37℃,5％CO2培养箱孵育15分钟。DMSO终浓度为0.2％。细胞对照孔：不加化合物，只含0.2％DMSO。

4.4检测：

将14C标记-尿酸溶液稀释加入细胞板，终浓度为50μM。置于37度,5％CO2培养箱孵育10分钟。弃去上清后，用HBSS缓冲液清洗细胞两遍。向细胞加入0.1M NaOH溶液进行裂解。将细胞裂解液收集于液闪管，加入液闪液后，使用液闪计数仪Tri-Carb读取信号值。

4.5数据处理和分析：

根据发光数据分析化合物对URAT-1抑制效果，计算抑制百分比数据。采用GraphPad Prism软件对抑制百分比(inh﹪)数据进行非线性拟合分析得到IC₅₀值。实验结果见下表9：

表9各实施例对URAT-1抑制效果IC₅₀测试结果

编号	化合物	IC<sub>50</sub>
			1	化合物1A的无定形II	8.0μM
2	化合物1B的无定形III	>20μM
			3	化合物1的无形性I	10.36μM
4	(±)-Lesinurad	23.97μM

结论：在URAT-1(MDCK)细胞系上，相比(±)-Lesinurad，化合物1和1a对URAT-1介导的尿酸转运展现了更强的抑制作用。

测试例2：体外评价

1.实验目的

该实验的目的是用LC-UV-MSⁿ(n＝1-2)检测手段来证实一系列化合物在人肝细胞中孵育120分钟后的代谢产物。数据采集后采用MetaboLynx^TM软件对MS和MS²数据进行分析。

2.实验方案

2.1肝细胞孵育体系

2.2样品处理与分析

样品孵育2h后，采用含01.％甲酸的乙腈进行沉淀蛋白，离心，取出上清在氮气下吹干，复溶后进样分析。

3.实验结果

3.1化合物1a的代谢产物鉴定结果见表10

表10

代谢产物	保留时间(分)	紫外面积百分含量	代谢途径
				化合物1a	9.71	100％	NA

3.2化合物1b的代谢产物鉴定结果见表11

表11

代谢产物	保留时间(分)	紫外面积百分含量	代谢途径
				化合物1b	9.71	100％	NA

3.3化合物(±)-Lesinurad的代谢产物鉴定结果见表12

表12

代谢产物	保留时间(分)	紫外面积百分含量	代谢途径
				(±)-Lesinurad-M1	6.26	4.40％	氧化
(±)-Lesinurad	9.02	95.60％	NA

4.实验结论

实验数据表明，在相同的人肝细胞代谢条件下，化合物(±)-Lesinurad产生了4.40％的代谢产物M1，而化合物1A的无定形II和化合物1b的无定形III则检测不到任何代谢产物的生成。相比(±)-Lesinurad，化合物1a和化合物1b体现了提高了的体外肝细胞稳定性。

测试例3：体内评价

1.实验目的

以食蟹猴为受试动物，应用LC/MS/MS法测定食蟹猴IV(静注)，PO(鼻饲)给予化合物1a(B晶型)，化合物1b(C晶型)，化合物1(A晶型)以及(±)-Lesinurad后，不同时刻测定血浆中化合物1a，化合物1b，化合物1以及(±)-Lesinurad的药物浓度，研究本发明的化合物在食蟹猴体内的药代动力学行为，评价其药动学特征。

2.实验方案

2.1试验药品

化合物1a(B晶型)，化合物1b(C晶型)，化合物1(A晶型)以及(±)-Lesinurad

2.2试验动物

健康成年雄性食蟹猴24只，分成8组(每个化合物各有IV,PO组)，每组3只。

2.3药物配制

称取适量样品，加入一定量的DMSO超声溶解，再加入PEG400溶液，制成受试化合物浓度为2mg/mL的DMSO/PEG400/H2O(5/40/55)澄清溶液用于IV给药。

称取适量样品，加入一定量的DMSO超声溶解，再加入0.5％MC溶液，制成受试化合物浓度为2mg/mL的DMSO/0.5％MC(5/95)混悬液溶液用于PO给药。

2.4给药

食蟹猴24只，分成8组，每组3只，雄性，禁食一夜后分别IV，PO给药。IV剂量为2mg/kg，给药体积为1mL/kg；PO剂量为10mg/kg，给药体积为5mL/kg。

3.实验操作

IV组于给药后0.083,0.25,0.5,1,2,4,6,8,24小时采血约200μL，置于K2-EDTA的抗凝管中，3000rpm离心15分钟，分离血浆，于-80℃保存。PO组于给药后0.25,0.5,1,2,4,6,8,24小时采血，其他操作同IV组。血浆样品经沉淀蛋白预处理后采用LC/MS/MS法测定血药浓度。分析方法的线性范围为20.00-6000nM。PO组采集给药后0-24小时内的尿液，采用LC/MS/MS法测定尿药浓度。分析方法的线性范围为20.00-6000nM。

4.药代动力学参数

实验结果表明：化合物1a(B晶型)，化合物1b(C晶型)，化合物1(A晶型)以及(±)-Lesinurad在食蟹猴体内展现了不同的药代动力学表现。在相同剂量，相同PO方式给药时，相比(±)-Lesinurad，化合物1a(B晶型)，化合物1b(C晶型)，化合物1(A晶型)展现了更高的血浆暴露量，总体药代动力学表现更优。相比(±)-Lesinurad，化合物1a(B晶型)和化合物1(A晶型)，也展现了更更高的尿液化合物浓度对靶点的有效覆盖率(0-24h)。注：尿液化合物浓度对靶点的有效覆盖率＝尿液平均药物浓度(0-24h)/药物对URAT1靶点的IC₅₀.同时，在体内未观察到两个轴手性异构体1a和1b的相互转化，在循环体系内保持为稳定的单一轴手性异构体。另外，实验结果见下表13：

表13各实施例在食蟹猴体内的药代动力学参数

测试例4：体外评价

1.实验目的：

采用稳定转染OAT-4(有机阴离子转运体-4)基因的MDCK(犬肾细胞)细胞系测定化合物抑制特定底物重吸收的IC₅₀值。

2.实验步骤和方法：

摄入抑制实验所用细胞培养基为DMEM(细胞基础培养基培养基)添加10％FBS(含青霉素和链霉素)。人药物转运体过表达的细胞株(MDCK-OAT4)及空载体细胞(MDCK-pcDNA3.1)经过复苏和传代培养后，选取生长良好的贴壁细胞用胰酶消化使其分散为单细胞悬液，之后用培养基调节细胞密度至2.0～3.0×105cells/mL，然后将细胞悬液以1mL/孔的量接种至24孔细胞培养板，在37℃、5％CO₂、饱和空气湿度的培养箱内培养2～3天使细胞长满各孔。先移去培养板内培养液，用Hanks缓冲盐溶液(无Cl^-)或者PBS清洗一次，之后每孔加入37℃Hanks缓冲盐溶液(无Cl^-)或者PBS缓冲盐溶液孵育10min，然后以500μL含放射性标记的探针底物溶液置换24孔板中Hanks缓冲盐溶液(无Cl^-)或者PBS缓冲盐溶液开始给药；给药结束后(2min)，用各自预冷的缓冲盐溶液终止反应，并清洗细胞3次；然后每孔添加400μL 0.1mmol/L NaOH裂解细胞；取细胞裂解液于闪烁瓶中，添加3mL的Aquasol-2闪烁液，并用Tri-Carb 2910TR液闪仪测定样品中的放射性强度。细胞转运试验中每个浓度及阳性对照、空白对照(mock)设置3孔(n＝3)。

3.数据处理：

将仅含放标底物给药组转运体细胞的摄入值(扣除本底background组即空载细胞的摄入值U₀)定义为100％(control，Uc)，以此为标准计算加入待测化合物后各给药组扣除本底后的摄入值U与control组的摄入值Uc的百分比(％)，并计算各浓度对转运体活性的抑制率(IR)，以此表示化合物对转运体抑制作用的强弱，公式如下：

IR＝1-[100×(U-U0)/(Uc-U0)]％

每一给药浓度设置3个重复(即n＝3)，Mean±standard error(SD)用

Excel 2010软件中统计学公式计算。根据每种转运体各给药浓度抑制率(IR)，通过Prism5.0并结合

Excel2010软件中Forecast函数计算化合物对药物转运体转运活性影响的IC₅₀。

实验结果见下表14：

表14各实施例对OAT-4抑制效果IC₅₀测试结果

结论：在OAT4-4(MDCK)细胞系上，相比(±)-Lesinurad，化合物1对OAT-4介导的两种不同底物(尿酸和硫酸雌酮铵)的转运展现了更弱的抑制作用。

由于OAT-4和URAT-1均位于肾小管上皮细胞刷状缘膜，化合物会对这两个转运体同时产生抑制。因此，通过比较化合物抑制URAT-1介导的¹⁴C-尿酸转运的IC₅₀和化合物抑制OAT-4介导的¹⁴C-尿酸和³H-硫酸雌酮铵的IC₅₀，我们发现：(±)-Lesinurad在对URAT-1转运尿酸产生有效抑制的同时，对OAT-4转运尿酸产生了更为强烈的抑制(11倍)，对OAT-4转运硫酸雌酮铵也产生了更为强烈的抑制(2倍)；相反，化合物1在对URAT-1转运尿酸产生有效抑制的同时，对OAT-4转运尿酸仅仅产生了相当的抑制(1倍)，对OAT-4转运硫酸雌酮铵也产生了更弱的抑制(0.6倍)。由于OAT-4转运体在维持人体正常功能中的重要作用，(±)-Lesinurad对其的强烈优先抑制具有一定安全风险，而化合物1对其相对较弱的抑制体现了较高的安全性。

Claims (24)

1.化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：7.16±0.2°，12.50±0.2°，14.61±0.2°，17.98±0.2°，19.62±0.2°，22.30±0.2°，24.63±0.2°，26.37±0.2°；

2.根据权利要求1所述化合物1的A晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：7.16±0.2°，9.56±0.2°，11.30±0.2°，12.50±0.2°，14.61±0.2°，17.98±0.2°，18.72±0.2°，19.62±0.2°，22.30±0.2°，24.63±0.2°，26.37±0.2°。

3.根据权利要求2所述化合物1的A晶型，其XRPD图谱如图1所示。

4.根据权利要求1～3任意一项所述化合物1的A晶型，其差示扫描量热曲线在167.42℃±2℃处具有吸热峰的起始点。

5.根据权利要求4所述化合物1的A晶型，其DSC图谱如图2所示。

6.根据权利要求1～3任意一项所述化合物1的A晶型，其热重分析曲线在143.64±3℃处失重达0.3708％。

7.根据权利要求6所述化合物1的A晶型，其TGA图谱如图3所示。

8.化合物1的无定形Ⅰ，其X射线粉末衍射图谱如图4所示；

9.化合物1a的B晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：13.77±0.2°，15.53±0.2°，17.34±0.2°，18.76±0.2°，20.36±0.2°，21.31±0.2°，23.10±0.2°，27.12±0.2°；

10.根据权利要求9所述化合物1a的B晶型，其XRPD图谱如图7所示。

11.根据权利要求9或10所述化合物1a的B晶型，其差示扫描量热曲线在140.76℃±2℃处具有吸热峰的起始点。

12.根据权利要求11所述化合物1a的B晶型，其DSC图谱如图8所示。

13.根据权利要求9或10所述化合物1a的B晶型，热重分析曲线在128.08℃±3℃处失重达0.4590％。

14.根据权利要求13所述化合物1a的B晶型，其TGA图谱如图9所示。

15.化合物1a的无定形Ⅱ，其X射线粉末衍射图谱如图10所示；

16.化合物1b的C晶型，其X射线粉末衍射图谱在下列2θ角处具有特征衍射峰：12.06±0.2°，13.69±0.2°，15.46±0.2°，17.24±0.2°，18.68±0.2°，20.26±0.2°，21.23±0.2°，27.04±0.2°；

17.根据权利要求16所述化合物1b的C晶型，其XRPD图谱如图13所示。

18.根据权利要求16或17所述化合物1b的C晶型，其差示扫描量热曲线在140.13℃±2℃处具有吸热峰的起始点。

19.根据权利要求18所述化合物1b的C晶型，其DSC图谱如图14所示。

20.根据权利要求16或17所述化合物1b的C晶型，热重分析曲线在134.98℃±3℃处失重达0.6612％。

21.根据权利要求20所述化合物1b的C晶型，其TGA图谱如图15所示。

22.化合物1b的无定形Ⅲ，其X射线粉末衍射图谱如图16所示；

23.根据权利要求1～7所述的化合物1的晶型A、权利要求8所述化合物1的无定形Ⅰ、权利要求9～14所述化合物1a的晶型B、权利要求15所述化合物1a的无定形Ⅱ、权利要求16～21所述化合物1b的晶型C、权利要求22所述化合物1b的无定形Ⅲ在制备治疗尿酸水平异常相关病症的药物上的应用。

24.根据权利要求23所述应用，其中所述病症为高尿酸血症、痛风性关节炎、肾结石、尿路结石或高血压。

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