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CN111511760B - 对btn2具有特异性的抗体及其用途 - Google Patents

对btn2具有特异性的抗体及其用途 Download PDF

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CN111511760B CN201880061477.7A CN201880061477A CN111511760B CN 111511760 B CN111511760 B CN 111511760B CN 201880061477 A CN201880061477 A CN 201880061477A CN 111511760 B CN111511760 B CN 111511760B
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Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Institut Jean Paoli and Irene Calmettes
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Abstract

本发明涉及对BTN2具有特异性的抗体及其用途，特别是用于治疗癌症。

Description

对BTN2具有特异性的抗体及其用途
技术领域
本发明涉及对BTN2具有特异性的抗体及其用途。
背景技术
白细胞是免疫系统中参与保护机体抵抗病原体侵害的细胞。除了常规的MHC I类限制性CD8+CTL和NK细胞外，其他非常规T细胞(特别是γδT细胞)也显示出与NK和T细胞相同的敏感性和溶细胞能力。Vγ9/Vδ2T细胞是循环γδT细胞的主要子集，其占人类外周血T细胞的1-10％。
Vγ9/Vδ2T细胞是免疫防御的重要效应子。它们直接裂解感染的病原体或异常细胞。此外，它们通过诱导树突状细胞(DC)成熟以及同型转换和免疫球蛋白生成来调节免疫应答。免疫系统的这一重要细胞平台由表面受体、趋化因子和细胞因子严格调控。Vγ9/Vδ2T细胞由非肽磷酸化类异戊二烯途径代谢物(称为磷酸激动剂(PAg))激活。
通过特化细胞的参与和趋化性细胞因子的分泌来调节T细胞的启动。如今，我们知道T细胞活化是两个协同事件的结果。首先是T细胞受体(TCR)和与抗原呈递细胞(APC)表面上的加工抗原结合的主要组织相容性复合物(MHC)之间的相互作用。第二个事件是涉及B7分子的共刺激抗原独立信号。缺乏共刺激信号会诱发无反应性，即抑制T细胞增殖、细胞因子分泌和细胞毒性活性。研究这些途径可以提供有关触发病理事件(诸如自身免疫性或淋巴增生性疾病)的洞察力。
嗜乳脂蛋白构成跨膜蛋白家族，其包含嗜乳脂蛋白(BTN)、BTN样(BTNL)以及上皮内T细胞(SKINT)蛋白的选择和维持(Arnett and Viney,2014)。它们的胞外部分含有与B7共刺激分子的相应结构域表现出同源性的IgV和IgC2结构域(Arnett and Viney,2014)，因此嗜乳脂蛋白被认为是扩展的B7或Ig超家族成员。
BTN1A1作为最早鉴定的嗜乳脂蛋白，是乳脂球的形成、分泌和稳定所需要的(Ogget al.,2004)。随后，有人提出B7基因和MHC I类和II类基因可能具有共同的祖先基因，并且可以编码参与类似功能(诸如T细胞活化)的蛋白质(Rhodes et al.,2001)。
随后越来越多的证据表明，嗜乳脂蛋白在免疫系统中起着多种作用。小鼠SKINT1和人BTN3A1的功能已得到最好的阐明，它们不属于保守家族成员。SKINT1驱动小鼠Vγ5+Vδ1+T细胞的胸腺分化(Boyden et al.,2008)。
BTN2亚家族在人中包含BTN2A1、BTN2A2和假基因BTN2A3。与BTN3A1和BTN3A3一样，BTN2A1和BTN2A2蛋白亚型显示IgV和IgC胞外结构域、跨膜结构域和特征性胞内结构域B30.2，但BTN3A2不显示。在小鼠中，BTN2A2是人BTN2A2基因的单拷贝基因和直系同源物。重组人BTN2A1-Fc蛋白显示，BTN2A1的特定糖型结合树突细胞(DC)上发现的凝集素分子DC-SIGN。BTN2A1与DC-SIGN的结合取决于通过肿瘤细胞中表达时蛋白质的高甘露糖糖基化作用(Malcherek et al.,2007)。然而，迄今为止，尚未鉴定出人BTN2A1/A2的明确功能，但是已经使用重组Fc蛋白在小鼠中进行了一些实验。
Smith等人，2010表明重组鼠BTN2A2-Fc和BTN1A1-Fc结合活化的T细胞，表明这些细胞上存在一种或多种受体。固定的BTN2A2-Fc或BTN2A1-Fc蛋白而非MOG-Fc蛋白抑制由抗CD3激活的CD4和CD8 T细胞的增殖。鼠BTN1A1和BTN2A2还抑制T细胞代谢、IL-2和IFN-g分泌。
Amman等人，2013发现小鼠BTN2A2-Fc与受抗CD3和抗CD28刺激的CD3+原代小鼠T细胞的结合减少了增殖细胞的数量和细胞进入细胞周期。BTN2A2-Fc与抗CD3-刺激的T细胞的结合抑制了CD3ε、Zap70和随后的Erk1/2激活。鼠BTN2A2-Fc还可以在体外诱导Foxp3表达和Treg分化。
Sarter等人，2016表明Btn2a2-/-小鼠表现出效应子CD4+和CD8+T细胞应答增强、CD4+调节性T细胞诱导削弱、抗肿瘤应答加强以及实验性自身免疫性脑脊髓炎恶化。
迄今为止，在移植物抗宿主病(GVHD)中，自身免疫性疾病的治疗和移植排斥的预防依赖于具有严重副作用或并不总是有效的免疫抑制剂。因此需要新的免疫抑制剂。
迄今为止，在移植物抗宿主病(GvHD)中自身免疫性疾病的治疗和移植排斥的预防仅依赖于免疫抑制剂。然而，这种免疫抑制剂可能并不总是有效的和/或具有严重的副作用。
因此，需要鉴定新的抑制剂和/或方法来抑制有需要的患者的免疫应答。
发明概述
本发明涉及对BTN2具有特异性的抗体及其用途。
特别地，本文公开了一种结合BTN2(例如人BTN2A1和BTN2A2多肽)的抗体，并且其表现出至少一种以下特性：
·其抑制由活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α，和/或
·其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，和/或
·其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖。
在具体实施方案中，根据本公开的抗BTN2抗体对人嗜乳脂蛋白-2A1(BTN2A1)和人嗜乳脂蛋白-2A2(BTN2A2)均具有特异性。
在具体实施方案中，根据本公开的抗BTN2抗体与至少一种以下参考鼠抗体竞争结合BTN2A2：
i.mAb 4.15，可通过以保藏号CNCM I-5231保藏于CNCM的杂交瘤获得；
ii.mAb 5.28，可通过以保藏号CNCM I-5232保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iii.mAb 7.28，可通过以保藏号CNCM I-5233保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iv.mAb 7.48，可通过以保藏号CNCM I-5234保藏于CNCM的杂交瘤获得；
v.mAb 8.15，可通过以保藏号CNCM I-5235保藏于CNCM的杂交瘤获得；或
vi.mAb 8.16，可通过以保藏号CNCM I-5236保藏于CNCM的杂交瘤获得。
在具体实施方案中，根据本公开的抗BTN2抗体包含：
i.包含抗体mAb 4.15的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 4.15可通过以保藏号CNCMI-5231保藏于CNCM的杂交瘤获得；
ii.包含抗体mAb 5.28的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 5.28可通过以保藏号CNCM I-5232保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iii.包含抗体mAb 7.28的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 7.28可通过以保藏号CNCM I-5233保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iv.包含抗体mAb 7.48的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 7.48可通过以保藏号CNCM I-5234保藏于CNCM的杂交瘤获得；
v.包含抗体mAb 8.15的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 8.15可通过以保藏号CNCMI-5235保藏于CNCM的杂交瘤获得；或
vi.包含抗体mAb 8.16的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 8.16可通过以保藏号CNCM I-5236保藏于CNCM的杂交瘤获得。
在其他具体实施方案中，本公开的抗BTN2抗体包含：
(i)分别为SEQ ID NO:3-8的mAb 4.15的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
(ii)分别为SEQ ID NO:11-16的mAb 5.28的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
(iii)分别为SEQ ID NO:19-24的mAb 7.28的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
(iv)分别为SEQ ID NO:27-32的mAb 7.48的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或
(v)分别为SEQ ID NO:35-40的mAb 8.15的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
(vi)分别为SEQ ID NO:43-48的mAb 8.16的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。
在可以与之前的实施方案组合的其他具体实施方案中，本公开的抗BTN2抗体是包含以下的抗体：
(i)其中VH区与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ IDNO:10具有至少95％同一性的轻链；
(ii)其中VH区与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ IDNO:18具有至少95％同一性的轻链；
(iii)其中VH区与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ IDNO:26具有至少95％同一性的轻链；
(iv)其中VH区与SEQ ID NO:33具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ IDNO:34具有至少95％同一性的轻链；
(v)其中VH区与SEQ ID NO:41具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ IDNO:42具有至少95％同一性的轻链；或
(vi)其中VH区与SEQ ID NO:49具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ IDNO:50具有至少95％同一性的轻链；
在具体实施方案中，根据本发明的抗BTN2抗体不与人CD277交叉反应，特别地，其不与人BTN3A1、BTN3A2和BTN3A3中的任何一个交叉反应。
在具体实施方案中，在激动剂抗CD277抗体mAb20.1存在下，根据本公开的抗BTN2抗体抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能。
在具体实施方案中，根据本公开的抗BTN2抗体抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，例如所述Vγ9/Vδ2T细胞通过与靶细胞系(即Daudi细胞系)共培养而激活，和/或通过磷酸激动剂(PAg)激活和/或通过诱导产生磷酸激动剂(PAg)的试剂激活。
在具体实施方案中，所述抗BTN2抗体是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
本公开的另一方面涉及编码如上所述的任何抗BTN2抗体的重链和/或轻链的核酸分子。
特别地，本公开还涉及包含此类核酸的宿主细胞在制备如上所述的任何一种抗BTN2抗体中的用途。
本公开的另一方面涉及如上定义的抗BTN2抗体在治疗中的用途，例如用于治疗自身免疫性和炎性疾病以及移植排斥的方法。
本公开的另一方面涉及在有需要的受试者中治疗自身免疫性和炎性疾病以及移植排斥的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如上所定义的抗BTN2抗体。
典型地，所述自身免疫性和炎性疾病选自下组：类风湿性关节炎(RA)、胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)、多发性硬化症(MS)、克罗恩病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、干燥综合征、寻常性天疱疮、类天疱疮、艾迪生氏病、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻、皮肌炎、Goodpasture综合征、Graves病、Guillain-Barre综合征、桥本氏病、特发性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、男性不育、混合性结缔组织病、重症肌无力、恶性贫血、致眼葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性粘液水肿、赖特氏综合征、僵人综合征、甲状腺毒症、溃疡性结肠炎和韦格纳肉芽肿病。
本公开还涉及包含如上定义的抗BTN2抗体的药物组合物。
本公开进一步提供了一种在受试者中抑制免疫应答的方法，其包括向所述受试者施用有效量的如本文所公开的抗BTN2抗体。
发明详述
定义
如本文所用，术语“BTN2”具有本领域的一般含义，并且是指包括SEQ ID NO:1的BTN2A1或SEQ ID NO:2的BTN2A2的人BTN2多肽。
SEQ ID NO:1：BTN2A亚型1前体(智人)：
MESAAALHFSRPASLLLLLLSLCALVSAQFIVVGPTDPILATVGENTTLRCHLSPEKNAE
DMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRTTFVSKDISRGSVALVIHNITAQEN
GTYRCYFQEGRSYDEAILHLVVAGLGSKPLISMRGHEDGGIRLECISRGWYPKPLTVWRD
PYGGVAPALKEVSMPDADGLFMVTTAVIIRDKSVRNMSCSINNTLLGQKKESVIFIPESF
MPSVSPCAVALPIIVVILMIPIAVCIYWINKLQKEKKILSGEKEFERETREIALKELEKE
RVQKEEELQVKEKLQEELRWRRTFLHAVDVVLDPDTAHPDLFLSEDRRSVRRCPFRHLGE
SVPDNPERFDSQPCVLGRESFASGKHYWEVEVENVIEWTVGVCRDSVERKGEVLLIPQNG
FWTLEMHKGQYRAVSSPDRILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAF
SVPVRPFFRLGCEDSPIFICPALTGANGVTVPEEGLTLHRVGTHQSL
SEQ ID NO:2：BTN2A亚型2前体(智人)：
MEPAAALHFSLPASLLLLLLLLLLSLCALVSAQFTVVGPANPILAMVGENTTLRCHLSPE
KNAEDMEVRWFRSQFSPAVFVYKGGRERTEEQMEEYRGRITFVSKDINRGSVALVIHNVT
AQENGIYRCYFQEGRSYDEAILRLVVAGLGSKPLIEIKAQEDGSIWLECISGGWYPEPLT
VWRDPYGEVVPALKEVSIADADGLFMVTTAVIIRDKYVRNVSCSVNNTLLGQEKETVIFI
PESFMPSASPWMVALAVILTASPWMVSMTVILAVFIIFMAVSICCIKKLQREKKILSGEK
KVEQEEKEIAQQLQEELRWRRTFLHAADVVLDPDTAHPELFLSEDRRSVRRGPYRQRVPD
NPERFDSQPCVLGWESFASGKHYWEVEVENVMVWTVGVCRHSVERKGEVLLIPQNGFWTL
EMFGNQYRALSSPERILPLKESLCRVGVFLDYEAGDVSFYNMRDRSHIYTCPRSAFTVPV
RPFFRLGSDDSPIFICPALTGASGVMVPEEGLKLHRVGTHQSL
如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”具有相同的含义，并且将在本发明中同等地使用。
本文所用的术语“抗体”是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即含有免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子。如此，术语抗体不仅涵盖完整的抗体分子，还涵盖抗体片段以及抗体和抗体片段的变体(包括衍生物)。
在天然抗体中，两条重链通过二硫键相互连接，并且每条重链通过二硫键与轻链连接。存在两种类型的轻链，lambda(1)和kappa(k)。存在五种主要的重链类别(或同种型)，其决定了抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每条链含有不同的序列结构域。轻链包括两个结构域，一个可变结构域(VL)和一个恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，一个可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区决定了对抗原的结合识别和特异性。轻链(CL)和重链(CH)的恒定区结构域赋予重要的生物学特性，诸如抗体链结合、分泌、转位移动、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。
Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分，并且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性在于抗体结合位点和抗原决定簇之间的结构互补性。抗体结合位点由主要来自高变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高变区或框架区(FR)的残基可参与抗体结合位点或影响整个结构域结构并因此影响结合位点。互补决定区或CDR是指一起定义天然免疫球蛋白结合位点的天然Fv区的结合亲和力和特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各自具有三个CDR，分别称为L-CDR1、L-CDR2、L-CDR3和H-CDR1、H-CDR2、H-CDR3。因而，抗原结合位点典型地包括六个CDR，其包含来自每一个重链和轻链V区中的CDR组。框架区(FR)是指插入CDR之间的氨基酸序列。轻链和重链的可变区典型地包含4个框架区和3个具有以下序列的CDR：FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。
抗体可变结构域中的残基通常根据Kabat等设计的系统编号。该系统在Kabat等，1987，Sequences of Proteins of Immunological Interest，US Department of Healthand Human Services，NIH，USA(以下称“Kabat等”)中阐述。本说明书使用此编号系统。Kabat残基命名并不总是与SEQ ID序列中氨基酸残基的线性编号直接对应。实际的线性氨基酸序列可含有比严格的Kabat编号中更少或更多的氨基酸，其对应于基本可变域结构的结构性组分(框架区或互补决定区(CDR))的缩短或插入。通过将抗体序列中的同源残基与“标准”Kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的残基的正确Kabat编号。根据Kabat编号系统，重链可变结构域的CDR位于残基31-35(H-CDR1)、残基50-65(H-CDR2)和残基95-102(H-CDR3)。根据Kabat编号系统，轻链可变结构域的CDR位于残基24-34(L-CDR1)、残基50-56(L-CDR2)和残基89-97(L-CDR3)。
在具体实施方案中，本文提供的抗体是抗体片段，更特别是包括如本文公开的抗体的抗原结合结构域的任何蛋白质。抗体片段包括但不限于Fv、Fab、F(ab')2、Fab'、dsFv、scFv、sc(Fv)2和双体。
如本文所用，术语“特异性”是指抗体可检测地结合抗原(诸如BTN2)上呈递的表位。在一些实施方案中，其意指结合如在实施例中所描述的细胞系(例如HEK293F细胞系)中表达的人BTN2A2的抗体或蛋白质，如实施例和图1中所测定，优选其EC50低于50μg/ml，更优选低于10μg/ml，甚至更优选低于1μg/ml。在一些实施方案中，其意指结合如在细胞系(例如HEK293F细胞系)中表达的人BTN2A1的抗体或蛋白质，如实施例中所述，其已被敲除BTN3和BTN2的所有亚型，优选其EC50低于1μg/ml，例如低于0.1μg/ml；和/或，其意指结合如在细胞系(例如HEK293F细胞系)中表达的人BTN2A2的抗体或蛋白质，如实施例所述，其已被敲除BTN3和BTN2的所有亚型，优选其EC50低于50μg/ml，例如低于1μg/ml或低于0.02μg/ml。在其他实施方案中，其以100nM或更小、10nM或更小、1nM或更小、100pM或更小或10pM或更小的KD结合抗原重组多肽。
“与除BTN2之外的抗原交叉反应”的抗体意指以10nM或更小、1nM或更小或100pM或更小的KD结合该抗原的抗体。“不与特定抗原交叉反应”的抗体意指以100nM或更大的KD、或1μM或更大的KD或10μM或更大的KD结合该抗原的抗体。在某些实施方案中，不与抗原交叉反应的此类抗体在标准结合测定中表现出对这些蛋白质的基本上不可检测的结合。
如本文所用，“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合BTN2的分离的抗体基本上不含特异性结合除BTN2以外的其他抗原的抗体)。但是，特异性结合BTN2的分离的抗体可与其他抗原(诸如来自其他物种的相关BTN2分子)具有交叉反应性。此外，分离的抗体可以基本上不含其他细胞物质和/或化学物质。
如本文所用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。
短语“识别抗原的抗体”和“对抗原具有特异性的抗体”在本文中与术语“特异性结合抗原的抗体”可互换使用。
本文所用的术语“Kassoc”或“Ka”意指特定抗体-抗原相互作用的结合速率，而本文所用的术语“Kdis”或“Kd”意指抗体-抗原相互作用的离解速率。
如本文所用，术语“KD”意指离解常数，其由Kd与Ka之比(即Kd/Ka)获得，并表示为摩尔浓度(M)。可以使用本领域众所周知的方法测定抗体的Kd值。可以从以下参考文献中找到测定mAb的Kd值的优选方法：Harlow,et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan et al.,eds.,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and WileyInterscience,N.Y.,(1992,1993),and Muller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)，这些参考文献通过引用整体并入本文。用于测定抗体的Kd的方法是通过使用表面等离振子共振，或使用诸如系统的生物传感器系统。
特异性可以进一步通过例如在抗原的特异性结合相对于与其他无关分子(在这种情况下，特异性抗原是BTN2多肽)的非特异性结合中约10:1、约20:1、约50:1、约100:1、10000:1或更高的亲和力/亲合力之比来表现。如本文所用，术语“亲和力”是指抗体与表位结合的强度。
一方面，本公开涉及一种对BTN2具有特异性的抗体，其特征在于其具有至少一种以下特性：
i.其抑制由活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α，和/或
ii.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，和/或
iii.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖。
可以使用如实施例中所述的细胞测定法，特别是Daudi细胞系上的CD107脱粒测定法，在抗BTN2抗体中筛选具有这种有利特性的本公开的抗BTN2抗体。
如本文所用，“抑制IFNγ或TNFα的产生”是指当与对照活化的Vγ9/Vδ2T细胞(以IgG1或IgG2a为对照)相比时，观察到由活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生至少IFNγ或TNFα的显著降低，所述Vγ9/Vδ2T细胞通过与靶细胞系(Daudi细胞系)共培养或通过磷酸激动剂(pAg)而被活化。典型地，由活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生IFNγ或TNFα的抑制可在细胞试验中通过用抗IFNγ或TNFα的抗体进行细胞内标记和流式细胞术来测定。在下文实施例中更详细地描述了这种测定。
如本文所用，“抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能”是指当与对照活化的人Vγ9/Vδ2T细胞(以IgG1或IgG2a为对照)相比时，观察到活化的人Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能的显著降低，所述人Vγ9/Vδ2T细胞通过与靶细胞系(Daudi细胞系)共培养或通过磷酸激动剂(pAg)而被活化。典型地，例如在激动剂抗体mAb20.1的存在下，活化的人Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能的抑制可根据针对标准细胞系诱导γδT细胞脱粒的抑制的测量来测定，其中CD107作为用于检测阳性脱粒γδT细胞的脱粒标志物。在下文实施例中更详细地描述了这种测定。
如本文所用，“抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖”是指当与用IgG1或IgG2a作为对照活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖相比时，观察到活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖的显著降低，所述Vγ9/Vδ2T细胞通过与靶细胞系(Daudi细胞系)共培养或通过磷酸激动剂(pAg)而被活化。典型地，活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖可在细胞测定中通过CFSE或Cell Trace紫染色和流式细胞仪来测量。
在一些实施方案中，本发明的抗体将活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能抑制到基本上等于或优于至少一种如下所述的参考抗体的水平：mAb 4.15、mAb 5.28、mAb 7.28、mAb 7.48、mAb 8.15和mAb 8.16。在其他具体实施方案中，抗BTN2抗体将活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能抑制到至少等于或优于mAb 103.2的水平，所述mAb 103.2公开于WO2012/080351中。
在一些实施方案中，本发明的抗体将由活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生的至少IFNγ或TNFα抑制到基本上等于或优于至少一种如下所述的参考抗体的水平：mAb 4.15、mAb 5.28、mAb 7.28、mAb 7.48、mAb 8.15和mAb 8.16。在其他具体实施方案中，抗BTN2抗体将活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能抑制到至少等于或优于mAb 103.2的水平，所述mAb 103.2公开于WO2012/080351中。
在具体实施方案中，根据本公开的抗BTN2抗体的特征还在于，即使在激动剂抗CD277抗体mAb20.1存在下，它们抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能。
抗CD277抗体mAb 20.1已公开于WO2012/080351中，并且该抗体增加活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能。典型地，在存在mAb20.1的情况下，可以根据针对标准细胞系(例如使用Daudi细胞系作为标准细胞系)诱导γδT细胞脱粒的抑制的测量来测定活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能的抑制，并使用CD107作为脱粒标志物以检测阳性的脱粒γδT细胞，并使用例如浓度为10μg/ml的mAb 20.1。在下文实施例中也更详细地描述了这种测定。
参考抗体mAb 1-6
本发明的抗体包括由杂交瘤产生的参考鼠单克隆抗体mAb1-mAb6，所述杂交瘤根据布达佩斯条约于2017年9月14日以下表1中所述的相应保藏号保藏于国家微生物培养物保藏中心(CNCM,Institut Pasteur,25rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15,France)：
表1：mAb1-mAb6
抗体 克隆名称 保藏号
mAb1 4.15 CNCM I-5231
mAb2 5.28 CNCM I-5232
mAb3 7.28 CNCM I-5233
mAb4 7.48 CNCM I-5234
mAb5 8.15 CNCM I-5235
mAb6 8.16 CNCM I-5236
本发明进一步涉及包含任何一种上述参考抗体的相应VH和VL区的任何抗体。
本发明进一步涉及可以保藏号CNCM I-5231、CNCM I-5232、CNCM I-5233、CNCM I-5234、CNCM I-5235或CNCM I-5236从CNCM获得的杂交瘤。
本发明的其他抗体包括具有通过氨基酸缺失、插入或取代而突变的氨基酸，但在CDR区中与任何一种上述参考抗体的CDR区具有至少60、70、80、90、95或100同一性百分比的那些抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体是mAb1-mAb6中任一项的突变体，其具有与参考mAb1-mAb6之一的相应6个CDR区100％相同的6个CDR区，并且其中与相应参考抗体的相应框架区相比，所述突变体抗体包括突变的氨基酸序列，其中不超过1、2、3、4或5个氨基酸已通过在FR1、FR2、FR3和FR4区中的氨基酸缺失、插入或取代而突变。
在具体实施方案中，本发明的抗BTN2抗体，优选人源化抗BTN2，包含：
i.包含抗体mAb 4.15的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 4.15可通过以保藏号CNCMI-5231保藏于CNCM的杂交瘤获得；
ii.包含抗体mAb 5.28的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 5.28可通过以保藏号CNCM I-5232保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iii.包含抗体mAb 7.28的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 7.28可通过以保藏号CNCM I-5233保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iv.包含抗体mAb 7.48的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 7.48可通过以保藏号CNCM I-5234保藏于CNCM的杂交瘤获得；
v.包含抗体mAb 8.15的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 8.15可通过以保藏号CNCMI-5235保藏于CNCM的杂交瘤获得；或
vi.包含抗体mAb 8.16的6个CDR的重链和轻链，所述mAb 8.16可通过以保藏号CNCM I-5236保藏于CNCM的杂交瘤获得。
因此，本公开的抗体还包括鼠抗BTN2抗体，其是分离的并通过如下表2所述的其可变重链和轻链氨基酸序列结构表征：
表2：本公开的鼠参考抗体的可变重链和轻链氨基酸序列
IgG4，IgG1的恒定同种型区域及其突变体形式的相应氨基酸和核苷酸编码序列是本领域众所周知的。
根据本公开的一些抗体的VH CDR1(也称为HCDR1)、VH CDR2(也称为HCDR2)、VHCDR3(也称为HCDR1)、VL CDR1(也称为LCDR1)、VL CDR2(也称为LCDR2)、VL CDR3(也称为HCDR3)的氨基酸序列的实例显示于表3中。
在表3中，使用Chothia系统(Chothia C,Lesk AM.1987,J Mol Biol 196,901-917)描绘了本公开的一些抗体的CDR区。
为了易于阅读，下文分别将CDR区称为HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3。
表3：根据Chothia定义的参考鼠抗体的CDR区
在具体实施方案中，根据本公开的分离的抗BTN2抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:3的HCDR1、SEQ ID NO:4的HCDR2、SEQ ID NO:5的HCDR3的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:6的LCDR1、SEQ ID NO:7的LCDR2和SEQ ID NO:8的LCDR3的可变轻链多肽；
(b)包含SEQ ID NO:11的HCDR1、SEQ ID NO:12的HCDR2、SEQ ID NO:13的HCDR3的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:14的LCDR1、SEQ ID NO:15的LCDR2和SEQ ID NO:16的LCDR3的可变轻链多肽；
(c)包含SEQ ID NO:19的HCDR1、SEQ ID NO:20的HCDR2、SEQ ID NO:21的HCDR3的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:22的LCDR1、SEQ ID NO:23的LCDR2和SEQ ID NO:24的LCDR3的可变轻链多肽；
(d)包含SEQ ID NO:27的HCDR1、SEQ ID NO:28的HCDR2、SEQ ID NO:29的HCDR3的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:30的LCDR1、SEQ ID NO:31的LCDR2和SEQ ID NO:32的LCDR3的可变轻链多肽；
(e)包含SEQ ID NO:35的HCDR1、SEQ ID NO:36的HCDR2、SEQ ID NO:37的HCDR3的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:38的LCDR1、SEQ ID NO:39的LCDR2和SEQ ID NO:40的LCDR3的可变轻链多肽；或
(f)包含SEQ ID NO:43的HCDR1、SEQ ID NO:44的HCDR2、SEQ ID NO:45的HCDR3的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:46的LCDR1、SEQ ID NO:47的LCDR2和SEQ ID NO:48的LCDR3的可变轻链多肽。
其中所述抗BTN2抗体对BTN2具有特异性。
在其他具体实施方案中，根据本公开的分离的抗BTN2抗体包含：
(a)包含SEQ ID NO:9的VH的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:10的VL的可变轻链多肽；
(b)包含SEQ ID NO:17的VH的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:18的VL的可变轻链多肽；
(c)包含SEQ ID NO:25的VH的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:26的VL的可变轻链多肽；
(d)包含SEQ ID NO:33的VH的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:34的VL的可变轻链多肽；
(e)包含SEQ ID NO:41的VH的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:42的VL的可变轻链多肽；或
(f)包含SEQ ID NO:49的VH的可变重链多肽和包含SEQ ID NO:50的VL的可变轻链多肽；
其中所述抗BTN2抗体对BTN2具有特异性。
功能性变体抗体
在另一个实施方案中，本发明的功能性变体抗体具有全长重链和轻链氨基酸序列；或可变区重链和轻链氨基酸序列，或与上述抗体mAb1-mAb6的相应氨基酸序列(特别在表1、2和3中)同源或优选一致的所有6个CDR区氨基酸序列，并且其中所述功能性变体抗体保留原始mAb1-mAb6抗体的所需功能特性。
在本发明单克隆抗体的上下文中所用的VL、VH或CDR的功能性变体仍然允许抗体保留亲本抗体(即任何一种mAb1-mAb6抗体)的至少相当大比例(至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)的亲和力/亲合力和/或特异性/选择性，并且在某些情况下，本发明的这种单克隆抗体可能涉及比亲本Ab更高的亲和力、选择性和/或特异性。
原始mAb1-mAb6抗体的所需功能特性可选自下组：
i.其对BTN2具有特异性，特别是其结合如实施例所述的细胞系(例如表达人BTN2A2的HEK293F细胞系)中表达的人BTN2，并且如实施例和图1所测定，优选其EC50低于50μg/ml，更优选低于10μg/ml，甚至更优选低于1μg/ml，
ii.其结合如在细胞系(例如HEK293F细胞系)中表达的人BTN2A1，如实施例中所述，其已被敲除BTN3和BTN2的所有亚型，优选其EC50低于1μg/ml，例如低于0.1μg/ml；
iii.其结合如在细胞系(例如HEK293F细胞系)中表达的人BTN2A2，如实施例所述，其已被敲除BTN3和BTN2的所有亚型，优选其EC50低于50μg/ml，例如低于1μg/ml或低于0.02μg/ml
iv.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的IFN-γ和/或TNF-α的产生，
v.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，和/或
vi.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖。
例如，本发明涉及mAb1-mAb6的功能性变体抗体，其包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)序列，其中CDR序列，即6个CDR区；HCDR1、HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR2、LCDR3与至少一种mAb1-mAb6抗体的相应CDR序列共享至少60、70、90、95或100序列同一性百分比，其中所述功能性变体抗体特异性结合BTN2，并且所述抗体表现出至少一种以下功能特性：
i.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α，
ii.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，和/或
iii.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖。
本发明进一步涉及mAb1-mAb6的功能性变体抗体，其包含与任何一种mAb1-mAb6抗体的相应重链可变区和轻链可变区(特别是如表2所示)至少80％、90％或至少95％或100％一致的重链可变区和轻链可变区；所述功能性变体抗体特异性结合BTN2，并且表现出至少一种以下功能特性：
i.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α，
ii.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，和/或
iii.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖。
在各种实施方案中，抗体可表现出上文讨论的一种或两种期望的功能特性。例如，所述抗体可以是人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。优选抗体或蛋白质是人源化的人抗体，更优选人源化沉默抗体。
如本文所用，术语“沉默”抗体是指在测量靶细胞的细胞裂解的体外ADCC活性测定中所测量的无或低ADCC活性的抗体。
在一个实施方案中，术语“无或低ADCC活性”是指沉默抗体表现出的ADCC活性低于相应野生型(非沉默)抗体(例如野生型人IgG1抗体)所观察到的ADCC活性的50％，例如低于10％。优选地，与对照Fab抗体相比，在沉默抗体的体外ADCC活性测定中未观察到可检测的ADCC活性。
沉默的效应子功能可以通过抗体的Fc恒定部分的突变获得，并且已经描述于本领域中：Strohl 2009(LALA&N297A)；Baudino 2008,D265A(Baudino et al.,J.Immunol.181(2008):6664-69,Strohl,CO Biotechnology 20(2009):685-91)。沉默的IgG1抗体的实例包含在IgG1 Fc氨基酸序列(EU编号)的第234、235和/或331位降低ADCC的突变。另一种沉默的IgG1抗体包含N297A突变，其导致糖基化或非糖基化抗体。
CDR变体的序列可能通过大多数保守性替换与亲本抗体序列的CDR序列(例如在表3中所示)不同，例如变体中至少10个，诸如至少9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个替换是保守性氨基酸残基替代。在本发明上下文中，保守性替换可以定义为如下所反映的氨基酸类别内的替换：
脂族残基I、L、V和M。
环烯基相关残基F、H、W和Y。
疏水性残基A、C、F、G、H、I、L、M、R、T、V、W和Y。
带负电荷的残基D和E。
极性残基C、D、E、H、K、N、Q、R、S和T。
带正电荷的残基H、K和R。
小残基A、C、D、G、N、P、S、T和V。
非常小的残基A、G和S。
涉及转角的残基A、C、D、E、G、H、K、N，Q、R、S、P和涉及形成的残基T。
柔性残基Q、T、K、S、G、P、D、E和R。
更多的保守性替换分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。与任何一个mAb1-6的CDR相比，在变体CDR中基本上保留了亲水(hydropathic)/亲水特性和残基重量/大小方面的保守性。本领域通常理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用的生物学功能方面的重要性。已经接受的是，氨基酸的相对亲水特性有助于所得蛋白质的二级结构，这反而限定了蛋白质与其他分子(例如酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。根据它们的疏水性和电荷特征，为每种氨基酸指定了亲水指数，它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。类似残基的保留也可以或替代地通过相似性得分来测量，如使用BLAST程序来测定(例如，可通过NCBI获得的BLAST 2.2.8，其使用标准设置BLOSUM62，Open Gap＝11和Extended Gap＝1)。合适的变体典型地表现出与亲本肽至少约70％的同一性。根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少70％同一性是指第一序列与第二氨基酸序列具有70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98；99或100％同一性。根据本发明，第一氨基酸序列与第二氨基酸序列具有至少50％同一性是指第一序列与第二氨基酸序列具有50；51；52；53；54；55；56；57；58；59；60；61；62；63；64；65；66；67；68；69；70；71；72；73；74；75；76；77；78；79；80；81；82；83；84；85；86；87；88；89；90；91；92；93；94；95；96；97；98；99或100％同一性。
在一些实施方案中，本发明的抗体是嵌合抗体，典型地是嵌合的小鼠/人抗体。术语“嵌合抗体”是指单克隆抗体，其包含衍生自非人动物的抗体的VH结构域和VL结构域和人抗体的CH结构域和CL结构域。作为非人动物，可以使用任何动物，诸如小鼠、大鼠、仓鼠、兔等。特别地，所述小鼠/人嵌合抗体可包含任一种mAb1-mAb6参考抗体的VH和VL结构域。
在一些实施方案中，本发明的抗体是人源化抗体。在具体实施方案中，本发明的抗体是包含任一种mAb1-mAb6参考抗体的6个CDR(例如在表3中所示)的人源化抗体。如本文所用，术语“人源化抗体”是指其中框架区(FR)已经被修饰以包含来自与亲本免疫球蛋白(例如鼠CDRs)相比具有不同物种(例如人种)的供体免疫球蛋白的FR的抗体。
在一些实施方案中，本发明的抗体选自下组：Fab、F(ab')2、Fab'和scFv。如本文所用，术语“Fab”表示具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其中在用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理IgG获得的片段中，约一半H链的N末端侧和整个L链通过二硫键结合在一起。术语“F(ab')2”是指具有约100,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，在用蛋白酶(胃蛋白酶)处理IgG获得的片段中，其比通过铰链区的二硫键结合的Fab略大。术语“Fab'”是指具有约50,000的分子量和抗原结合活性的抗体片段，其通过切割F(ab')2的铰链区的二硫键获得。单链Fv(“scFv”)多肽是共价连接的VH::VL异二聚体，其通常由包括通过肽编码接头连接的VH和VL编码基因的基因融合体表达。本发明的人scFv片段包括优选通过使用基因重组技术保持适当构象的CDR。
具有突变体氨基酸序列的功能性变体抗体可通过编码核酸分子的诱变(例如，定点诱变或PCR介导的诱变)，然后使用本文所述的功能测定法测试编码的改变抗体的保留功能(即上述功能)来获得。
与任何一个mAb1-mAb6交叉阻断和/或与mAb1-mAb6结合相同表位的抗体
可以基于它们以统计学显著的方式与任何一种上述参考抗体mAb1-mAb6交叉竞争(例如，竞争性抑制结合)的能力，在标准BTN2结合测定中鉴定具有与本文公开的参考抗体mAb1-mAb6的类似有利特性的其他抗体。
例如，首先可以从人重组抗体文库中使用例如噬菌体展示技术或从表达用BTN2抗原免疫的人可变区抗体的转基因小鼠中筛选测试抗体与BTN2的结合亲和力。
测试抗体交叉竞争或抑制本发明的抗体与人BTN2结合的能力证实了所述测试抗体可以与该抗体竞争与人BTN2的结合。根据非限制性理论，该抗体可以如与其竞争的抗体结合人BTN2(例如，BTN2A2和/或BTN2A1)上相同或相关的(例如，结构上相似或空间上接近)表位。
例如，为了筛选抗BTN2抗体与mAb1-mAb6参考抗体之一结合相同表位的能力，将用人BTN2A2转染的HEK293细胞或敲除BTN2或BTN3的所有亚型并表达人BTN2A2或人BTN2A1的HEK293细胞(如实施例中所述)在4℃下用饱和浓度(10μg/ml)的参考抗体mAb1-mAb6之一染色30分钟。洗涤2次后，测试不同剂量的测试抗BTN2 mAb(在4℃下30分钟)与任何一种mAb1-mAb6参考抗体的竞争潜力。在存在此类参考抗体的情况下，确实与参考抗体竞争相同的结合位点的mAb将不能识别BTN2。数据可以表示为平均荧光强度。
可以进一步测试所选择的抗体的mAb1-mAb6的有利特性，特别是针对激活的Vγ9Vδ2T细胞的抑制特性。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种分离的抗体，其交叉阻断mAb1-mAb6的至少一种抗体结合BTN2或被mAb1-mAb6的至少一种抗体交叉阻断结合BTN2，其中所述抗体：
i.对BTN2具有特异性，特别是其结合如实施例所述的细胞系(例如表达人BTN2A2的HEK293F细胞系)中表达的人BTN2，如实施例和图1所测定，优选其EC50低于50μg/ml，更优选低于10μg/ml，甚至更优选低于1μg/ml，
ii.其结合如在细胞系(例如HEK293F细胞系)中表达的人BTN2A1，如实施例中所述，其已被敲除BTN3和BTN2的所有亚型，优选其EC50低于1μg/ml，例如低于0.1μg/ml；
iii.其结合如在细胞系(例如HEK293F细胞系)中表达的人BTN2A2，如实施例所述，其已被敲除BTN3和BTN2的所有亚型，优选其EC50低于50μg/ml，例如低于1μg/ml或低于0.02μg/ml
iv.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α，
v.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能，和/或
vi.其抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的增殖。
在另一个实施方案中，本发明提供了与如本文所述的至少一种抗BTN2抗体mAb1-mAb6结合相同表位的抗体。
在某些实施方案中，交叉阻断抗体或如任何一种mAb1-mAb6结合人BTN2上相同表位的抗体是嵌合、人源化或人重组抗体。
产生单克隆抗体的转染瘤的产生
通过本领域已知的任何技术产生本发明的抗体，例如但不限于任何单独或组合的化学、生物学、遗传学或酶学技术。典型地，已知所需序列的氨基酸序列，本领域技术人员可以通过用于生产多肽的标准技术容易地生产所述抗体。例如，它们可以使用熟知的固相方法合成，优选使用市售的肽合成装置(诸如由Applied Biosystems，Foster City，California制造的)并遵循制造商的说明书。或者，可以通过本领域熟知的重组DNA技术合成本发明的抗体。例如，在将编码抗体的DNA序列整合入表达载体并将这些载体引入将表达所需抗体的合适的真核或原核宿主中后，可以获得作为DNA表达产物的抗体，之后可以使用已知技术分离它们。
因此，本发明的另一个目的涉及编码根据本发明的抗体的核酸分子。更特别地，核酸分子编码本发明抗体的重链或轻链。更特别地，核酸分子包含与编码任何一种参考抗体mAb1-mAb6的重链可变区(VH区)或轻链可变区(VL)的相应核酸具有至少70％、80％、90％、95％或100％同一性的VH或VL编码区。
典型地，所述核酸是DNA或RNA分子，其可以包括在任何合适的载体中，诸如质粒、粘粒、附加体、人工染色体、噬菌体或病毒载体。如本文所用，术语“载体”、“克隆载体”和“表达载体”是指可以将DNA或RNA序列(例如外源基因)引入宿主细胞，以转化宿主并促进引入序列的表达(例如转录和翻译)的介质。因此，本发明的另一个目的涉及包含本发明核酸的载体。此类载体可包含调节元件，诸如启动子、增强子、终止子等，以在施用于受试者时引起或指导所述抗体的表达。用于动物细胞的表达载体的启动子和增强子的实例包括SV40的早期启动子和增强子、Moloney小鼠白血病病毒的LTR启动子和增强子、免疫球蛋白H链的启动子和增强子等。可以使用任何用于动物细胞的表达载体，只要可以插入并表达编码人抗体C区的基因即可。合适载体的实例包括pAGE107、pAGE103、pHSG274、pKCR、pSG1βd2-4等。质粒的其他实例包括含有复制起点的复制质粒，或整合质粒，诸如pUC、pcDNA、pBR等。病毒载体的其他实例包括腺病毒、逆转录病毒、疱疹病毒和AAV载体。可通过本领域已知的技术产生此类重组病毒，诸如通过转染包装细胞或通过用辅助质粒或病毒进行瞬时转染。病毒包装细胞的典型实例包括PA317细胞、PsiCRIP细胞、GPenv+细胞、293细胞等。例如，用于产生这种复制缺陷型重组病毒的详细方案可以在WO 95/14785、WO 96/22378、US 5,882,877、US6,013,516、US 4,861,719、US 5,278,056和WO 94/19478中找到。
本发明的进一步的目的涉及通过上述核酸和/或载体转染、感染或转化的宿主细胞。如本文所用，术语“转化”是指将“外源”(即外部或细胞外)基因、DNA或RNA序列引入宿主细胞，从而宿主细胞将表达引入的基因或序列以产生所需的物质，典型地是由引入的基因或序列编码的蛋白质或酶。接受并表达引入的DNA或RNA的宿主细胞被“转化”。
本发明的核酸可用于在合适的表达系统中产生本发明的抗体。术语“表达系统”是指在合适条件下的宿主细胞和相容载体，例如，其用于表达由载体携带并引入宿主细胞的外源DNA编码的蛋白质。常见的表达系统包括大肠杆菌宿主细胞和质粒载体、昆虫宿主细胞和杆状病毒载体，以及哺乳动物宿主细胞和载体。宿主细胞的其他实例包括但不限于原核细胞(诸如细菌)和真核细胞(诸如酵母细胞、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞等)。具体实例包括大肠杆菌、克鲁维酵母或酵母菌、哺乳动物细胞系(例如Vero细胞、CHO细胞、3T3细胞、COS细胞等)以及原代或已建立的哺乳动物细胞培养物(例如，由淋巴母细胞、成纤维细胞、胚胎细胞、上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等产生)。实例还包括小鼠SP2/0-Ag14细胞(ATCC CRL1581)、小鼠P3X63-Ag8.653细胞(ATCC CRL1580)、其中二氢叶酸还原酶基因(下文称为“DHFR基因”)有缺陷的CHO细胞(Urlaub G等；1980)、大鼠YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(ATCC CRL1662，以下称为“YB2/0细胞”)等。
本发明还涉及用于产生表达根据本发明的抗体的重组宿主细胞的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将如上所述的重组核酸或载体在体外或离体导入感受态宿主细胞，(ii)体外或离体培养获得的重组宿主细胞，和(iii)任选地，选择表达和/或分泌所述抗体的细胞。这些重组宿主细胞可用于产生本发明的抗体。
通过常规免疫球蛋白纯化方法，例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析适当地从培养基分离本发明的抗体。
在一些实施方案中，本发明的人嵌合抗体可以通过以下来产生：获得如前所述的编码VL和VH结构域的核酸序列，通过将它们插入具有编码人抗体CH和人抗体CL的基因的动物细胞的表达载体来构建人嵌合抗体表达载体，并通过将表达载体引入动物细胞来表达编码序列。作为人嵌合抗体的CH结构域，可以是属于人免疫球蛋白的任何区域，但IgG类的那些区域是合适的，并且也可以使用属于IgG类的任何一个亚类，诸如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。另外，作为人嵌合抗体的CL，可以是属于Ig的任何区域，也可以使用κ类或λ类的区域。产生嵌合抗体的方法涉及常规重组DNA，且基因转染技术是本领域熟知的(参见MorrisonSL等(1984)和专利文献US5,202,238；和US5,204,244)。
本发明的人源化抗体可以通过以下产生：获得如前所述的编码CDR结构域的核酸序列，通过将它们插入具有编码以下的基因的表达载体来构建人源化抗体表达载体：(i)与人抗体相同的重链恒定区和重链可变框架区，和(ii)与人抗体相同的轻链恒定区轻链可变框架区，并通过将表达载体引入合适的细胞系来表达基因。人源化抗体表达载体可以是这样的类型：其中编码抗体重链的基因和编码抗体轻链的基因存在于不同的载体上，或者两种基因存在于同一载体上(串联型)。考虑到构建人源化抗体表达载体的容易性，引入细胞系的容易性，以及细胞系中抗体H和L链的表达水平之间的平衡，优选串联型人源化抗体表达载体。串联型人源化抗体表达载体的实例包括pKANTEX93(WO 97/10354)、pEE18等。
基于常规重组DNA和基因转染技术人源化抗体的方法是本领域熟知的(参见例如，Riechmann L.等，1988；Neuberger MS等，1985)。可以使用本领域已知的多种技术将抗体人源化，包括例如CDR-移植(EP 239,400、PCT公开WO91/09967、美国专利号5,225,53、5,530,101和5,585,089)、镶饰(veneering)或重塑(EP 592,106、EP 519,596、Padlan EA(1991)、Studnicka GM等(1994)、Roguska MA等(1994))和链替换(美国专利号5,565,332)。用于制备此类抗体的一般重组DNA技术也是已知的(参见欧洲专利申请EP 125023和国际专利申请WO 96/02576)。
可以通过用蛋白酶(木瓜蛋白酶)处理与AMH特异性反应的抗体而获得本发明的Fab。此外，可以通过以下来产生Fab：将编码抗体Fab的DNA插入用于原核表达系统或用于真核表达系统的载体，并将载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以表达Fab。
可以通过用蛋白酶(胃蛋白酶)处理与AMH特异性反应的抗体而获得本发明的F(ab')2。此外，可以通过用硫醚键或二硫键结合下述Fab'来产生F(ab')2。
可以通过用还原剂二硫苏糖醇处理与AMH特异性反应的F(ab')2而获得本发明的Fab'。此外，可以通过以下来产生Fab'：将编码抗体的Fab'片段的DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体中，并将载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以进行表达。
可以通过以下来产生本发明的scFv：获得如前所述编码VH和VL结构域的cDNA，构建编码scFv的DNA，将DNA插入原核生物的表达载体或真核生物的表达载体，然后将表达载体引入原核生物或真核生物(视情况而定)以表达scFv。
为制备人源化scFv片段，可以使用称为CDR移植的公知技术，其涉及从供体scFv片段选择互补决定区(CDR)，并将它们移植到已知三维结构的人scFv片段框架上(例如，参见WO98/45322、WO87/02671、US5,859,205、US5,585,089、US4,816,567、EP0173494)。
本发明的工程化抗体进一步包括其中对VH和/或VL内的框架残基进行修饰，例如，以改善抗体特性的抗体。典型地，进行该框架修饰以降低抗体的免疫原性。例如，一种途径是将一个或多个框架残基“回复突变”到相应的种系序列。更具体地，已经历体细胞突变的抗体可以含有与衍生抗体的种系序列不同的框架残基。可以通过将抗体框架序列与衍生抗体的种系序列进行比较来鉴定这些残基。为了使框架区序列恢复其种系构型，例如可以通过定点诱变或PCR介导的诱变将体细胞突变“回复突变”至种系序列。这种“回复突变”抗体也涵盖在本发明中。另一种类型的框架修饰涉及突变框架区内或甚至一个或多个CDR区内的一个或多个残基，以去除T细胞表位，从而降低抗体的潜在免疫原性。该途径也称为“去免疫化”，并且进一步详细描述于Carr等的美国专利公开号20030153043中。
Fc工程化
本发明的抗体可以通过上述方面的一个或多个功能或结构特征，或通过选择的功能和结构特征的任何组合来表征。
本发明的抗体可以是任何同种型。同种型的选择典型地由期望的效应子功能(诸如ADCC沉默)来引导。示例性同种型是IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区中的任一个，κ或λ。如果需要，可以通过已知方法转换本发明的抗体类别。典型地，类别转换技术可用于将一个IgG亚类转换成另一个，例如从IgG1转变为IgG2。因此，为各种治疗用途，可以通过同种型转换为例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgD、IgA、IgE或IgM抗体来改变本发明抗体的效应子功能。在一些实施方案中，本发明的抗体是全长抗体。在一些实施方案中，全长抗体是IgG1抗体。在一些实施方案中，全长抗体是IgG4抗体。在一些实施方案中，BTN2特异性IgG4抗体是稳定化的IgG4抗体。合适的稳定化的IgG4抗体的实例是其中人IgG4的重链恒定区中第409位的精氨酸(如在以上Kabat等的EU索引中所示)被赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或亮氨酸，优选赖氨酸取代(描述于WO2006033386中)和/或其中铰链区包含Cys-Pro-Pro-Cys序列的抗体。其他合适的稳定化的IgG4抗体公开于WO2008145142中。
在一些实施方案中，本发明的抗体不包含诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的Fc部分。术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”是指抗体重链的C末端片段，例如，人γ重链从约第230位氨基酸(aa)至约第450位aa或其在其他类型的抗体重链(例如，人抗体的α、δ、ε和μ)中的对应序列，或其天然存在的同种异型。除非另有说明，否则在本公开内容中使用普遍接受的免疫球蛋白的Kabat氨基酸编号(参见Kabat等(1991)Sequences of Protein ofImmunological Interest，5th ed，United States Public Health Service，NationalInstitute of Health，Bethesda，MD)。在一些实施方案中，本发明的抗体不包含能够基本上结合FcgRIIIA(CD16)多肽的Fc结构域。在一些实施方案中，本发明的抗体缺少Fc结构域(例如缺少CH2和/或CH3结构域)或包含IgG2或IgG4同种型的Fc结构域。在一些实施方案中，本发明的抗体由以下组成或包含以下：Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv、双体、单链抗体片段或包含多种不同抗体片段的多特异性抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体不与毒性部分连接。在一些实施方案中，选自氨基酸残基的一个或多个氨基酸可以用不同的氨基酸残基替换，使得抗体具有改变的C2q结合和/或减少或消除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。美国专利No.6,194,551进一步详细描述了该途径。
本发明预期的本文抗体的另一种修饰是聚乙二醇化。例如，可以将抗体聚乙二醇化以增加抗体的生物学(例如血清)半衰期。为了使抗体聚乙二醇化，抗体或其片段典型地在一个或多个PEG基团变得与抗体或抗体片段连接的条件下与聚乙二醇(PEG)反应，诸如PEG的反应性酯或醛衍生物。聚乙二醇化可以通过酰化反应或与反应性PEG分子(或类似的反应性水溶性聚合物)的烷基化反应来进行。如本文所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖用于衍生其他蛋白质的任何形式的PEG，例如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在一些实施方案中，待聚乙二醇化的抗体是无糖基化的抗体。使蛋白质聚乙二醇化的方法是本领域已知的，并且可以应用于本发明的抗体。例如，参见Nishimura等的EP0154 316和Ishikawa等的EP 0 401 384。
本发明预期的抗体的另一种修饰是至少本发明抗体的抗原结合区与血清蛋白(诸如人血清白蛋白或其片段)的偶联物或蛋白质融合物，以增加所得分子的半衰期。
在一些实施方案中，本发明还提供多特异性抗体。本发明的多特异性抗体分子的示例性形式包括但不限于(i)通过化学异源偶联交联的两种抗体，一种对BTN2具有特异性，另一种对第二抗原具有特异性；(ii)包含两个不同抗原结合区的单个抗体；(iii)包含两个不同抗原结合区的单链抗体，例如，通过额外的肽接头串联连接的两个scFv；(iv)双可变结构域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有通过短肽连接串联的两个可变结构域(Wu等Generation and Characterization of a Dual Variable Domain Immunoglobulin(DVD-IgTM)Molecule,In:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(v)化学连接的双特异性(Fab')2片段；(vi)Tandab，其是两个单链双体的融合物，产生对于每种靶标抗原具有两个结合位点的四价双特异性抗体；(vii)flexibody，其是scFv与双体的组合，产生多价分子；(viii)基于蛋白激酶A中的“二聚化和对接结构域”的所谓的“对接和锁定”分子，当应用于Fab时，可以产生由与不同的Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(ix)所谓的Scorpion分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(x)双体。双特异性抗体的另一种示例性形式是具有互补CH3结构域的IgG样分子，以推动异源二聚化。这些分子可以使用已知技术制备，诸如称为Triomab/Quadroma(Trion Pharma/Fresenius Biotech)、Knob-into-Hole(Genentech)、CrossMAb(Roche)和静电匹配(Amgen)、LUZ-Y(Genentech)、链交换工程化结构域体(SEEDbody)(EMD Serono)、Biclonic(Merus)和DuoBody(Genmab A/S)技术的那些。在一些实施方案中，双特异性抗体典型地使用DuoBody技术通过受控的Fab臂交换获得或可获得。通过受控的Fab臂交换产生双特异性抗体的体外方法已描述于WO2008119353和WO2011111717(均由Genmab A/S)中。在WO 2008119353中描述的一种示例性方法中，在还原条件下孵育时，通过两种单特异性抗体之间的“Fab-臂”或“半分子”交换(交换重链和连接的轻链)形成双特异性抗体，所述两种单特异性抗体均包含IgG4样CH3区域。所得产物是具有两个Fab臂的双特异性抗体，其可包含不同的序列。在WO 2011131746中描述的另一种示例性方法中，通过包括以下步骤的方法制备本发明的双特异性抗体，其中第一和第二抗体中的至少一种是本发明的抗体：a)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第一抗体，所述Fc区包含第一CH3区；b)提供包含免疫球蛋白的Fc区的第二抗体，所述Fc区包含第二CH3区；其中所述第一和第二CH3区的序列不同，并且所述第一和第二CH3区之间的异源二聚体相互作用比所述第一和第二CH3区之间的同源二聚体相互作用强；c)在还原条件下孵育所述第一抗体和所述第二抗体；和d)获得所述双特异性抗体，其中所述第一抗体是本发明的抗体，所述第二抗体具有不同的结合特异性，或反之亦然。例如，还原条件可以通过添加例如选自2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦的还原剂来提供。步骤d)可以进一步包括将条件恢复为变成非还原或较少还原，例如通过去除还原剂，例如通过脱盐。优选地，第一和第二CH3区的序列不同，仅包含少数相当保守的不对称突变，使得所述第一和第二CH3区之间的异源二聚体相互作用比所述第一和第二CH3区的每个同源二聚体相互作用强。通过引用整体并入本文的WO 2011131746提供了关于这些相互作用及其如何实现的更多细节。以下是这种不对称突变的组合的示例性实施方案，任选地其中一个或两个Fc区是IgG1同种型。
本发明的用途和方法
本发明的抗体或蛋白质具有体外和体内诊断和治疗用途。例如，可以将这些分子(例如体外或体内)施用于培养的细胞，或(例如体内)施用于受试者，以治疗、预防或诊断多种疾病。
该方法特别适于治疗、预防或诊断BTN2相关的疾病和/或自身免疫性、炎性疾病和移植排斥。
本公开还涉及制备用于治疗炎性病症、自身免疫性疾病和器官或组织移植排斥的药物的方法，所述药物包含如之前章节中所述的本公开的抗BTN2抗体。
如本文所用，“BTN2相关的疾病”包括与异常BTN2A1或BTN2A2水平相关的疾病或以其为特征的病症和/或可通过调节人血细胞中的BTN2A1和/或BTN2A2诱导的信号传导活性(例如通过抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞产生IFN-γ和/或TNF-α和/或抑制活化的Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能)来治疗的疾病或病症。这些包括炎症性疾病、自身免疫性疾病以及器官或组织移植排斥。
可以治疗的自身免疫性包括但不限于类风湿性关节炎(RA)、胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)、多发性硬化症(MS)、克罗恩病、系统性红斑狼疮(SLE)、硬皮病、干燥综合征、寻常性天疱疮、类天疱疮、艾迪生氏病、强直性脊柱炎、再生障碍性贫血、自身免疫性溶血性贫血、自身免疫性肝炎、乳糜泻、皮肌炎、Goodpasture综合征、Graves病、Guillain-Barre综合征、桥本氏病、特发性血小板减少症、特发性血小板减少性紫癜、男性不育、混合性结缔组织病、重症肌无力、恶性贫血、致眼葡萄膜炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性粘液水肿、赖特氏综合征、僵人综合征、甲状腺毒症、溃疡性结肠炎和韦格纳肉芽肿病。
本发明的抗体可以作为唯一的活性成分施用、或与例如佐剂联合施用、或与其他药物(例如免疫抑制剂或免疫调节剂)或其他抗炎剂联合施用，以例如用于治疗或预防上述疾病。
本发明的目的涉及一种在受试者中抑制免疫应答，特别是在有需要的受试者中抑制Vγ9Vδ2T细胞的溶细胞特性的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本发明的抗体。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”或“治疗(treat)”是指预防性或防治性治疗以及治愈性或疾病改善性治疗，包括治疗有感染疾病风险或怀疑已经感染疾病的受试者，以及患病或被诊断为患有疾病或医学病症的受试者，包括抑制临床复发。可以向患有医学疾病或最终可能患有疾病的受试者施用治疗，以便预防、治愈、延迟疾病或复发疾病的一种或多种症状的发作，降低疾病或复发疾病的一种或多种症状的严重程度，或缓解疾病或复发疾病的一种或多种症状，或为了将受试者的存活率延长至超过在没有这种治疗的情况下的预期。“治疗方案”是指疾病的治疗模式，例如治疗期间使用的剂量模式。治疗方案可包括诱导方案和维持方案。短语“诱导方案”或“诱导期”是指用于疾病初始治疗的治疗方案(或治疗方案的一部分)。诱导方案的总体目标是在治疗方案的初始阶段向受试者提供高水平的药物。诱导方案可以采用(部分或全部)“加载方案”，其可以包括施用比医生在维持方案期间使用的剂量更大的药物，比医生在维持方案期间施用的更频繁地施用药物，或两者兼有。短语“维持方案”或“维持期”是指用于在治疗疾病期间维持受试者，例如使受试者长期保持缓解(数月或数年)的治疗方案(或治疗方案的一部分)。维持方案可以采用连续治疗(例如，以规律的间隔，例如每周、每月、每年等施用药物)或间歇治疗(例如，中断治疗、间歇治疗、复发时的治疗或实现特定预定标准的治疗[例如，疾病表现等]。
如本文所用，术语“治疗有效量”是指在必要的剂量和时间段内有效实现所需治疗结果的量。治疗有效量的本发明抗体可根据诸如以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及本发明的抗体在个体中引发所需应答的能力。治疗有效量也是其中治疗有益效果超过抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用的量。本发明抗体的有效剂量和剂量方案取决于待治疗的疾病或病症，并且可由本领域技术人员确定。具有本领域普通技术知识的医生可以容易地确定和开出所需药物组合物的有效量。例如，医生可以以低于实现所需治疗效果所需的水平开始药物组合物中采用的本发明抗体的剂量，并逐渐增加剂量直至达到所需效果。通常，合适剂量的本发明组合物将是这样：化合物的量是根据特定剂量方案有效产生治疗效果的最低剂量。这种有效剂量通常取决于上述因素。例如，用于治疗用途的治疗有效量可以通过其稳定疾病进展的能力来测量。典型地，例如，可以在预测治疗自身免疫性疾病功效的动物模型系统中评估化合物治疗自身免疫性疾病的能力。或者可以通过熟练医生已知的体外测定法检查化合物抑制诱导免疫应答的能力来评估组合物的这种特性。治疗有效量的治疗化合物可以减小免疫或炎症应答，或减轻受试者的症状。本领域普通技术人员将能够基于诸如以下因素来确定这样的量：受试者的大小、受试者症状的严重性和所选择的特定组合物或施用途径。本发明抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是约0.1-100mg/kg、诸如约0.1-50mg/kg、诸如约0.1-20mg/kg、诸如约0.1-10mg/kg、例如约0.5、诸如约0.3、约1、约3mg/kg、约5mg/kg或约8mg/kg。本发明抗体的治疗有效量的示例性、非限制性范围是0.02-100mg/kg、诸如约0.02-30mg/kg、诸如约0.05-10mg/kg或0.1-3mg/kg，例如约0.5-2mg/kg。可以例如静脉内、肌肉内、腹膜内或皮下施用，例如在靶标位点附近施用。调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的所需反应(例如治疗反应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用几个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。在一些实施方案中，在治疗期间监测治疗功效，例如在预定义的时间点。在一些实施方案中，可通过疾病区域的可视化或通过本文进一步描述的其他诊断方法监测功效，例如，通过使用例如本发明的标记抗体、衍生自本发明抗体的片段或小抗体进行一次或多次PET-CT扫描。如果需要，药物组合物的有效每日剂量可以作为两个、三个、四个、五个、六个或更多个亚剂量(任选地，以单位剂型)，在一天中以适当的间隔分开施用。在一些实施方案中，本发明的人单克隆抗体通过长时间(诸如超过24小时)的缓慢连续输注施用，以使任何不希望的副作用最小化。还可以使用每周、每两周或每三周一次的给药期来施用有效剂量的本发明抗体。给药期可以限制在例如8周、12周或直到建立临床进展。作为非限制性实例，在治疗开始后的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天的至少一天，或在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周的至少一周，或其任意组合，每24、12、8、6、4或2小时使用单次或分次剂量，或其任何组合，根据本发明的治疗可以作为含量为以下的本发明抗体的每日剂量提供：每天约0.1-100mg/kg，诸如0.2、0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg。
典型地，本发明的抗体以药物组合物的形式向受试者施用，所述药物组合物包含药学上可接受的载体。可用于这些组合物的药学上可接受的载体包括但不限于：离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白(诸如人血清白蛋白)、缓冲物质(诸如磷酸盐)、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质(诸如硫酸鱼精蛋白)、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙烯乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。为了用于向患者施用，将组合物配制成用于向患者施用。本发明的组合物可以通过以下施用：口服、胃肠外、通过吸入喷雾、局部、直肠、经鼻、经颊、阴道或通过植入型药盒。本文使用的包括皮下、静脉内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。本发明组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。可以根据本领域已知的技术使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制这些悬浮液。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如作为1,3-丁二醇溶液。可以采用的可接受载体和溶剂包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以采用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。与天然的药学上可接受的油，诸如橄榄油或蓖麻油，尤其是它们的聚氧乙基化形式一样，脂肪酸，诸如油酸及其甘油酯衍生物可用于制备注射剂。这些油溶液或悬浮液还可含有长链醇类稀释剂或分散剂，诸如羧甲基纤维素或通常用于配制药学上可接受的剂型(包括乳剂和混悬剂)的类似分散剂。通常用于制备药学上可接受的固体、液体或其它剂型的其他常用的表面活性剂，诸如Tween、Span和其他乳化剂或生物利用度增强剂也可用于配制目的。本发明的组合物可以以任何口服可接受的剂型口服施用，包括但不限于胶囊、片剂、水性悬浮液或溶液。在口服用片剂的情况下，常用的载体包括乳糖和玉米淀粉。典型地，还添加润滑剂，诸如硬脂酸镁。对于胶囊形式的口服施用，有用的稀释剂包括例如乳糖。当口服使用需要水性悬浮液时，将活性成分与乳化剂和悬浮剂组合。如果需要，还可以添加某些甜味剂、调味剂或着色剂。或者，本发明的组合物可以用于直肠施用的栓剂的形式施用。这些可以通过将试剂与合适的无刺激性赋形剂混合来制备，所述赋形剂在室温下为固体但在直肠温度下为液体，因此将在直肠中融化以释放药物。这种材料包括可可脂、蜂蜡和聚乙二醇。本发明的组合物也可局部施用，尤其是当治疗靶标包括局部施用易于接近的区域或器官时，包括眼、皮肤或下肠道疾病。对于这些区域或器官中的每一个，容易制备合适的局部制剂。对于局部应用，组合物可以配制成合适的软膏，其含有悬浮或溶解在一种或多种载体中的活性组分。用于局部施用本发明化合物的载体包括但不限于矿物油、液体凡士林、白凡士林、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蜡和水。或者，可以将组合物配制成合适的洗剂或乳膏，其含有悬浮或溶解在一种或多种药学上可接受的载体中的活性组分。合适的载体包括但不限于矿物油、脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、十六烷基酯蜡、鲸蜡硬脂醇、2-辛基十二烷醇、苯甲醇和水。用于下肠道的局部应用可以以直肠栓剂制剂(参见上文)或以合适的灌肠制剂实现。也可以使用贴剂。本发明的组合物还可以通过鼻气雾剂或吸入施用。这种组合物根据药物制剂领域熟知的技术制备，并且可以使用苯甲醇或其他合适的防腐剂、提高生物利用度的吸收促进剂、碳氟化合物和/或其他常规的增溶剂或分散剂制备为盐水溶液。
例如，存在于本发明药物组合物中的抗体可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用小瓶中以10mg/mL的浓度提供。该产品配制为用于静脉内施用：9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨醇酯80和无菌注射用水。将pH调节至6.5。本发明药物组合物中抗体的示例性合适剂量范围可为约1mg/m2-500mg/m2。但是，应当理解，这些明细是示例性的，并且考虑到必须在临床试验中测定的药物组合物中特定抗体的亲和力和耐受性，可以调整最佳明细和方案。可以制备用于注射(例如，肌肉内静脉注射)的本发明的药物组合物以含有无菌缓冲水(例如对于肌肉内，1ml)和约1ng-约100mg，例如约50ng-约30mg或更优选约5mg-约25mg的本发明的抗BTN2抗体。
通过以下附图和实施例进一步说明本发明。但是，这些实施例和附图不应以任何方式解释为限制本发明的范围。
附图说明
图1：将BTN2 mAb结合在HEK293F细胞上。用BTN2A2-Flag质粒转染HEK293F细胞。转染后第1天，将BTN2A2转染的HEK293F细胞(A)和未转染HEK293F细胞(B)用纯化的小鼠抗人BTN2 mAb在4℃下染色20分钟。单克隆抗-Flag抗体用作转染的阳性对照。洗涤2次后，将细胞与次级山羊抗小鼠IgG PE和细胞活力标志物在4℃下一起孵育20分钟。在LSRFortessa(BD)上采集细胞，并用FlowJo(TreeStar)分析。
图2：在癌细胞系上表达BTN2。将衍生自实体瘤(A)或造血系统恶性肿瘤(B)的癌细胞系用纯化的BTN2(8.16)mAb(10μg/ml)在4℃下染色20分钟。洗涤2次后，将细胞与次级山羊抗小鼠IgG PE和细胞活力标志物在4℃下一起孵育20分钟。在LSRFortessa(BD)上采集细胞，并用FlowJo(TreeStar)分析。细胞系源自：前列腺癌(PC3、DU145、LNCaP)、黑素瘤(Gerlach)、胰腺癌(L-IPC、Panc-1、Mia-PACA-2)、结直肠癌(Caco-2)、Hela(宫颈癌)、肾癌(A498)、肺癌(A549)、乳腺癌(MDA-MB-134、MDA-MB-231、SKBR3)、伯基特淋巴瘤(Daudi、Raji)、非霍奇金淋巴瘤(RL)、慢性髓细胞性白血病(K562)、急性髓性白血病(U937)。
图3：BTN2 mAb抑制Vγ9Vδ2T细胞的溶细胞功能。γδ-T细胞从6个健康供体的PBMC扩增而来(参见材料和方法)。将纯化的γδ-T细胞在IL-2(200UI/ml)中模拟过夜。然后，在存在或不存在抗BTN2(4.15、5.28、7.28、7.48、8.15、8.16、8.33)mAb(10μg/ml)的情况下，将γδ-T细胞与Daudi靶细胞系(效应子:靶(E:T)之比为1:1)与抗CD107a和抗CD1072抗体和Golgi stop在37℃下共培养。4小时后，收集细胞，固定并透化，然后用细胞内mAb(IFN-γ、TNF-α)染色并通过流式细胞仪分析。该图显示(A)γδ-T细胞的脱粒和炎性细胞因子的产生(B)TNF-α，(C)IFN-γ。下虚线表示γδ-T细胞针对Daudi细胞系的基础溶细胞功能。
图4：BTN2 mAb抑制抗CD277(20.1)mAb对Vγ9Vδ2T细胞的溶细胞功能的激动作用。将纯化的γδ-T细胞在IL-2(200UI/ml)中模拟过夜。然后在存在或不存在与抗CD27720.1mAb联合或不联合的抗BTN2(4.15、5.28、7.28、7.48、8.15、8.16、8.33)mAb的情况下，将γδ-T细胞与Daudi靶细胞系(效应子:靶(E:T)之比为1:1)与抗CD107a和抗CD1072抗体和Golgi stop在37℃下共培养。4小时后，收集细胞并通过流式细胞仪分析。该图显示γδ-T细胞中CD107(脱粒标志物)阳性细胞的百分比。下虚线表示γδ-T细胞针对Daudi细胞系的基础脱粒。上虚线表示用抗CD277 20.1抗体观察到的中值脱粒。
图5：BTN2 mAb不与转染有CD277亚型(BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3)的HEK293F细胞交叉反应。将用BTN3A1、BTN3A2、BTN3A3转染的HEK293F细胞和未转染HEK293F细胞用纯化的小鼠抗人BTN2 mAb、或用小鼠抗人CD277 20.1mAb或用同型对照IgG1在4℃下染色20分钟。抗Flag用作转染的阳性对照。洗涤2次后，将细胞与次级山羊抗小鼠IgG PE和细胞活力标志物在4℃下一起孵育20分钟。在LSRFortessa(BD)上采集细胞，并用FlowJo(TreeStar)分析。
具体实施方式
材料和方法
细胞培养
外周血单核细胞(PBMC)获自当地血库(EFS-Marseille-France)提供的健康志愿者供体(HV)，并通过密度梯度(Eurobio)分离。
伯基特淋巴瘤细胞系Daudi获自美国典型培养物保藏中心，并在含10％FCS的RPMI1640培养基中培养(0.5x 106/mL)。
扩增γδ-T细胞
如之前所述建立效应子γδ-T细胞。在第0天，用唑来膦酸(Sigma，1μM)和rhIL-2(Proleukin，200IU/mL)刺激来自HV的PBMC。从第5天起，每两天更新rhIL-2，并将细胞以1.15 x 106/mL保持15天。最后一天，通过流式细胞术评估γδ-T细胞的纯度。仅选择达到大于80％的γδ-T细胞的细胞培养物用于功能测试。将纯化的γδ-T细胞解冻直至使用。
产生单克隆抗体(mAb)
从细胞培养上清液中纯化小鼠抗人BTN2抗体(具有IgG1同种型的克隆4.15、5.28、7.28、7.48、8.15、8.16、8.33)和小鼠抗人CD277(也称为BTN3A；具有IgG1同种型的克隆20.1)。
流式细胞术
使用DIVA软件(BD bioscience)在LSRFortessa(Becton Dickinson)上分析之前，将PBMC、纯化的γδ-T细胞或肿瘤细胞系与特定的mAb一起孵育。用于γδ-T细胞脱粒测定的抗体包括：抗CD107a-FITC(BD Biosciences)、抗CD107b-FITC(BD Biosciences)、抗CD3-PeVio700(Miltenyi)、抗Tgd-PE(Miltenyi)、活/死近IR(Thermofisher)。用于筛选肿瘤细胞系上BTN2表达的抗体是：纯化的抗BTN2(克隆8.16，10μg/ml)、FcR阻断剂(Miltenyi)、山羊抗小鼠PE(Jackson immunoresearch)、活/死近IR(Thermofisher)。
γδ-T细胞上的功能测定
将来自HV的纯化的γδ-T细胞在IL-2(200UI/ml)中培养过夜。然后，在存在或不存在抗BTN2(4.15、5.28、7.28、7.48、8.15、8.16、8.33)mAb和/或抗CD277 20.1mAb(10μg/ml)的情况下，被或不被磷酸激动剂(Pag)活化的情况下，将γδ-T细胞与Daudi靶细胞系(效应子:靶(E:T)之比为1:1)在37℃下共培养，并在存在GolgiStop和可溶性CD107(a&b)-FITC的情况下，在4小时测定中进行细胞毒性试验。4小时后，收集细胞，固定并透化，然后，用细胞内mAb(IFN-γ、TNF-α)染色。最后，将细胞重悬浮于2％多聚甲醛的PBS中，并在BDLSRFortessa(BD Biosciences,San Jose,CA)上临时分析。基于对CD107a和CD107b阳性的细胞百分比(脱粒)和/或炎性细胞因子(IFN-γ、TNF-α)的产生来测量γδ-T细胞的溶细胞功能的程度。
抗BTN2单克隆抗体对BTN2A1和BTN2A2表达细胞的结合测试
产生携带BTN3和BTN2所有亚型的CRISPR-Cas9介导的缺失的HEK-293F细胞(293FBTN3/BTN2 KO)(数据未显示)，在DMEM(Life Technologies)10％胎牛血清(FBS，Gibco)1mM丙酮酸钠(Thermofisher science)中培养，并根据制造商的说明使用Lipofectamine 2000试剂(Thermofisher science)用pcDNA3-Zeo-BTN2A1-CFP或pcDNA3-Zeo-BTN2A2-CFP(其编码BTN2A1和BTN2A2 CFP(Nter)-融合蛋白)单独转染。
流式细胞术
转染后二十四小时，收集细胞(5x104个/样品)并一式两份以指定浓度(从20μg/mL到64pg/mL的2倍稀释度)在50μL染色缓冲液(DPBS1X(Thermofisher scientific)1％FBS,1mM EDTA(Thermofisher scientific))中对所有7种纯化的抗人BTN2 mAb在4℃下染色30分钟。将等浓度的小鼠IgG1抗体(Miltenyi)用作染色的同种型对照。然后，将细胞用200μL染色缓冲液洗涤两次，并与1:200稀释的山羊抗小鼠Ig-PE偶联物(JacksonImmunoresearch)在染色缓冲液中在黑暗中在4℃下孵育30分钟。最后，将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，然后根据制造商的说明使用BD Cytofix试剂(BD Bioscience)固定。对Cytoflex LX(Beckman Coulter)中的每个样品评估CFP阳性群体中PE通道上的平均荧光强度(MFI)，并使用FlowJo V10.4.2软件(FlowJo，LLC 2006-2018)分析。
统计
基于可变斜率模型非线性回归后的log(剂量)应答曲线测定BTN2A1和BTN2A2转染的293F BTN3/BTN2 KO细胞上纯化的抗人BTN2 mAb的EC50。使用GraphPad Prism 7.04软件(GraphPad)进行这些分析。
γδ-T细胞的增殖
使用抗TCRγδ微珠试剂盒(Miltenyi Biotec)从健康供体的PBMC中分离γδ-T细胞。通过流式细胞术评估的γδ-T细胞的纯度大于80％。在37℃下用CellTrace紫罗兰标记γδ-T细胞20分钟。然后，在存在200UI/ml IL-2、有或没有Pag和有或没有抗BTN2抗体(10μg/ml)的情况下，在96孔圆底板中培养5.105个CellTrace标记的细胞。培养5天后，在BDLSRFortessa(BD Biosciences,San Jose,CA)上通过流式细胞术评估CellTrace稀释度。
统计
结果表示为中值±SEM。使用Spearman相关性、Wilcoxon测试和Mann-Whitney t测试进行统计分析。p值<0.05被认为是显著的。使用GraphPad Prism程序进行分析。
结果
鉴定参考抗体mAb1-mAb7
参考抗体mAb1-mAb7按如下获得：
用BTN2A1-Fc抗原免疫小鼠。收集小鼠的脾细胞并与骨髓瘤融合以获得杂交瘤。筛选并分离产生与BTN2亲和力最高的抗体的杂交瘤，分别得到能够产生mAb1-mAb7的以CNCMI-5231,CNCM I-5232,CNCM I-5233,CNCM I-5234,CNCM I-5235,CNCM I-5236和CNCM I-5237保藏的杂交瘤。
用作根据本公开的抗体的比较对照的产生mAb7(mAb 8.33)的杂交瘤已根据布达佩斯条约于2017年9月14日保藏于国家微生物培养物保藏中心(CNCM,Institut Pasteur,25 rue du Docteur Roux,75724 Paris Cedex 15,France)。
mAb 8.33的保藏杂交瘤的CNCM保藏号为CNCM I-5237。
mAb1-6结合在HEK293F细胞上
图1中的图表显示了小鼠抗人BTN2 mAb对用人BTN2A2转染的HEK293F细胞(图1A)或未转染的HEK293F细胞(图1B)的亲和力的滴定曲线。
下表列出了每种抗体的EC50。除了不通过流式细胞仪结合BTN2A2的mAb 8.33(mAb7)之外，所有测试的抗体均能够识别并结合HEK细胞上的BTN2A2。
抗体 克隆名称 EC50(μg/ml)
mAb1 mAb 4.15 0.07
mAb2 mAb 5.28 0.07
mAb3 mAb 7.28 31.3
mAb4 mAb 7.48 0.08
mAb5 mAb 8.15 0.1
mAb6 mAb 8.16 0.11
mAb7 mAb 8.33 -
BTN2多肽在癌细胞系上表达。
将肿瘤细胞系与mAb6(小鼠抗人BTN2 mAb 8.16)一起孵育，然后与次级山羊抗小鼠PE一起孵育。如图A所示，观察到BTN2蛋白在衍生自实体瘤或造血系统恶性肿瘤的肿瘤细胞系的图中广泛表达，包括Daudi细胞系(Burkitt淋巴瘤)，这是Vγ9Vδ2T细胞脱粒测定中使用的标准细胞系。
mAb 1-6抑制Vγ9Vδ2T细胞的溶细胞功能。
从健康供体的PBMC中扩增纯化的Vγ9Vδ2T细胞。将Vγ9Vδ2T细胞与Daudi靶细胞共培养。如图3所示，抗CDN2 mAb 1-6的添加导致Vγ9Vδ2T细胞的溶细胞功能的抑制，如CD107脱粒所测量，并产生针对Daudi靶细胞系的炎性细胞因子(TNF-α，IFN-γ)。
不通过流式细胞仪结合BTN2A2的对照抗体mAb 7(mAb 8.33)对Vγ9Vδ2T细胞脱粒(溶细胞功能)或炎性细胞因子的产生没有影响。
抗CD277 20.1激动剂抗体用作Vγ9Vδ2T细胞脱粒的活化抗体的对照实例，并且抗CD277 103.2拮抗剂抗体用作Vγ9Vδ2T细胞脱粒的抑制抗体的对照实例。
mAb 1-6抑制抗CD277(20.1)mAb对Vγ9Vδ2T细胞的溶细胞功能的激动作用。
我们还测试了在激动剂抗CD277 20.1mAb(公开于WO2012/080351中并且已知会增加Vγ9Vδ2T细胞的脱粒)存在下抗BTN2 mAb 1-6的组合的作用。
如图4所示，mAbs 1、2和4(分别是抗BTN2 mAbs 4.15、5.28、7.48)出乎意料地抑制抗CD277 20.1抗体对Vγ9Vδ2T细胞针对Daudi靶细胞系的溶细胞功能的激动作用。
mAb 5和6(分别是Anti-BTN2 8.15、8.16)部分地抑制抗CD277 20.1抗体对Vγ9Vδ2T细胞针对Daudi靶细胞系的溶细胞功能的激动作用。
mAb 3(抗BTN2 7.28)和mAb 7(抗BTN2 8.33)并未显示出抗CD277 20.1抗体对Vγ9Vδ2T细胞针对Daudi靶细胞系的溶细胞功能的激动作用的显著抑制作用。
如之前所述，拮抗剂103.2和激动剂20.1抗CD277的组合用作对照：拮抗剂103.2抗体抑制20.1抗体对Vγ9Vδ2T细胞针对Daudi靶细胞系的溶细胞功能的激动作用。
以下总结了mAb 1-6(和对照mAb 7)的表征结果：
mAb 1-6不与转染有CD277亚型(BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3)的HEK293F细胞交叉反应。
BTN2 mAb在转染有CD277的任何一种亚型(BTN3A1、BTN3A2或BTN3A3)的HEK293F细胞上的结合与在未转染的HEK293F细胞上观察到的结合相似(参见图5)。我们可以得出结论，抗BTN2 mAb不与CD277的亚型之一交叉反应。
mAbs 1-6对人BTN2A1和BTN2A2亚型具有结合特异性
mAb 1-6在BTN3/BTN2 KO HEK293F细胞上的结合。
下表中列出了BTN2A1和BTN2A2上每种抗体的EC50。测试的所有抗BTN2抗体均能够结合除mAb 8.33(mAb7)之外的两种亚型，其在流式细胞仪上不显示染色。
总表：
用于实施要求保护的发明的核苷酸和氨基酸序列
参考文献：
贯穿本申请，各种参考文献描述了本发明所属的技术水平。这些参考文献的公开内容通过引用结合到本公开中。

Claims (11)

1.一种对人嗜乳脂蛋白-2(BTN2)具有特异性的抗体，其特征在于其包含：
i.分别为SEQ ID NO:3-8的mAb 4.15的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
ii.分别为SEQ ID NO:11-16的mAb 5.28的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
iii.分别为SEQ ID NO:19-24的mAb 7.28的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
iv.分别为SEQ ID NO:27-32的mAb 7.48的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；
v.分别为SEQ ID NO:35-40的mAb 8.15的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3；或
vi.分别为SEQ ID NO:43-48的mAb 8.16的H-CDR1、H-CDR2、HCDR3、L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3。
2.根据权利要求1所述的抗体，其对人嗜乳脂蛋白-2A1(BTN2A1)和人嗜乳脂蛋白-2A2(BTN2A2)均具有特异性。
3.根据权利要求1所述的抗体，其与至少一种以下参考鼠抗体竞争结合BTN2A2：
i.mAb 4.15，可通过以保藏号CNCM I-5231保藏于CNCM的杂交瘤获得；
ii.mAb 5.28，可通过以保藏号CNCM I-5232保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iii.mAb 7.28，可通过以保藏号CNCM I-5233保藏于CNCM的杂交瘤获得；
iv.mAb 7.48，可通过以保藏号CNCM I-5234保藏于CNCM的杂交瘤获得；
v.mAb 8.15，可通过以保藏号CNCM I-5235保藏于CNCM的杂交瘤获得；或
vi.mAb 8.16，可通过以保藏号CNCM I-5236保藏于CNCM的杂交瘤获得。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其是包含以下的抗体：
i.其中VH区与SEQ ID NO:9具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ ID NO:10具有至少95％同一性的轻链；
ii.其中VH区与SEQ ID NO:17具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ ID NO:18具有至少95％同一性的轻链；
iii.其中VH区与SEQ ID NO:25具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ ID NO:26具有至少95％同一性的轻链；
iv.其中VH区与SEQ ID NO:33具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ ID NO:34具有至少95％同一性的轻链；
v.其中VH区与SEQ ID NO:41具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ ID NO:42具有至少95％同一性的轻链；或
vi.其中VH区与SEQ ID NO:49具有至少95％同一性的重链和其中VL区与SEQ ID NO:50具有至少95％同一性的轻链。
5.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其特征在于其不与人CD277交叉反应。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其在激动剂抗CD277抗体mAb20.1存在下，抑制Vγ9/Vδ2T细胞的溶细胞功能。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的抗体，其是人抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
8.一种核酸分子，其编码根据权利要求1-7中任一项所述的抗体。
9.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8所述的核酸。
10.根据权利要求1-7中任一项所述的抗体在制备用于治疗选自炎症性疾病、自身免疫性疾病和移植排斥的疾病的药物中的用途。
11.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗体和至少一种药学可接受的载体。
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